WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 4 ] --

До настоящего времени в практике мирового здравоохранения отсутствует вакцина против менингококковой инфекции серогруппы В. Результаты, полученные авторами, позволяют предложить в качестве кандидата такой вакцины секретируемую менингококком и рядом других микробов IgA1 протеиназу, являющуюся фактором их патогенности. Для работы использовали очищенные препараты IgA1 протеиназы менингококков серогрупп А или серогруппы В. Было установлено, что оба полученных препарата обладают выраженной иммуногенной и протективной активностью в опытах на мышах, обеспечивая их защиту от заражения живыми вирулентными штаммами менингококков трех основных эпидемических серогрупп (А, В и С). Уровень специфических антител к IgA1 протеиназе, определяемых методом твердофазного ИФА, составлял 1:20 000–1:40 000. Защищенность иммунизированных мышей от заражения менингококком увеличивалась в 3 и более раз по сравнению с контрольными мышами, а число погибших животных составляло от 10 до 30%, по сравнению с 90% в контрольной группе.

Таким образом, показано, что IgA1 протеиназа, полученная из различных источников, обладает поливалентной активностью и способна эффективно защищать мышей от заражения живой менингококковой культурой гетерологичных серогрупп, а, следовательно, может рассматриваться как кандидат для создания поливалентной менингококковой вакцины.

Работа выполнена при финансовой поддержке госконтракта № 16.512.11.2110.

Секционные доклады 151

ПЕПТИДНЫЕ ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА С



Колесанова Е.Ф., Мойса А.А., Пындык Н.В., Фарафонова Т.Е., Фуников С.Ю., Соболев Б.Н., Арчаков А.И.

Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10 E-mail: Ekolesanova@yandex.ru Чрезвычайно высокая генетическая вариабельность и изменчивость оболочечных белков вируса гепатита С (ВГС) делает разработку средств вакцинопрофилактики вызываемого этим возбудителем заболевания непростой задачей. Одним из перспективных вариантов такого средства является синтетическая пептидная вакцина на основе фрагментов оболочечных белков вируса гепатита С (ВГС).

Пептидные иммуногены конструировали с использованием биоинформационных подходов, включающих анализ аминокислотных последовательностей оболочечных белков вируса гепатита С (ВГС), предсказание возможных В- и Т-эпитопов и вероятности формирования стабильных вторичных структур в молекулах пептидов. Пептиды синтезировали методом твердофазного синтеза.

Были получены 6 синтетических пептидных конструкций, каждая из которых состояла из двух высококонсервативных фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС.

Один из фрагментов представлял собой предсказанный in silico Т-хелперный эпитоп. Тестирование иммуногенности полученных пептидных конструкций на лабораторных животных показало, что они способны вызывать эффективную продукцию антител не только к самим конструкциям и входящим в их состав фрагментам, но и к целому оболочечному белку Е2 ВГС и гетеродимеру Е1Е2, причём даже в низких дозах (до 200 нг/животное). Пептидные В-Т-эпитопные конструкции в водном растворе образуют олигомеры размером 4–20 нм, что, возможно, способствует проявлению ими высокой иммуногенности. При иммунизации смесью пептидных конструкций титры антител к каждой отдельной конструкции были такими же, как и при иммунизации индивидуальными пептидами, но титры антител против целого белка Е2 и гетеродимера Е1Е2 при этом возрастали.

Полученные против синтетических пептидных конструкций антитела связывали вирусные частицы из плазмы крови больных гепатитом С, причём антитела против смеси конструкций практически не проявляли изолят-специфичности.





Создание пептидных иммуногенных конструкций является перспективным направлением разработки кандидатных вакцин против гепатита С и других возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих высокой генетической вариабельностью и генетической изменчивостью.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 07-04-12117офи и № 10-04-91054_НЦНИ.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПЕПТИДНЫЙ ФРАГМЕНТ 29-40 АМИНОКИСЛОТНОЙ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МОНОЦИТАРНОГО ХЕМОТАКСИЧЕСКОГО

БЕЛКА-1 (МСР-1) СТИМУЛИРУЕТ МИГРАЦИЮ МОНОЦИТОВ

Красникова Т.Л., Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Соколов В.О., Рулева Н.Ю., Пылаева Е.А., Азьмуко А.А., Сидорова М.В., Беспалова Ж.Д.

Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития РФ, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а E-mail: krasnikova@cardio.ru, tlkrasnikova@gmail.com Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) является одним из важнейших хемокинов, стимулирующих миграцию лейкоцитов и обладающих провоспалительным и ангиогенным действием. В связи с этим ингибиторы МСР-1 могут быть эффективны в терапии воспалительных и онкологических заболеваний. Ранее нами был разработан пептидный препарат Инграмон – фрагмент 65-76 С-концевого домена МСР-1 Н-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH, обладающий противовоспалительным действием у пациентов с атеросклерозом, подвергшихся стентированию коронарных артерий. Напротив, при инфаркте миокарда и ишемии периферических органов, когда важной задачей является стимуляция ангиогенеза, агонисты МСР-1, способные стимулировать миграцию моноцитов в зону ишемии, могут являться перспективными препаратами для медицины. Целью настоящей работы явился поиск пептидов – агонистов МСР-1. При компьютерном анализе первичной структуры МСР-1 был выявлен фрагмент 29-40 H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH, который вызывал миграцию моноцитов in vitro так же эффективно, как и МСР-1. Стимулирующее действие пептида на миграцию лейкоцитов было показано in vivo у крыс, как при подкожном введении самого пептида, так и при имплантации агарозных «таблеток» с пептидом. В модели ранозаживления у линейных крыс при использовании пептида отмечали более чистое состояние раневой поверхности и её более ровные края по сравнению с контролем. Согласно данным ИФА пептид IX в значительной степени ингибировал связывание МСР-1 с гепарином. По данным ДСН – электрофореза пептид IX в растворе образует гомодимеры и, возможно, олигомеры. Предполагается, что механизм действия пептида IX опосредован взаимодействием олигомеров пептида с гликозаминогликанами на поверхности клеток.

Работа выполнена при финансовой поддержке контракта правительства Москвы № 8/3-280н-10.

Секционные доклады 153

НОВЫЙ ПОДХОД К СОЗДАНИЮ УСТОЙЧИВЫХ

К ФЕРМЕНТАТИВНОМУ ГИДРОЛИЗУ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Валуева Т.А.1, Валуев Л.И.2, Валуев И.Л.2 Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2 Учреждение РАН Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 29

E-mail: valuevа@inbi.ras.ru

Природа создала практически непреодолимый барьер для проникновения полипептидов в кровоток при их прохождении через пищеварительную систему, в которой под действием протеолитических ферментов желудка и тонкого кишечника происходит гидролитическое расщепление белков до аминокислот. Вследствие этого для устранения дефицита в организме какого-либо полипептида его в виде раствора обычно вводят инъекционно, минуя пищеварительный тракт.

Эксперименты на модельных системах показали, что при разбавлении растворов полипептидов наблюдается повышение количества нативных форм, диффундирующих через ферментсодержащие мембраны. В опытах на животных показана принципиальная возможность проникновения в кровоток полипептидов при пероральном введении их разбавленных растворов. Так, подкожная инъекция раствора 10 ед. инсулина/кг массы животного приводила к снижению уровня глюкозы в крови на 60–75%. В то же время пероральное введение такого же количества инсулина в 1 мл воды не сопровождалось изменением уровня глюкозы в крови животных. Увеличение количества воды до 3.0, 5.0, 10.0 и 15.0 мл при сохранении дозы вводимого гормона приводило к статистически достоверному снижению уровня глюкозы в крови животных на 155, 277, 304 и 328% соответственно.

Таким образом, чем меньшей была концентрация полипептида в вводимом растворе, тем более ярким было гипогликемическое действие препарата.

Похожий эффект проникновения в кровоток наблюдали при пероральном введении кроликам раствора глюкагона – полипептида с молекулярной массой примерно 3500 Да, а также более высокомолекулярного полипептида – гормона роста с молекулярной массой 24000 Да.

Предположено, что использование разбавленных растворов полипептидов позволит разработать новую стратегию лечения некоторых заболеваний, в том числе сахарного диабета.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

Стендовые доклады 155

ТЕЗИСЫ СТЕНДОВЫХ ДОКЛАДОВ

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

10-ЦИСТЕИНОВЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ ПШЕНИЦЫ

TRITICUM KIHARAE: РОЛЬ В ОТВЕТЕ НА СТРЕСС И ПРОИСХОЖДЕНИЕ

Андреев Я.А.1, Коростылева Т.В.2, Одинцова Т.И.2, Егоров Ц.А.1, Гришин Е.В.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва, ул. Губкина, 3

E-mail: ay@land.ru

Для защиты от патогенов в растениях существует ряд защитных реакций, к которым относится конститутивный или индуцируемый синтез соединений с антимикробными свойствами, в том числе, антимикробных пептидов (АМП). Исследование АМП позволит лучше понять механизмы иммунитета растений при стрессовом воздействии, выделить наиболее перспективные для использования в защите растений соединения, использовать полученные данные для создания сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к фитопатогенным грибам, а также улучшения уже имеющихся сортов.

В семенах пшеницы Triticum kiharae были обнаружены два гевеин-подобных АМП WAMP-1a и WAMP-1b, различающихся одним аминокислотным остатком в С-концевой области и содержащих уникальный 10-цистеиновый мотив. Было показано, что WAMP-1a обладает широким спектром антимикробной и антигрибковой активности против как хитин-содержащих, так и не содержащих хитин патогенов растений.

Были определены последовательности кДНК и генов, кодирующих предшественник WAMP-1 и шесть его близких гомологов. Предшественники пептидов состоят из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Гены, кодирующие пептиды WAMP, не содержат интронов. Анализ последовательностей кДНК позволил предположить происхождение генов wamp из генов хитиназ.

По-видимому, в результате делеции и сдвига рамки считывания был утерян каталитический домен хитиназы, что привело к появлению генов wamp.

Биотические и абиотические факторы влияют на экспрессию генов wamp. Солевой стресс и взаимодействие с разными патогенными грибами приводит к индукции экспрессии, что предполагает важную роль пептидов WAMP в ответе на стресс. Так, при взаимодействии проростков пшеницы с патогенным грибом Aspergillus niger меняется не только уровень, но и профили экспрессии генов wamp. Впервые показана экспрессия генов гевеин-подобных АМП в ответ на солевой стресс.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРОТЕОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ УБИКВИТИНИРОВАННЫХ БЕЛКОВ

МИТОХОНДРИЙ МОЗГА МЫШИ В НОРМЕ И ПРИ ВВЕДЕНИИ

НЕЙРОТОКСИНА МРТР

Бунеева О.А.1, Копылов А.Т.1, Згода В.Г.1, Неробкова Л.Н.2, Капица И.Г.2, Непоклонов А.В., Медведев А.Е.

Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, Погодинская ул., 10 Учреждение РАМН НИИ фаpмакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва

E-mail: olga.buneeva@ibmc.msk.ru

В настоящее время становится все более очевидной роль митохондриальной дисфункции и нарушения деятельности убиквитин-протеасомной системы в развитии болезни Паркинсона. В связи с этим представляет интерес протеомный анализ убиквитинированных белков митохондрий мозга животных с экспериментальным паркинсонизмом.

Введение нейротоксина МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина) мышам С57BL/6 в дозе 30 мг/кг приводило к развитию характерных двигательных нарушений.

Убиквитинированные белки из митохондриальной фракции мозга мышей, извлеченного через 2 часа после инъекции, выделяли с использованием иммуноаффинного сорбента с иммобилизованными на протеин А-сефарозе антителами к убиквитину. Масс-спектрометрический анализ триптических фрагментов элюированных с иммуноаффинной колонки белков осуществляли с помощью обратнофазовой нанопроточной жидкостной хроматографической системы Agilent 1100 и масс-спектрометра Agilent XCT Ultra.

Введение МРТР приводило к увеличению числа белков, специфически связывающихся с иммуноаффинным сорбентом (49 против 34 в контроле), однако количество убиквитинированных белков внутреннего компартмента митохондрий менялось незначительно (7 против 9 в контроле). При этом в митохондриальной фракции животных, получивших инъекцию МРТР, появлялись белки теплового шока и цитоскелета, отсутствовавшие в контроле. Последнее, очевидно, отражает раннюю реакцию митохондрий мозга на введение нейротоксина.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-00530-а).

Стендовые доклады 159

СУБСТРАТ-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА C-КОНЦЕВЫХ МОДУЛЕЙ

ЛАМИНАРИНАЗЫ LIC16A CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM

Дворцов И.А., Лунина Н.А., Великодворская Г.А.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: dvortsov@img.ras.ru Гликозилгидролазы часто содержат некаталитические субстрат-связывающие модули (CBM) одного или разных семейств. Наличие комплекса CBM в составе фермента приводит к изменению качественных и количественных характеристик связывания – увеличению константы связывания на 1–2 порядка по сравнению с константами отдельных модулей (синергизм), связыванию с субстратами, к которым у отдельных модулей нет сродства, к мультивалентности связывания (связывание в нескольких сайтах субстрата/модуля одновременно) и т.п.

Исследование мультивалентных свойств CBM проводится нами на примере CBM ламинариназы Lic16A из Clostridium thermocellum. Свойства и функции фермента изучались нами ранее. Фермент является мультимодульной гликозилгидролазой, проявляющей наибольшую активность на растворимых субстратах лихенане и ламинарине. Помимо каталитического модуля, лидерного пептида и 3 гомологов протеинов S-слоя клеточной стенки, в его состав входят N-концевой CBM семейства 54, и расположенный на C-конце тандем из четырёх CBM семейства 4.

Модули семейства 4 проявляют сродство к ксилану, глюканам с -1,3- и смешанными -1,3-1,4-связями, аморфной, но не кристаллической, целлюлозе. Нами были проклонированы 4 отдельных C-концевых CBM и весь тандем, изучены их субстрат-связывающие свойства. Было получено, что все отдельные CBM проявляют сродство к ксилану (константа связи K~106 M-1), 1-ый, 2-ой и 3-ий CBM – к кристаллической целлюлозе и -1,3-глюкану клеточной стенки дрожжей (K~105 M-1), 3-ий и 4-ый CBM – к Avicel (аморфная целлюлоза) (K~103 M-1). Кроме того, 3-ий CBM показал сродство к пустулану (субстрат с -1,6-связями), а 4-ый CBM – к хитозану. 1-ый и 2-ой CBM не связывались с Avicel и пустуланом, а 4-ый CBM – с кристаллической целлюлозой и хитином (отличающимся от хитозана боковыми цепями). Связывание 3-го CBM как с кристаллической, так и с аморфной целлюлозой говорит о присутствии 2 независимых сайтов связывания. Субстрат-связывающие свойства 4-ый CBM проявляет только в виде своего димера, у мономера они отсутствуют. Исследуется синергизм при связывании всего тандема модулей.

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-00204-a.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ-МАРКЕРОВ

НЕОСМОТИЧЕСКОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ НАТРИЯ

У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ

Доброхотов И.В.1, Валеева О.А.1, Пастушкова Л.Х.1, Николаев Е.Н.2, Попов И.А.2, Кононихин А.С., Иванисенко В.А., Ларина И.М.

Учреждение РАН Государственный научный центр РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, 123007 Москва, Хорошевское ш., 76А Учреждение РАН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва Учреждение РАН Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

E-mail: hum.d@narod.ru

В последние годы было показано, что изменение содержания натрия в организме, при определенных условиях может не сопровождаться адекватными изменениями в содержании общей воды тела, что противоречит классической теории водно-солевого обмена. Была выдвинута гипотеза о возможности изменения депо сухого натрия в организме на фоне изменения уровня его потребления или даже без такового. Анализ современного состояния данного вопроса позволил составить список белков-кандидатов, физиологическая роль которых может быть связана с сухим депонированием натрия в организме и которые определяются в моче протеомными методами.

Целью работы была оценка динамики изменения в моче предполагаемых белков-маркеров неосмотического депонирования натрия у 6 здоровых добровольцев во время их жизнедеятельности в изолированном гермообъекте в течение 105 суток. Сбор и подготовка к анализу образцов осуществлялись согласно стандартному протоколу, после чего был проведён хромато-масс-спектрометрический анализ образцов мочи на гибридном масс-спектрометре ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье LTQ FT MS фирмы Thermo, в котором было идентифицировано около 700 белков. Были выявлены белки-маркеры активизации депонирования натрия в соединительной ткани, такие как синдекан IV – 21628,03Da, дерматопонтин – 24559,01Da, Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein – 479247,56Da и ряд других.

Кроме того, с помощью программы ANDCell были построены сети взаимодействий между белками, динамически отвечающими на изменение потребляемого испытателями натрия и основными компонентами соединительной ткани, участвующими в его депонировании. В результате, для исследуемых белков, были обнаружены как прямые связи (белок-белок), так и воссозданы связи через одного посредника (белок-компонент соединительной ткани-белок).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 09-04-12225-офи_м, 2009–2010 гг.

Стендовые доклады 161

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ

ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ-СОДЕРЖАЩИХ ПРОТЕОГЛИКАНОВ

КУЛЬТУРЫ МИОБЛАСТОВ L6J1

Ермакова И.И.1,2, Сакута Г.А.1, Федорова М.A.3, Морозов В.И.1 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, С.-Петербург Учреждение РАН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, С.-Петербург Leipzig University, Institute of Bioanalytical Chemistry, Faculty of Chemistry and Mineralogy, Leipzig, Germany

E-mail: irinabiochem@mail.ru

Регенерация мышечной ткани – сложный процесс, важными этапами которого являются активация, пролиферация, миграция и дифференцировка стволовых клеток скелетных мышц – миобластов. В этот процесс вовлекаются различные регуляторные молекулы, в том числе и протеогликаны (ПГ) – компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ), состоящие из корового белка, связанного с одной или более полисахаридными цепями – гликозаминогликанами (ГАГ). Важными элементами в цепи событий, составляющих миогенез, являются межклеточное узнавание и адгезия миобластов. Цель настоящей работы состояла в выделении и характеристике основных хондроитинсульфат-содержащих ПГ культуры трансформированных миобластов крысы L6J1, а также изучении влияния ПГ на адгезию этих клеток.

Выделение ПГ проводили с помощью анионообменного сорбента Q-сефароза из трех компонентов культуры миобластов L6J1 – культуральной среды, ВКМ и клеток. Элюция сорбированного материала в градиенте NaCl позволила отделить ПГ от основной массы белков, элюируемых при низкой концентрации соли. С помощью ферментов хондроитиназы и гепариназы, специфически расщепляющих цепи ГАГ, было показано, что преобладающим классом ПГ во всех составляющих клеточной культуры являются хондритин/дерматансульфаты. Коровые белки ПГ, выявленные в результате обработки указанными ферментами и последующего электрофореза SDS-PAGE, подвергали масс-спектрометрическому анализу MALDI-TOF. Были идентифицированы следующие хондроитинсульфат-содержащие ПГ: версикан – в ВКМ, бигликан, коллаген XII («part-time» ПГ) и интер-альфа-ингибитор трипсина – в культуральной среде. В опытах по изучению влияния ПГ на клеточную адгезию было показано, что миобласты не прикрепляются и не распластываются на субстрате, состоящем из смеси фибронектина и ПГ ВКМ или ПГ культуральной среды. Предварительная обработка такого субстрата хондроитиназой привела к нормализации адгезии и распластывания миобластов, что указывает на участие цепей ГАГ в подавлении адгезии этих клеток.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОСКЕЛЕТНОГО БЕЛКА ЗИКСИНА

С РЕЦЕПТОРОМ HEDGEHOG КАСКАДА PATCHED 2

В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ ЦНС XENOPUS LAEVIS

Мартынова Н.Ю., Ермолина Л.В., Зарайский А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: m61@hotmai.ru В результате поиска белковых партнёров цитоскелетного белка зиксин у шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) при помощи двугибридной дрожжевой системы мы идентифицировали трансмембранный рецептор hedgehog-сигнального каскада – Patched2 (Ptc2). Hedgehog-сигнальный каскад регулирует многие процессы клеточной дифференцировки в эмбриональном развитии. В частности, дифференцировку клеток в зачатке центральной нервной системы (ЦНС). В тоже время, основная функция зиксина – регуляция динамики актинового цитоскелета и морфогенетических движений клеток. Однако в некоторых случаях зиксин может перемещаться в ядро и модулировать экспрессию специфических генов. В связи с этим, изучение взаимодействия зиксина с рецептором сигнального каскада hedgehog важно для понимания координации дифференцировки и морфогенетических движений клеток – двух основных процессов, необходимых для нормального эмбрионального развития ЦНС.

