WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Учреждение РАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 E-mail: lab_motiv@mail.ru При анализе биологической активности свободных регуляторных пептидов (РП) и их искусственно синтезированных комплексов с белками-носителями (на примере вазоактивных и опиоидных пептидов) обнаружено, что белково-пептидные комплексы (БПК) по сравнению с нативными РП характеризуются расширением и интерференцией спектров активности, пролонгированными и интенсивными физиологическими эффектами, селективно влияют на врожденное и приобретенное поведение. Ранее нами выдвинута гипотеза о том, что эндогенные БПК являются особым классом сигнальных молекул, опосредующих полифункциональность свободных РП и их дифференцированное включение в интегративные регуляторные процессы в ходе онтогенетического развития организма.

При изучении ангиотензинов – вазоактивных РП, проявляющих отчетливую плейотропность физиологического действия в регуляции центральных и периферических функций (водно-солевой обмен, гемодинамика, эмоциональный стресс, воспаление, гуморальный и клеточный иммунитет и др.) показано, что физиологическая активность БПК отчетливо модулируется функционально различными белками, входящими в их состав (транспортный белок плазмы крови – бычий сывороточный альбумин – БСА и Ca+2-связывающий нейроспецифический белок S100b). Продемонстрированы эффекты введения свободных и связанных с белками ангиотензинов – I – IV (А-I, A-II, A-III и A-IV) на врожденное и приобретенное питьевое поведение, а также показатели гемодинамики у крыс. Выявлено, что БПК A-II и A-IV с БСА участвуют в фиксации, стабилизации и извлечении памятных следов приобретенных навыков удовлетворения жажды, тогда как БПК А-I и A-III с БСА вовлечены в обеспечение преимущественно врожденного питьевого поведения. Периферические механизмы питьевого поведения включаются за счет БПК ангиотензинов с S100b, обеспечивая функции гемодинамики и поддержания водно-солевого баланса.



Представляется, что комплексы РП с функционально различными белками обеспечивают дивергенцию путей сигнальной трансдукции, вызывая адекватные клеточные ответы с их участием в рамках целого организма.

Работа поддержана РГНФ (проект № 11-06-00847а).

Секционные доклады 103

БЕЛОК HLDF И АУТОАНТИТЕЛА К НЕМУ – БИОМАРКЕРЫ

СОПРЯЖЕННЫХ ПОРАЖЕНИЙ НЕРВНОЙ, СОСУДИСТОЙ И ИММУННОЙ

СИСТЕМ У ЧЕЛОВЕКА

Грудень М.А.1, Костанян И.А.2 Учреждение РАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, 125009 Москва, ул. Моховая, 11, стр.4 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: mgruden@mail.ru

Согласно современным представлениям в механизмах развития гипертонической болезни и ее церебральных осложнений важную роль играют нарушения процессов клеточного гомеостаза, микроциркуляции, трофического обеспечения, а также развитие аутоиммунных реакций с направленностью к факторам-регуляторам развития и гибели клеток. Одним их таких факторов может служить выделенный из клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека фактор дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), обнаруженный недавно в мозгу и крови животных и человека и имеющий в своей структуре пептидные фрагменты, обладающие гемодинамическими и нейротропными свойствами. Проведенные комплексные клинико-иммунобиохимические исследования, в частности, по изучению концентрации HLDF, уровня идиотипических и антиидиотипических антител к HLDF в сыворотке крови пациентов возрастной нормы (n=30), гипертонической болезнью (n=35), гипертоническим кризом (n=38), ишемическим инсультом (n=45), энцефалопатией (n=45), начальными нарушениями мозгового кровообращения (n=25) в динамике в критические периоды развития заболеваний выявили корреляционные взаимосвязи с функциональным состоянием нервной, сосудистой, а также иммунной систем при изучаемых патологиях и в нормальных условиях. Обнаружена также взаимосвязь изменений содержания фактора HLDF и системы аутоантител к HLDF с развитием когнитивного дефицита при острых и хронических цереброваскулярных осложнениях гипертонической болезни. Показана прогностическая значимость выявленных закономерностей в специфических концентрациях HLDF и соотношений в уровне аутоантител к нему для ранней диагностики поражений мозга гипертонического генеза.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

HLDF-6 – ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ПЕПТИДНЫЙ ПРЕПАРАТ

С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ, НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМ И НООТРОПНЫМ

ДЕЙСТВИЕМ

Богачук А.П., Липкин В.М., Сурина Е.А., Костанян И.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: apbog@mx.ibch.ru В России, где число больных с впервые установленным диагнозом злокачественных новообразований увеличивается ежегодно на 2–3% и к настоящему моменту достигает 550–600 тыс. человек за год, остро стоит вопрос о разработке отечественных противоопухолевых препаратов. Поскольку патогенез ряда злокачественных новообразований связан с нарушениями процесса дифференцировки, одним из многообещающих подходов к лечению является создание противоопухолевых препаратов на основе факторов клеточной дифференцировки. Достоинством данного подхода является то, что эти вещества способны вызывать регрессию опухоли через активацию естественного механизма ингибирования роста клеток в результате активации их дифференцировки.

Лейкоцитарный фактор дифференцировки – HLDF был впервые открыт и выделен в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН из культуральной среды клеток линии HL-60, обработанных ретиноевой кислотой. Белок вызывает дифференцировку клеток исходной линии по гранулоцитарному пути, а также играет важную роль в индукции апоптоза в клетках HL-60. В белке присутствует два активных центра. В состав первого центра входит шестичленный пептид HLDF-6, который отвечает за дифференцирующую и протекторную активности фактора. Пептид HLDF-6 полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора дифференцировки и обладает широким спектром ноотропной и нейропротективной активностей.

Нами получены прямые свидетельства нейропротекторного эффекта HLDF-6 в экспериментах на первичной культуре нейрональных клеток гиппокампа, мозжечка, а также иммунокомпетентных клеток. В нашей лаборатории ведется активное исследование препарата на основе пептида, действие которого приводит к регрессии опухоли через активацию естественного механизма ингибирования роста клеток в результате активации их дифференцировки, и при этом проявляет нейропротекторные свойства.

Перспективе применения пептида в качестве противоопухолевого препарата способствуют его высокая селективность действия, минимальные побочные эффекты, высокая стабильность per os, растворимость в водных средах, низкая токсичность, отсутствие иммуногенности. Кроме того, пептид потенцирует действие химиотерапевтических средств, при этом поддерживает качество жизни и снижает динамику опухолевой прогрессии.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ГК№ 16.512.11.2044 Министерства образования и науки Российской Федерации.

Секционные доклады 105

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ ГАПОНИНА

С ПОМОЩЬЮ ПАНЕЛИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

С ИЗМЕНЁННЫМИ УРОВНЯМИ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА

Ракитина Т.В.1,2, Смирнова Е.В.1, Воробьёва Е.Е.1, Иванова Д.Л.1, Богатова О.В.1, Поздеев В.И.1, Юдкина О.В.2, Костанян И.А.1, Липкин В.М.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 1

E-mail: taniarakitina@yahoo.com

Белки, биологическая роль которых ещё не до конца изучена, составляют не менее 30–40% протеома человека. Именно к таким белкам относится гапонин (haponin, HLDF-alike protein), первоначально выделенный из клеток линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60. С целью функционального изучения этого белка нами была разработана методика наработки 6хГис-гапонина в бакуловирусной и бактериальной системах экспрессии. Очищенный рекомбинантный гапонин был использован для получения поликлональных антител и поиска его потенциальных клеточных партнёров. В результате проведённых исследований было установлено, что одним из партнёров гапонина является глицеральдегид-3фосфат дегидрогеназа (GAPDH) – фермент, который помимо своей основной гликолитической функции обладает широким спектром дополнительных активностей, включая участие в клеточном ответе на окислительный стресс.

Для дальнейшего изучения биологической роли гапонина, была создана панель генетически-модифицированных клеточных линий с измененными уровнями экспрессии гапонина, включая линии, сверхэкспрессирующие гапонин дикого типа и химерный GFP-гапонин, а также линии, уровень экспрессии гапонина в которых был снижен путём введения киРНК. Основные ростовые характеристики данных линий были изучены в норме и в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода. В результате было установлена, что чувствительность клеток к окислительному стрессу зависит от уровня экспрессии гапонина, а именно, увеличивается при сверхэкспрессии гапонина дикого типа и снижается при введении в клетки киРНК к гапонину.

Работа выполняется при поддержке программы Президиума Российской академии наук «Молекулярная и клеточная биология».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПЕПТИДЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ:МИФЫ И РЕАЛЬНОСТЬ

Наволоцкая Е.В.1, Костанян И.А.2 Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, Московская обл., пр. Науки, 6 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: navolotskaya@fibkh.serpukhov.su

В 1970 г. Найяр и Нишиока обнаружили, что при ферментативном расщеплении IgG образуется пептид, способный стимулировать фагоцитарную функцию макрофагов. Они назвали пептид тафтсином, определили структуру – TKPR, а спустя два года осуществили его химический синтез. Оказалось, что эндогенный и синтетичесикий тафтсин в одинаковой степени стимулируют такие функции полиморфонуклеарных лейкоцитов, как миграция, фагоцитоз бактерий и латекса, противоопухолевая активность. На основании этих результатов была выдвинута идея о том, что функциональные белки могут содержать потенциально биологически активные аминокислотные последовательности. Открытие Брантлом и соавт. в середине 1980-х годов опиоидподобных пептидов, образующихся в результате ферментативного гидролиза -казеина и гемоглобина подтвердило эту гипотезу. В настоящее время биологически активные пептиды обнаружены в IgG: тафцин (Najar and Nishioka, 1970) и p23 (Morgan and Weigle, 1980); гемоглобине: геморфины и киоторфины (Ivanov et al., 1997; Zhao et al., 1997); казеине: казоморфины (Meizel, 1997; Teschemacher et al., 1997); альбумине: кинетензин (Carraway, 1984) и др.

Первоначально ставилась под сомнение образования таких пептидов in vivo, однако последующие исследования подтвердили наличие в организме млекопитающих эндогенного тафсина и геморфинов. В 1990 г. Чипенс и соавт. предложили гипотезу о новой системе биорегуляции, в которой ключевую роль играют пептиды, образующиеся в результате ограниченного протеолиза белков-предшественников (иммуноглобулинов, цитокинов и др.). Такие биологически активные соединения отнесли к новому классу клеточных гормонов – тетинов. Их функцией является передача информации на клеточном уровне.

В докладе проанализированы литературные данные (тафтсин, ригин, p23) и результаты собственных исследований (иммунорфин, иммунокортин) с целью получить ответы на следующие вопросы:

1). Где и под действием каких ферментов происходит процессинг IgG в организме? 2). Если этот процесс запрограммирован, то каков биологический смысл одновременного освобождения и действия нескольких пептидов?

Секционные доклады 107

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ БЕЛКОВ ЗРИТЕЛЬНОЙ

СИСТЕМЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ БЛИЗОРУКОСТИ (МИОПИИ)

Липкин В.М.1, Богачук А.П.1, Минкевич Н.И.1, Иомдина Е.Н.2, Курылева И.М.3, Бабиченко И.И., Костанян И.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца, Москва Московский государственный медико-стоматологический университет, Москва ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, Москва

E-mail: vmlipkin@mx.ibch.ru

Миопия или близорукость одно из самых распространенных заболеваний глаз.

При миопии происходят изменения биомеханических и биохимических свойств склеры глаз. Нарушение метаболизма склеральной ткани взаимосвязано с патологическими изменениями в пигментном эпителии сетчатки. Индикатором этих процессов является PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor – фактор, выделенный из пигментного эпителия). Проведенные нами исследования показали, что в тканях близоруких глаз PEDF выявляется как внутри клеток, так и в виде экстраклеточного ореола. Причем при миопии секретируемый PEDF устойчив, в то время как в норме подвергается протеолизу по серпиновой петле с отщеплением С-концевого фрагмента. Было также показано, что вокруг фибробластов склеры в случае миопии наблюдается образование фибрилл. При этом локализация фибрилл и секретируемого PEDF совпадает. Нами была осуществлена экспрессия в бакуловирусной системе как полноразмерного PEDF, так и PEDF c усеченным С-концевым фрагментом и было установлено, что полноразмерный PEDF способен образовывать амилоидные фибриллы, в то время как PEDF c усеченным С-концом такой способностью не обладает. Наиболее доступным биологическим объектом для биохимических исследований, характеризующих локальные изменения обмена веществ в тканях глаза, является слезная жидкость (СЖ). Нами изучено содержание в СЖ белков, отражающих её секреторную и метаболическую активность (лизоцим, лактоферрин). Установлено, что у подростков с прогрессирующей миопией отношение концентрации лактоферрина к концентрации лизоцима в СЖ достоверно меньше, чем у подростков с эмметропией. Определение данного показателя, вероятно, может быть использовано в качестве диагностического критерия в клинике прогрессирующей близорукости.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ГК № 16.512.11.2044 Министерства образования и науки Российской Федерации.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ

СИНТЕТИЧЕСКИХ МЕЛАНОКОРТИНОВ ОТ СТРУКТУРЫ

Левицкая Н.Г.1, Глазова Н.Ю.1, Атанов М.С.2, Манченко Д.М.2, Андреева Л.А.1, Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, д.2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1/12

E-mail: nglevitskaya@gmail.com

Меланокортины (АКТГ/МСГ-подобные пептиды) являются одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов. Предполагается, что последовательность АКТГ включает в себя несколько сайтов, которые могут активировать различные рецепторы, вызывая при этом широкий спектр физиологических эффектов. Проведенные ранее исследования позволяют предположить, что присоединение обогащенной пролином последовательности PGP к различным фрагментам АКТГ приведет к увеличению выраженности их эффектов.

