WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

«ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ OROSTACHYS SPINOSA (L.) SWEET (CRASSULACEAE J.ST.-HIL.) ПО ДАННЫМ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОCТЕЙ МЕЖГЕНН ...»

На правах рукописи

НИКУЛИН АРТУР ЮРЬЕВИЧ

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ OROSTACHYS

SPINOSA (L.) SWEET (CRASSULACEAE J.ST.-HIL.) ПО ДАННЫМ

АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОCТЕЙ

МЕЖГЕННЫХ СПЕЙСЕРОВ ЯДЕРНОЙ И ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток – 2017

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии» Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гончаров Андрей Анатольевич

Официальные оппоненты:

Семериков Владимир Леонидович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной экологии растений Туранов Сергей Викторович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Национальный научный центр морской биологии» Дальневосточного отделения Российской академии наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной систематики



Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук

Защита диссертации состоится « 20 » октября 2017 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Национальный научный центр морской биологии» Дальневосточного отделения Российской академии наук по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

Факс: (423) 2310-900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Национальный научный центр морской биологии» Дальневосточного отделения Российской академии наук: http://wwwimb.dvo.ru/misc/dissertations/index.php/sovet-d-005-008-01/35nikulin-artur-yurevich Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан «___» августа 2017 г.

Ученый секретарь диссертационного Ващенко Марина совета, кандидат биологических наук Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Семейство Crassulaceae J.St.-Hil. (толстянковые) объединяет около 1400 видов растений, классифицируемых в 33 рода (Eggli, 2005). Это, преимущественно, многолетние травянистые растения суккулентного облика, широко распространенные в теплых и засушливых областях. Наибольшее число видов встречается в Южной Африке, Восточной Азии, Средиземноморье и Америке.

Представители семейства являются популярными декоративными растениями (особенно в странах Восточной Азии), однако основной практический интерес представляют виды, обладающие ценными лекарственными свойствами, например, некоторые виды Rhodiola L.





, Kalanchoe Adans., Orostachys Fisch. и других родов (Бялт, 1999а). Экстракты из многих видов толстянковых широко применяются в народной медицине стран юговосточной Азии с давних пор (Mayuzumi, Ohba 2004). Медицинское значение они приобрели благодаря наличию биологически-активных веществ, содержащихся в их надземных сочных частях, в частности, большому количеству органических кислот (яблочной, галловой, янтарной, щавелевой), алкалоидов, флавоноидов, кумаринов, антиоксидантов, витаминов и микроэлементов (Zhang et al., 2010). Одним из видов Crassulaceae, используемых в традиционной восточной медицине благодаря своим адаптогенным свойствам, является Orostachys spinosa (L.) Sweet (горноколосник колючий, заячья капуста).

Род Orostachys включает 10–15 видов (Eggli et al., 1995; Mayzumi, Ohba, 2004; Eggli, 2005) и характеризуется сложной таксономической структурой, остающейся предметом дискуссий, т.к. морфологические признаки, используемые для разграничения внутриродовых таксонов, высоко полиморфны. Филогенетические отношения между O. spinosa и близкими ему видами до сих пор остаются слабо изученными, хотя представляют большой теоретический и практический интерес. Отличительной особенностью этого вида является нехарактерный для большинства толстянковых протяженный ареал, охватывающий большую часть северной Азии от побережья Тихого океана до Урала. Исследование полиморфизма нуклеотидных последовательностей O. spinosa поможет пролить свет на его положение в трибе Telephieae, в роде, а также на филогеографию этого широко распространенного вида и генетическую структуру его популяций.

Степень разработанности. Родственные отношения между представителями рода Orostachys ранее практически не изучались. Попытка реконструировать филогенетические связи в роде с помощью сравнения набора морфологических признаков была предпринята лишь В.В. Бялтом (Бялт, 1999а).

Другие исследования проводились молекулярно-генетическими методами и включали представителей Orostachys и некоторых других родов/клад трибы Telephieae (’t Hart) Ohba and Thiede ined., но были представлены очень ограниченным числом видов (Mayuzumi, Ohba, 2004; Гончарова, 2006а; Гончарова и др., 2008). Относительно недавно были получены новые генетические данные для типовой подсекции Orostachys (Kozyrenko et al., 2013), но без привлечения других представителей трибы. Исследования же генетической структуры популяций O. spinosa и филогенетических отношений между видами подсекции Appendiculatae (Borissova) H. Ohba ранее не проводились.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление филогенетических связей, изучение генетического разнообразия и популяционной структуры O. spinosa на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК и межгенных спейсеров хпДНК.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

Получить нуклеотидные последовательности ITS региона рДНК для O.

1.

spinosa и близких ему видов подсекции Appendiculatae (O. chanetii (H.

Lveill) A. Berger, O. japonica (Maxim.) A. Berger, O. thyrsiflora Fisch.), произвести моделирование вторичных структур транскриптов ITS1 и ITS2.

Уточнить родственные связи O. spinosa в трибе Telephieae по данным 2.

ITS региона рДНК и провести анализ молекулярной датировки, для определения времени диверсификации основных линий трибы.

Осуществить поиск информативных на популяционном уровне маркеров хпДНК, секвенировать их нуклеотидные последовательности и дать оценку генетического разнообразия и популяционной структуры O. spinosa.

Провести анализ генеалогических связей между гаплотипами и реконструировать возможные пути расширения ареала O. spinosa.

Научная новизна. Результаты, полученные в данном исследовании, являются новыми и приоритетными. В ходе работы получены 84 нуклеотидные последовательности ITS региона рДНК (ITS1–5.8S–ITS2) представителей 6 видов трибы Telephieae и 621 последовательность некодирующих регионов хпДНК – межгенных спейсеров trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL 25 популяций O. spinosa. Все нуклеотидные последовательности депонированы в базу данных GenBank EMBL/NCBI. Выполнено моделирование вторичных структур транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 рДНК с использованием универсальной номенклатуры основных структурных элементов. На основе анализа ITS региона рДНК установлены с высокой достоверностью филогенетические связи между основными эволюционными линиями трибы Telephieae и определен их возраст методом молекулярной датировки. Впервые показано, что монотипный род Meterostachys Nakai является членом клады подсекции Appendiculatae, а не ее сестринской группой, как считалось ранее. Показано, что образец M. sikokiana (Makino) Nakai близок к O. thyrsiflora. Впервые обнаружен внутригеномный полиморфизм в ITS1 у вида O. japonica.

На основе анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров хпДНК trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL впервые получены знания о генетическом разнообразии, популяционной структуре и филогеографии O. spinosa. Установлен предполагаемый центр происхождения вида. Предложена гипотеза расширения ареала O. spinosa в восточном и западном направлениях и определены основные пути распространения вида.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные уточняют имеющиеся представления о филогенетических отношениях в семействе Crassulaceae, в целом, и в трибе Telephieae подсемейства Sempervivoideae A. Berger, в частности, а так же обогащают новыми знаниями о генетическом разнообразии, популяционной структуре и филогеографии O. spinosa – одного из самых широко распространенных видов семейства.

Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций для студентов, специализирующихся на кафедрах ботаники, генетики и биотехнологии. Практическая значимость состоит в том, что эти данные могут быть полезны для мониторинга состояния природных популяций с целью сохранения биоразнообразия, для проведения фармакологических исследований вида и для развития биотехнологических разработок на основе растительного сырья.