Способность зиксина взаимодействовать с рецептором Ptc2 была подтверждена нами в серии экспериментов по осаждению комплекса гибридных белков и их делеционных мутантов из лизата зародышей шпорцевой лягушки. Было показано, что взаимодействие этих белков обусловлено способностью второго Lim-домена зиксина связываться с фрагментом С-концевого цитоплазматического примембранного участка Рtc2 из шпорцевой лягушки (с 1220 по 1312 а.о). Мы также подтвердили взаимодействие второго Lim-домена гомолога зиксина человека с Сконцевой областью человеческого прямого гомолога Ptc2 из шпорцевой лягушки – Ptc1. Полученные данные позволяют предположить наличие эволюционно консервативного молекулярного механизма регуляции зиксином сигнального каскада hedgehog.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского фонда фундаментальных исследований.

Стендовые доклады 163

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО РЕГУЛЯТОРА SохD

С ГОМЕОДОМЕННЫМ ФАКТОРОМ XANF1 В РАННЕМ РАЗВИТИИ

ПЕРЕДНЕГО МОЗГА У ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ

Мартынова Н.Ю., Ерошкин Ф.М., Зарайский А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: m61@hotmai.ru В экспериментах по изучению цис-регуляторных элементов в составе промотора гена Xanf1, кодирующего гомеодоменный транскрипционный регулятор развития переднего мозга у шпорцевой лягушки, нами был выявлен потенциальный сайт связывания транскрипционных факторов семейства Sox.

С использованием EMSA-метода мы показали, что напрямую связываться с регуляторным элементом промотора может один из представителей семейства Sox-факторов, транскрипционный регулятор SoxD. Гены семейства SOX регулируют ранние этапы дифференцировки нервной пластинки и кодируют HMG-доменный белки, которые часто проявляют активность в результате взаимодействия с другими транскрипционными регуляторами. При помощи двугибридной дрожжевой системы мы установили, что фактор SoxD, может физически взаимодействовать с белком Xanf1. Кроме того, в модельной дрожжевой системе SoxD проявлял свойства сильного активатора транскрипции. Взаимодействие транскрипционных регуляторов SoxD и Xanf1 было подтверждено методом ко-иммунопреципитации. Полученные данные позволяют предложить гипотетический механизм, позволяющий избежать эффекта само-репрессирования гена Xanf1 в переднеголовной области нервной пластинки, где в нормальном развитии наблюдается высокий уровень экспрессии Xanf1 и SoxD. Как было показано ранее, Xanf1, связываясь с регуляторным участком собственного промотора, блокирует экспрессию собственного гена. Однако SoxD, образуя комплекс с белком Xanf1, мог бы выполнять функцию ингибитора подобной само-репрессорной активности белка Xanf1.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРОТЕОМНЫЙ СОСТАВ И ФУНКЦИИ

РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВОЙ ОРГАНЕЛЛЫ PING-BODY,

ОБНАРУЖЕННОЙ В ПЕРВИЧНЫХ СПЕРМАТОЦИТАХ

DROSOPHILA MELANOGASTER

Оленина Л.В., Кибанов М.В., Егорова К.С., Рязанский С.С., Соколова О.А., Котов А.А., Оленкина О.М., Гвоздев В.А.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: olenina_ludmila@mail.ru Эволюционно консервативный механизм piРНК-сайленсинга с участием коротких 25-30 н. piРНК молекул предотвращает экспрессию нежелательных элементов генома, таких как ретротранспозоны и повторяющиеся гены в герминальных тканях эукариот. Белки, отвечающие за его реализацию, сконцентрированы в околоядерных рибонуклеопротеиновых гранулах, образующих особую структуру – nuage. С помощью конфокальной микроскопии иммуноокрашенных семенников Drosophila мы обнаружили в первичных сперматоцитах наряду с обычными гранулами nuage новую более крупную структуру, одну на клетку, названную нами piNG-bogy. Мы показали, что эта структура является основным местом локализации белков piРНК-сайленсинга, Aubergine, AGO3, Vasa, Tudor, Squash, Spindle-E, Cutoff, а также ряда белков микроРНК-сайленсинга, таких как AGO1 и Belle. Размеры piNG-bogy (2,38±0,35 мкм) позволили нам разрешить его внутреннюю структуру и выявить компартментализацию его компонентов. Ключевые белки piРНК-сайленсинга, Aubergine и AGO3, расположены в неперекрывающихся зонах на периферии piNG-bogy и в его центре, соответственно. Мутационный анализ показал, что мутации aubergine, ago 3 и vasa приводили к исчезновению piNG-bogy и гиперэкспрессии тандемных генов Stellate, в норме репрессированных с помощью piРНК-сайленсинга. Известно, что функциональность Aubergine и AGO3 зависит от симметричного метилирования остатков аргинина в N-концевых участках этих белков. На фоне мутации гена dart 5, кодирующего аргининметилтрансферазу, ответственную за метилирование Aubergine и AGO3, мы наблюдали распад piNG-bogy, сопровождающийся дерепрессией генов Stellate и исчезновением piРНК. Мы полагаем, что piNG-bogy является центром piРНК-процессинга в сперматоцитах D. melanogaster, а выявленная внутренняя организация способствует быстрому и эффективному образованию пула piРНК.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта РФФИ № 10-04-00535-а.

Стендовые доклады 165

ПОЛУЧЕНИЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И БЕЛКОВЫХ

ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ ГИДРОБИОНТОВ БАРЕНЦЕВА МОРЯ

Рысакова К.С., Лыжов И.И., Новиков В.Ю.

Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ПИНРО), 183038 Мурманск, ул. Книповича, 6 E-mail: rysakova@pinro.ru Гиалуроновая кислота (ГК) является основным компонентом внеклеточного матрикса, входит в состав многих биологических тканей и жидкостей. В связи с возрастающим интересом к данному полимеру, представляется интересным проведение исследований по содержанию ГК в различных органах и тканях гидробионтов.

В работе использовались различные ткани (глаза, шкуры, хребты) 3 видов рыб:

черного палтуса (Reinhardtius hippoglossoides), атлантической трески (Gadus morhua) и камбалы (Pleuronectes platessa).

Исходную ткань обрабатывали 0,2 моль/л раствором NaOH, после нейтрализации 0,1 моль/л уксусной кислотой проводили ферментативный гидролиз белков препаратом, полученным из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus. Из полученного гидролизата высокомолекулярные полисахариды осаждали двойным объемом этилового спирта и затем сушили на воздухе.

Содержание ГК в полученных препаратах проводилось методом ВЭЖХ (по выходу глюкозамина) и спектрофотометрическим методом количественного определения гексуроновых кислот (метод Дише). Наибольшее содержание ГК наблюдалось в препаратах, выделенных из хрящевой ткани хребтов.

Предпринята попытка разработки нового метода получения гиалуроновой кислоты из отходов рыбного промысла. Показано, что наибольший выход ГК наблюдался при обработке сырья щелочью, а затем ферментным препаратом. Ранее существовали 2 варианта получения ГК: 3-кратная экстракция гиалуроновой кислоты из измельченных петушиных гребней водно-хлороформенным раствором, и 2-кратная экстракция сырья водным раствором н-пропилового или трет-бутилового спирта с дальнейшим добавлением хлорид натрия до расслоения системы и осаждением из данной системы гиалуроновой кислоты (патент RU 2017751).

Таким образом, ферментативный гидролиз может быть использован для получения белковых гидролизатов и препарата гиалуроновой кислоты. Показано, что источниками выделения ГК могут служить отходы переработки рыб и предложен новый метод выделения гиалуроновой кислоты.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОДУКТА ГЕНА 145 НА ЧАСТИЦЕ БАКТЕРИОФАГА

phiKZ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Сыкилинда Н.Н., Курочкина Л.П., Кадыков В.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: sykilinda@mail.ru Бактериофаг phiKZ – один из самых больших и сложноустроенных вирусов семейства Myoviridae, инфицирует условно патогенные для человека и животных штаммы Pseudomonas aeruginosa, устойчивые к широкому спектру антибиотиков.

Определение генома бактериофага phiKZ [1] обусловило возросшее внимание к гигантским фагам как со стороны фундаментальной, так и прикладной науки. Поскольку phiKZ-подобные бактериофаги входят в состав фаговых смесей, используемых в терапии псевдомонадных инфекций, требуется тщательное изучение их молекулярно- биологических свойств.

Геном бактериофага phiKZ составляет 280334 п.н. и содержит 306 открытых рамок считывания. На основании гомологии с генами других организмов идентифицировано лишь 59 фаговых белков. Из 38 структурных белков идентифицированы: продукт гена (пг) 120 (основной белок капсида), пг29 (хвостовой чехольный белок), пг30 (белок хвостового cтержня), пг144 (литическая трансгликозилаза) и пг181 (пептидогликан гидролаза).

Целью данной работы явилась локализация одного из мажорных структурных белков вирусной частицы – пг145 (84 кДа). На основании сравнительного анализа белков интактного фага и термочувствительного мутанта phiKZ, продуцирующего капсид, установлено, что пг145 является белком капсида. Нами был сконструирован плазмидный вектор для экспрессии гена 145 в клетках E.coli и отработаны условия для получения его продукта в растворимой форме. Разработан метод очистки рекомбинантного белка. Получены поликлональные антитела на пг145. На препарате очищенного бактериофага phiKZ с использованием полученных антител проведена иммуноэлектронная микроскопия. Установлено, что пг145 локализован в вершинах капсида. С помощью иммуноблоттинга показано также, что ряд phiKZ-подобных фагов содержит структурный белок, гомологичный пг145.

Литература

1. Mesyanzhinov, V.V., Robben, J., Grymonprez, B., Kostyuchenko, V.A., Bourkaltseva, M.V., Sykilinda, N.N., Krylov, V.V., Volckaert, G. (2002) The genome of bacteriophage KZ of Pseudomonas aeruginosa. J. Mol. Biol. 317, 1–19.

Стендовые доклады 167

ПОИСК БЕЛКОВ-ПАРТНЁРОВ МАЛОЙ ГТФазы НОВОГО СЕМЕЙСТВА

RAS-DVA Терёшина М.Б., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: ma-treshka@yandex.ru Недавно нами была описана новая группа малых ГТФаз, Ras-dva. Исследования роли малой ГТФазы Ras-dva-1 в процессе эмбрионального развития зародышей позвоночных на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis показали, что её нормальное функционирование необходимо на начальных этапах формирования и развития головного мозга, органов чувств и производных нервного гребня (жаберных дуг). В настоящей работе для выяснения молекулярных функций Rasdva-1 мы провели поиск белков-партнёров этой малой ГТФазы с помощью дрожжевой двугибридной системы в экспрессионной кДНК библиотеке эмбрионов шпорцевой лягушки на стадии ранней нейрулы (ст.12,5-14).