Осуществлен синтез пептидов, структура которых включает в себя природный фрагмент АКТГ и трипептид PGP – АКТГ(6-9)PGP, АКТГ(7-10)PGP и АКТГ(4PGP. Исследовалось влияние этих пептидов на способность к обучению и эмоциональное состояние белых крыс. В качестве вещества сравнения использовали ранее исследованный препарат семакс – АКТГ(4-7)PGP. Пептиды вводили интраназально в дозе 62 мкмоль в объеме 0.1 мл/кг за 15 мин или за 20 часов до тестирования.

Показано, что все исследованные пептиды обладают ноотропной активностью.

При введении за 15 мин до обучения эффекты пептида АКТГ(6-9)PGP сопоставимы с эффектами семакса, эффекты АКТГ(7-10)PGP менее выражены, декапептид АКТГ(4-10)PGP улучшает обучение животных более эффективно, чем семакс.

При введении за 20 час до тестирования АКТГ(6-9)PGP и АКТГ(7-10)PGP, в отличие от семакса, не влияли на обучение животных. В условиях, провоцирующих реакцию тревоги и страха, все исследованные пептиды оказывают анксиолитическое действие.

Можно заключить, что новые аналоги фрагментов АКТГ обладают ноотропной активностью. При этом только один из исследованных препаратов – декапептид АКТГ(4-10)PGP более эффективно улучшает обучение животных, чем семакс.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК № 14.740.11.0179 и ГК № П1057), Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» и РФФИ (гранты № 09-04-12202 офи-м и № 11-04-01329).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНЫХ

ВЛИЯНИЙ ПЕПТИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА КОГНИТИВНЫЕ ФУНКЦИИ И

МЕЖПОЛУШАРНУЮ АСИММЕТРИЮ МОЗГА ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ И

ОРГАНИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Соллертинская Т.Н.1, Шорохов М.В.1, Мясоедов Н.Ф.2 Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194233 С.-Петербург, просп. М. Тореза, 44 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: tns-peptidus@mail.ru

Нейрохимические механизмы компенсации нарушений высших нервных функций (ВНФ) при функциональной и органической патологии изучены недостаточно; в эволюционном плане отсутствуют.

Нейропептидная регуляция функциональной асимметрии мозга не исследована. Цель работы – сравнительное изучение церебропротективных влияний пептидных препаратов: Семакса (Сем) и Селанка (Сел) в когнитивных процессах и межполушарной асимметрии мозга при функциональной (стресс) и органической (деструкция гиппокампа – Hipp и амигдалы – AM) патологии в восходящем ряду млекопитающих. Сем и Сел вводили в дозах 0,1–5 мкг/кг и 0,25–100 мкг/кг соответственно. У ежей компенсаторные эффекты препаратов при функциональной патологии однонаправленны, неспециализированны, неотчётливы; при органической они значительны и длительны. Сем и Сел различно меняют межполушарные взаимоотношения; эффекты кратковременны (1–2 дня). У ежей «правшей» Сем приводит к чередованию реакций выбора; Сел – изменяет профиль поведения на левую сторону. На фоне деструкции Hipp Сем восстановливает нарушенные межполушарные взаимоотношения. У крыс возрастает роль препаратов в восстановлении ВНФ и проявляется отчётливая тенденция к дифференциации их действия при функциональной патологии. На фоне разрушения Hipp Сем и Сел осуществляют выраженное компенсаторное влияние на ВНФ.

Эффекты Сем и Сел на межполушарную асимметрию мозга дифференцированы.

Сел приводит к длительному изменению профиля поведения и «рукости» у крыс «амбидектров». На фоне деструкции Hipp эффекты Сел на межполушарные отношения более выражены и длительны по сравнению с AM. Сем изменяет профиль поведения у крыс «правшей», особенно на начальных этапах после разрушения Hipp и AM. У обезьян действие препаратов на ВНФ при функциональной патологии возрастает и преобретает специфический характер. Роль Сем и Сел в межполушарной асимметрии мозга носит дозозависимый характер, различный по выраженности ЭЭГ показателей новой коры.

Секционные доклады 111

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Дудков А.В., Трофимов А.В.

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 С.-Петербург, пр. Динамо, 3 E-mail: miayy@yandex.ru Разработанная в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии концепция пептидной регуляции старения свидетельствует, что короткие пептиды способны изменять уровень экспрессии более 150 генов, 15 из которых относится к категории генов клеточного деления и 17 – к генам клеточного цикла. В связи с этим изучение воздействия синтетических пептидов на пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека может открыть новые подходы к использованию имеющегося в организме ресурса стволовых клеток в лечении заболеваний, связанных со старением. Целью исследования явилась оценка пролиферативной активности культуры МСК человека при введении различных коротких пептидов.

В исследовании использовали тетрапептид H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH, трипептид H-Lys-Glu-Asp-OH и дипептид H-Lys-Glu-OH. МСК культивировали в среде, содержащей -MEM (Биолот, Россия) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (Gibco BRL, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco BRL, США) и гентамицина (100 ед/мл) при 37°С и 5% СО2. В исследовании использовали 13 образцов культур – 3 контрольных и 10 опытных (5 пассаж, 20 000 клеток в образце), в которые добавляли один из пептидов (20 нг/мл). В контрольных образцах культуры вместо пептида добавляли фосфатно-солевой буфер. На 3 и 5 сутки культивирования клетки подсчитывали в камере Горяева.

В контрольных образцах культур МСК на 3 и 5 сутки количество клеток составило соответственно 50000±5600 и 65000±6200 клеток. Под действием трипептида на 3 и 5 сутки количество клеток в культуре достоверно возрастало в 1.7 и 2 раза по сравнению с контролем и составило 85000±9900 и 125000±11500 клеток.

Под влиянием пептидов дипептида и тетрапептида на 3 сутки количество МСК имело тенденцию к снижению и составило соответственно 50000±3200 и 40000±34000 клеток. На 5 сутки после введения дипептида и тетрапептида в культуру МСК количество клеток достоверно снижалось соответственно в 1.9 и 1.6 раза и составило 35000±3000 и 40000±2900 клеток. В зависимости от структуры пептида наблюдалось разнонаправленное действие пептидов на пролиферативную способность МСК. Трипептид стимулировал рост МСК, тогда как ди- и тетрапептиды оказывали ингибирующее действие на пролиферацию МСК.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ИММУНОРФИНА –

АГОНИСТА НЕОПИОИДНОГО РЕЦЕПТОРА БЕТА-ЭНДОРФИНА

Ковалицкая Ю.А.1, Чернов А.С.2, Катаев А.А.3, Садовников В.Б.1, Наволоцкая Е.В.1 Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, Московская обл., пр-т Науки, 6 Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская обл.

Учреждение РАН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: kovalitskaya@inbox.ru

В лаборатории пептидных биорегуляторов ФИБХ разработана уникальная модель для изучения неопиоидного (нечувствительного к блокатору опиоидных рецепторов налоксону) рецептора -эндорфина. Нами синтезирован пептид иммунорфин, селективный агонист неопиоидного рецептора -эндорфина, представляющий собой фрагмент 364-373 тяжелой цепи IgG, подобный центральной части молекулы

-эндорфина. -Эндорфин обеспечивает взаимосвязь нервной, иммунной и эндокринной систем, выполняя ряд важных функций в организме, взаимодействуя с этим типом рецепторов. Однако о механизмах действия данного типа рецепторов до настоящего времени ничего не известно. Используя иммунорфин в качестве инструмента, мы изучили биохимические и электрофизиологические составляющие механизмов действия неопиоидного рецептора -эндорфина.

Используя метод флуоресцентной микроскопии, мы установили, что иммунорфин (6-10) (1 мкМ) инициирует медленный (35–40 мин) выход ионов Ca2+ в цитоплазму из внутриклеточных депо у 2- и 8-клеточных эмбрионов мыши. Используя блокатор активности аденилатциклазы (SQ22,536, Sigma), мы установили, что стимулирующее действие пептида на ранние эмбрионы осуществляется при активации аденилатциклазной сигнальной системы.

Методом фиксации напряжения мы исследовали изменение свойств ионных каналов плазмалеммы клеток Chara corallina в присутствии 1 нМ иммунорфина.

Было установлено, что в ответ на деполяризацию мембраны изменялась амплитуда Ca2+-компоненты тока и значительное увеличение Ca2+-зависимого Cl-тока.

Амплитуда Cl-тока возрастала в два раза, по сравнению с контрольными токами.

Мы предполагаем, что увеличение концентрации ионов кальция влияет на состояние Ca2+-зависимых Cl-каналов. Это приводит к стабилизации осмотического давления клетки, кроме того, в концентрации 1мкМ иммунорфин увеличивает сопротивляемость мембраны клеток Chara corallina.

Таким образом, с помощью иммунорфина впервые показано, что в механизмах действия неопиоидного рецептора -эндорфина задействованы ионы Ca2+, Ca2+зависимые Cl-каналы, аденилатциклазная сигнальная система.

Секционные доклады 113

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

НА РАЗВИТИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ НА МОДЕЛИ DANIO RERIO

Рафиева Л.М., Гасанов Е.В., Костров С.В.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Ак.Курчатова, 2 E-mail: rafievalm@gmail.com Нейротрофины (НТФ) – семейство факторов роста, определяющих развитие и функционирование нервной системы (НС). Эти белки синтезируются в виде предшественников – пронейротрофинов (проНТФ), имеющих в своем составе пропептид и зрелую часть, определяющую нейротрофическую активность этих факторов роста. Биологические функции пропептидов, а также проНТФ на сегодня изучены недостаточно. Существуют данные, что проНТФ способны оказывать противоположные зрелым НТФ эффекты, в т.ч. запускать механизм программируемой клеточной смерти. Большая часть исследований действия зрелых НТФ и их предшественников выполнена на моделях in vitro и незначительная – ex vivo. В связи с этим поиск удобных моделей для исследования влияния нейротрофических факторов на развитие и функционирование нервной системы in vivo весьма актуален.

Костистая рыба Danio rerio является одним из наиболее перспективных биологических объектов, моделирующих развитие и функционирование НС. Среди преимуществ D. rerio как модели: внеутробное развитие эмбриона, его доступность для различных манипуляций и наблюдений, возможность генноинженерных модификаций. Используя D. rerio, мы планируем изучить действие НТФ на развитие и функционирование мозга и периферической НС in vivo.

Ранее нами были получены различные формы нейротрофических факторов NGF и BDNF. Исследован фолдинг этих факторов в системе in vitro, с использованием различных клеточных линий была проанализирована биологическая активность различных форм NGF и BDNF, в том числе пропептидов, в системе ex vivo.

Было показано, что про-часть является внутримолекулярным шапероном для NGF, в то время как для нейротрофина BDNF, она, по-видимому, подобную роль не выполняет. Используя пропептиды обоих факторов, мы показали, что в случае NGF про-часть способна моделировать биологическую активность этого фактора роста. При этом собственной биологической активностью пропептид не обладает.

Также была получена мРНК, кодирующая различные варианты BDFN, включая пропептид и предшественник. Полученная мРНК будет введена в эмбрионы D. rerio и, используя флуоресцентные маркерные элементы, предполагается оценить изменения в развитии популяций нервных клеток, экспрессирующих рецепторы к данным нейротрофическим факторам.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

С-КОНЦЕВОЙ СЕГМЕНТ КАК ВСТРОЕННЫЙ МОДУЛЯТОР

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА НЕЙРОНАЛЬНЫХ

КАЛЬЦИЕВЫХ СЕНСОРОВ

Зерний Е.Ю.1, Колпакова Т.В.1, Пермяков С.Е.2, Назипова А.А.2, Зинченко Д.В.3, 1,4 4 1 2 4 Комолов К.Е., Шольтен А., Григорьев И.И., Пермяков E.A., Кох К.-B., Филиппов П.П., Сенин И.И.

НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40 Учреждение РАН Институт биологического приборостроения РАН, Пущино, Московская обл.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

Университет Ольденбурга имени Карла фон Осецкого, Ольденбург, Германия

E-mail: kolpakovatatiana@mail.ru

Нейрональные Cа2+-сенсоры (НКС) – семейство EF-hand содержащих Са2+-связывающих белков, способных в ответ на изменения концентрации внутриклеточного Cа2+ с высокой специфичностью регулировать белки мишени, принимая участие в передаче различных сигналов. В пределах семейства НКС обладают высокой степенью структурного сходства, однако при этом проявляют различные чувствительности к Cа2+, а диапазон мишеней, индивидуальных для каждого НКС, достаточно широк. Ранее нами было показано, что С-концевой сегмент, вариабельная в пределах семейства С-концевая последовательность, в случае фоторецепторного НКС рековерина отвечает за регуляцию функциональных свойств этого белка, таких как сродство к Са2+, способность связываться с мембранами, а также способность модулировать активность мишени – родопсинкиназы. В настоящей работе высказано предположение о том, что такая регуляторная функция С-концевого сегмента является универсальным свойством белков НКС. Для проверки этого предположения сконструированы два химерных белка на основе НКС рековерина и GCAP2: в каждом таком белке С-концевой сегмент заменен на аналогичную последовательность из другого НКС.