Методология и методы диссертационного исследования. В данной диссертационной работе используются стандартные методики проведения молекулярно-генетических исследований. Для подтверждения результатов секвенирования использовали молекулярное клонирование. Привлечен биоинформатический подход: моделирование спиралей вторичных структур транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 и построение обобщенных струкур для растений рода Orostachys подсекции Appendiculatae. Полученные нуклеотидные последовательности были включены в матрицы данных, на основании которых производились филогенетические анализы в современных компьютерных программах с использованием методов максимального правдоподобия (ML), максимальной экономии (MP) и Баесовского подхода (BI)

Положения, выносимые на защиту:

ITS регион рДНК является информативным маркером для реконструкции родственных отношений в роде Orostachys и между видами в трибе Telephieae, а межгенные спейсеры trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL хпДНК

– для изучения генетического разнообразия, популяционной структуры и филогеографии O. spinosa.

Модели вторичных структур транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 2.

рДНК, построенные для растений рода Orostachys подсекции Appendiculatae, являются эффективным инструментом для выравнивания дивергентных нуклеотидных последовательностей и имеют типичное строение ITS региона растений.

Происхождение O. spinosa датируется примерно 6 млн. л. н. Распространение вида из центра происхождения (в горах Алтая) могло происходить в трех направлениях: на запад до предгорий Южного Урала и двумя линиями на восток – в район озера Байкал и северо-восточную Азию (Якутия, Магадан). Последняя линия дала начало Восточной группе, предки которой дивергировали около 3,5 млн. л. н., и распространялись в южном направлении (Китай, Приморский край).

Специфическое островное распределение местообитаний O. spinosa 4.

(на скалах, сухих склонах, в расщелинах) привело к изоляции отдельных популяций и постепенному дрейфу генов с накоплением нуклеотидных отличий.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов подтверждается современными молекулярно-генетическими и статистическими методами исследования, которые соответствуют поставленным в работе целям и задачам. Для анализа были использованы выборки достаточного объема – до 10–12 образцов из популяции (конкретного места выборки). Научные результаты подкреплены убедительными фактическими данными, наглядно представленными в приведенных таблицах и рисунках.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2011); II (Х) Международной ботанической конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2012); на ХI Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2012); на международном симпозиуме «The East Asian Flora and its role in the formation of the world's vegetation» (Vladivostok, 2012); на I межрегиональной молодежной школеконференции «Актуальные проблемы биологических наук» (Владивосток, 2013); на конференции «Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics» (MAPEEG; Vladivostok, 2013); на IV международной конференции «Molecular Phylogenetics» (MolPhy; Москва, 2014); международной конференции «Сохранение разнообразия растительного мира в ботанических садах: традиции, современность, перспективы» (Новосибирск, 2016).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 10 публикациях, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 13 таблиц. Список литературы содержит 182 источника, из них 144 на иностранном языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю Андрею Анатольевичу Гончарову за внимательное и конструктивное руководство. Автор благодарит коллег за помощь в сборе материала для настоящей работы: Ш.Р. Абдуллина, В.А. Бакалина, В.В. Богатова, А.А. Гончарова, Р.В. Дудкина, А.С. Дубровину, К.В. Киселева, Ю.В.

Овчинникова, Д.А. Сидорова, В.П. Шохрина, В.В. Шохрину, В.В. Якубова, M. Dobos. Отдельно автор благодарен К.В. Киселеву и А.П. Тюнину за помощь в проведении экспериментов по молекулярному клонированию. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 15-29и ДВО РАН (15-II-6-034).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данном разделе освещены биологические особенности растений семейства толстянковые: распространение, морфология, а также противоречивые результаты недавних исследований филогенетических отношений между его некоторыми представителями. Далее рассмотрена информация о видах семейства, обладающих лекарственными свойствами. Приведен целый ряд исследований, в которых отмечалось адаптогенное действие экстракта O.

spinosa и перспективность исследования этого вида с целью введения в медицинскую практику. Затем изложена краткая история изучения рода, информация о морфологических особенностях представителей Orostachys и таксономических вопросах, стоящих перед исследователями до сих пор. Приводится детальная характеристика изучаемого вида. Далее дается определение термину «филогеография». Освещен ряд вопросов, которые рассматривает эта область исследований. Затем рассмотрены примеры использования ядерного маркера ITS региона рДНК для реконструкции филогении в различных группах растений, в том числе в семействе Crassulaceae. Представлена информация о методе моделирования вторичных структур транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 для получения информации о фолдинге и поиска гомологичных позиций. Освещены особенности строения хлоропластного генома, поиска и применения информативных межгенных спейсеров хпДНК для популяционного исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы. Материалом для исследования служило 261 растение из 47 популяций шести видов рода Orostachys: O. spinosa (28 популяций, 211 образцов), O. japonica (14 популяций, 45 образцов), O. thyrsiflora (2 популяции, 2 образца), O. chanetii (1 популяция, 1 образец)) подсекции Appendiculatae и O. boehmeri (Makino) H. Hara (1 популяция, 1 образец) и O.

paradoxa (A.P. Khokhr. & Vorosch.) Czerep. (1 популяция, 1 образец) подсекции Orostachys. Часть растений была собрана самостоятельно, часть получена с помощью коллег, в том числе образцы из частной коллекции (Рис. 1).

Рисунок 1 – Карта мест сбора растений (O. spinosa – белые окружности, O.

japonica – черные).

2.2. Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли, используя набор QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany).

2.3. Амплификация ДНК. ITS регион рДНК амплифицировали в два приема: в первом раунде амплификации использовали праймеры 1400F (Elwood et al., 1985) и ITS055R (Marin et al., 2003); во втором раунде (при необходимости) использовали внутренние праймеры 18Sm10 (Wen, Zimmer,

1996) и ITS4R (White et al., 1990). Для амплификации межгенных спейсеров trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL, trnD–trnT и trnS–trnG хпДНК использовали праймеры из работ Шоу с соавт. (Shaw et al., 2005, 2007).

2.4. Электрофорез амплифицированных участков ДНК в агарозном геле. Для проверки эффективности ПЦР и определения длины ПЦРпродукта фрагменты ДНК с маркером длин 100+ bp DNA Ladder (Евроген, Россия) разделяли горизонтальным электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

2.5. Секвенирование ДНК. Циклическое секвенирование обеих цепей фрагментов ДНК осуществляли с использованием набора флуоресцентно меченных Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems Inc., Forster City, USA) и тех же праймеров. Определение нуклеотидных последовательностей обеих цепей ПЦР-продуктов проводили на секвенаторе ABI PRIZM 3130 (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA) на базе ЦКП ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН.

2.6. Клонирование ITS региона рДНК. Клонирование проводили с использованием InsT/AcloneTM PCR Product Cloning Kit (Fermentas, Литва), следуя инструкциям производителя.

2.7. Моделирование вторичных структур транскриптов ITS1 и ITS2 рДНК. Вторичные структуры транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 строились с использованием веб сервера Mfold (Zuker, Markham, 1995; Zuker, 2003). Нами производился поиск оптимальных моделей, структур с наиболее низкими показателями свободной энергии при стандартных настройках фолдинга (Mathews et al., 1999; Reuter, Mathews, 2010). Полученная матрица использовалась для построения обобщенных (консенсусных) моделей вторичной структуры ITS1 и ITS2 в программе 4SALE (Seibel et al., 2006).