Среди идентифицированных в результате проведенного скрининга 52-х клонов одним из наиболее представленных оказался клон, содержащий кДНК легкой цепи клатрина – белка, участвующего в процессе сборки т.н. «клатриновой оболочки» на формирующихся эндоцитозных везикулах. Кроме того, данный белок регулирует взаимодействия между везикулами и элементами цитоскелета (актиновыми филаментами). Дальнейшие эксперименты по перекрестной смене векторов с последующей ко-трансфекцией в дрожжи и ко-иммунопреципитации в зародышах шпорцевой лягушки подтвердили взаимодействие между Ras-dva-1 и легкой цепью клатрина. Реальность такого взаимодействия в эмбриогенезе была также подтверждена результатами анализа экспрессии гена легкой цепи клатрина в целых эмбрионах шпорцевой лягушки, которые выявили повышенную концентрацию транскриптов этого гена в клетках тех же областей, где наблюдается экспрессия гена малой ГТФазы Ras-dva. Результаты настоящей работы хорошо согласуются с ранее полученными данными о примембранной локализации белка Ras-dva-1 и специфической экспрессии его гена в клетках различных органов эмбрионов шпорцевой лягушки, обладающих повышенной эндо/экзоцитозной активностью.

Таким образом, логично предположить, что в клетке малая ГТФаза Ras-dva-1 вовлечена в регуляцию процессов везикулярного переноса (эндо/экзоцитоза).

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и РФФИ.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРОТЕОМА КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА

Трифонова О.П.1, Пахарукова Н.А.1, Пастушкова Л.Х.1, Мошковский С.А.2, Лисица А.В., Ларина И.М.

Учреждение РАН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, 123007 Москва, Хорошевское ш., 76А Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10

E-mail: oxana.trifonova@gmail.com

Одной из главных задач диагностической протеомики является сравнительный анализ биологических жидкостей здоровых людей и пациентов различных нозологических групп с целью поиска новых высокоспецифичных биомаркеров. Однако медицинское применение результатов протеомного анализа осложняется как значительными популяционными различиями, так и ограничениями существующих технологических платформ. Задачей данного исследования было оценить пределы изменчивости протеома крови в группе здоровых добровольцев, признанных здоровыми в результате углубленного медицинского освидетельствования.

Образцы плазмы и сыворотки крови анализировались: (1) методом двумерного электрофореза (2-DE) после удаления мажорных белков и концентрирования минорных с помощью микрогранул ProteoMinerTM (Bio-Rad) и (2) методом прямого масс-спектрометрического (МС) профилирования после префракционирования на магнитных частицах MB WCX с помощью робота ClinProt (Bruker Daltonics).

Обнаружено, что протеом сыворотки и плазмы крови здоровых лиц характеризуется значительной как внутри-, так и межиндивидуальной вариабельностью.

Причем межиндивидуальные различия значительно превысили внутрииндивидуальные изменения уровня содержания белков крови с течением времени. Большой разброс среди изученной группы здоровых мужчин имели следующие белки – фибриноген - и -цепи, тромбоцитарный фактор IV, 2-микроглобулин, цистатин С, аполипопротеины A-I, A-IV, Е и C-I, фрагменты фактора С3 и С4 комплемента и другие. Среди этих белков – аполипопротеины A-I, Е и C-I и цистатин С отличались и наибольшей индивидуальной изменчивостью во времени. Для некоторых белков было характерно увеличение дисперсии с возрастом. Данные результаты позволяют предположить, что эти белки не могут рассматриваться в качестве очевидных биомаркеров и должны быть тщательно исследованы в последующих более масштабных работах.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы ОБН РАН.

Стендовые доклады 169

–  –  –

Химия белков и пептидов.

Методы синтеза, химическая модификация V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

УДОБНЫЙ И ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ВВЕДЕНИЯ

NIND-ФОРМИЛЬНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ В МОЛЕКУЛУ ТРИПТОФАНА

И НОВАЯ ПОБОЧНАЯ РЕАКЦИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

H-Trp(NIND-For)-OH В ТВЁРДОФАЗНОМ ПЕПТИДНОМ СИНТЕЗЕ Азев В.Н., Чулин А.Н., Мустаева Л.Г., Горбунова Е.Ю., Родионов И.Л.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: viatcheslav.azev@fibkh.serpukhov.su Триптофан, защищённый Nind-формильной группой, нашёл широкое применение в химическом синтезе пептидов. Классический способ введения этой защитной группы в индольное кольцо имеет недостаток в необходимости наличия специального оборудования для насыщения реакционной смеси сухим газообразным хлористым водородом. Мы осуществили формилирование триптофана муравьиной кислотой в присутствииии бромистого водорода, генерируемого in situ из муравьиной кислоты и трибромида фосфора или бромтриметилсилана. Предложенный метод отличается удобством осуществления процесса и высоким выходом продуктов. Данный подход распространен на ряд 3-алкилиндолов.

Известно, что лабильность Nind-формильной защитной группы по отношению к нуклеофилам проявляется в виде побочной реакции формилирования свободной аминогруппы лизина. Мы обнаружили, что растущая цепь пептидилполимера может быть подвержена терминированию формильной группой из остатка Trp(NindFor), находящегося на полимере. Нами предложены условия проведения процесса наращивания цепи пептидилполимера, которые позволили свести к минимуму появление продуктов терминирования.

Стендовые доклады 171 ПЕПТИД m 879 – ИНГИБИТОР ИНТЕГРАЗЫ ИЗ HIV-I Елякова Л.А., Васьковский Б.В., Ванцева С.И., Гаранин С.К.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: svetvan@yandex.ru Предварительная работа по установлению структур пептидов-ингибиторов: m 673, YPIEMeHis [1] (I ревертазы, IC50 10-7М); m 683, DLHSerHAQ [2] и m 727, YAGFLR [3] (I интегразы, IC50 3х10-5М и 10-4M, соответственно) – показала, что в состав проявивших активность (ИА) по отношению к интегразе из HIV-I входило ещё вещество m 879. Сиквенс (6 шагов) дал последовательность Ser-Asp-Ser-Arg-Val-Gly. УФспектр пептида показал наличие в нём Phe; тогда недостающей АК должна быть m 113 (Leu, Ileu). Далее (при отсутствии наиболее активного пептида m 673 [1]) в «слепом» опыте было показано, что при 40-кратном разбавлении сохранили ИА лишь образцы, в которых присутствовала m 879 (IC50 8х10-6 М). Масс-фрагментация дала массы 879439,486,544,574,586,600,615,643,714,732,756,861.

Эти масс-фрагменты дают структуру:

SER – ASP – SER – ARG – VAL – GLY – LEU – PHE Вероятно, m 439 представляет собой двухзарядный ион от m 879. Фрагменты b8,b7, b6, b5,b4 имеют массы m 861,714,601,544 и 445, из чего собирается частичная последовательность …Phe-Leu-Gly-Val... Интересно, что из остальных данных, где аминокислоты находятся в ацетатной форме (m+42), m 756,643,586 и 487 – снова собирается часть последовательности с С-конца …VAL-GLY-LEU-… Для фрагмента ARG-VAL-GLY-LEU-PHE, наряду с нормальной формой (m 573), была получена и его ацетатная форма (m 615).

Литература

1. Елякова Л.А., Васьковский Б.В., Бочаров Э.В., Туницкая В.Л., Кочетков С.Н., Еляков Г.Б.

Патент РФ № 2314818. Опубл. 20.01.2008. Бюлл. № 2.

2. Елякова Л.А., Васьковский Б.В., Хорошилова Н.И., Ванцева С.И., Агапкина Ю.Ю. Биоорган. химия (2011) 37(2), 233–243.

3. Елякова Л.А., Васьковский Б.В., Ванцева С.И., Гаранин С.К. Химия природ. соедин.

(2011), в печати.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ КОНЪЮГАТОВ АРГИНИНСОДЕРЖАЩИХ

ПЕПТИДОВ С ГЕМИНОМ И ИХ АНТИГРИБКОВАЯ АКТИВНОСТЬ

Желтухина Г.А.1, Окороченков С.А.1, Арзуманян В.Г.2, Небольсин В.Е.3 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 119571 Москва, просп. Вернадского, 86 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 105064 Москва, Малый Казенный пер., 5а ООО «Фарминтерпрайсез», 119571 Москва, просп. Вернадского, 86

E-mail: laboratory211@yandex.ru

В связи с развитием резистентности грибов к уже существующим антибиотикам и антигрибковым средствам, а также недостаточной эффективностью и токсичностью последних проводится поиск новых антигрибковых агентов среди различных классов соединений, в том числе пептидов.

Целью данной работы явилось создание антигрибковых агентов на основе конъюгатов природных соединений: гемина, пептидов и их аналогов, выявление их биологической активности, исследование взаимосвязи между структурой и активностью в ряду полученных соединений.

В ряду синтезированных конъюгатов гемина (КГ) наиболее высокую активность в отношении дрожжеподобных грибов С. albicans проявил дизамещенный разветвленный КГ, содержащий 4 остатка эфира аргинина. Производные монозамещенного гемина, содержащего линейные три – гексапептиды с одним – тремя остатками аргинина, активности не проявили (RGD, combi-1). Конъюгат гемина с гексапептидом combi-1 был успешно синтезирован твердофазным методом по Fmoc-стратегии на полимере с тритилхлоридной якорной группой с использованием незащищенного по гуанидину производного аргинина. Пептид RGD и соответствующий КГ HemRGD получены нами по оригинальным схемам в растворе с высокими выходами с применением Z3ArgOH, метода смешанных ангидридов и силилирования. Показано, что синтез Hem(Glu(ArgOMe)ArgOMe)2 путем ступенчатого присоединения отдельных аминокислот к активированному эфиру гемина является более эффективным по сравнению с присоединением пептида Glu(ArgOMe)ArgOMe.

Таким образом, разветвленная структура, присутствие заместителей по двум пропионовокислым остаткам гемина, наличие нескольких положительно заряженных остатков аргинина способствуют проявлению антигрибковой активности.