Показано, что обмен последовательностями Сконцевых сегментов не оказывает существенного влияния на структурные особенности и термостабильность исходных белков. Однако замена С-концевого сегмента сказывается на функциональных свойствах каждого НКС. Так, в случае рековерина замена вызывает снижение аффинности белка к Са2+ с одновременным повышением его сродства к мембранам при низких концентрациях катиона, а также нарушение его способности взаимодействовать с родопсинкиназой. Однако такая замена не придает рековерину способность активировать мишень GCAP2 – гуанилатциклазу. При этом в случае GCAP2 замена С-концевого сегмента ухудшает способность белка активировать гуанилатциклазу. Таким образом, наличие в структуре НКС определенного С-концевого сегмента является необходимым, но недостаточным условием для выполнения им соответствующих функциональных свойств.

Секционные доклады 115

ПРИМЕНЕНИЕ ПЕПТИДНОЙ СТРАТЕГИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

И РЕГУЛЯЦИИ ГОРМОНАЛЬНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ

Шпаков А.О.

Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. М. Тореза, 44 E-mail: alex_shpakov@list.ru Пептидная стратегия – одно из наиболее динамично развивающихся направлений в современной биохимии и молекулярной эндокринологии. Она включает синтез, изучение и использование в фундаментальной биологии и медицине сравнительно коротких пептидов, которые по первичной структуре соответствуют функционально важным участкам белков, компонентов гормональных сигнальных систем.

Основными точками приложения пептидной стратегии являются рецепторы серпантинного и тирозинкиназного типа, гетеротримерные G-белки, ферменты, катализирующие образование вторичных посредников. Пептиды взаимодействуют с сигнальными белками, которые сопряжены с гомологичным им белком, а также с комплементарными участками белка, производными структуры которого они являются, и влияют на их функциональную активность. Поскольку действие пептидов реализуется только в отношении гомологичных белков, их можно применять в качестве функциональных зондов для расшифровки молекулярных механизмов передачи в клетку гормональных сигналов и для селективной регуляции сигнальных каскадов, включающих эти белки. Многие пептиды, производные сигнальных белков, активны не только в условиях in vitro, но и in vivo, что позволяет рассматривать их в качестве прототипов для создания лекарственных препаратов нового поколения, обладающих направленным действием на клетки-мишени. Нами на модели гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы изучена биологическая активность широкого спектра пептидов, соответствующих участкам третьей цитоплазматической петли рецепторов серпантинного типа, которая в большинстве рецепторов ответственна за связывание и активацию гетеротримерных G-белков. Наряду с немодифицированными пептидами, исследовали их разветвленные аналоги, а также пептиды, модифицированные мембрано-активными гидрофобными радикалами. На основе анализа полученных данных предложены три наиболее вероятных молекулярных механизма действия пептидов, производных рецепторных белков.

Работа поддержана РФФИ (проект № 09-04-00746) и Программой «Фундаментальные науки – медицине» (2009–2011 гг.).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЭФФЕКТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ

Некрасов А.Н., Зинченко А.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ГСП-7, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: alexei_nekrasov@mail.ru В работе обсуждается вопрос об эффективности взаимодействия полипептидных цепей в различных молекулярных комплексах. Эффективность взаимодействия между полипептидными цепями обусловлена не только наличием взаимодействующих функциональных групп, но и способностью этих групп располагаться на расстояниях, оптимальных для данного конкретного взаимодействия. Возможность аминокислотных остатков, несущих взаимодействующие функциональные группы, обеспечивать такие оптимальные расстояния определяется в первую очередь влиянием на них соседних по цепи остатков. Взаимодействие остатков с ближайшими соседями в полипептидной цепи может ограничивать их способность к адаптивным конформационным перестройкам. Нами предложен критерий, позволяющий оценить способность аминокислотных остатков к адаптивным конформационным перестройкам, основанный на локальных статистических характеристиках полипептидной цепи.

Использование данного критерия позволило дать новую интерпретацию экспериментальных данных по стадийности тепловой денатурации дрожжевой алкогольдегидрогеназы, описанной в работе [1]. Проведенный анализ различных межмолекулярных белковых комплексов с известной пространственной структурой позволил объяснить механизм функционирования комплексов гидролаза-ингибитор [2], белков, формирующих «чехол» вируса KZ, комплексов рецепторов с сигнальными белками.

Литература

1. Markossian K.A., Golub N.V., Khanova H.A., Levitsky D.I., Poliansky N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. Biochimica et Biophysica Acta (2008) 1784, 1286–1293.

2. Nekrasov A.N., Zinchenko A.A. J. Biomol. Struct. Dyn. (2010) 28(1), 85–96.

Секционные доклады 117

ОБРАТИМАЯ АГРЕГАЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ

VIBRIO CHOLERAE ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Родина Е.В.1, Курилова С.А.2, Воробьева Н.Н.1, Тарасова Е.А.1, Назарова Т.И.2 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы

E-mail: rodina@belozersky.msu.ru

Агрегация белков под действием ионов тяжелых металлов представляет интерес для медицинских и биотехнологических исследований. У млекопитающих агрегация амилоидных пептидов под действием Cu2+, Zn2+ и Fe2+ связана с развитием нейропатологий. У бактерий обратимая агрегация некоторых белков под действием Cu2+ или Cd2+ служит одним из способов снижения внутриклеточной концентрации этих токсичных ионов. Кроме того, образование агрегатов под действием ионов металлов используется в пищевой промышленности для зажеления белковых продуктов.

В настоящей работе исследована агрегация под действием ионов тяжелых металлов бактериального белка неорганической пирофосфатазы из Vibrio cholerae (V-РРазы). Это металлозависимый белок, способный связывать ионы металла в активном центре, межсубъединичном центре и на поверхности. Агрегация VРРазы обратима и является следствием образования межбелкового мостика из иона металла. Физиологические активаторы РРазы, Mg2+ или Mn2+, не вызывают агрегацию. Из двузарядных катионов наиболее эффективным индуктором агрегации являетcя Cd2+. Показано, что агрегацию вызывает связывание кадмия на поверхности глобулы. Добавление Ca2+, который сам по себе агрегацию РРазы V.

сholerae не вызывает, потенцирует агрегацию под действием Cd2+. Этот результат можно объяснить тем, что центр связывания, отвечающий за агрегацию, состоит из двух подцентров, в одном из которых связывается Ca2+, а во втором – Сd2+. С использованием второй производной УФ-спектров определены константы диссоциации центров связывания Ca2+ и Сd2+, которые участвуют в агрегации. Структура агрегатов была исследована методами динамического светорассеяния, скоростной седиментации и атомно-силовой микроскопии. Показано, что агрегаты в форме «лепешки» образуются из интактных гексамеров. На основании кристаллической структуры V-РРазы предложена модель образования агрегатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-00596).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РОЛЬ ЛИГАНДОВ И ВНЕШНИХ УСЛОВИЙ

В ПРОЦЕССАХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И САМООРГАНИЗАЦИИ

МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА GROEL IN VITRO

Семисотнов Г.В., Марченков В.В., Марченко Н.Ю., Котова Н.В., Кашпаров И.А., Кашпарова Н.Я., Рябова Н.А.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 Е-mail: nina@vega.protres.ru Молекулярный шаперон GroEL является представителем семейства белков теплового шока клеток Escherichia coli (Hsp 60) и состоит из 14-ти идентичных субъединиц (м.в. 57.5 кДа каждая), объединенных в 2 взаимодействующие торцами кольцевые структуры по 7 субъединиц каждая. Он участвует в процессах правильного сворачивания и олигомеризации большого количества как вновь синтезированных белков, так и белков, денатурированных в результате различных клеточных стрессов или in vitro. Механизмы функционирования GroEL как молекулярного шаперона и его самоорганизации самого по себе до конца не выяснены, но установлено, что в обоих этих процессах важную роль играют лиганды белка (ионы Mg2+, АТФ, АДФ и белковый ко-шаперонин GroES). В настоящей работе проведены исследования роли лигандов и внешних условий (ионной силы) в процессах функционирования и самоорганизации GroEL in vitro. Во-первых, показано, что лиганды белка (Mg-АДФ, Mg-АТФ и GroES) с различной эффективностью ослабляют взаимодействие GroEL с денатурированными белками. Кроме того, установлено, что наряду с гидрофобными взаимодействиями в формировании комплекса GroEL с денатурированными белками большую роль играют электростатические взаимодействия. На основании полученных результатов предложена модель функционирования GroEL как молекулярного шаперона. Во-вторых, с помощью методов электрофореза в поперечном градиенте мочевины и электрофореза в неденатурирующих условиях исследованы процессы денатурации и ренатурации олигомерной и мономерной форм GroEL и влияние лигандов белка на эффективность его олигомеризации. Показано, что сворачивание мономерной формы GroEL не зависит от присутствия лигандов, а эффективность ее олигомеризации определяется природой лигандов и ионной силы раствора.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-00768-а), при поддержке Российской академии наук (программы «Молекулярная и клеточная биология»), Федерального агентства по науке и инновациям (02.740.11.0295).

Секционные доклады 119

ВИРУСНЫЕ ШАПЕРОНИНЫ: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

Курочкина Л.П.1, Семенюк П.И.2, Орлов В.Н.2, Амарантов С.В.3, Сыкилинда Н.Н.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва

E-mail: lpk@ibch.ru

Шаперонины являются одним из классов молекулярных шаперонов и помогают правильно сворачиваться как новосинтезированным полипептидным цепям, так и денатурированным под воздействием стресса белкам. Шаперонины имеются у представителей всех царств живой природы, и любые нарушения функций этих консервативных белков приводят к многочисленным болезням. Их делят на две группы: I – шаперонины бактерий, митохондрий и хлоропластов, II – шаперонины архей и эукариот. При анализе геномов родственных бактериофагов EL и RU Pseudomonas aeruginosa нами впервые были идентифицированы вирусные шаперонины, которые, вероятнее всего, представляют новую группу этого класса белков. Нами разработаны система экспрессии генов, кодирующих фаговые шаперонины, в клетках E. coli, а также метод очистки рекомбинантных белков. Показано, что размножение фагов EL и RU в бактериальных клетках сопровождается синтезом собственных шаперонинов.

Рекомбинантный шаперонин фага EL охарактеризован с помощью электронной микроскопии, седиментационного анализа, дифференциальной сканирующей калориметрии, изотермического калориметрического титрования и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Установлено, что фаговый шаперонин подобно бактериальному GroEL состоит из 14 идентичных субъединиц, формирующих два уложенных стопкой гептамерных кольца с полостью внутри. Однако, в отличие от GroEL, который функционирует в паре с GroES, фаговому шаперонину не требуется кофактор. Для выполнения своих функций фаговому шаперонину, как и всем известным шаперонинам, необходима энергия гидролиза АТФ. При физиологических условиях шаперонин имеет асимметричную структуру: одно его кольцо находится в открытой конформации, а другое – в закрытой. Для понимания механизма функционирования вирусного шаперонина мы исследуем структуру его комплексов с низкомолекулярными лигандами в различных конформационных состояниях.

Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00935-а.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛЕТОЧНОГО ПРОТЕОМА:

ЭНЕРГОЗАВИСИМЫЕ ПЕПТИДГИДРОЛАЗЫ

И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ШАПЕРОНЫ

Ротанова Т.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: tatyana.rotanova@ibch.ru Сохранность клеточного протеома во всех природных царствах обеспечивается функционированием системы контроля качества (СКК) белков, объединяющей молекулярные шапероны и энергозависимые пептидгидролазы. Компоненты СКК играют решающую роль в процессах сворачивания (фолдинга) белков, сборкиразборки белковых комплексов, предотвращения образования белковых агрегатов, а также осуществляют быструю деградацию регуляторных, аномальных и поврежденных белков.

Пептидгидролазы СКК – это комплексные бифункциональные ферменты, сформированные протеолитическими и АТР-азными составляющими, которые могут быть представлены либо индивидуальными субъединицами, либо доменами единой полипептидной цепи. Протеолитические компоненты АТР-зависимых протеиназ относятся к пептидгидролазам разных классов, а АТР-азные являются членами единого суперсемейства ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями). Уникальной характеристикой АТР-зависимых протеиназ служит процессивный характер гидролиза ими белковых субстратов (без высвобождения промежуточных высокомолекулярных продуктов), обусловленный особенностями мультимерной организации этих ферментов.

Молекулярные шапероны СКК преимущественно являются белками теплового шока (heat shock proteins, Hsps) пяти различных семейств. Шапероны семейств Hsp100, Hsp90, Hsp70 и Hsp60 (цифры – усредненные значения Мм в кДа) обладают АТР-азной активностью, при этом только шапероны Hsp100 относятся к ААА+-белкам. Семейство sHsps (small Hsps, Мм 12–43 кДа) включает не-АТР-азные малые белки теплового шока.