2.8. Анализ молекулярно-генетических данных. Расчет параметров генетического разнообразия осуществлялся в программе Arlequin v. 3.11 (Excofier et al., 2005). Филогенетические деревья были построены с использованием методов ML и MP в программе PAUP* 4.0b10 (Swofford, 2002). Для проведения ML-анализа в программе jModelTest 2.1.1 (Darriba et al., 2012) определялась подходящая для набора данных модель нуклеотидных замен.

Также реконструкция проводилась с помощью Баесовского подхода в программе MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Устойчивость узлов филогенетических деревьев для ML-анализа рассчитывали с помощью вебсервера RAxML web server version 7.7.1 (Stamatakis et al., 2008), а методом бутстрепа (Bootstrap Percentage, далее BP) с 1000 репликациями эвристического поиска (Felsenstein, 1985) для МP в PAUP* 4.0b10. Для оценки достоверности ВI-анализа были определены апостериорные вероятности (Posterior Probabilities, далее РР). Для оценки парных генетических дистанций (pдистанции) использовали программу MEGA v.6.06 (Tamura et al., 2013). Молекулярная датировка (определение времени дивергенции) возникновения основных линий Telephieae проведена в рамках байесовского подхода в пакете программ BEAST 1.8.1 (Drummond et al., 2012) на основании средних скоростей нуклеотидных замен в ITS регионе рДНК (Zhang et al., 2014). Объединение трех межгенных спейсерных регионов хпДНК в одно выравнивание, аппаратный подсчет мутационных событий, построение графиков распределения парных нуклеотидных различий, тест на филогенетическую структурированность, проводились в пакете DnaSP v. 4.50 (Rozas et al., 2003). Расчет и визуализацию возможных вариантов мутационных переходов между гаплотипами на основе метода максимальной парсимонии с 95%-ным доверительным интервалом осуществляли с помощью программы TCS v. 1.21 (Clement et al., 2000). Расчет значения t-критерия Стьюдента для несвязанных выборок производился с помощью веб-интерфейса «Медицинская статистика» (Марапов, 2013). Значения индексов генетической дифференциации (F SС, FST, FСT) внутри, между группами популяций определялись в ходе анализа молекулярной дисперсии (AMOVA; Excoffier et al., 1992) в программе Arlequin v. 3.11 с тестовыми перестановками (1000 повторов).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Нами были амплифицированы и секвенированы 84 нуклеотидные последовательности ITS региона рДНК (ITS1–5.

8S–ITS2) и 685 последовательностей некодирующих регионов хпДНК, из них по 207 последовательностей каждого спейсера trnH–psbA, trnQ–rps16 и rpl32–trnL, 24 последовательности trnD–trnT и 40 последовательностей спейсера trnS–trnG. Два последних региона секвенировали с целью поиска информативных на популяционном уровне молекулярных маркеров, но не включили в дальнейшие анализы.

3.1. Вариабельность последовательностей ITS региона и моделирование вторичных структур транскриптов ITS1 и ITS2. Первый набор последовательностей был создан с целью уточнения положения O. spinosa в трибе Telephieae и включал 38 нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК (полученных нами и из базы данных GenBank). При создании второго набора данных для реконструкции филогенетических отношений в подсекции Appendiculatae рода Orostachys было привлечено 90 последовательностей представителей этой группы.

В пяти образцах, принадлежащих исключительно культивируемым растениям O. japonica (популяции P6, P7, P8, P13, P14), обнаружены пики со сдвигом на несколько нуклеотидов в сторону. ПЦР-продукты этих образцов были клонированы в E. сoli и отсеквенированы (по 10 клонов), что позволило обнаружить присутствие двух аллельных типов участка ITS1 в равных пропорциях. Эти варианты, обозначенные нами как риботипы R4 и R5, имели 8 и 7 нуклеотидов в поли-С участке соответственно (Рис. 2).

Общая длина ITS региона у представителей подсекции Appendiculatae варьировала от 607 пн (P49) до 614 пн (P47). Участки спейсеров ITS1 и ITS2 были практически идентичны по длине и содержанию ГЦ-оснований, 225,7±1,5 пн, 62,6±1,6% и 225,03±1,3 пн, 63±1,6% соответственно. Ген 5.8S был консервативен по длине (161 пн). Консервативность последовательностей межгенных спейсеров в наборе данных была умеренной: 152 позиции (67%) в ITS1 и 168 позиций (75%) в ITS2 (универсально консервативные позиции). Поэтому для создания однозначного выравнивания, поиска гомологичных позиций, нами была привлечена структурная информация, полученная при моделировании вторичной структуры транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 для членов Orostachys подсекции Appendiculatae. Все обнаруженные гомологичные позиции (401 признак, универсальная позиция) были пронумерованы отдельно для каждого спейсера. Эта номенклатура далее использовалась для указания точного положения вариабельных и консервативных регионов, а также для локализации основных структурных доменов на моделях вторичных структур. Обе построенные модели РНК-транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 формировали структуры, состоящие из четырех спиральных (стеблевых) доменов, которые разделялись неспаренными одноцепочными участками (Рис. 2). В участке ITS1 на их долю приходилось около 37% всей длины спейсера, а в ITS2 они были относительно короткими – всего 18% нуклеотидов. Правильность фолдинга нуклеотидной цепи поддерживается наличием компенсаторных и полукомпенсаторных замен оснований, обнаруженных в двуцепочечных доменах. Даже самые консервативные регионы спейсера ITS2 (спирали 2 и 3) содержали 15 полукомпенсаторных замен (2 и 13 соответственно).

Рисунок 2 – Обобщенные модели транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 видов Orostachys подсекции Appendiculatae, реконструированные на основании консервативности (66 и 90% в ITS1 и ITS2 соответственно) 90 последовательностей ITS региона. Цифрами указаны позиции согласно универсальной номенклатуре. В прямоугольнике отмечен внутригеномный полиморфизм ITS1.

Нам удалось произвести однозначное выравнивание всего ITS региона (624 позиции; 147 информативных согласно методу MP – 88 для ITS1, 6 для

5.8S, 53 для ITS2), за исключением нескольких инделей.

3.2. Анализ филогенетической структуры трибы Telephieae (’t Hart) Ohba and Thiede ined. по данным ITS региона рДНК. Данный этап исследования был направлен на изучение филогенетической структуры трибы Telephieae подсемейства Sempervivoideae с охватом большинства родов.

При реконструкции методом ML и BI с использованием сложной модели замен нуклеотидов (GTR+I+G модель) получены деревья одинаковой топологии, на которых виды Telephieae были распределены между двумя кладами (Рис. 3). Первая устойчивая клада образована представителями подсекции Appendiculatae рода Orostachys и Meterostachys sikokiana, монотипного рода.

Вторую кладу с невысокой поддержкой (65%, ML) составили виды рода Hylotelephium Ohba, подсекции Orostachys рода Orostachys и виды Sinocrassula (Franchet) A. Berger (Рис. 3).

Клада Appendiculatae была хорошо структурирована и большинство ее внутренних ветвей оказались устойчивы.