Стендовые доклады 173

N-АЦИЛИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ИНСУЛИНА

И ЕГО ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ АНАЛОГОВ

Зинченко А.А., Мелихова Т.Д., Гордеева Е.А., Нокель Е.А., Красильщикова М.С., Михалев А.В., Зиганшин Р.Х., Шибанова Е.Д.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ГСП-7, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: alezin@ibch.ru Перспективным путем повышения эффективности терапевтических белков вообще и противодиабетических пептидных препаратов, в частности, является химическая модификация белковых молекул, позволяющая получать соединения с новыми физиологическими свойствами. Целью настоящей работы было изучение условий синтеза N-ацилированных 3-(4-карбоксибутил)-1,2-дитиоланом три-замещенных производных инсулина человека и его генно-инженерных аналогов, инсулинов лизпро и аспарт, доказательство структуры и исследование некоторых свойств полученных соединений. В качестве ацилирующего агента использовали активированный оксисукцинимидный эфир -липоевой кислоты. Реакции проводили в различных средах, варьируя концентрации и соотношения компонентов, температуру, рН и время реакции. Течение реакций контролировали ОФ ВЭЖХ.

Хроматографическую очистку N-ацилированных инсулинов осуществляли в две стадии, с использованием ионообменной хроматографии низкого давления и обращеннофазовой ВЭЖХ. Структуру полученных соединений доказывали массспектрометрическим анализом, пептидным картированием и титрованием свободных аминогрупп. Стабильность полученных соединений в условиях протеолиза исследовали в растворах с физиологическими концентрациями трипсина, химотрипсина и пепсина, контроль гидролиза осуществляли методом ОФ ВЭЖХ по убыванию исходных соединений. Биологическую активность N-ацилированных инсулинов определяли по снижению концентрации глюкозы в крови нормальных мышей после подкожного введения растворов соответствующих препаратов, концентрацию глюкозы в плазме крови определяли глюкозооксидазным методом.

В результате проведенных исследований разработаны способы получения три-NA1,NB1,NB29-липоилзамещенных производных инсулина человека, инсулина аспарт и инсулина лизпро с хроматографической (ОФ ВЭЖХ) чистотой (93±3)%. Показано, что полученные соединения проявляют повышенную, в сравнении с исходными инсулинами, устойчивость к протеолизу, обладают высокой гипогликемической активностью и увеличенной длительностью гипогликемического действия.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СИНТЕЗ ГК-2 – ДИПЕПТИДНОГО ДИМЕРНОГО МИМЕТИКА ФАКТОРА

РОСТА НЕРВОВ

Курилов Д.В., Помогайбо С.В., Гудашева Т.А.

Учреждение РАМН НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 E-mail: kur-dv@mail.ru В НИИ фармакологии РАМН сконструирована и синтезирована группа дипептидных димерных миметиков фактора роста нервов (NGF), для которых in vitro на клеточных моделях была показана нейропротективная активность [1].

Из этой группы для развития в качестве лекарственного препарата был отобран дипептидный димерный миметик -изгиба 4-ой петли NGF, гексаметилендиамид бис-(моносукцинил-глутамил-лизина) [(HOOC-(CH2)2-CO-Glu-Lys-NHCH2)3-]2, получивший шифр ГК-2. В связи с этим возникла необходимость разработать оптимальный синтетический подход к получению ГК-2, который должен лечь в основу лабораторного регламента. Были реализованы две схемы синтеза. В обеих схемах применён метод активированных оксисукцинимидных эфиров в растворе. В схеме I использовали стратегию Z(Bzl)-защиты боковых радикалов и наращивание пептидной цепи проводили с N-конца. При этом сукцинильный остаток вводили на первой стадии с помощью оксисукцинимидного эфира монозащищенной янтарной кислоты, а гексаметиленовый спейсер присоединяли на последних стадиях синтеза. В схеме II использовали стратегию Z/Boc-защитных групп и наращивание пептидной цепи проводили с C-конца. В этом случае гексаметиленовый спейсер вводили на первой стадии, а сукцинильный остаток – на финальных стадиях синтеза посредством ацилирования гексаметилендиамида бис-дипептида янтарным ангидридом. Удаление защитных групп осуществляли классическими способами. Для очистки целевого продукта применяли ВЭЖХ и ионообменную хроматографию. В обеих схемах синтеза диастереомерная чистота ГК-2 была не менее 98% (по данным 1H ЯМР-спектроскопии), и наблюдались совпадающие величины удельных углов оптического вращения.

На основании данных по выходам, временным затратам и стоимости реагентов для синтеза пептида ГК-2 в качестве оптимальной выбрана схема II.

Литература

1. Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Докл. Акад. Наук (2010) 434(4), 549–552.

Стендовые доклады 175

ИНГИБИТОРЫ КАСПАЗ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ

ПЕПТИДОМЕТИЛКЕТОНОВ

Мартинович В.П.1, Грибовская О.В.1, Голубович В.П.1, Бурая Т.А.1, Янченко В.В.2 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141 Минск, ул. Акад. Купревича, 5/2, Беларусь Витебский государственный медицинский университет, 210602 Витебск, ул. Фрунзе, 27, Беларусь

E-mail: vermar@iboch.bas-net.by

Регуляция активности каспаз – цистеиновых протеиназ, главных исполнителей апоптоза, с использованием синтетических ингибиторов представляется перспективным путем создания препаратов для лечения различных сосудистых, нейродегенеративных и других видов расстройств, сопровождающихся клеточной гибелью. Среди синтезированных к настоящему времени ингибиторов особый интерес вызывают производные пептидокетонов, которые способны ацилировать активный центр каспаз, образованный каталитической диадой (остатки His237 и Cys285), проявляя свойства обратимых ингибиторов.

Целью настоящего исследования являлось создание новых ингибиторов каспаз, относящихся к пептидометилкетонам с ацильными заместителями в кетометильной группе. В качестве базовой пептидной структуры был выбран дипептидный фрагмент валил-аспарагинил, основная часть субстратной последовательности (P2-Р1) каспазы-3, с N-карбобензоксизащитой по -аминогруппе. Полупродуктом при синтезе кетопроизводных служил бромметилпептидокетон Z-ValAsp(Me)-CH2Br, который был получен из соответствующего диазокетона; для замены N2 на Br использовали раствор HBr в уксусной кислоте. Ацилированные производные метилкетонов получалали по методу Крантца [1], в котором катализатором для замещения брома на ацильный остаток служит KF. Структура соединений общей формулы Z-Val-Asp(Me)-CH2Ас, где Ас – остатки ароматических и алифатических кислот, была подтверждена методами масс-спектрометрии и ЯМРспектрометрии.

Влияние синтезированных соединений на выживаемость клеток исследовали на модели апоптоза лейкоцитов. Наряду с ингибированием апоптоза были отмечены парадоксальные эффекты его индукции, возможные причины этого явления обсуждаются.

Работа была выполнена при поддержке гранта БРФФИ №Х09-044.

Литература

1. Krantz A., Copp J.L., Coles J.P. Biochemistry (1991) 30, 4678–4687.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОБОЧНЫЕ РЕАКЦИИ В ХОДЕ СИНТЕЗА АПЕЛИНА-12

И ЕГО АНАЛОГОВ И ПУТИ ИХ ПРЕОДОЛЕНИЯ

Палькеева М.Е., Сидорова М.В., Азьмуко А.А., Молокоедов А.С., Бушуев В.Н., Беспалова Ж.Д.

Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития РФ, 121552 Москва, 3-я Черепковская ул., 15а E-mail: peptide1@cardio.ru В настоящее время твердофазный синтез (ТФС) 20–25-членных пептидов представляется рутинной задачей, и побочные реакции на стадии заключительного деблокирования и отщепления от носителя пептидов являются обычным и хорошо описанным феноменом.

Образующиеся при действии TFA карбокатионы алкилируют такие чувствительные аминокислотные остатки как Trp, Cys, Tyr, Met, происходит также ацидолитическое окисление Met до соответствующего сульфоксида; некоторые побочные реакции обусловлены алкилированием чувствительных аминокислот продуктами разрушения якорных групп полимера Ванга или амидного полимера Ринка. Часто подобные побочные реакции драматически отражаются на качестве продукта ТФС и существенно осложняют его очистку. Поэтому в каждом конкретном случае зачастую приходится проводить специальное исследование с целью минимизации образования нежелательных побочных продуктов.

При синтезе вазоактивных додекапептидов – апелина-12 H-Arg-Pro-Arg-Leu-SerHis-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-OH и четырех его протеолитически устойчивых аналогов мы столкнулись с побочными реакциями при действии TFA. Пептиды получали с использованием Fmoc-технологии, очищали с помощью ВЭЖХ, структуру подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Нами было установлено, что в процессе заключительного деблокирования апелина-12 и его аналогов происходит сульфатирование гидроксильной группы остатка Ser с образованием соответствующего сложного эфира. При этом донором сульфогруппы служит сульфо-фрагмент отщепляющихся Pmc-защит остатков Arg. Количество побочного продукта зависит от наличия воды в составе деблокирующей смеси.

Кроме того, при синтезе амидов апелина заключительное отщепление защит сопровождается образованием побочного 4-гидроксибензиламида соответствующего пептида, содержание которого в реакционной смеси колеблется от 20 до 8% (по ВЭЖХ) и также зависит от состава деблокирующей смеси. Обсуждаются пути подавления побочных реакций сульфатирования серина и алкилирования С-концевой амидной функции пептида Стендовые доклады 177

ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИАНИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ

ДЭЦ С АЛЬБУМИНОМ ЧЕЛОВЕКА, НО НЕ С АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНОМ

И АЛЬБУМИНАМИ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

Панова И.Г.1, Татиколов А.С.2 Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 Учреждение РАН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, ул. Косыгина, 4

E-mail: pinag@mail.ru

Для исследования белковых компонентов внеклеточного матрикса нами был разработан спектрально-флуоресцентный зонд ДЭЦ на основе полиметинового (цианинового) красителя. Характерным свойством этого зонда является способность распознавать молекулы коллагенов и сывороточного альбумина человека. Образование комплекса красителя с альбумином вызывает появление длинноволновой полосы поглощения (~612 нм) и резкий рост флуоресценции, а в присутствии коллагенов краситель образует на них наноструктуры J-агрегатов, обладающие длинноволновой полосой поглощения (640–650 нм) и флуоресценцией. Этот зонд оказался эффективным для исследования жидких сред организма, например, сыворотки крови и жидких сред глаза, таких как стекловидное тело и жидкость передней камеры. В настоящей работе с применением красителя ДЭЦ было проведено исследование стекловидного тела у плодов и взрослого человека, новорожденных и взрослых крыс, быков, эмбрионов кур и взрослых травяных лягушек. Показано, что краситель ДЭЦ выявляет сывороточный альбумин только в стекловидном теле человека. При этом с альфа-фетопротеином, который присутствует в стекловидном теле плодов человека, данный зонд не взаимодействует, также как и с альбуминами других представителей позвоночных животных. Способность красителя ДЭЦ взаимодействовать с разными типами коллагенов позволила установить, что в стекловидном теле травяной лягушки основным является коллаген типа I, в отличие от млекопитающих, где основным коллагеном стекловидного тела является коллаген типа II. Таким образом, данный зонд позволяет эффективно использовать его как для диагностических, так и для научно-исследовательских целей.