Выявлено топологическое сходство между АТР-азными составляющими Lonпротеиназ подсемейства А и шаперонами ClpB (Hsp100). Обсуждается роль компонентов СКК в поддержании функционального состояния внутриклеточных белков.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-01015).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ДЕСТАБИЛАЗА-ЛИЗОЦИМ МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ.

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ

Завалова Л.Л.1, Антипова Н.В.1, Фадеева Ю.И.2, Павлюков М.С.1, Плетнева Н.В.1, Плетнев В.З.1, Баскова И.П.2 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякинаи Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва

E-mail: lz@ibch.ruE-mail: Saliva1@yandex.ru

Дестабилаза-лизоцим (Дест-Лиз) секрета слюнных клеток медицинской пиявки – полифункциональный фермент, обладающий эндо--(-Glu)-Lys-изопептидазной, лизоцимной и антимикробной функциями. Нами была установлена его полная аминокислотная последовательность и идентифицированы три гена, кодирующие изоформы фермента Действие фермента направлено на растворение стабилизированного фибрина и расщепление продукта его деградации – Д-димера в процессе тромболизиса, где реализуется изопептидазная функция Дест-Лиз. Лизоцимная функция проявляется в способности фермента разрушать клеточные стенки M.

lysodeikticus и гидролизовать гексамер N-ацетил-глюкозамина. Нами разработан метод получения высокоочищенного рекомбинантного препарата рек. Дест-Лиз из «телец включения», образующихся в клетках E.coli,при экспрессии вектора pQE30, содержащего ген Дест-Лиз, и показано, что такой фермент обладает всеми функциями, свойственными нативному ферменту. Задачей настоящего исследования является идентификация двух активных центров фермента путем выделения группы наиболее вероятных остатков на основе стереохимического анализа структурной модели фермента. Оценка функциональной роли выбранных аминокислотных остатков проводилась точечными заменами их на аланин методом сайт-направленного мутагенеза с последующим определением мурамидазной (гликозидазной/лизоцимной) и изопептидазной активностей полученных мутированных форм рек. Дест-Лиз. Полученные результаты находятся в соответствии с гипотезой о том, что гликозидазный активный центр Дест-Лиз включает каталитические остатки Glu14 и Asp26, а изопептидазный центр фермента работает как Ser/Lys каталитическая диада, представленная каталитическими остатками Ser29 и Lys38.

Таким образом, в группе лизоцимов беспозвоночных Дест-Лиз является первым бифункциональным ферментом, в котором предварительно установлено положение изопептидазного активного центра с локализацией соответствующих каталитических остатков.

Секционные доклады 123

ПРОБЛЕМЫ ОРГАНИЗАЦИИ

И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОТЕИНАЗ ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ.

ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ

Михайлова А.Г., Румш Л.Д.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: anna.mikhailova@.ibch.ru Высокоспецифические протеиназы, такие, как энтеропептидаза и олигопептидаза В из различных источников, представляют большой интерес как с точки зрения фундаментальных, так и прикладных исследований. Наши исследования продемонстрировали тонкую регуляциию их каталитической эффективности как с помощью дистальных участков этих белковых молекул, так и дополнительных эффекторов – ионов кальция и высоких концентраций субстратов. Так, установлено, что уникальные свойства энтеропептидазы обусловлены существованием трех субстрат-связывающих центров. Легкая цепь энтеропептидазы содержит классический трипсиноподобный первичный субстрат-связывающий центр (S1) и вторичный субстрат-связывающий центр (S2), придающий ферменту присущую ему высокую специфичность. Вторичный субстрат-связывающий центр (SII), расположенный на удаленном от каталитического центра участке 118-465 тяжелой цепи, обеспечивает высокую эффективность энтеропептидазы по отношению к ее природному субстрату – трипсиногену. Ион кальция при этом выступает в роли дополнительного эффектора.

Такая тонкая дополнительная регуляция гидролиза субстратов разного типа с помощью как ионов кальция, так и субстратного ингибирования в высокой степени характерна и для олигопептидаз В, в том числе для обнаруженного нами нового представителя этих ферментов – олигопептидазы В из Serratia proteamaculans.

Проведен сравнительный кинетический анализ эффективности четырех вариантов энтеропептидазы: природной энтеропептидазы быка, ее рекомбинантной легкой цепи, а также полноразмерной энтеропептидазы человека и ее легкой цепи по отношению к модельным пептидным субстратам, в том числе фрагментам PAR1 и PAR4, а также к природному субстрату этого фермента – трипсиногену.

Полученные нами результаты демонстрируют ярко выраженный видовой характер специфичности энтеропептидаз из разных источников.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 08-04-00886-а и № 10-04-01381-а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ – ММП-1,-2,-9

И ИХ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ

ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЕ ШЕЙКИ МАТКИ

Соловьева Н.И.1, Рыжакова О.С.1, Андреева Ю.Ю.2, Завалишина Л.Э.2 Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10, корп.Б ФГУ Московский НИ онкологический институт им. П.А. Герцена, Росздрав, Москва

E-mail: Nina.Solovyeva@ibmc.msk.ru

Матриксным металлопротеиназам (ММП) отводится ключевая роль в развитии процессов инвазии и метастазирования, которые являются главными проявлениями прогрессии опухоли. К таким ММП в первую очередь относятся коллагеназы, отвечающие за развитие инвазивного процесса, и желатиназы, которые считаются маркером метастатического потенциала опухолей. Цель настоящего исследования – выяснение особенностей экспрессии интерстициальной коллагеназы (ММПжелатиназ А и Б – ММП-2 и ММП-9, а также эндогенных регуляторов их активности: тканевых ингибиторов ММП – ТИМП-1 и ТИМП-2, активатора плазминогена урокиназного типа – уАП (активатор ММП-1 через плазмин) и индуктора экспрессии ММП – EMMPRIN, как факторов инвазии и метастазирования, в плоскоклеточных карциномах шейки матки. Исследования проводились на послеоперационных образцах карцином и образцах морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухоли и находящихся в плоскости операционного поля. Работа проводилась с использованием четырех методов: RT-PCR, иммуногистохимии, зимографии и определения коллагенолитической активности. В большей части опухолевых образцов экспрессия ММП, уАП и EMMPRIN была повышена, а экспрессия ингибиторов ММП снижена по сравнению с нормальной тканью.

Полученные данные свидетельствуют о том, что основной вклад в деструктивный (инвазивный) и метастатический потенциал карцином шейки матки вносят увеличение экспрессии ММП-1 и ММП-9 и индуктора экспрессии ММП – EMMPRIN, а также снижение экспрессии ингибиторов – ТИМП-1 и ТИМП-2, и в меньшей степени экспрессия ММП-2 и уАП.

В морфологически нормальной ткани обнаружена существенная экспрессия ММП-1, ММП-2, ММП-9 и индуктора экспрессии ММП – EMMPRIN, которые вносят свой дополнительный вклад в увеличение деструктивного потенциала опухоли. Данные важны для понимания механизма деструкции матрикса и развития процессов инвазии и метастазирования, имеют прогностическое значение и определяют мишени для разработки фармакологических средств.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 10-04-01573а.

Секционные доклады 125

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ И ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ

ПРИ МЕТАСТАЗИРОВАНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ

НОВООБРАЗОВАНИЙ

Кондакова И.В.1, Клишо Е.В.1, Спирина Л.В.1, Какурина Г.В.1, Малахова Е.В.1, Савенкова О.В.1, Шишкин Д.А.1, Чойнзонов Е.Л.1, Шарова Н.П.2 НИИ онкологии СО РАМН, Томск Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

E-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru

Исследование молекулярных механизмов метастазирования является одной из приоритетных задач биохимии, в процессе решения которой возможно найти новые биомаркеры, позволяющие прогнозировать развитие метастазов и разработать новые мишени для таргетной антиметастатической терапии. Известно, что развитие злокачественных новообразований тесно связано с протеолитическими ферментами, которые могут наделять опухолевые клетки способностью к инвазии и метастазированию.

В представленной работе изучали экспрессию компонентов системы внеклеточных матриксных металлопротеиназ (ММП), их генов, активность и субъединичный состав протеасом, осуществляющих внутриклеточный селективный гидролиз белков, в опухолях, различающихся по способности к метастазированию.

Иммуногистохимическое определение ММП-1,-2,-9 и их тканевых ингибиторов (ТИМП) в тканях плоскоклеточного рака головы и шеи показало значительное снижение экспрессии ингибитора ТИМП-2 в тканях метастазирующих карцином по сравнению с опухолями, не образующими лимфогенные метастазы. Кроме того, наблюдалось уменьшение экспрессии гена ТИМП-2 при увеличении распространенности опухоли на лимфатические узлы. В опухолях, образующих метастазы, было зарегистрировано возрастание тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом и пула 26S протеасом, а также увеличение содержания иммунных субъединиц LMP7 в 2 раза по сравнению с неметастазирующими опухолями, что свидетельствует о вероятном участии протеасом в метастазировании злокачественных новообразований. Таким образом, компоненты системы ММП и протеасомы играют важную роль в патогенезе злокачественных новообразований. Значительное снижение экспрессии ТИМП-2 и его гена, повышение активности протеасом и содержания в них субъединиц LMP7 при появлении метастазов позволяет рассматривать эти показатели как возможные маркеры метастазирования и потенциальные избирательные мишени для антиметастатической терапии.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК № П320).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНВАЗИИ БАКТЕРИЙ,

СИНТЕЗИРУЮЩИХ ГРИМЕЛИЗИН И ПРОТЕАЛИЗИН,

В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

Хайтлина С.Ю.1, Божокина Е.С.1, Демидюк И.В.2, Цаплина О.А.1, Ефремова Т.Н.1 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий просп., 4 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: skhspb@yahoo.com

Исследуя функциональные свойства открытого нами фермента, бактериальной металлопротеиназы ЕСР32/гримелизин (Matveyev et al., 1996; Bozhokina et al.,

2008) и ее гомолога протеализина (Demidyuk et al., 2006), мы обнаружили, что продуценты протеиназы, непатогенные бактерии рода Serratia, способны проникать в эукариотические клетки и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Efremova et al., 2001; Bozhokina et al., 2011). Трансформация E.coli плазмидной ДНК, несущей ген гримелизина или протеализина, приводит к появлению в бактериях инвазивного фенотипа. Эти результаты явились прямым экспериментальным подтверждением нашего предположения об активном участии фермента в процессе инвазии.

При инвазии бактерий-продуцентов протеализина в клетки 3T3-SV40 фермент обнаруживается как в цитоплазме инвазированных клеток, так и в культуральной среде. Кроме того, протеализин расщепляет предшественник матриксной металло протеиназы ММП-2 с образованием белка с М.м. 66 кДа, что указывает на возможность активации ММП-2 протеализином. Однако добавление протеализина в клеточную среду не приводит к проникновению неинвазивных бактерий E. coli внутрь эукариотических клеток. Эти данные позволяют предположить, что процесс инвазии включает перенос фермента в цитоплазму клетки-хозяина.

Субстратная специфичность гримелизина/протеализина ограничена небольшим кругом нативных белков. Кроме ММР2, это актин (Khaitlina et al., 1988, Цаплина и др., 2009), гистоны (Matveyev et al., 1996) и белок теплового шока бактерий DnaK (Морозова и др., 2011). При этом наиболее вероятной мишенью для внутриклеточного действия протеализина является актин. Расщепление как глобулярного, так и фибриллярного актина существенно влияет на физиологические функции актина, в том числе, усиливает динамику полимеров актина, значительно ускоряя их деполимеризацию. Это означает, что расщепление протеиназой изменяет свойства актина в направлении, благоприятном для инвазии, и таким образом может способствовать интернализации бактерий, синтезирующих этот фермент. Кроме того, мы предполагаем, что мишенью фермента является не только актин эукариотической клетки, но и собственные гистоноподобные белки бактерии и DnaK.

Секционные доклады 127

ПРОТЕИНАЗЫ СЕМЕЙСТВА КАЛЬПАИНОВ

У ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И РЫБ

Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: l-lysenko@yandex.ru Кальпаины – кальций-зависимые протеиназы, ответственные за селективную деградацию белков в цитозоле клеток эукариот и ряда прокариот. К настоящему времени наиболее полно изучены два белка этого семейства из тканей позвоночных – (микро)- и m(милли)-кальпаины, различающиеся необходимым для активации уровнем кальция, а также их эндогенный ингибитор кальпастатин. Сведения о кальпаин-кальпастатиновой системе у рыб и беспозвоночных фрагментарны, между тем, такая информация крайне важна для установления хода молекулярной эволюции белков семейства. Несмотря на ограниченность структурных исследований кальций-зависимых протеиназ и кодирующих их генов у беспозвоночных и рыб, продемонстрирована роль этой внутриклеточной протеолитической системы во многих клеточных процессах (перестройке цитоскелета, слиянии, клеточной гибели, оплодотворении и др.), включая патологические, а также в развитии ответных реакций на изменяющиеся условия окружающей среды.