Она разделилась на две подклады:

первая включала O. spinosa, O. chanetii и O. japonica (100%), вторая – Meterostachys sikokiana и O. thyrsiflora (80%). В устойчивой кладе (97%) вида O. spinosa была очевидна дивергенция последовательностей на две подклады, условно названные нами Восточной и Западной группами по географическому принципу (100 и 67% соответственно). Последовательности O. japonica образовали сестринскую группу к O. chanetii, однако статистическая поддержка была слабой. Как и в предыдущих исследованиях, клада Hylotelephium–Orostachys подсекции Orostachys с умеренной поддержкой (86%) была сестринской по отношениию к Sinocrassula, но порядок ветвления в ней остался неразрешенным (Рис. 3). Дивергенция последовательностей Hylotelephium была велика, что не позволило, вероятно, достоверно установить отношения между ними. Представители Orostachys подсекции Orostachys, напротив, мало отличались друг от друга и слагали обособленную группу с длинной ветвью в составе Hylotelephium (Рис. 3).

В нашем анализе представитель Meterostachys достоверно (100%) являлся членом клады подсекции Appendiculatae и кластеризовался с О.

thyrsiflora (Рис. 3). Скрининг матрицы данных показал, что все члены клады Appendiculatae характеризуются 4 общими заменами в различных участках ITS, отличающими их от остальных членов трибы Telephieae.

В последовательностях Sinocrassula обнаружены две мутации, общие со всеми последовательностями представителей подсекции Appendiculatae:

делеция С в поз. 621 и замена AG в поз. 145 в ITS1, в то время как у членов клады Hylotelephium–Orostachys подсекции Orostachys эти две мутации отсутствуют. Наличие большого числа общих мутаций позволило, вероятно, Sinocrassula группироваться с кладой трибы, тогда как в предыдущих анализах она занимала сестринское к Telephieae положение (Mayuzumi, Ohba, 2004;

Гончарова и др., 2006).

Рисунок 3 – Филогенетическое дерево трибы Telephieae, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК методом ML, модель GTR+I+G. Цифрами указана устойчивость ветвей, рассчитанная методом бутстрепа. Ветви с поддержкой 100% выделены утолщенными линиями. Жирным шрифтом обозначены последовательности таксонов, полученные в настоящем исследовании. Указаны индели и замены с позициями в универсальном выравнивании: общие для некоторых групп и синапоморфные (в прямоугольниках).

Молекулярная датировка, основанная на данных о средних скоростях нуклеотидных замен в ITS регионе, впервые позволила произвести временную оценку дивергенции видов трибы. Согласно результатам, возраст трибы Telephieae составляет около 30 млн. лет. Дивергенция основных клад трибы подсекции и Telephieae: Sinocrassula, Orostachys Appendiculatae Hylotelephium–Orostachys подсекции Orostachys приходилась на относительно короткий период времени в первой половине миоцена – 20–18 млн. л. н.

Большинство видов Orostachys подсекции Appendiculatae и Hylotelephium возникли на границе миоцена и плиоцена – около 6 млн. л. н., тогда как виды подсекции Orostachys образовались значительно позднее – примерно 1,5 млн.

л. н., Восточная и Западная линии популяций O. spinosa дивергировали около 3,5 млн. л. н.

3.3. Реконструкция родственных отношений в подсекции Appendiculatae (Borissova) H. Ohba рода Orostachys. Следующим этапом исследования явилось построение первой молекулярной филогении подсекции Appendiculatae рода Orostachys на основании вариабельности нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК. На филогенетическом MLдереве (Рис. 4), были выделены четыре высоко поддержанные клады, соответствующие определенному виду: O. spinosa (98 и 98%, 1.00 в ML, MP, PP анализах соответственно), O. japonica (98 и 97%, 1.0), O. chanetii (91 и 70%, 1.0), и O. thyrsiflora (100 и 100%, 1.00). M. sikokiana вновь оказался достаточно близок к О. thyrsiflora. Их умеренно поддержаная клада (79 и 61% в ML и MP соответственно) была сестринской к относительно высоко поддержаной (100 и 99%, 1.0) линии, содержащей O. spinosa, O. japonica и O. chanetii. Клады видов O. spinosa и O. japonica были достоверно структурированы. Последовательности O. spinosa дивергировали на подклады/группы: Восточную, представляющую собой устойчивую линию (100 и 100%, 1.0) из 6 риботипов (R16–R20, R24), и Западную, включающую с низкой поддержкой (75 и 67% в ML и MP соответственно) риботипы R21 и R22 с Шантарских островов и Северо-Восточной Азии (Магаданская обл.) соответственно (Рис. 4). Кроме этого, риботипы O. spinosa были сгруппированы согласно географическому расположению популяций. Все риботипы растений из Приморского края (R19, R20, R24), Амурской области (R16–R18), северо-восточной Азии (R21 и R22), Алтайских и Уральских предгорий (R13 и R26) и озера Байкал (R12, R14, R15, R27) образовали высоко и умеренно поддержанные группы (Рис. 4).

Расширенный набор последовательностей ITS региона для подсекции Appendiculatae, позволил обнаружить ряд молекулярных синапоморфий для всех основных клад, установленных в нашем анализе (Рис. 4).

3.4. Филогения и филогеография O. spinosa по данным хпДНК. Выбранные нами маркеры характеризовались высокой информативностью на низких таксономических уровнях во многих группах растений: trnH–psbA, trnQ–rpS16, rpl32–trnL (Shaw et al., 2005, 2007; Kozyrenko et al., 2013).

–  –  –

–  –  –

50% Рисунок 4 – ML-дерево, основанное на данных сравнения 28 риботипов ITS региона рДНК (612 пн; модель GTR+I+G) четырех видов Orostachys и M.

sikokiana. Поддержка ветвей указана для ML/MP/PP анализов, утолщенной линией – ветви со 100% и 1.0 поддержками. Бутстреп поддержка менее 50% и апостериорные вероятности менее 0.90 не рассматривались. В прямоугольниках приведены синапоморфные замены для клад. Последовательности видов Sinocrassula indica A. Berger, S. yunnanensis A. Berger и Hylotelephium pseudospectabile (Praeger) S.H. Fu использованы в качестве внешней группы.

3.4.1. Гаплотипический анализ популяций O. spinosa. Выявленная нуклеотидная изменчивость обусловила присутствие большого числа гаплотипов хпДНК (хлоротипов). Анализ 207 последовательностей 25 популяций выявил 86 хлоротипов, отношения между которыми были визуализированы в виде сети (Рис. 5).

Рисунок 5 – Генеалогическая сеть хлоротипов O. spinosa. Окружности пропорциональны частотам встречаемости соответствующего хлоротипа. Черные точки – гипотетические хлоротипы. Отрезки соответствуют одному мутационному шагу. Коды популяций соответствуют таковым на рисунке 1.

Коллекционные образцы P20, P41, P43, P45 окрашены одним тоном.

Особый интерес представляет тот факт, что исследуемые популяции O.

spinosa практически не имеют общих хлоротипов, кроме географически близких популяций (не более 100 км друг от друга) P34, P35 (Приморский край) и P26, P27 (Иркутская обл.), хлоротипы H7 и H31 соответственно (Рис.

5).