Авторы выражают благодарность Р.А. Полтавцевой за помощь в работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 09-04-01054-а; № 10-03-00647-а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МУЛЬТИПЛЕТНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В ОБРАЗОВАНИИ

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ И КОМПЛЕКСНЫХ ЛИГАНДОВ

Скляров Л.Ю.1, Козин С.А.2, Градюшко А.Т.3, Вагида М.С.3, Казанский Д.Б.3 ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24-2 Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

E-mail: lsklyarov@immune.umos.ru

Основой (кором) мультиплетных пептидов служат трифункциональные аминокислоты, кором белков являются гетероциклы – порфирины, 3-гидроксипиридины, имидазолоны и др. Был предпринят синтез для получения аналогов порфринов, исходя из аддуктов производных аминокислот и пептидов с ненасыщенными дикарбоновыми кислотами. При этом наблюдался ряд неизвестных ранее процессов, например, присоединение к пиридиновым ядрам воды, аммиака и возможный распад аддуктов (в случае производных этиленовых и ацетиленовых кислот) с превращением пиридинового ядра в пиррольное и гидролиз ядра пептидилпиридинов. Образование хинониминовых производных порфирина, возможно связано с каталитическими свойствами получаемых соединений. Боковые функциональные группы в порфиринах служат источником связей для образования из них дендримеров и супрамолекулярных структур не только за счет ковалентных и водородных связей, но и за счет сильных металлохелатных и иминохингидронных связей.

Структурирование за счет гидрофобных связей наблюдалось у мультиплетных пептидов содержащих остатки жирных кислот и алкилированных производных порфирина (ковалентные липосомы). Агрегация пептидов, содержащих боковые металлохелатные группы (пиридоксина и порфирина), наблюдалась при добавлении солей металлов (в том числе и цинка). На основе пептидов, способных хелатировать цинк, был получен ряд ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента – возможно, эти препараты также связываются с участками белков, содержащих цинк. Это важно при изучении болезни Альцгеймера и биохимических процессов, связанных с металлами. Уникальные спектральные характеристики (поглощение и флуоресценция в красной области спектра) могут быть использованы в фотодинамическом лечении рака. Присоединение природных хромофоров (хлорина, фолиевой кислоты) к мультиплетному пептиду, содержащему последовательность RGDS и Form-MPL, позволило получить комплексный клеточный лиганд. Широкий спектр флуоресценции мультиплетных производных порфирина (400–900 nm) позволил наблюдать связывание этих соединений с клеточными линиями методом проточной цитофлуориметрии с различными источниками возбуждения.

Стендовые доклады 179

ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА -ФЛУОРЕНИЛМЕТИЛОВОГО

ЭФИРА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Чулин А.Н., Азев В.Н., Мустаева, Л.Г., Родионов И.Л.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: pepsylab@fibkh.serpukhov.su Использование достаточно редкого соединения Fmoc-Asp(OFm)-OH в синтезе пептидов, которые содержат аспарагиновуюю кислоту на N-конце цепи, имеет рядпреимуществв над производнымиаспарагиновойй кислоты с защитными группами бензильного или трет-бутильного типа. В частности, защитные группы на основе флуоренилметанола предпочтительныы при синтезе пептидов имеющих в своей последовательности труднодоступные неприродные аминокислоты, содержащие замещённые индолы (например, 5-йодтриптофан) и другие электронодонорные гетероциклические системы (например, тиенилаланин). В этом случае исключаются побочные реакции, имеющие место быть при снятии Bn, Cbz, tBu, Boc защитных групп: гидрогенолиз или алкилирование гетероциклической системы.

Ключевым производным в синтезе Fmoc-Asp(OFm)-OH является H-Asp(OFm)OH. Последнее соединение может быть получено с помощью прямой -селективной этерификации аспарагиновой кислоты флуоренилметанолом. Мы обнаружили, что этот метод имеет ряд недостатков при масштабировании. Нами предложен альтернативный четырёхстадийный способ получения H-Asp(OFm)-OH исходя из Boc-Asp(OBzl)-OH. Суммарный выход продукта (ca. 70%) гораздо выше опубликованного выхода по одностадийному способу (ca. 40%).

–  –  –

СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ЛЮЛИБЕРИНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

В СИСТЕМАХ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ

Яблокова Т.В.1, Челушкин П.С.1, Дорош М.Ю.1, Орлов С.В.2, Ефремов А.М.2, Буров С.В.1 Учреждение РАН Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004 С.-Петербург, В.О., Большой пр., 31 Учреждение РАМН НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, С.-Петербург

E-mail: burov@hq.macro.ru

Адресная доставка генов в клетки-мишени является важнейшей проблемой, от решения которой зависит эффективность используемых методов генотерапии. При разработке систем доставки «суицидных» генов в опухолевые клетки особенный интерес представляет применение в качестве носителей аналогов люлиберина. В этом случае терапевтический эффект может быть усилен благодаря наличию специфических рецепторов на поверхности злокачественных клеток и собственной противоопухолевой активности пептидного носителя.

Поскольку классические аналоги люлиберина (GnRH) не способны образовывать комплексы с ДНК, нами разработаны методы синтеза гибридных соединений, содержащих последовательность ядерной локализации (NLS) вируса SV40.

Наличие NLS обеспечивает эффективное связывание ДНК и направленную доставку комплекса в ядро клетки, не влияя на способность пептидного носителя избирательно связываться с рецепторами GnRH. Синтез пептидов проводили твердофазным методом при использовании стратегии ортогональной защиты или фрагментной конденсации. Второй подход имеет определенные преимущества при получении различных по структуре пептидных носителей, поскольку позволяет независимо варьировать последовательность аналога, обеспечивающего взаимодействие с рецептором, и ДНК-связывающего домена. Нами исследованы различные варианты синтеза с применением защищенных или деблокированных фрагментов. Для селективной конъюгации пептидов, содержащих незащищенные остатки лизина, использовали реакцию гидразида NLS с аналогом [D-Lys6]GnRH, модифицированным пировиноградной кислотой. Исследование с помощью ОФ ВЭЖХ показывает, что образующийся гидразон устойчив в водном растворе при pH4.

Синтезированные аналоги люлиберина использованы в качестве носителей для адресной доставки «суицидного» гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в клетки гепатокарциномы человека HepG2. При этом в ряде случаев удается добиться полного уничтожения опухолевых клеток, что свидетельствует о перспективности предложенного подхода.

Стендовые доклады 181

–  –  –

Биотехнология (конструирование и получение рекомбинантных белков и пептидов) V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

КОНСТРУИРОВАНИЕ ФНО-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

НА ОСНОВЕ ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА МЕТОДОМ ПЕРЕСАДКИ CDR

Крюкова Е.А.1, Петровская Л.Е.1, Шингарова Л.Н.1, Болдырева Е.Ф.1, Якимов С.А.1, Гурьянова С.В.1, Долгих Д.А.1, Кирпичников М.П.1,2 Учреждение РАН Институт биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

E-mail: kelen@fromru.com

Фактор некроза опухолей (ФНО) играет ключевую роль в патогенезе различных заболеваний. Использование связывающих белков для снижения повышенной концентрации ФНО в организме человека представляет собой эффективный подход к их лечению. С целью изучения возможности конструирования ФНО-связывающих белков методом пересадки CDR проведена замена петель 10 домена фибронектина человека III типа (10Fn3) аминокислотными последовательностями CDR легкой и тяжелой цепей нейтрализующего ФНО антитела F10. Соответствующие белки FNL и FNH наработаны в клетках E. coli и очищены при помощи металлоаффинной хроматографии. С целью изучения вклада отдельных петель в связывание антигена получены варианты, содержащие замены одного из CDR последовательностями петель домена фибронектина дикого типа.

Исследование ФНО-связывающих свойств полученных белков при помощи ELISA показало, что наиболее высокой активностью обладает вариант Hd3, содержащий CDR-H1 и CDR-H2. Сконструированные нами белки на основе домена фибронектина специфически связывают ФНО в Вестерн-блоте, а также ослабляют его цитотоксическое действие на линию клеток L929. Наиболее высокую нейтрализующую активность демонстрируют белки Hd2 и Hd3, вызывающие, соответственно, 10- и 50-кратное повышение эффективной концентрации ФНО, необходимой для 50%-ной гибели клеток.

Работа проводится при финансовой поддержке гранта НШ-5207.2010.4, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

Стендовые доклады 183

СОЗДАНИЕ ПАНЕЛИ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ

ДЛЯ ПОИСКА И ИЗУЧЕНИЯ НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ

Липкин А.В.1, Ракитина Т.В.1,2, Юдкина О.В.1, Осипов Е. M.3, Чилов Г.Г.4 НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр.2 ООО «Молекулярные технологии», 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.75А

E-mail: lipus57@yahoo.com

Классический подход к созданию таргетных (направленных на определённую белковую мишень) лекарственных препаратов основан на выборе биологически активных молекул из многомиллионных коллекций химических соединений. Использование методов биоинформатики и молекулярного моделирования может существенно сократить размер коллекций, используемых для скрининга, а следовательно, время и затраты на поиск ингибиторов. В то же время задача получения белков-мишеней в количестве и с качеством, позволяющими отбирать химические соединения, способные связаться с заданными белками и воздействовать на интересующую исследователя активность не теряет свою актуальность.

С целью поиска низкомолекулярных ингибиторов тирозиновых киназ (ТК) были отобраны и экспрессированы в бакуловирусной системе шестнадцать генов, кодирующих терапевтически важные ТК. Рекомбинантные белки, содержащие на N-конце шесть остатков гистидина, были выделены с помощью аффинной хроматографии, и после определения их активности с помощью люциферазного тирозинкиназного теста использованы для проведения скрининга коллекции химических соединений. Были найдены соединения активные в отношении одной или нескольких киназных мишеней и определены их коэффициенты ингибирования. Для ряда соединений был проведён молекулярный докинг и предложен механизм взаимодействия с активными центрами ТК. В результате, было установлено, что производные катехола являются новым типом химических ингибиторов тирозиновых киназ, а также обнаружено, что ТК наряду с рядом белков других классов являются мишенями для воздействия экологических загрязнителей группы фенантренхинонов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Госконтракт № 02.512.12.2051).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГИРУДИНА

В РАСТЕНИЯХ РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR)

Таранов А.И.1,2, Фирсов А.П.2, Долгов С.В.2 Пущинский государственный университет, 142290 Пущино, Московская обл., пр. Науки, 3 Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, Московская обл.