В работе приводятся результаты исследования уровня активности, структурных и энзиматических характеристик кальпаинов у некоторых водных беспозвоночных, принадлежащих к классам малощетинковых червей, пиявок, ракообразных, насекомых, брюхоногих и двустворчатых моллюсков, а также костистых рыб. Установлены особенности протеиназ беспозвоночных, отличающие их от типичных µ- и m-кальпаинов позвоночных животных: более низкая чувствительность к активатору (Са2+), отсутствие малой субъединицы, олигомерная структура, чувствительность (в ряде случаев) к ингибиторам протеиназ нецистеинового типа, повышение селективности действия, отсутствие эндогенного регулятора их активности (кальпастатина). Вероятно, выявленные отличия отражают как усиление пространственно-временного контроля активности кальций-зависимых протеиназ в эволюционном ряду, так и изменение функционального назначения этой протеолитической системы в метаболизме клетки.

Работа выполнена при поддержке проекта ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (ГК №14.740.11.1034), программы президента РФ «Ведущие научные школы»

(НШ-3731.2010.4), гранта РФФИ № 11-04-00167-а и проекта Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА IgA1 ПРОТЕИНАЗЫ N. MENINGITIDIS

Жигис Л.С.1, Ягудаева Е.Ю.1, Серова О.В.1, Бичучер А.М.2, Дрожжина Е.Ю.1, Зуева В.С., Козлов Л.В., Котельникова О.В., Разгуляева О.А., Аваков А.Э., Аллилуев А.П.3, Румш Л.Д.1, Зинченко А.А.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ФГУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов (медицинский факультет), Москва Филиал ФГУН (НПО «Микроген») предприятие по производству бактерийных препаратов им. Г.Н.Габричевского, Москва

E-mail: zhigis@ibch.ru

IgA1 протеиназа, впервые обнаруженная в клетках рода Neisseria (менингококка и гонококка), обладает уникальной субстратной специфичностью к иммуноглобулинам А1, которые являются первым защитным барьером организмов человека и высших приматов на пути целого ряда патогенов.

Настоящая работа посвящена получению, очистке и характеристике ферментативной, иммуногенной и протективной активности IgA1 протеиназы, выделенной из культуры N. meningitidis серогрупп А и В.

Нативную IgA1 протеиназу серогруппы А выделяли из промежуточных продуктов, получаемых на разных этапах производства менингококковой полисахаридной вакцины.

Для получения IgA1 протеиназы серогруппы В были использованы новая рекомбинантная плазмидная ДНК pBIGAPS1, кодирующая секретируемую форму IgA1 протеиназы, несущую гистидиновую метку на C-конце, и штамм бактерий E. coli BL21(DE3)/pBIGAPS1, продуцент функционально активного фермента.

Чистоту полученных препаратов анализировали методом электрофореза в ПААГДСН, активность полученных ферментов определяли модифицированным методом ИФА, иммуногенную и протективную активность препаратов изучали на модели лабораторных животных.

В результате работы получены препараты нативной IgA1 протеиназы серогруппы А и рекомбинантной IgA1 протеиназы серогруппы В. Оба препарата обладали специфической ферментативной активностью и защищали мышей от заражения менингококком трех основных серогрупп А, В и С.

Работа поддержана госконтрактом № 16.512.11.2110.

Секционные доклады 129

ЭНДОГЕННЫЙ ИНГИБИТОР ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА

КАМЧАТСКОГО КРАБА PARALITHODES CAMCHATICUS

Руденская Г.Н.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы E-mail: gnruden@genebee.msu.ru Серпины – суперсемейство белковых ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ представляют собой - мономерные белки из 350–500 аминокислотных остатков. Серпины, как ингибиторы протеиназ, вовлечены в такие важные биологические процессы, как коагуляция, фибринолиз, активация комплемента, воспалительные процессы различного рода, метастазирование опухолей, формирование внеклеточного матрикса. Новый эндогенный ингибитор выделен аффинной хроматографией на грамицидин-силохроме и гельфильтрацией на Сефадексе G-100 из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camchaticus. Ингибитор подавляет активность трипсина, химотрипсина, субтилизина, тромбина, сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба и папаина, но не действует на плазмин и глутамилэндопептидазу. Белок с Mr 67 kDa, имеет оптимум активности

-15–20оС, стабилен от 4 до 40оC, при нагревании до 50оС и выше полностью инактивируется. Для проявления ингибиторного действия нуждается в 0,5–2 М NaCl.

Первичная структура ингибитора краба в определенной степени гомологична серпинам членистоногих. Методом тромбоэластографии установлено, что при инкубации с ингибитором плазмы крови наблюдается выраженная гипокоагуляция, удлиняется время тромбопластино- и тромбинообразования, уменьшается индекс коагуляции и плотность сгустка. Помимо замедления начала свертывания, значительно растягивается во времени процесс формирования фибриновых нитей, что доказывает выраженное торможение гемокоагуляции в присутствии ингибитора и зависимость этого процесса от времени взаимодействия компонентов плазмы с ингибитором. Увеличение времени инкубации до 60 минут и добавление гепарина полностью блокирует процесс тромбообразования. Активирующая ингибитор роль гепарина подтверждена и в эксперименте с использованием хромогенного субстрата Gly-Arg-pNA. Если ингибитор инактивирует только 14% тромбина, то в присутствии гепарина – 89% Методом иммуноферментного анализа было показано, что ингибитор краба способен взаимодействовать с ключевым белком системы комплемента С1s аналогично серпину С1 плазмы крови человека. Серпин краба тормозит рост культур клеток рабдосаркомы, HeLa, мышиных иммортализованных фибробластов NIH 3T3 в системе in vitro.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОТЕАСОМЫ И ИММУНОПРОТЕАСОМЫ

ПОД ДЕЙСТВИЕМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ

РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

Бачева А.В.1, Кузина Е.С.1, Белогуров А.А.2, Пономаренко Н.А.2, Габибов А.Г.1,2 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: anbach@genebee.msu.ru

Протеасома играет ключевую роль в регуляции уровня специфических белков, поддерживая гомеостаз внутри клеток. Она катализирует деградацию белков, участвующих в управлении жизненным циклом клеток, регулируя их концентрации, а также избирательно уничтожает потенциально вредоносные аномальные или денатурированных белки, образующиеся при различных патологических процессах.

Кроме того, протеасома участвует в процессах, связанных с работой иммунной системы, а именно в деградации белков с образованием антигенных пептидов, которые затем презентируются на молекулах МНС. В организме животных содержится два типа протеасомы – стандартная и иммунопротеасома. Под действием провоспалительных цитокинов в клетках начинается биосинтез каталитических иммуносубъединиц. Они обладают другой субстратной специфичностью, встраиваясь во вновь собирающиеся частицы протеасомы вместо конститутивных субъединиц. Для регуляции активности протеасомы разработаны ингибиторы нескольких классов. Среди них пептидоборонаты, в том числе бортезомиб, являются сильными ингибиторами, с Ki около нескольких нмоль. Однако эти вещества действуют как на конститутивную, так и на иммунопротеасому, на любые клетки, что приводит к остановке протеолиза и к смерти клеток через апоптоз. Предполагается, что пептидилэпоксикетоны, другой класс ингибиторов, обладают большей селективностью к иммунопротеасоме. Активность протеасомы, выделенной из различных источников (эукариотические клетки линий CHO и NSO, обработанные и не обработанные гамма-интерфероном, и мозг мышей линий BALB/c и SJL), была изучена в присутствии ряда ингибиторов. Использованы ингибиторы четырех классов, а именно пептидоборонат бортезомиб, пептидоальдегид MG132, лактамный ингибитор лактацистин, а также пептидилэпоксикетоны эпоксомицин, MG132ek, LMP2- и LMP7-специфические ингибиторы. Были получены значения IC50 для всех перечисленных ингибиторов и в некоторых случаях рассчитаны Ki.

Показано, что эпоксикетоны в субмикромолярных концентрациях селективно ингибируют образцы протеасомы с высоким содержанием иммуносубъединиц. Это создает предпосылки для возможного использования ингибиторов данного класса в качестве лекарств направленного действия.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-04-01546.

Секционные доклады 131

МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ОШИБОК ТРАНСКРИПЦИ

И БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ

Кульбачинский А.В.1,2, Пупов Д.В.1, Есюнина Д.М.1,2 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: akulb@img.ras.ru

Высокая точность транскрипции необходима для правильной экспрессии генетического материала. Ошибки транскрипции могут приводить к появлению нефункциональных молекул РНК и мутантных вариантов белков и снижать жизнеспособность клеток. Основным механизмом исправления ошибок транскрипции служит удаление неправильно включенных нуклеотидов за счет реакции гидролитического расщепления РНК. Эта реакция происходит в том же активном центре РНКП, что и синтез РНК, при участии двух ионов магния. Расщепление РНК происходит после смещения элонгационного комплекса назад по матрице ДНК и регулируется специализированными белковыми факторами (Gre-факторами у бактерий).

Точный молекулярный механизм реакции расщепления, а также механизмы действия Gre-факторов, во многом остаются непонятны.

В нашей работе мы исследовали механизмы расщепления РНК РНКП Escherichia coli и Deinococcus radiodurans, которые обладают сходными скоростями синтеза РНК, но значительно различаются по скоростям расщепления. Это позволило выявить факторы, влияющие на реакцию расщепления. Показано, что скорость реакции во многом определяется особенностями структуры участков РНКП, взаимодействующих с 3-концом РНК, в частности, G-петли в активном центре фермента. Эти районы, вероятно, принимают непосредственное участие в реакции расщепления. Впервые клонированы и охарактеризованы Gre-факторы D.

radiodurans и показано, что они способны значительно стимулировать реакцию расщепления РНК на транскрипционных матрицах разной структуры. Выявлены участки Gre-факторов, необходимые для их связывания с РНКП и стимуляции расщепления РНК.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 10-04-00925 и гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых ученых (МДV Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕСИИ ГЕНОВ ПРОБЕЛОК-КОНВЕРТАЗ

ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО

Демидюк И.В.1, Шубин А.В.1, Гасанов Е.В.1, Куринов А.М.1, Демкин В.В.1, Виноградова Т.В.2, Зиновьева М.В.2, Сасс А.В.2, Зборовская И.Б.3, Костров С.В.1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

E-mail: duk@img.ras.ru

Пробелок-конвертазы (ПК) – субтилизинподобные сериновые протеиназы млекопитающих, осуществляющие специфический процессинг неактивных предшественников белков и пептидов. Многие известные субстраты ПК, такие как факторы роста, их рецепторы, интегрины и матриксные металлопротеиназы, вовлечены в развитие и прогрессию злокачественных опухолей. Показано, что изменение экспрессии ПК влияет на пролиферацию, подвижность, адгезивную и инвазивную способность раковых клеток, поэтому ПК рассматриваются как потенциальные мишени противораковой терапии и маркеры онкологических заболеваний.

В данной работе впервые была проведена количественная оценка экспрессии генов всех девяти ПК на уровне мРНК в опухолевых тканях лёгкого человека с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени. Образцы злокачественных и прилежащих нормальных тканей были взяты у 30 пациентов с диагнозом «карцинома лёгкого». Были обнаружены значимые повышение экспрессии в опухоли по сравнению с нормальной тканью для гена фурина (p0,0001) и снижение для генов PCSK2 (p0,01), PCSK5 (p0,001), PCSK7 (p0,01) и MBTPS1 (p0,0001). Однако выявить статистически значимых различий между уровнями экспрессии проанализированных генов или их паттернами экспрессии для групп образцов, отличающихся клиническими характеристиками, не удалось.

Кластерный анализ данных об изменении экспрессии ПК в опухоли относительно нормальной ткани показал, что исследованные образцы формируют четыре группы. Основной характеристикой каждой из них является максимальное увеличение или минимальное снижение экспрессии в опухоли одного из генов ПК (FURIN, PCSK1, PCSK6 или PCSK5).

Полученные результаты показывают, что изменение экспрессии генов системы ПК при раке легкого происходит по нескольким сценариям, что может быть связано с различными механизмами возникновения опухолей.

Секционные доклады 133

OCOБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ИММУННЫХ ПРОТЕАСОМ

В ЦНС МЫШЕЙ, НОКАУТНЫХ ПО 2-МИКРОГЛОБУЛИНУ

Люпина Ю.В.1, Богатырев М.Е.1, Астахова Т.М.1, Абатурова С.Б.1, Марюхнич Е.В.2, Казанский Д.Б., Шарова Н.П.

Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, Вавилова, 26 Институт канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

E-mail: yulial@bk.ru

Присутствие главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГ I) установлено в клетках ЦНС, в том числе и в нейронах. В нейронах ГКГ I локализован постсинаптически и совместно с иммунными протеасомами регулирует функцию синаптической структуры в ответ на изменение нейрональной активности. Исследование особенностей пула протеасом в ЦНС при нарушенной экспрессии ГКГ I важно для понимания механизмов пластичности ЦНС. Исследованы содержание иммунных и конститутивных субъединиц протеасом, общий уровень протеасом, химотрипсин-подобная активность (ХПА) и каспаза-подобная активность (КПА) в различных отделах ЦНС мышей, нокаутных по 2-микроглобулину ГКГ I (2м), и мышей контрольной группы: во фронтальной коре (кора), стриатуме, медиабазальном гипоталамусе, мозжечке и стволе мозга. Показано, что количество иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 в коре увеличивается, а в стриатуме уменьшается у нокаутных 2м животных. В стриатуме нокаутных 2м мышей снижен уровень конститутивных субъединиц протеасом 1 и 2. Обнаружено уменьшение содержания субъединицы РА28 активатора РА28 и тотального пула протеасом в стриатуме, стволе мозга и увеличение содержания РА28 в коре нокаутных 2м мышей. ХПА снижена в медиабазальном гипоталамусе и мозжечке, а в стволе мозга нокаутных 2м мышей наблюдалось снижение ХПА и КПА. В коре, мозжечке и стволе мозга нокаутных 2м мышей снижена экспрессия NeuN (нейронального ядерного белка). В каудальных отделах мозга снижена, а в коре отмечено достоверное увеличение экспрессии gFAP (глиального фибриллярного кислого белка). Выявлены возможные регуляторные пути изменения содержания иммунных протеасом. Показано, что количество белка теплового шока 70 – активатора экспрессии иммунных протеасом, и количество nNO-синтазы, запускающей этот сигнальный путь, увеличивается в коре нокаутных животных. Изменение соотношения иммунных протеасом, NeuN и gFAP в ЦНС связано с процессами нейрогенеза и дифференцировки, а также с компенсацией отсутствия ГКГ I у нокаутных 2м мышей.