Сеть хлоротипов состоит из двух дивергентных гаплогрупп, разделенных самой длинной ветвью сети – 11 мутационных шагов (Рис. 5). В первой группе (Восточная группа) объединены 27 хлоротипов (92 образца), обнаруженные в 10 популяциях из восточной части ареала вида – P30 (H64) и P31 (H27–H30) Амурской обл.; P37 (H63) и P39 (H70–H74) Хабаровского края;

P33–P36 из Приморского края (H1–H7; H11–H13; H17; H25–26); P29 (H61–

62) и P32 (H65) из Китая. Неожиданным оказался тот факт, что гаплотипы, выявленные на Шантарских островах (Н9 и Н10) и Магаданской обл. (Н8), не входили в эту группу. Приморские хлоротипы (H1– H7, H11– H13, H17, H25– H26) были связаны, в основном, одномутационными переходами (Рис. 5).

Данный паттерн распределения гаплотипов, скорее всего, обусловлен относительно недавним заселением O. spinosa этой территории. Вторую группу (Западная группа) сформировали 59 хлоротипов популяций: P38 Хабаровского края (H9–H10), P40 Магаданской обл. (H8), P21 и P22 Республики Башкортостан (H14–H16 и H23–H24 соответственно), P28 Забайкальского края (H18– H22), P26 и P27 Иркутской обл. (H31–H32 и H33–H38 соответственно), P23, P24 и P53 Республики Алтай (H39–H48, H49–H60 и H75–H84 соответственно), P54 Новосибирской обл. (H85–H86) и образцов из коллекции: P20, P41, P43, P45 (Рис. 5). Количество уникальных гаплотипов хпДНК в сети велико – 59 (68%): в Восточной группе выявлено 16, в Западной – 43.

Для подтверждения наличия филогенетической структуры, мы рассчитали показатели GST и NST. Первый учитывает только частоты гаплотипов, второй – сходство гаплотипов. Установлено, что GST=0.501 (p0.01), а NST=0.822 (p0.01). Более высокое значение для NST, чем GST (p0.05) указывает на присутствие филогеографической структуры.

3.4.2. Оценка генетического разнообразия популяций O. spinosa.

Показатели гаплотипического и нуклеотидного разнообразия, среднего числа парных нуклеотидных различий широко варьировали (0,0000–1,0000; 0,0000– 0,0143; 0,0000–32,651515 соответственно). Самыми высокими значениями данных параметров характеризовались все популяции с Алтая (P23, P24, P53), из которых максимальными – популяция P24. Среди популяций из Восточной группы высокими показателями отличалась P35 из Анучинского р-на Приморского края (0,5606; 0,002615; 5,833333). Популяции P20, P30, P32, P41, P43, P45 характеризовались нулевыми значениями, так как были представлены в анализе или одним образцом, или были мономорфными.

Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) всей выборки O. spinosa выявил достоверно высокую общую межпопуляционную дифференциацию (FST=0,76364, p0,001), на долю которой приходится 76,4% вариабельности, а на долю внутрипопуляционной дисперсии – 23,6%. Иерархический анализ распределения генетической изменчивости показал, что только 16,3% от общей дисперсии обусловлено различиями между Западной и Восточной группами, а генетические различия между популяциями в группе и внутрипопуляционная изменчивость составили 62,12 и 21,58% соответственно.

Для проверки гипотезы о демографической экспансии O. spinosa проведен тест на распределение парных различий (mismatch distribution test) для 16 популяций, представленных 8 и более образцами. Графики, построенные для популяций из Западной группы, в основном, имеют мультимодальный характер, что предполагает демографическое равновесие, т.е. длительную популяционную стабильность. Распределение парных генетических различий в популяциях Восточной группы показывает практически полное совпадение с ожидаемым унимодальным распределением модели экспансии, что свидетельствует о быстром росте популяций в недавнем прошлом.

3.4.3. Анализ внутривидовых филогенетических отношений. С целью реконструкции филогенетических отношений между представителями исследуемых популяций O. spinosa (86 хлоротипов, 25 популяций, 2300 пн) построена кладограмма методом МР, топология которой сходным образом отражала картину генеалогических связей хлоротипов O. spinosa.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Изменчивость последовательностей ITS региона рДНК. Нуклеотидные последовательности ITS региона рДНК растений рода Orostachys подсекции Appendiculatae характеризовались высокой генетической дивергенцией и оказались достаточно информативными для исследования филогенетических отношений на разных уровнях: для установления родства между близкими родами Orostachys, Hylotelephium, Meterostachys, Sinocrassula и видами O. spinosa, O. chanetii, O. japonica и O. thyrsiflora (Nikulin et al., 2015).

Полученные нами данные относительно мутационной динамики свидетельствуют о разнице в скоростях нуклеотидных замен между видами Orostachys подсекции Appendiculatae. Наибольшей дивергенцией последовательностей характеризовались виды O. spinosa и O. chanetii, в отличие от O.

japonica и O. thyrsiflora. Вообще, для представителей подсекции Appendiculatae были отмечены более высокие уровни генетической изменчивости последовательностей ITS региона, чем для типовой подсекции Orostachys. В первой подсекции на основании 94 последовательностей было обнаружено 27 риботипов (Рис. 4), тогда как для типовой – 7 риботипов у 86 последовательностей (Kozyrenko et al., 2013).

Внутригеномные варианты рДНК у растений встречаются довольно часто (Bailey et al., 2003; Xiao et al., 2010). Полиморфизм такого рода обнаружен нами в гомополимерном регионе ITS1 (риботипы R4 и R5) у пяти образцов O. japonica (Рис. 2), принадлежавших исключительно культивируемым растениям (популяции P6, P7, P8, P13, P14). Этот факт не учитывался нами при реконструкции дерева, т.к. ранее было показано, что внутригеномная изменчивость не оказывает большого влияния на достоверность реконструкции филогенетических связей (Chen et al., 2012; Song et al., 2012).

Интерес в последовательностях ITS региона представляют молекулярные синапоморфии – уникальные признаки, маркирующие линии (Рис. 3, 4).

Обнаружение синапоморфий имеет большое значение для систематики, так как изучаемая нами группа растений является высоко полиморфной в морфологическом плане и не имеет отличительных фенотипических признаков. В анализе выявлена одна синапоморфная замена (AG в позиции 95, ITS2), отличающая представителей Orostachys подсекции Appendiculatae, в том числе и Meterostachys, от остальных членов трибы. Филогенетическая значимость остальных мутаций, найденных в этой ветви достоверно не была установлена. Однако в филогенетическом контексте отмечены замены, выявленные у O. spinosa (в ITS2: GT в поз. 84 и AG в поз. 222), и в двух дивергентных группах (в ITS1: GA в поз. 205 и GA в поз. 210; C T в поз. 49, ITS2; Рис. 4).

Сестринские отношения между представителями рода Sinocrassula и кладой Hylotelephium/Orostachys подсекции Orostachys (Рис. 3) оказались несколько неожиданными, поскольку ранее этот род всегда достоверно занимал базальное положение на дереве Telephieae (Mayuzumi, Ohba, 2004; Гончарова и др., 2006). Мы определелили признаки, которые привели к изменению положения Sinocrassula на дереве. Предположительно, ими являются три мутации в ITS1: _R, в позиции 12, C_ в поз. 621 и AG в поз. 145. Полученный нами результат, ввиду слабой поддержки в анализе (65%), требует подтверждения с включением большего числа образцов и видов Sinocrassula.