E-mail: taranovemva@rambler.ru

Гирудин – высокоспецифический прямой ингибитор тромбина, обнаруженный в слюнных железах медицинской пиявки Hirudo medicinalis. В настоящее время препараты гирудина используются при лечении широкого спектра заболеваний, таких как: антикоагулятнтная терапия при тромбозах, профилактика и лечение тромбозов после хирургических вмешательств и переломов и др.

На данный момент существует два источника получения гирудина – природный из слюнных желез пиявки и синтез рекомбинантного гирудина в дрожжах.

Оба этих способа дорогостоящи, кроме того, гирудин, синтезированный в дрожжах, обладает лишь 20–30% активности от природного. Это связано с недостаточной точностью процессинга молекул гирудина в дрожжах.

Нами исследуется возможность синтеза гирудина в растительных экспрессионных системах. Преимуществом такого подхода является низкая стоимость конечного продукта, а также наличие в растениях биохимических систем, необходимых для формирования корректной вторичной структуры гирудина.

Аминокислотная последовательность гирудина была получена из баз данных GenBank. К N-концу аминокислотной последовательности гирудина в трансляционном слиянии был добавлен сигнальный пептид -амилазы риса. Для усиления экспрессии гирудина в растениях была проведена оптимизация кодонного состава последовательности кодирующей ДНК с помощью программы Gene Composer.

Синтез последовательности ДНК был выполнен методом полимеразной цепной реакции. Для дизайна наборов перекрывающихся олигонуклеотидов была использована программа Primo Optimum 3.6 Optimal Gene Synthesis And Expression. Полученная нуклеотидная последовательность была клонирована в вектор pBI121под контролем 35S промотора CaMV и отсеквенирована, нуклеотидная последовательность 3 из 5 проанализированных клонов соответствовала заданной.

Полученный вектор был перенесен в Agrobacterium tumefaciens CBE21 и будет использован для трансформации растений табака и ряски малой (Lemna minor).

Стендовые доклады 185

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ

ДЕЛЕЦИОННЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА DRGA ЦИАНОБАКТЕРИИ

SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803 И ИХ ГИБРИДОВ С ГЕНАМИ,

КОДИРУЮЩИМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ

Топорова В.А.1, Алешин А.В.2, Некрасов А.Н.1, Муронец Е.М.2, Лукашев Е.П.2, Тимофеев К.Н., Долгих Д.А., Еланская И.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1

E-mail: toporova-viktorija@rambler.ru, assol5@rambler.ruE-mail: ivelanskaya@mail.ru

Растворимая NAD(P)H:хинон-оксидоредуктаза цианобактерии Synechocystis sp.

PCC 6803, кодируемая геном drgA, участвует в окислении NADPH и контролирует устойчивость клеток к нитроароматическим ингибиторам и к ингибиторам хинонного типа, индуцирующим окислительный стресс. С целью выяснения роли белка DrgA в клетках цианобактерии, а также изучения его структурно-функциональных характеристик, на основе анализа информационной структуры белка выявлены потенциальные участки для проведения сайт-направленного мутагенеза и сконструированы рекомбинантные последовательности ДНК, которые содержали делеционные варианты гена drgA с присоединенной к 3’-концу гена синтетической последовательностью, кодирующей 12 гистидиновых остатков. Кроме того, для визуализации белка в клетках, к гену drgA присоединены кодирующие последовательности флуоресцентных белков Cherry и EGFP. Полученные кодирующие последовательности использованы для конструирования на основе pTrc99А плазмид для прямой конститутивной и индуцируемой внутриклеточной экспрессии в E. coli гена drgA и его делеционных производных под контролем промотора Ptrc с усилителем трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7. Нативный и мутантные гены drgA экспрессированы в клетках E. coli штамма BL21(DE3). Соответствующие гибридные белки очищены методом металл-аффинной хроматографии.

Для изучения роли и клеточной локализации DrgA в клетках Synechocystis sp.

PCC 6803 на основе полученных рекомбинантных плазмид сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC 6803, несущие делеции в отдельных районах гена drgA, а также штаммы цианобактерии, содержащие белок DrgA с присоединенной к нему последовательностью флуоресцентных белков Cherry и EGFP. Охарактеризована фотосинтетическая активность мутантов и их устойчивость к ингибиторам.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 09-04-01119 ).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА CIS ДИСПЛЕЯ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

НА ОСНОВЕ ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА

Шингарова Л.Н., Петровская Л.Е., Ключарева А.Ю., Крюкова Е.А., Болдырева Е.Ф., Хабибуллина Н.Ф., Долгих Д.А., Кирпичников М.П.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: lshing@mx.ibch.ru Фактор некроза опухолей (TNF) является одним из основных медиаторов воспаления и врожденного иммунитета. При некоторых заболеваниях нейтрализация его активности дает ярко выраженный клинический эффект, поэтому поиск различных блокаторов TNF является перспективным направлением белковой инженерии и биотехнологии. Домен фибронектина (10 домен фибронектина III типа, Fn3) является структурным аналогом VH домена иммуноглобулинов. Варьирование аминокислотных последовательностей в трех петлях Fn3, соответствующих CDR в молекулах антител, позволяет получать белки, обладающие способностью связывать различные антигены.

Целью работы явилось изучение возможности конструирования TNF-связывающих белков на основе домена фибронектина методом CIS дисплея. На первом этапе была получена библиотека генов Fn3, содержащих статистические последовательности нуклеотидов (NNB+KMT) в участках, кодирующих петли BC, DE и FG. Для получения второй библиотеки использован метод ДНК-шаффлинга ранее полученных вариантов генов TNF-связывающих белков на основе Fn3. Далее обе библиотеки были объединены с фрагментом ДНК, кодирующим белок RepA и последовательность ori. Проведена селекция библиотек при помощи бесклеточного CIS-дисплея с отбором вариантов, связывающих биотинилированный TNF. Полученные в результате 3 раундов селекции варианты экспрессированы в клетках E.

coli, рекомбинантные белки выделены и охарактеризованы физико-химическими и иммунологическими методами. Выявлено 2 клона, специфически связывающих TNF с константой около 7х10-8 М. Таким образом впервые показана возможность получения антиген-связывающих белков на основе Fn3 методом CIS дисплея.

Работа проводится при финансовой поддержке гранта НШ-5207.2010.4, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

Стендовые доклады 187

–  –  –

Физико-химические и компьютерные методы исследования.

Пространственная структура и динамика.

Биоинформатика V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МОДЕЛИРОВАНИЕ ФОРМЫ И РАДИАЛЬНОЙ ПЛОТНОСТИ БЕЛКА

-КРИСТАЛЛИНА ПО КРИВЫМ МАЛОУГЛОВОГО РЕНТГЕНОВСКОГО

РАССЕЯНИЯ

Амарантов С.В.1, Волков В.В.1, Налётова И.Н.2, Аттанасио Ф.3 Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, 119333 Москва, Ленинский просп., 59 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Institute of Biostructure and Bioimaging (IBB), National Council of Research (CNR), Catania, Italy

E-mail: amarantov_s@mail.ru

По экспериментальной кривой рентгеновского малоуглового рассеяния Iexp(s) где s модуль вектора рассеяния, и методом аналитического ультрацентрифугирования нами был получен набор моделей формы белка -кристаллина (далее частицы) в растворе.

В рамках однородного, для плотности частицы, приближения были построены три трёхмерные модели формы с различной степенью разрешения. Первая модель – приближение формы частицы трёхосным эллипсоидом заданным своим форм-фактором ( s, a, b, c ), где параметры a, b, c – полуоси эллипсоида. Методом нелинейной минимизации квадратичного отклонения модельной кривой рассеяния ( s, a, b, c ) от экспериментальной Iexp(s) были получены числовые значения полуосей эллипсоида; вторая модель – приближение формы частицы набором сферических гармоник. В этом случае независимыми параметрами модели являлись коэффициенты ряда Фурье flm по сферическим гармоникам Ylm, а форма L l

–  –  –

ТРИТИЕВАЯ ПЛАНИГРАФИЯ. ОТЛИЧИЯ В ПРОСТРАНСТВЕННОЙ

СТРУКТУРЕ БЕЛКА М1 ВИРУСА ГРИППА В КРИСТАЛЛЕ, РАСТВОРЕ

И ВИРИОНЕ

Богачева Е.Н.1, Долгов А.А.1, Чуличков А.Л.1, Шишков А.В.1, Ксенофонтов А.Л.2, Федорова Н.В., Баратова Л.А.

Учреждение РАН Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40

E-mail: bogen_chph@mail.ru

Методом тритиевой планиграфии в сочетании с компьютерными алгоритмами предсказания вторичной, третичной структуры и моделирования бомбардировки объекта атомами трития исследована структура белка М1 вируса гриппа А/Puerto Rico/8/34 (PR8, подтип H1N1) в растворе, вирионе и кристаллическом состоянии.

Предложена предварительная модель С-концевого домена белка, для которого отсутствуют данные РСА. Анализ данных для свободного белка, белка в составе вириона и в кристаллическом состоянии (NM-домен) показал ряд существенных отличий в их структуре. На основании полученных данных можно сделать следующие выводы: 1) пространственная структура белка в растворе отличается от структуры в вирионе; 2) структура NM-домена в растворе отлична от структуры этого домена в кристаллическом состоянии, определенной с помощью РСА; 3) как и в случае с белком в составе вируса, основное отличие для белка в растворе наблюдается в области контакта N- и М-доменов, которые более плотно упакованы в кристаллическом состоянии. Мы предполагаем, что in vivo переход молекулы белка из подмембранного чехла, образованного агрегатами белка, в свободное состояние приводит к серьезным конформационным изменениям пространственной структуры М1 белка и даже смещению доменов друг относительно друга.

Работа поддержана грантами РФФИ (№№ 09-03-00469, 09-04-01160).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТЕРЕОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СИЛЬНО СКРУЧЕННЫХ И ИЗОГНУТЫХ

-ШПИЛЕК В ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКАХ

Бражников Е.В., Ефимов А.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, ул. Институтская, 4, Московская обл.