Работа поддержана РФФИ (грант № 09-04-00077а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА-1, АКТИВИРУЕМОГО

ПРОТЕИНАЗОЙ (иПАР1-II), НА ВЫЗВАННУЮ ТРОМБИНОМ ГИБЕЛЬ

НЕЙРОНОВ

Горбачева Л.Р.1, Румш Л.Д.2, Беспалова Ж.Д.3, Фельдман Б.М.4, Ворожцов Г.Н.4, Струкова С.М.

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий, Москва ФГУП «Государственный научный центр «НИОПИК», Москва

Е-mail: LyubovGorbacheva@gmail.com

Увеличение проницаемости ГЭБ при травме, воспалении и других патологических состояниях приводит к появлению в нервной ткани сериновых протеиназ системы свертывания крови, в том числе тромбина. Известно, что тромбин регулирует функции клеток через рецепторы, активируемые протеиназами (ПАР) 1 и 4 типа, экспрессия которых обнаружена в разных областях мозга. Тромбин может вызывать отек мозга и гибель нейронов в очаге повреждения мозга, где обнаруживают высокие концентрации тромбина, которые отвечают за развитие тромбообразования и системного воспаления. Таким образом, исследование антагонистов ПАР как возможных цитопротекторных препаратов, препятствующих гибели нейронов, вызванной высокими концентрациями тромбина, при тяжелых патологических состояниях представляется весьма перспективным.

В настоящей работе на первичной культуре гиппокампальных нейронов крысы было исследовано влияние тромбина в высокой концентрации на выживаемость клеток, а также влияние разных концентраций нового синтетического пептида – антагониста ПАР1(иПАР1-II) на гибель нейронов в условиях действия тромбина.

В ходе исследования выявлено, что тромбин в высокой (100 нМ) концентрации приводит к гибели до 30% нейронов. Мы исследовали влияние иПАР1 в разных концентрациях (1 нМ, 10 нМ и 100 нМ) на гибель гиппокампальных нейронов и действие иПАР1 в присутствии цитотоксической концентрации тромбина. Выявлено, что предварительная инкубация нейронов с низкими (1 и 10 нМ) концентрациями иПАР1 защищала клетки от токсического действия 100 нМ тромбина, стабилизируя выживаемость нейронов на уровне контроля. Вместе с тем, в отличие от низких концентраций, иПАР1 в высокой (100 нМ) концентрации вызывал гибель более 40% нейронов. Полученные данные позволяют предполагать, что в низких концентрациях иПАP1-II может защищать нейроны от цитотоксического действия высоких концентраций тромбина.

Работа выполнена при поддержке НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения атеросклероза и его осложнений» на 2009–2011 гг.

Секционные доклады 135

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОТЕИНАЗЫ ВИРУСА

ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ЕЕ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНОГО

МУТАНТА СО СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ИНГИБИТОРАМИ

МЕТОДОМ ОСТАНОВЛЕННОГО ПОТОКА

Дронина М.А.3, Кузнецов Н.А.1, Захарова М.Ю.3, Смирнов И.В.3, Козырь А.В.2, Колесников А.В.2, Калиберда Е.Н.3, Румш Л.Д.3, Федорова О.С.1, Габибов А.Г.3 Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Институт инженерной иммунологии, Любучаны, Московская обл.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: mdronina@mail.ru

СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита – в течение последних лет привлекает к себе внимание как тяжелое, приводящее к гибели, заболевание человека, имеющее тенденцию к пандемическому распространению и до настоящего времени являющееся неизлечимым. Одним из подходов к терапии СПИДа является поиск и разработка ингибиторов вирусных ферментов. Эти ингибиторы прерывают жизненный цикл патогена и способны на годы отсрочить развитие заболевания. Среди лекарственных форм, применяющихся на сегодняшний день, можно отметить ингибиторы вирусной протеиназы – ампренавир, ритонавир, саквинавир, индинавир, дарунавир и др. Однако серьезной проблемой является возникновение мутантных форм фермента, резистентных к ингибиторам. Поэтому для селекции новых ингибиторов требуется изучение кинетических параметров действия протеиназы СПИДа, позволяющее наблюдать динамику этого процесса.

В данном исследовании мы сравнивали между собой рекомбинантные белкиферменты: дикого типа протеиназы ВИЧ-1 (WT1) и ее мультирезистентного мутанта (mut 1) (L10I/L31I/M46I/I54V/L63I/V82A/I84V/L90M) методом остановленного потока («stopped-flow»). Гены протеиназы мутантного белка и дикого типа получали методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, встраивали в экспрессионный вектор pET15, проводили экспрессию и очистку ферментов.

Нами было проанализированы элементарные стадии гидролиза FRET – субстрата (Arg-Glu(EDANS)-Ser-Gln-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Lys(DABCYL)-Arg) протеиназой дикого типа и мультирезистентной протеиназой в присутствии специфических ингибиторов I (саквинавир, индинавир) и II (дарунавир) поколений.

Анализ динамики формирования комплексов протеиназа-ингибитор методом остановленного потока позволил выявить фундаментальное отличие между связыванием протеиназы ВИЧ с ингибиторами I и II поколений, что будет способствовать разработке новых высокоэффективных ингибиторов протеиназы ВИЧ.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОВ

ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ

ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ

Еремеев Н.Л., Борзенкова А.В., Драчевская М.И.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 Определение первичной специфичности является обязательным этапом характеристики любой новой протеиназы (под первичной специфичностью подразумевают избирательность фермента по отношению к аминокислоте, образующей гидролизуемую амидную связь своей карбоксильной группой – по классификации Шехтера-Бергера это положение P1 субстрата).

В настоящее время первичную специфичность протеолитических ферментов выявляют двумя основными методами – определение констант гидролиза в сериях гомологичных субстратов или разделение продуктов протеолиза белковых субстратов с известной аминокислотной последовательностью и определение их структуры (N-концевой сиквенс или тандемная масс-спектрометрия), что позволяет выявлять гидролизованные пептидные связи. Оба этих подхода весьма трудоемки.

Нами предлагается метод изучения первичной специфичности протеолитических ферментов статистическим анализом масс продуктов протеолиза белковых субстратов, не требующий прямого определения аминокислотной последовательности этих продуктов.

Идея метода заключается в следующем. Проводят гель-электрофорез в восстанавливающих и денатурирующих условиях белка-субстрата с известной аминокислотной последовательностью. Полосу субстрата подвергают протеолизу изучаемой протеиназой. МАЛДИ масс-спектр реакционной смеси дает набор масс продуктов протеолиза. С помощью программы FindPept теоретически находят все пептиды белкового субстрата, обладающие конкретной массой в пределах той или иной ошибки измерения. Месторасположение этих пептидов в первичной аминокислотной последовательности субстрата позволяет выделить для каждого из них две аминокислоты, после которых потенциально произошел гидролиз. Подобную процедуру проводят для каждой массы в масс-спектре, в результате чего получают набор произошедших событий. Первичная специфичность протеиназы должна проявляться в максимальной частоте встречаемости той или иной аминокислоты при статистическом анализе полученного набора.

Секционные доклады 137

–  –  –

Создание новых лекарственных средств V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АНТИЭПИЛЕПТИЧЕСКОЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ

КОРТЕКСИНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СУДОРОЖНОЙ

АКТИВНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛА,

У КРЫС Аниол В.А.1, Новицкая Ю.А.2, Лазарева Н.А.1, Моисеева Ю.В.1, Онуфриев М.В.1, Попова М.С., Степаничев М.Ю., Тишкина А.О., Яковлев А.А., Гранстрем О.К., Гуляева Н.В.

Учреждение РАН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва ООО «Герофарм», С.-Петербург

E-mail: aniviktor@narod.ru

Современная терапия эпилепсии является главным образом симптоматической, направленной на купирование пароксизмальных состояний, поэтому актуальна разработка лекарств, которые позволяют управлять течением заболевания (антиэпилептический потенциал) и повышать устойчивость тканей мозга к повреждающему действию судорожной активности (нейропротекторные свойства). Возможным перспективным направлением является разработка пептидных препаратов, чье действие основано на модулировании нейрональной пластичности и нормализации метаболизма поврежденных тканей. Целью данной работы было изучение противосудорожных, антиэпилептических и нейропротекторных свойств препарата кортексин, представляющего собой комплекс водорастворимых полипептидных фракций мозга крупного рогатого скота.

В исследовании на крысах была использована модель хронических экспериментальных судорог, вызванных введением химического конвульсанта пентилентетразола (ПТЗ) – пентилентетразоловый киндлинг. Кортексин вводили животным внутрибрюшинно (0,015 мг/кг, 0,15 мг/кг и 1,0 мг/кг) или интраназально в комплексе с наночастицами (0,015 мг/кг). Было обнаружено, что при моделировании хронической судорожной активности с помощью ПТЗ кортексин (преимущественно в дозе 1,0 мг/кг) удлиняет латентный период развития судорожной активности, так и, в ряде случаев, снижает силу судорог. Хроническая судорожная активность при длительном введении ПТЗ сопровождается потерей нормальной нейрональной плотности в различных полях гиппокампа. Введение кортексина (0,015 мг/кг и 0,15 мг/кг) предотвратило снижение нейрональной плотности в поле СА4 и зубчатой фасции гиппокампа.

Таким образом, при моделировании экспериментальной хронической судорожной активности у крыс было выявлено антиэпилептическое и нейропротекторное действие кортексина.

Секционные доклады 139

ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ И ОПТИЧЕСКОЙ ИЗОМЕРИИ

НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ

И ПРОИЗВОДНЫХ 2,5-ДИКЕТОПИПЕРАЗИНОВ

Дейгин В.И.1, Ксенофонтова О.Б.1, Ефремов Е.С.1, Шевченко А.С.2, Семин Ю.А.2, Изместьева О.С.2, Лузянина А.А.2,Саенко А.С.2 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Федеральное государственное бюджетное учреждение МРНЦ Минздравсоцразвития РФ, 249036 Обнинск, Московская обл., ул. Королёва, 4

E-mail: vdeigin@gmail.com

Одним из основных ограничений к широкому внедрению пептидных лекарственных препаратов в медицинскую практику является их низкая устойчивость к ферментативному расщеплению при введении в организм. Исследователями используются различные методы и приемы, увеличивающие стабильность молекул при введении в организм, в том числе получение различных циклических производных.

Выделение из экстракта тимуса биологически активного пептида L-Glu-L-Trp положило начало структурно – функциональным исследованиям низкомолекулярных пептидов, содержащих в своем составе дипептид Glu-Trp. Ранее нами было показано влияние этих соединений на процессы пролиферации стволовых гемопоэтических клеток костного мозга экспериментальных животных in vivo; была установлена роль оптической изомерии в направленности биологических эффектов.

Основываясь на полученных данных о влиянии оптических и химических свойств пептидов семейства Glu-Trp на их биологическую активность, было высказано предположение о реципрокном действии ряда изомеров Glu-Trp на иммунную и гемопоэтическую системы. Исследование влияния оптических и химических свойств изомеров Glu-Trp показало, что существует взаимосвязь между биологическим действием, химической структурой и оптической активностью для каждого из восьми возможных изомеров [1]. Для низкомолекулярных пептидных препаратов (до 800 – 1000 D) нами предложен подход, позволяющий создавать стабильные при пероральном приеме соединения, путем «включения» биологически активного фрагмента в структуру дикетопиперазинового производного. Наряду с иммуно- и гемоактивными препаратами получены дикетопиперазиновые производные нейропептидов, обладающие анальгетической активностью при пероральном приеме, а также «химерные» производные, содержащие в своем составе различные фармакофоры.