Сестринские отношения между Meterostachys sikokiana и подсекцией Appendiculatae (Mayuzumi, Ohba, 2004; Гончарова и др., 2006), подтвердившие родовой статус первого вида, нами подвергаются сомнению. Более близкие отношения между этими таксонами (Рис. 3, 4) были поддержаны не только высокими значениями бутстрепа (100% и 100%, 1.00 в ML, MP, PP анализах соответственно), но и наличием четырех синапоморфий (Никулин и др., 2015). Таким образом, род Meterostachys достоверно является членом клады подсекции Appendiculatae, а не ее сестринским таксоном. Следует отметить, что M. sikokiana и близкий к нему О. thyrsiflora не только различаются морфологически, но и имеют удаленные друг от друга ареалы, что указывает на давнюю дивергенцию этих видов (около 10 млн. лет). На данном этапе преждевременно говорить о включении M. sikokiana в состав рода Orostachys. Необходимо подтвердить полученные данные с привлечением дополнительных образцов Meterostachys и других молекулярных маркеров.

Таким образом, результаты филогенетического анализа ITS региона рДНК представителей рода Orostachys (Рис. 3, 4) согласуются с ранее высказанными представлениями (Mayuzumi, Ohba, 2004; Гончарова и др., 2006;

Гончарова, Гончаров, 2009) о полифилии рода Orostachys и требуют соответствующих таксономических корректив. Учитывая, что типовой вид рода (O.

malacophylla) вошел в состав клады Hylotelephium, а подсекция Appendiculatae является самостоятельной кладой, она заслуживает выделения в отдельный род, либо объединения с родом Meterostachys под именем последнего, поскольку оно будет иметь право приоритета (Никулин и др., 2015).

4.2. Изменчивость межгенных спейсеров хпДНК. Межгенные спейсеры trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL хпДНК у представителей O. spinosa оказались высоко вариабельными. В этих регионах обнаружено относительно большое количество вариабельных сайтов (в среднем, 38), из них более половины (27) были информативны согласно методу MP. Сравнение 621 нуклеотидной последовательности этих межгенных спейсеров для 207 образцов O.

spinosa 25 популяций выявило большое число хлоротипов (86) и очень высокую дивергенцию между образцами и популяциями.

Генеалогическая сеть гаплотипов (Рис. 5) позволила установить наличие двух гаплогрупп популяций O. spinosa: Западная группа, которая включала 59 хлоротипов (15 популяций) из западной и северо-восточной части ареала вида, и Восточная группа – 27 хлоротипов (10 популяций) из юговосточной части ареала. В нашем наборе данных Восточная и Западная группы популяций были представлены примерно одинаковым числом последовательностей (92 и 115 соответственно), но при этом гаплотипическое разнообразие Западной группы было достоверно выше такового Восточной (59 и 27 хлоротипов соответственно; р0,05, согласно t-критерию Стьюдента для несвязанных выборок). Эта дивергенция популяций с высокой достоверностью зафиксирована во всех наших анализах, основанных на изменчивости ядерного маркера и хлоропластных межгенных спейсеров. Так на дереве трибы Telephieae (Рис. 3) бутстреп поддержки для Западной и Восточной клад были не всегда высоки, но значимы (в ML-анализе 67 и 100% соответственно). В расширенном анализе представителей рода Orostachys подсекции Appendiculatae (Рис. 4) поддержка была немногим выше (в ML-анализе 75 и 100% соответственно). В то время как при анализе генеалогических связей хлоротипов дивергенция между группами составляла 11 мутационных шагов (Рис. 5), на MP-кладограмме разделение на две группы было высоко поддержано (96%). Молекулярное датирование показало, что дивергенция видов в Западной группе началась значительно раньше (около 2,5 млн. л. н.), чем в Восточной (около 1 млн. л. н.). В связи с этим, мы можем предположить, что молекулярные признаки (замены нуклеотидов) в Западной группе хлоротипов являются более древними – плезиоморфными.

4.3. Филогеография O. spinosa. Как правило, при исследовании особенностей филогеографии того или иного вида основное внимание уделяется поиску общих гаплотипов для двух или нескольких популяций, а также географическому паттерну распределения гаплотипов в популяциях. Исследуемые популяции O. spinosa не имели общих гаплотипов хпДНК, что оказалось несколько неожиданным. Исключение составляли лишь две географически близкие популяции P34, P35 (H7) из Приморского края и две P26, P27 (H31) из Иркутской области (Рис. 5). Тем не менее, мы можем сделать некоторые предположения относительно филогеографии O. spinosa.

Наличие филогеографической структуры (NST достоверно выше GST, p0,05) и высокий уровень межпопуляционной дифференциации (FST=0,76364, p0,001) у O. spinosa могут быть результатами ограниченного потока генов между популяциями, вызванным изоляцией и дрейфом генов с накоплением нуклеотидных отличий (Chiang et al., 2006). Несмотря на достаточно широкий ареал O. spinosa, его генетическая структура характеризуется «островным» паттерном распределения. Этому, вероятно, способствует специфическое мозаичное распространение вида: на скалах, сухих склонах, в расщелинах.

Хлоротипы популяций из алтайских гор (32, половина хлоротипов Западной группы) характеризовались самыми высокими показателями разнообразия в наборе данных, причем почти каждый образец нес отдельный (уникальный) гаплотип. Ранее высказывалось предположение (Posada, Crandall,

2001) о том, что согласно теории коалесценции предковые аллели чаще всего занимают внутренние узлы на сети гаплотипов. Именно алтайские хлоротипы: H40, H44, H48, H57–59, H75, H83, H84 занимают внутреннее положение в сети (Рис. 5) и, вероятно, могут рассматриваться как предковые. Это подтверждается результатами молекулярной датировки – возраст наиболее древних представителей этой гаплогруппы оценивается в 2,5–2 млн. л.

Учитывая полученные данные филогенетических анализов и молекулярного датирования, мы предлагаем следующий сценарий распространения O. spinosa. Разделение предковых генетических линий основных клад трибы Telephieae (подсекции Appendiculatae и Sinocrassula/Hylotelephium/Orostachys подсекции Orostachys) произошло в первой половине миоцена (20 – 18 млн.

лет назад). На это время как раз приходится период формирования горной системы Гималаев. Распространение предков Sinocrassula и клады Hylotelephium/Orostachys подсекции Orostachys шло, веорятно, на восток через Гималаи, а предок подсекции Appendiculatae мог продвигаться на северовосток в направлении Алтая. Далее линии O. chanetii и O. japonica, возникшие на границе миоцена и плиоцена (около 6 млн. л. н.), отделились от O.

spinosa, вероятно, в горах Алтая. Именно там, по нашему мнению, находится центр происхождения O. spinosa (Рис. 6).

Рисунок 6 – Гипотетическая схема расширения ареала O. spinosa. Обозначены места сбора растений с номерами популяций. Пунктирной линией проведена предполагаемая граница между Западной и Восточной группами популяций. Стрелками показаны направления распространения. Затененная окружность – предполагаемый центр происхождения вида и зона предкового разнообразия.

Виды O. chanetii и O. japonica достигли Восточной Азии (Китай, Дальний Восток России и Япония соответственно), продвигаясь вдоль Монгольского Алтая и далее на восток. Распространение O. spinosa происходило в противоположных направлениях: на запад до предгорий Южного Урала и двумя линиями на восток – в район озера Байкал и северо-восточную Азию (Якутия, Магадан). Последняя линия, вероятно, была предковой для Восточной группы гаплотипов, ее потомки продвигались на юго-восток, на территорию современных Амурской области, Хабаровского и Приморского краев и Китая (Рис. 6). Мы полагаем, что граница между группами популяций O.

spinosa пролегает по западным склонам Большого Хинганского хребта на северо-востоке Китая и хребту Джагды на востоке Амурской области (Рис. 6).

Данный сценарий подтверждается результатами анализа распределения парных нуклеотидных различий, который показал, что в Западной группе гаплотипов предполагается длительная демографическая стабильность, в отличие от Восточной, где отмечен популяционный рост в недавнем прошлом.

В целом, обнаруженная нами генетическая подразделенность популяций O. spinosa соответствует морфологическим особенностям произрастания в природе: в виде дерновинок из особей (преимущественно многолетние поликарпические растения в условиях Горного Алтая, Магадана, Якутии) и отдельно растущих растений (многолетники-монокарпики, встречающиеся в Амурской области и Приморском крае). Мы полагаем, что эти отличия могут иметь генетические основания. Вполне вероятно, что незадолго до пересечения географической преграды, разделяющей Восточную и Западную группы (около 3,5 млн. л. н.), возникли не только мутации, маркирующие эти группы, но и некоторые физиологические особенности O. spinosa, унаследованные потомками. Трудно ответить на вопрос, что именно привело к таким изменениям, но мы можем предположить, что этот вид претерпел разделение на экотипы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования получены и депонированы в базу данных GenBank более 700 нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК и межгенных спейсеров trnH–psbA, trnQ–rps16, rpl32–trnL хпДНК O. spinosa и близких ему видов из подсекции Appendiculatae рода Orostachys (Crassulaceae). Высокая дивергенция последовательностей ITS региона рДНК у представителей подсекции и внутригеномный полиморфизм ITS1 у O. japonica обусловили необходимость использования информации о вторичных структурах транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 для создания однозначного выравнивания (поиска гомологий). На разработанных обобщенных моделях ITS1 и ITS2 установлены основные структурные элементы (спиральные и одноцепочечные домены), для их описания была разработана универсальная номенклатура; определены позиции инделей, компенсаторных и полукомпенсаторных замен оснований; проведен поиск гомологичных позиций. Этот набор данных использовался нами для уточнения родственных связей O. spinosa в трибе Telephieae, подсекции Appendiculatae и молекулярной датировки времени диверсификации основных линий Telephieae. Установлено, что O. spinosa близок O. japonica и O. chanetii, и входит в состав одной из двух клад Telephieae – устойчивой клады, образованной представителями подсекции Appendiculatae рода Orostachys. Также нами обнаружены синапоморфные замены, маркирующие основные клады дерева. Согласно байесовскому датированию, возраст наиболее древних представителей Telephieae составляет около 25 млн. л., а предковой ветви вида O. spinosa – около 6 млн. л.

Высокая вариабельность нуклеотидных последовательностей маркеров ядерной рДНК и хпДНК обусловили выявление большого числа риботипов и хлоротипов O. spinosa. Специфический «островной» паттерн распределения хлоротипов в сети и высокий уровень межпопуляционной дифференциации могут быть обусловлены ограниченным потоком генов между популяциями, вызванным изоляцией и дрейфом генов.

Филогенетический сигнал позволил в анализах методами ML, MP и BI с высокой достоверностью обнаружить разделение популяций O. spinosa на Западную и Восточную группы, различающиеся не только генетически, но и особенностями произрастания – в виде дерновинок из особей поликарпиков и отдельно растущих монокарпических растений соответственно. Не исключено, что представители этих групп отличаются между собой и содержанием биологически-активных веществ, поэтому мы советуем фармакологам и хемосистематикам обратить внимание на эту особенность биологии O. spinosa.

На основании анализа маркеров хпДНК мы установили предполагаемый центр происхождения O. spinosa (горы Алтая) и предложили гипотезу расширения его ареала.

ВЫВОДЫ

Разработаны обобщенные модели вторичных структур транскриптов спейсеров ITS1 и ITS2 рДНК для представителей подсекции Appendiculatae рода Orostachys, позволившие провести выравнивание дивергентных нуклеотидных последовательностей ITS региона.

Установлено, что триба Telephieae слагается двумя кладами – 2.

устойчивой кладой подсекции Appendiculatae рода Orostachys и слабоподдержанной Hylotelephium/Orostachys подсекции Orostachys/Sinocrassula.

Выявлено близкое родство видов O. spinosa, O. japonica и O.

3.

chanetii. Впервые показано, что вид Meterostachys sikokiana монотипного рода является членом клады подсекции Appendiculatae и близок O. thyrsiflora.

Согласно результатам молекулярной датировки возраст трибы 4.

Telephieae составляет около 30 млн. лет. Большинство видов Hylotelephium и Orostachys подсекции Appendiculatae (в том числе O. spinosa) возникли около 6 млн. л. н., а подсекции Orostachys – 1,5 млн. л. н.

Показано, что межгенные спейсеры trnH–psbA, trnQ–rps16, 5.

rpl32–trnL хпДНК являются информативными на популяционном уровне (86 хлоротипов в 207 образцах 25 популяций O. spinosa), в то время как нуклеотидные последовательности trnD–trnT и trnS–trnG оказались мономорфными.

Во всех анализах, основанных на данных ядерной и хпДНК, с 6.

высокой достоверностью установлена дивергенция популяций O. spinosa на две группы. Предполагаемая географическая граница между ними пролегает по западным склонам Большого Хинганского хребта на северо-востоке Китая и хребту Джагды на востоке Амурской области.

Выявлены достоверно высокая межпопуляционная дифференциация (FST=0,76364; p0,001) и филогеографическая структура (NSTGST;

p0,05), что указывает на отсутствие потока генов между большинством популяций O. spinosa вследствие их изоляции в течение долгого времени.

Распространение O. spinosa из центра происхождения (в горах 8.

Алтая) шло в трех направлениях: на запад до предгорий Южного Урала, на восток, предположительно двумя линиями – в район озера Байкал и северовосточную Азию (Якутия, Магадан). Последняя линия дала начало Восточной группе, предки которой дивергировали около 3,5 млн. л. н., и распространялись на юг (Китай, Приморский край).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналахиз списка, рекомендованного ВАК:

1. Никулин А.Ю., Никулин В.Ю., Гончаров А.А. К вопросу о филогенетической структуре трибы Telephieae (Sempervivoideae, Crassulaceae) По данным сравнения нуклеотидных последовательностей ITS-региона рДНК // Ботанический журнал. 2015. Т. 100, № 10. С. 1030–1040.

2. Nikulin A.Yu., Nikulin V.Yu., Gontcharova S.B., Gontcharov A.A. ITS rDNA sequence comparisons resolve phylogenetic relationships in Orostachys subsection Appendiculatae (Crassulaceae) // Plant Systematics and Evolution.

2015. Vol. 301, № 5. P. 1441–1453.

Работы в материалах конференций:

3. Никулин А.Ю., Гончаров А.А. Молекулярная эволюция межгенного спейсера trnH–psbA хлоропластной ДНК в семействе Crassulaceae – Толстянковые // Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии: материалы X Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток, 4–6 мая 2011 г. Владивосток: Издательство Дальневосточного университета, 2011. С. 186– 189.