Литература

1. Deigin V.I., et.al. «The effects of the EW dipeptide optical and chemical isomers on the CFU-S population in intact and irradiated mice». Int. Immunopharmacology. (2007) 7, 375–382.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПСИХОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ СПЕКТР АКТИВНОСТИ

НЕЙРОТЕНЗИНПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ

Кост Н.В.1, Мешавкин В.К.1, Батищева Е.Ю.1, Соколов О.Ю.1, Андреева Л.А.2, Мясоедов Н.Ф.2 Научный центр психического здоровья РАМН, Москва, Каширское ш., 34 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: nat-kost@yandex.ru

Предполагается, что регуляторный пептид нейротензин играет роль эндогенного антипсихотика, а так же способен модулировать другие психические функции, в частности, тревогу и депрессию. На основе фармакофора нейротензина (Pro-Tyr) был синтезирован ряд олигопептидов, названных нейротензинподобными пептидами (НТП). В поведенческих экспериментах в условиях фармакологически измененной активности дофаминовой, серотониновой и глутаматной систем НТП проявили свойства, характерные для антипсихотиков. НТП были эффективны в экспериментальных моделях позитивной и негативной симптоматики шизофрении и не вызывали выраженных отрицательных побочных эффектов. Кроме того НТП оказывали антидепрессивное и анксиолитическое действие на животных в тестах «принудительное плавание» и «приподнятый крестообразный лабиринт», соответственно. В тесте «открытое поле» НТП повышали «исследовательскую» активность животных, что косвенно свидетельствует об их ноотропных свойствах. Сопоставление результатов, полученных в поведенческих тестах и в экспериментах in vitro (радиолигандный метод, агрегация тромбоцитов), показало, что биологические эффекты НТП могут быть опосредованы дофаминовыми и серотониновыми рецепторами.

Таким образом, НТП обладают широким спектром действия и могут послужить основой для создания новых пептидных антипсихотиков, эффективных в терапии позитивной, негативной симптоматики и когнитивных расстройств при шизофрении, а также антидепрессантов и других психофармакологических препаратов.

Секционные доклады 141

СОЗДАНИЕ СИСТЕМНО АКТИВНОГО ДИПЕПТИДНОГО МИМЕТИКА

ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ

Гудашева Т.А., Середенин С.Б.

Учреждение РАМН НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, 125315 Москва, Балтийская, 8 E-mail: tata-sosnovka@mail.ru Многочисленные литературные данные свидетельствуют об участии фактора роста нервов (NGF) в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Белковая природа NGF исключает возможность заместительной терапии, а созданные к настоящему времени его циклоолигопептидные аналоги в качестве низкомолекулярных миметиков не проявляют достаточной фармакологической активности при системном введении.

Нами был сконструирован и синтезирован N-ацилдипептидный миметик -изгиба 4-й петли NGF. По своей последовательности он совпадает с центральным участком (Glu94-Lys95) -изгиба, а N-ацил представляет собой биоизостер Asp93.

Поскольку NGF является гомодимером, были синтезированы димеры этого дипептида, и соединение с гексаметилендиамидным спейсером [ГК-2; HOOCCH2)2-CO-Glu-Lys-NH-СН2-СН2-СН2-)2] было отобрано для подробного изучения.

Нейропротективная активность ГК-2 (10-5–10-9М) in vitro установлена на клеточных моделях в условиях оксидативного стресса, глутаматной, МФТП и 6-оксидофаминовой нейротоксичности. Подобно NGF, ГК-2 усиливал фосфорилирование ТrkA и синтез HSP32 и HSP70. (Т.А.Антипова, 2010).

В опытах in vivo ГК-2 обнаружил противоинсультную, антипаркинсоническую и антиишемическую активности. Эффекты проявлялись в интервале доз 0,01–5 мг/кг i.p. и 10–30 мг/кг p.o. Так, при хроническом введении ГК-2 (1 мг/кг i.p.) уменьшал на 60% зону инфаркта на модели фотоиндуцированного инсульта коры головного мозга крыс и на 16% – на модели инсульта, вызванного окклюзией среднемозговой артерии, а на модели геморрагического инсульта полностью предупреждал смертность крыс. На модели индуцированного нейротоксином МФТП паркинсоничского синдрома ГК-2 достоверно уменьшал выраженность акинезии и ригидности, а при хроническом введении полностью снимал паркинсонический синдром, вызванный унилатеральным введением 6-оксидофамина в стриатум. На модели неполной глобальной ишемии, вызванной двусторонней перевязкой сонных артерий у крыс, хроническое введение ГК-2 (1 мг/кг i.p.) полностью предотвращало гибель животных и восстанавливало нарушенное поведение.

Таким образом, ГК-2 можно рассматривать в качестве первого NGF-подобного нейропротективного препарата, эффективного при системном введении.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (грант № 11-04-00538-а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОИСК МАЛЫХ МОЛЕКУЛ С АНТИПСИХОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

НА ОСНОВЕ НЕЙРОТЕНЗИНА

Островская Р.У., Гудашева Т.А., Середенин С.Б.

Учреждение РАМН НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, 125315 Москва, Балтийская, 8 E-mail: rita.ostrovskaya@gmail.com Данные о тесной взаимосвязи нейротензин (НТ)- и дофамин (ДА)-ергической систем позволили выдвинуть гипотезу о роли НТ как эндогенного нейролептика (Nemeroff, 1980). Структура этого тридекапептида, обуславливающая низкую биодоступность для мозга, делает невозможным его практическое использование.

Оригинальный подход к поиску системно активных пептидных препаратов, развиваемый в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, состоит в создании малых молекул – замещенных дипептидов, имитирующих конформацию активного центра эндогенного пептида, выявленного на основании структуры дипептидного прообраза соответствующего непептидного лекарства [Gudasheva T.A. et al., 1996, 1998]. За основу моделирования активных НТ-подобных нейролептиков был взят дипептид пролил-тирозин в связи с тем, что он имеет топологическое сходство с атипичным нейролептиком сульпиридом и соответствует центральному фрагменту -изгиба НТ8-13, На основании структуры выявленного активного дипептидного участка нейротензина получена новая группа потенциальных атипичных нейролептиков, N- ацилпролилтирозинов [Середенин и соавт., Патент РФ № 2091390], из серии которых для подробного изучения был отобран метиловый эфир N-капроил-L-пролил-L-тирозина (Дилепт). Дилепт (в диапазоне доз 0,4-4 мг/кг для в/б введения, 8–24 мг/кг для перорального введения) ослабляет апоморфиновую вертикализацию и стереотипию, стимуляцию двигательной активности и нарушение экстраполяционного избавления, обусловленные введением дофаминомиметиков, устраняет дефицит препульсового торможения, вызванный дофамино-миметиками или блокатором NMDA-рецепторов («трансляционная» модель шизофрении), потенцирует эффект барбитуратов. Даже в дозах, превышающих в 500 раз таковые по антидофаминовым эффектам, он не вызывает каталепсии, седации. Важным преимуществом Дилепта перед известными антипсихотиками является также положительное влияние на когнитивные функции и нейропротективное действие [Островская Р.У., 2000–2008]. В отличие от пептидных препаратов более сложной структуры, Дилепт в условиях перорального введения проникает в мозг. Препарат не вызывает толерантности, лекарственной зависимости и синдрома отмены.

Секционные доклады 143

ГЛИПРОЛИНЫ И ЯЗВА ЖЕЛУДКА

Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Умарова Б.А., Багликова К.Е., Бакаева З.В.

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва E-mail: g_samonina@mail.ru Распространенность язвенной болезни по-прежнему не имеет тенденции к снижению, поэтому проблема поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) при воздействии на нее различных повреждающих факторов остается весьма актуальной. Особое внимание уделяется роли эндогенных регуляторных пептидов в процессе поддержания гомеостаза СОЖ. Несмотря на различный характер повреждающих факторов, вызывающих экспериментальные язвы желудка у крыс (этанол, стресс, индометацин, ледяная уксусная кислота и др.), первоначальной реакцией является воспаление, приводящее к разной степени язвенных повреждений.

Мы исследовали влияния на гомеостаз СОЖ крыс различных глипролинов:

PG, GP, PGP, GPG, GPGP, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyp на этаноловой, стрессорной, индометациновой, ацетатной и при введении вещества 48/80, вызывающего массивную дегрануляцию тучных клеток.

Глипролины – фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина, обладают целым рядом физиологических свойств, среди которых следует отметить в первую очередь противовоспалительные и антиульцерогенные. Протекторным противоязвенным эффектом, как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном способах введения глипролинов (3.7 и 0.37мкг/кг) на этаноловой модели язвообразования обладают PGP, PG, GPGP и GPGPGP, а устойчивость СОЖ к действию стресса повышают PGP, GP, GPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP и PGHyp. На ацетатной модели язвообразования было показано, что все изученные глипролины обладают и лечебным противоязвенным действием.

Наибольшие противоязвенные эффекты проявляют PGP и GPGPGP. Противоязвенные эффекты этих пептидов обусловлены восстановлением нарушенного кровотока, уменьшением кислой и усилением щелочной секреции, усилением образования слизи, снижением секреторной активности тучных клеток, уменьшением вызванных воспалением нарушений микроциркуляции и сократительной активности лимфатических сосудов. Способность глипролинов предотвращать или уменьшать повреждения СОЖ позволяет рассматривать их как вещества перспективные для создания новых лекарственных средств.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 97-04а, 00-04-48086-а, 03-04-48664-а, 06-04-48833-а, 09-04-00669-а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПЕПТИД МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА ЛАКТАПТИН

КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ПРОТИВОРАКОВЫЙ ПРЕПАРАТ

Рихтер В.А.1, Коваль О.А.1, Каледин В.И.2, Фомин А.С.1, Потапенко М.О.1, Кулигина Е.В.1, Семенов Д.В.1 Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8 Учреждение РАН Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

E-mail: richter@niboch.nsc.ru

Ранее было обнаружено, что в человеческом молоке содержится пептид, вызывающий апоптоз клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Было установлено, что исследуемый пептид является протеолитическим фрагментом каппа-казеина человека. Учитывая происхождение пептида и его апоптотические свойства, его назвали лактаптином.

Далее был создан штамм-суперпродуцент и получен генно-инженерный аналог лактаптина RL2. Было показано, что RL2 подавляет жизнеспособность онкотрансформированных клеток и не влияет на немалигнизированные клетки человека.

Был разработан способ лечения метастазирующих злокачественных заболеваний животных рекомбинантным аналогом лактаптина RL2. Показано, что при двухразовом внутривенном введении RL2 в дозе 40 мг/кг рост солидной опухоли замедляется на 65% по сравнению с контрольной группой животных. В экспериментах по моделированию процессов метастазирования у животных установлено, что при внутривенном введении RL2 в дозе 40 мг/кг (2–4 раза) продолжительность жизни животных увеличивается в среднем на 24%. При этом RL2 не оказывает общего токсического действия.

Было установлено, что механизм действия рекомбинантного аналога лактаптина RL2 на клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 включает в себя взаимодействие RL2 с белками микротрубочек ( и цепи тубулина и -актинин-1), нарушение динамики веретена деления, остановку клеточного цикла в G2/M фазе, что приводит к p53 регулируемой апоптотической гибели клеток по митохондриальному пути.

Работа поддержана грантами: РФФИ № 10-04-01109-а, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» № 02.740.11.0715.

Секционные доклады 145

ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ

АЛЬФА7-СУБЪЕДИНИЦЫ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА

И ПРИОННОГО БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ

БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

Камынина А.В.1, Бобкова Н.В.2, Медвинская Н.И.2, Александрова И.Ю.2, Короев Д.О.1, Волкова Т.Д.1, Вольпина О.М.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: aneskaminina@mail.ru

Болезнь Альцгеймера (БА) – тяжелое нейродегенеративное заболевание, которое сопровождается накоплением амилоидных бляшек, состоящих из агрегированной формы бета-амилоидного пептида (A). В настоящее время неизвестен точный механизм того, как именно A оказывает свое губительное действие. В последние годы в качестве наиболее перспективного подхода для лечения БА рассматривается иммунотерапия, основанная на индукции специфических антител к A, снижающих его уровень в мозгу пациентов. Однако этот подход имеет ряд недостатков, поэтому остается актуальным поиск новых альтернативных путей для борьбы с БА.

Нами был предложен новый подход к терапии БА, основанный на выработке антител не к A, а к его предполагаемым рецепторам. Известно несколько мишеней A, среди которых альфа7-тип ацетилхолинового рецептора (АХР) и прионный белок. Мы предположили, что специфические антитела к этим рецепторам будут препятствовать их связыванию с A и, таким образом, защищать клетки от гибели. Нами были выбраны и синтезированы фрагменты этих рецепторов: пептид последовательности 173-193 альфа7-субъединицы АХР (АХР173-193) и пептиды последовательностей 95-123 и 203-229 прионного белка (Пр95-123 и Пр 203соответственно). Была изучена их иммунотерапевтическая активность на мышах с экспериментально индуцированной формой БА. Было выявлено, что активная иммунизация пептидами АХР173-193 и Пр95-123 оказывала терапевтический эффект в модели БА, а именно, приводила к восстановлению пространственной памяти и понижению уровня A. Чтобы доказать, что наблюдаемая терапевтическая активность вызвана именно действием антител, были проведены опыты по пассивной защите мышей с экспериментально индуцированной формой БА аффинноочищенными антителами к пептидам АХР173-193 и Пр95-123. Было выявлено, что пассивное введение антител, также как и активная иммунизация, приводило к восстановлению пространственной памяти экспериментальных животных.