4. Никулин А.Ю., Гончаров А.А. Анализ генетической структуры популяций Orostachys spinosa (L.) C.A. Mey (Crassulaceae DC.) на основании секвенирования межгенных спейсеров trnH–psbA и trnQ–rps16 хлоропластной ДНК // Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии: тезисы докладов ХI Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток, 3–4 мая 2012 г. Владивосток: Издательство Дальневосточного университета,

2012. С. 191–196.

5. Никулин А.Ю., Гончарова С.Б. Анализ генетической структуры популяций Orostachys spinosa (Crassulaceae) на основании сравнения межгенных спейсеров хлоропластной ДНК trnH–psbA, trnQ–rps16 и rpl32–trnL // II (Х) Международная ботаническая конференция молодых ученых в СанктПетербурге: тезисы докладов. Санкт-Петербург, 11–16 ноября 2012 г. СПб:

БИН РАН, 2012. С. 19–20.

6. Nikulin A.Y., Gontcharova S.B. Analysis of genetic structure of Orostachys spinosa (L.) C.A. Mey (Crassulaceae) populations based on comparisons of cpDNA intergenic spacers trnH–psbA, trnQ–rps16 and rpl32–trnL // The East Asian Flora and its role in the formation of the world's vegetation: abstracts of the symposium. Vladivostok, September 23–27, 2012. Vladivostok: BGI FEB RAS, 2012. P. 58.

7. Никулин А.Ю. Анализ генетической структуры популяций горноколосника колючего (Orostachys spinosa (L.) C.A. Mey (Crassulaceae)) на основании нуклеотидной изменчивости 3 межгенных спейсеров хлоропластной ДНК // Актуальные проблемы биологических наук: материалы I Межрегиональной молодежной школы-конференции. Владивосток, 13–18 мая 2013 г.

Владивосток: Издательство «Русский остров», 2013. С. 198–203.

8. Nikulin A.Y., Gontcharova S.B. Phylogeography of Orostachys spinosa (L.) C.A. Mey (Crassulaceae DC.) inferred from variation in non-coding chloroplast DNA sequences // Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics: International Symposium. Vladivostok, September 2–6, 2013. P.

55.

9. Nikulin A.Yu., Gontcharova S.B. ITS rDNA as a highly informative marker for phylogenetic inferences in Orostachys subsection Appendiculatae (Crassulaceae DC.) // Molecular Phylogenetics: Contributions to the 4th Moscow International Conference. Moscow, September 23–26, 2014. Moscow: Torus Press,

2014. P. 51.

10. Никулин А.Ю. Филогения и молекулярная датировка основных линий трибы Telephieae (Sempervivoideae, Crassulaceae) // Сохранение разнообразия растительного мира в ботанических садах: традиции, современность, перспективы: материалы Международной конференции, посвященной 70летию Центрального сибирского ботанического сада. Новосибирск, 1–8 августа 2016 г. Новосибирск: ЦСБС СО РАН, 2016. С. 208–210.

НИКУЛИН АРТУР ЮРЬЕВИЧ

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ

OROSTACHYS SPINOSA (L.) SWEET (CRASSULACEAE J.ST.-HIL.)

ПО ДАННЫМ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОCТЕЙМЕЖГЕННЫХ СПЕЙСЕРОВ ЯДЕРНОЙ

И ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК

АВТОРЕФЕРАТ

–  –  –



Похожие работы:

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 26 (65). 2013. № 3. С. 232-245. УДК 612.135:528.811+537-96 АДАПТАЦИОННО-ЗАЩИТНЫЕ РЕАКЦИИ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА КОЖИ В УСЛОВИЯХ ЛОКАЛЬНОГО ХОЛОДОВОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ПРИ...»

«1.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Санжарова Н. И., Молин А. А., Козьмин Г. В., Ко Sanzharova N. I., Moline A. A., Koz’min G. V., Ko бялко В. О. Радиационные агробиотехнологи...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 574 496 C1 (51) МПК G08G 1/01 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014127098/11, 03.07.2014 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Давыдов Юрий Львович (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Ш...»

«Вестник Тюменского государственного университета. 20 Экология и природопользование. 2016. Т. 2. № 4. С. 20–32 Павел Евгеньевич КАРГАШИН1 Платон Сергеевич ЯСЕВ2 УДК 528.87+528.94 КАРТОГРАФИРОВАНИЕ ПРОМЫШЛЕННОГО ОСВОЕНИЯ ХОХРЯКОВСКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ кандидат географических наук, доцент кафедры картографии и геоинформатики, геогр...»

«УДК 338.48-6:502/504 С.М. НИКОНОРОВ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ СУЩНОСТЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ТУРИЗМА Ключевые слова: туристская конкурентоспособность, рейтинг туристской конкурентоспособности, совокупный рейтинг конкурентоспособности страны, критерии туристской конкурентоспособности, потенциал экотуризма, компоненты экотуризма,...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Ка...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Н.В.Сорокина ТЕРИОЛОГИЯ Учебно-...»

«УДК 577.152.193 ВЭЖХ-АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ ПСЕВДОПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВ МЕТГЕМОГЛОБИНОМ Е.В. Бондарюк, В.В. Сенчук Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь Флавонолы – природные биологически активные полигидрокс...»

«1. ЦЕЛИ ОСВОЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ В курсе экология человека раскрывается биосоциальная природа человека, основные законы его развития в природной и социальной среде. Цель курса – раскрыть особенности взаимного влияния человека на среду своего обитания и этой среды на человека. Он посвящн познанию закономерностей взаимодейств...»

«Ученые записки Таврического национального университета имени В. И. Вернадского Серия "География". Том 27 (66), № 2. 2014 г. С. 3–15. РАЗДЕЛ 1. ФИЗИЧЕСКАЯ ГЕОГРАФИЯ И ГЕОЭКОЛОГИЯ УДК 620.91:712.253.58 "ЗЕЛЁНАЯ" ЭНЕРГЕТИКА В САДОВО-ПАРКОВЫХ КОМПЛЕКСАХ...»

«РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ НА ЮГЕ АРЕАЛА В ПОВОЛЖЬЕ Г.В. Епланова Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти eplanova_ievb@mail.ru Живородящая ящерица Zootoca vivipara (Lichtenstein, 1823) – вид с обширным транспалеарктическим ареалом. Она распространена в северной половине Евразии от Ирл...»

«ПРАВИЛА ПРОЖИВАНИЯ В КВАРТИРЕ БЛОКИРОВАННОГО ЖИЛОГО ДОМА В ЖИЛОМ КОМПЛЕКСЕ "ПАВЛОВО-2"1. СФЕРА ДЕЙСТВИЯ ПРАВИЛ ПРОЖИВАНИЯ. 1.1. Пользование Квартирой в блокированном жилом доме, приквартирным участком и Единой инфраструктурой поселка осуще...»

«Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Кольцово – 2008 Работа выпо...»

«Экологическое общество "Зеленое спасение" Республика Казахстан, Алматы, 2008 К Третьему совещанию сторон Орхусской конвенции For the Third Meeting of the Parties to the Aarhus Convention The Ecological Society Green Salvation The Republic of Kazakhstan, Almaty, 2008 ББК 20.1...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.