Была выявлена обратная дозо-зависимость эффекта. Таким образом, предлагаемый нами подход, основанный на действии антител к рецепторам A, может рассматриваться как перспективный путь для борьбы с БА у людей.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТРАНСПЛАНТАЦИИ VEGF И FGF2

В ОБЛАСТЬ ТРАВМАТИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ СПИННОГО МОЗГА

КРЫСЫ ПРИ ПОМОЩИ КЛЕТОК КРОВИ ПУПОВИНЫ

И ПУТЕМ ПРЯМОЙ ИНЪЕКЦИИ

Шаймарданова Г.Ф.1, Мухамедшина Я.О.2, Ризванов А.А.3, Салафутдинов И.И.3, Челышев Ю.А.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 Казанский государственный медицинский университет, 420012 Казань, ул. Бутлерова, 49 Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18

Е-mail: Gulnara_kzn@rambler.ru

Ввиду низкого регенераторного потенциала ЦНС, используемые сегодня методы лечения травмы спинного мозга, остаются малоэффективными. Определенные перспективы открываются в связи с применением стволовых клеток. Так, трансплантация клеток крови пуповины человека сдерживает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое действие, стимулирует неоваскуляризацию, снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает выживание нейронов.

Усилить терапевтический эффект можно путем применения генетически модифицированных клеток, обладающих способностью к длительной гиперэкспрессии ключевых факторов, которые поддерживают выживание и дифференцировку нейральных клеток.

В этом качестве особый интерес вызывают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2). VEGF проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Однако, данные о влиянии на нейрорегенерацию прямой доставки VEGF в область повреждения спинного мозга противоречивы. FGF2 активирует дифференциацию предшественников макроглии в зрелые клетки. Влияние на процессы нейрорегенерации комбинации VEGF-FGF2 не изучено. С этой целью нами впервые сконструирована двухкассетная плазмида pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующая одновременно два гена vegf и fgf2. В настоящей работе на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне T8 изучены эффекты немедленного однократного введения в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-FGF2 и путем прямой инъекции плазмид pBud-VEGF-FGF2. Животным контрольной группы в тех же условиях вводили аналогичные клетки, трансфицированные геном зеленого флуоресцентного белка (EGFP).

По данным морфометрии на 30-е сутки после операции как трансплантация клеток, так и инъекция плазмиды приводят к увеличению площади сохраненного серого и белого вещества на расстоянии 3 и 5 мм в ростральном и каудальном направлениях от эпицентра травмы. При трансплантации клеток, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, площадь сохраненного серого вещества на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы увеличивается более чем на 60%. В наружных зонах белого вещества отмечено уменьшение площади патологических полостей и рост числа миелиновых волокон. При трансплантации трансфицированных клеСекционные доклады 147 ток крови пуповины количество периваскулярных клеток, экспрессирующих бета рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRbeta), на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы возрастает в среднем на 30%, а в случае прямой инъекции – на 54%. Наибольшее количество PDGFR+-клеток выявлено в наружных зонах белого вещества. Количество S100+-клеток на этом расстоянии возрастает при введении трансфицированных клеток крови пуповины на 55%, в случае прямой инъекции плазмиды – на 46% (Р0,05).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОДХОДЫ К ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА ПУТЕМ

СЕЛЕКТИВНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ АУТОРЕАКТИВНЫХ В-КЛЕТОК

Степанов А.В., Белогуров А.А.-мл., Пономаренко Н.А., Козлов Л.В., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: stepanov.aleksei.v@gmail.com Рассеянный склероз (РС) – это хроническое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы, при котором повреждается миелиновая оболочка нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. РС представляет собой острую медико-социальную проблему, поскольку, как правило, поражает лиц молодого и среднего возраста. Проблема лечения РС остается далекой от разрешения, на сегодняшний день существуют лекарственные препараты, способные только в некоторой степени замедлить течение РС, но не излечивать от этой патологии. В основном современная терапия РС состоит в применении иммуносупрессоров, копаксона (сополимер глатирамера ацетат) и моноклонального анти-CD20/19 антитела (ретуксимаб). Все вышеперечисленные подходы обладают рядом существенных недостатков, в основном связанных с неспецифическим действием на всю иммунную систему. В данной работе мы предлагаем подходы для направленной и эффективной элиминации аутореактивных В-клеток, позволяющие избежать подавления функций В-клеточного звена в целом. В ходе выполнения работы были получены иммунотоксины (ИТ) на основе барназы, псевдомонадного токсина, шига-подобного токсина и Fc домена человеческого антитела класса IgG1, слитных с последовательностью c-myc эпитопа. Данные ИТ были протестированы как на наличие функциональной активности, так и на связывание с антителами, продуцируемыми клетками-мишенями. Нами было показано, что последовательность c-myc, слитная с токсинами, во всех случаях обеспечивала адресную доставку токсичного агента к клетке-мишени. Молекула на основе псевдомонадного токсина оказалась одной из наиболее цитотоксичных, однако она обладала и высоким неспецифическим действием. Иммунотоксин на основе шига-подобного токсина продемонстрировал средние значения обоих параметров. Согласно нашим данным наиболее эффективными ИТ, сочетающими высокую токсичность и селективность, являются иммунотоксины на основе барназы и Fc домена человека. Терапия РС с их использованием представляется наиболее перспективной.

Секционные доклады 149

ОЦЕНКА ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ

ПРОСТАМАКС И КОРТАГЕН НА МОДЕЛИ ХИМИЧЕСКОГО ОТЕКА

СТОПЫ КРЫС: ИССЛЕДОВАНИЕ В СООТВЕТСТВИИ

С ТРЕБОВАНИЯМИ КАЧЕСТВЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКИ

Ленцман М.В.1, Артемьева А.И.1, Гранстрем О.К.2, Шопотов И.К.2 Учреждение РАН Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, 199034 С.-Петербург, наб. Макарова, 6 ООО «Герофарм», 197022 С.-Петербург, ул. Ак. Павлова, 5

E-mail: Lensman@kolt.infran.ru; Granstrem@geropharm.ru

Пептиды Простамакс и Кортаген обладают широким спектром биологической активности. Для выяснения одного из возможных механизмов действия этих пептидов, в данном исследовании, проведенном в соответствии с требованиями качественной лабораторной практики, была выполнена оценка их противовоспалительной (противоотечной) активности.

Исследование проведено на 90 неанестезированных белых крысах-самцах линии Вистар весом 250–320 г с применением «слепого» экспериментального протокола. Экспериментальный отек вызывался субплантарным введением 3% раствора полисахарида Агар-Агар (А-А). Исследуемые вещества (ИВ) вводились внутрибрюшинно за 60 мин до введения ирританта. Степень отека оценивалась по изменению объема стопы (методом плетизмометрии) сразу после и через 2, 4 и 6 часов после введения ирританта и выражалась в приросте объема стопы в % относительно фонового значения у данного животного. В исследование были включены 12 групп ИВ (по 3 группы каждого из 4 ИВ в дозах 10, 100 и 1000 мкг/кг), группы негативного (0,9% р-р хлорида натрия, НК) и позитивного (Диклофенак, 50 мг/кг, ПК) контролей.

В группах НК происходило формирование выраженного отека стопы в ответ на введение А-А: 43–44% через 2 часа, 62–64% через 4 часа и 58–60% через 6 часов после введения А-А. Вещество ПК практически полностью блокировало развитие отека.

Кортаген в дозе 1000 мкг/кг статистически достоверно снижал степень отека в точках регистрации 4 часа (на 24% меньше группы НК) и 6 часов (на 24% меньше группы НК).

Простамакс в дозе 1000 мкг/кг снижал степень отека в точках регистрации 2 часа (на 23 % меньше группы НК) и 4 часа (на 19% меньше группы НК).

По результатам исследования Кортаген и Простамакс могут быть признаны обладающими выраженной противовоспалительной активностью.

Исследование проведено по заказу и при финансовом обеспечении ООО «Герофарм».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА IgA 1 ПРОТЕИНАЗЫ

МЕНИНГОКОККА

Котельникова О.В.1, Бичучер А.М.3, Дрожжина Е.Ю.1, Жигис Л.С.1, Зуева В.С.1, Мельников Э.Э.1, Разгуляева О.А.1, Серова О.В.1, Ягудаева Е.Ю.1, Аваков А.Э.4, Аллилуев А.П., Козлов Л.В., Румш Л.Д.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов (медицинский факультет), 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8 ФГУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, 125212 Москва, ул. Адм. Макарова, 10 Филиал ФГУН (НПО «Микроген») предприятие по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского, 125212 Москва, ул. Адм. Макарова, 10

E-mail: ovkot.2003@mail.ru



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 9 |
Похожие работы:

«For Official Use ENV/EPOC/EAP/MIN(2004)2 Organisation de Coopration et de Dveloppement Economiques Organisation for Economic Co-operation and Development _ _ Russian Or. English ENVIRONMENT DIRECTORATE ENVIRONMENT POLICY COMMITTEE For Official Use ENV/EPOC/EAP/MIN(2004)2 TASK FORCE FOR THE IMPLEMENTATIO...»

«НАЗАРЕНКО Александр Владимирович СИСТЕМА ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КОМПЕТЕНТНОСТНО-ОРИЕНТИРОВАННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой ст...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ ЕВРОПЕЙСКАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ КОМИССИЯ Нью-Йорк, Женева, 1996 г. ЗАЩИТА ТРАНСГРАНИЧНЫХ ВОД Пособие для политиков и лиц, принимающих решения ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. РУКОВОДСТВО ПО МОНИТОРИНГУ И ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ТРАНСГРАНИЧНЫХ РЕК Документ подготовлен группой по мониторингу и оценке совместно с Нидерландами, в качес...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Казинцев...»

«НТП И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДСТВА УДК 621.301. Н. П. КУНДЕНКО, доктор технических наук, ХНТУСХ им. П. Василенко, г. Харьков Л. Н. МИХАЙЛОВА, кандидат технических наук, доцент ПАТУ, г. Харьков e-mail: n.p.kundenko@inbox.ru ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНЫХ АКУСТИЧЕСКИХ КОЛЕБАНИЙ В ПРОЦЕССЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ Предлож...»

«Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВО О РЫБОЛОВСТВЕ И СОХРАНЕНИИ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ В ВОПРОСАХ И ОТВЕТАХ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Руководитель авторского коллектива кандидат юридических наук Д.О. Сиваков Москва ИНФРА-М УДК 349 ФЗ Издание...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижневартовский государственный университет" Факультет экологии и инжиниринга Рабочая программа дисциплины (модуля) Б1.В.ДВ.4.2 Гео...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии К...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ У...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Учебная ознакомительная практика студентов II курса, специализирующихся на кафедре молекулярной биологии, является составной частью учебного процесса и направлена на подготовку квалифицированных...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 119-126. УДК 591.5:598.113.6 ЖИВОРОДЯЩАЯ ЯЩЕРИЦА, LACERTA VIVIPARA, КАК ИНТЕГРА...»

«Светлова Марина Всеволодовна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ПРИМОРСКИХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 25.00.36 – Геоэкология (Науки о Земле) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: д.г.н., профессор Денисов В...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Международный государственный экологический университет имени А. Д. Сахарова" А. С. Шиляев С. П. Кундас А. С. Стукин ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ УЛЬТРАЗВУКА В МЕДИЦИНЕ И ЭКОЛОГИИ Учебно-методическое пособие Рекомендовано к изданию УМО высших уче...»

«Приказ Минздрава России от 15.11.2012 N 927н Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пострадавшим с сочетанными, множественными и изолированными травмами, сопровождающимися шоком (Зарегистрировано в Минюсте России 21.01.2013 N 26634) Документ предоставлен Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки. Дата сохранения: 03.08.2015 Прика...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и прикладного значения химии в жизни обще...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Юргинский технологический институт Направление под...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА Vladimir Ya. Levanidov’s Biennial Memorial Meetings Вып. 5 ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЕ ФЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ САМОК И САМЦОВ СЕВЕРООХОТОМОРСКОЙ ГОРБУШИ ONCORHYNCHUS GORBUSCHA (WALBAUM) Г.А. Агапова Институт би...»

«Биология. 7 класс Пояснительная записка Рабочая программа составлена на основе Закона об образовании Российской Федерации от 29.12.1012 приказ №273/ФЗ, Федерального государственного образовательного стандарта основного общего образования, Федерального базисного учебного плана для общеобразовательных учреждений, Примерной програм...»

«Технология развития критического мышления(ТРКМ) на уроках биологии Учитель биологии Переладова Н.А. Соавторы-разработчики В основу этого подхода к обучению положены труды ученых с мировым именем: Джени Л. Стил Д. Дьюи Кертис С. Мередит Ж.Пиаже Технология (РКМЧП) была Чарльзом Темплом Л.С. Выготс...»

«Экологическое общество "Зеленое спасение" Республика Казахстан, Алматы, 2008 К Третьему совещанию сторон Орхусской конвенции For the Third Meeting of the Parties to the Aarhus Convention The Ecological Society Green Salvation The Republic of Kazakhstan, Almaty, 200...»

«Мензбирлік орнитологиялы оамы л-Фараби атындаы аза лтты университеті азастан Республикасы БМ К "Зоология институты" РМК СОЛТСТІК ЕУРАЗИЯНЫ XIV ХАЛЫАРАЛЫ ОРНИТОЛОГИЯЛЫ КОНФЕРЕНЦИЯСЫ (Алматы, 18-24 тамыз 2015 ж.) I. Тезистер Бізді демеушілеріміз: "Мензбирлік орнитологиялы оамы" "азастанны лтты географиялы оамы (Г) "азастан старынын орау...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.