E-mail: tefg@vega.protres.ru

-Шпильки широко распространены в белках и встречаются как в обособленном виде, так и в составе других структурных мотивов, таких как abcd-единицы, S- и Z-образные -листы, - и 3-уголки и др. Многие -шпильки в белках скручиваются и изгибаются очень сильно, что приводит к образованию своеобразных двойных спиралей, имеющих вогнутые и выпуклые поверхности [1,2]. Такие шпильки представляют особый интерес, поскольку образуют не только правые двойные спирали, но и сами являются правыми, т.е. в них второй по цепи -тяж располагается справа относительно первого, если смотреть со стороны вогнутой поверхности [2]. Основная задача настоящей работы состоит в том, чтобы выяснить особенности аминокислотных последовательностей, кодирующих сильно скрученные -шпильки, по сравнению с плоскими аналогами. Для этого создана база данных белков, содержащих такие шпильки, используя Банк белковых данных (PDB). Всего в негомологичных белках было найдено 386 сильно скрученных и изогнутых -шпилек, в которых длина -тяжей была 5 и более остатков. Определены частоты встречаемости всех 20 аминокислотных остатков на внутренней (вогнутой) и внешней (выпуклой) поверхностях сильно скрученных -шпилек и построены соответствующие гистограммы. Установлено, что позиции на внутренних сторонах в большинстве случаев заняты гидрофобными остатками, а на внешних сторонах – гидрофильными. В этом сильно скрученные шпильки не отличаются от обычных шпилек в глобулярных белках. Однако обнаружено, что во внутренних позициях сильно скрученных и изогнутых -шпилек аномально часто встречаются глицины и аланины, а во внешних позициях – пролины. Более того, во внутренних позициях этих шпилек пролины не встречаются вовсе. По-видимому, эти особенности и определяют образование сильно скрученных и изогнутых

-шпилек.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-00727-а и грантом Федерального агентства по науке и инновациям № 02.740.11.0295.

Литература

1. Chothia C. (1973). J. Mol. Biol. 75, 295–302.

2. Efimov A.V. (1991). FEBS Lett. 284, 288–292.

Стендовые доклады 191

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ МОДЕЛЬ КОМПЛЕКСА ИНГИБИТОРА

ФОТОСИНТЕЗА И ФОТОСИСТЕМЫ II ИЗ THERMOSYNECHOCOCCUS

ELONGATES

Габдулхаков А.Г.1, Донцова М.В.1, Зенгер В.2 Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 Институт кристаллографии, Свободный университет, Берлин, Германия

E-mail: azat@vega.protres.ru

Ключевым компонентом в фотосинтетическом образовании кислорода является фотосистема II. Этот сложный многокомпонентный комплекс располагается в тилакойдной мембране цианобактерий, зеленых водорослей и растений. Фотосистема II является наиболее удобной мишенью для ингибиторов фотосинтеза, что позволяет получать новые высокоэффективные гербициды. В данной работе методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 3,2 (Rfactor=26,9%, Rfree=29,9%, rmsd длин связей – 0,013, валентных углов – 2,2о, соответственно) впервые определена и уточнена пространственная модель фотосистемы II из цианобактерии Thermosynechococcus elongates в комплексе с гербицидом тербутрином (2-tert-butylamino-4-ethylamino-6-methylthio-1,3,5-triazine). Структура комплекса была получена методом молекулярного замещения, в качестве стартового образца использовалась структура мономера фотосистемы II из T. elongates, определенная нами ранее c разрешением 2,9 (PDB ID 3BZ1). Была обнаружена одна молекула тербутрина на мономер фотосистемы II, расположенная в сайте связывания подвижного пластохинона QB. Координаты уточненной структуры комплекса фотосистемы II с тербутрином депонированы в международный банк белковых структур под номерами PDB ID: 3PRQ, 3PRR.

Кристаллографическая часть работы выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук и Программы «Молекулярная и клеточная биология»

Президиума РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ КРОВИ

В ВОДНЫХ ДИСПЕРСИЯХ НАНОУГЛЕРОДА

Горюнов А.С., Рожков С.П., Борисова А.Г., Суханова Г.А.

Учреждение РАН Институт биологии Карельского научного центра РАН, 185610 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: goryunov@krc.karelia.ru Разработка технологий получения все новых и новых наноматериалов на основе углерода и перспективы их медицинского применения требуют изучения биофизикохимических взаимодействий углеродных наночастиц с белковыми, структурами в устойчивых водных дисперсиях для выяснения общих закономерностей влияния наноуглерода на биопроцессы на молекулярном и субклеточном уровне.

Цель настоящей работы – охарактеризовать структурно-динамические, термодинамические и гидродинамические особенности состояния белковых макромолекул в нанодисперсии углерода и в составе белковой короны наночастиц (НЧ).

Исследование методами ЭПР спин-метки и спин-зонда, дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК), спектроскопии лазерного светорассеяния, хроматографии позволило установить, что в случае сывороточного альбумина (СА) при образовании в бессолевой водной среде устойчивых комплексов белок-углеродная наночастица (наноалмаз, шунгитовый наноуглерод) в их состав входит практически весь белок раствора, образуя многослойную белковую корону, тогда как в случае гемоглобина – лишь малая часть белка. При хроматографическом разделении комплексы на основе шунгитового наноуглерода выходят из колонки во фракциях со значительно меньшим объемом элюции, чем чистый СА, в то время как гемоглобин не оказывает влияния на хроматографическую подвижность наноуглерода, которая в этом случае, а также в отсутствии белка близка к нулю. В составе белковой короны альбумин, находящийся в непосредственном контакте с НЧ, оказывается в частично развернутом состоянии: взаимодействие молекулы СА с НЧ, имеющими неполярную природу поверхности, вероятно, осуществляется за счет центров на СА, связывающих неполярные молекулы жирных кислот; происходит перераспределение молекулярных контактов между структурными доменами СА, меняется его термостабильность; свойства остальной части альбумина в составе короны изменяются мало. Показано также, что наночастицы углерода могут выступать в качестве фактора, ускоряющего или даже обеспечивающего процессы индуцированного восстановления/окисления органических соединений (спин-зонд ТЕМПО) и автоокисления гемоглобина.

Стендовые доклады 193

АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ СИНТЕТИЧЕСКИХ

ПЕПТИДОМИМЕТИКОВ

Горячева Е.А., Архипова С.Ф., Артемьев И.В., Плетнев В.З.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: goryacheva@ibch.ru Ограничения при использовании молекул пептидной природы связаны с их высокой метаболической активностью, конформационной подвижностью и сильным влиянием внешних условий (температура, pH и др.) на структурно-функциональные свойства. Одним из подходов к стабилизации природных пептидов является создание на их основе псевдопептидных соединений с ограниченной конформационной свободой, получивших название «пептидомиметиков». Пептидомиметики дают возможность направленно изменять конформацию исходной пептидной молекулы и вводить «неприродные» модификации в полипептидную цепь, что позволяет повысить метаболическую устойчивость природных соединений и получить модифицированные пептиды с существенно более высоким cродством к молекулам-мишеням.

Ограничение конформационной подвижности пептидной цепи может быть достигнуто в результате образования дополнительной непептидной амидной связи с участием определенных аминокислотных остатков. В работе был проведен теоретический конформационный анализ синтезированных с помощью реакции аминоацильного включения циклических дипептидов, образованных с участием Asp, Lys, Glu, Orn и Dab: Boc-Lys-Glu But, Boc-Dab-Glu-OBu t, Z-Orn-Glu-OBzl и Z-Lys-Asp-OBzl Также для соединения Boc-Dab-Glu-OBu t Z-Lys-Asp-OBzl.

был проведен анализ конформационных свойств как в LL, так и LD пространственной ориентации аминокислотных остатков. Для определения структуры низкоэнергетических конформационных состояний исследуемых циклических дипептидов был использован программный комплекс CHARMM.

Теоретический конформационный анализ циклопептидов показал, что конформационная подвижность циклической системы исследуемых соединений зависит от числа атомов в цикле, взаимного расположением амидных связей и природы Nи C-концевых фрагментов. При этом взаимное расположение амидных связей оказывает существенное влияние на конформационную подвижность исследуемых молекул.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ МАТРИКСНОГО М1-БЕЛКА

ВИРУСА ГРИППА В РАСТВОРЕ

Ксенофонтов А.Л.1, Федорова Н.В.1, Добров Е.Н.1, Богачева Е.Н.2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40 Учреждение РАН Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, ул. Косыгина, 4

E-mail: ksenofon@belozersky.msu.ru

Матриксный М1-белок вируса гриппа выполняет важную роль при сборке вируса за счет выраженной склонности к самополимеризации при ассоциации с липидными мембранами. Ша и Луо [1] удалось закристаллизовать N-концевую часть молекулы М1 (остатки 2-158) и установить ее пространственную структуру. Структура С-концевого домена (остатки 159-252) остается неизвестной.

С помощью метода тритиевой планиграфии мы оценили включение тритиевой метки в цельный М1-белок при кислых рН. Обнаружено преимущественное включение тритиевой метки в С-концевой домен, что говорит о «рыхлости» его структуры. Методами аналитического центрифугирования и динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) при кислых рН (3,5–5,0) мы определили необычно большой для глобулярного белка гидродинамический диаметр молекулы М1 (DH = 5,6 ± 1,5 нм). Анализ ряда доступных в интернете программ предсказания областей неструктурированности белков показал высокую долю разупорядоченности в С-домене (от 29%-FoldIndex до 66%-IUPred) и лишь незначительную в N-концевом фрагменте (7±4%). Также изучена склонность М1-белка к самополимеризации и ассоциации в растворе. Данные кругового дихроизма (КД) интактного М1-белка при рН 4,0–5,0 показали рост структурированности при увеличении концентрации белка (в диапазоне 0,1–10 мг/мл) или добавлении трифторэтанола, что подтверждает наличие неструктурированных областей, склонных к сворачиванию. Повышение температуры приводило к «плавлению» структуры М1-белка при 60оС.

При этом происходила необратимая, но частичная денатурация (до 50%). По данным ДЛС в диапазоне 55–65оС происходило слипание денатурированных молекул и диаметр частиц DH возрастал до 12–16 нм. Повышение рН до 6,0–6,5 приводило к резкому увеличению мутности раствора (ОД320). При этом происходила ассоциация молекул с появлением пиков с DH равным 50–60 нм и 400–800 нм, не сопровождающаяся заметной денатурацией по данным КД. По-видимому, при повышении рН раствора происходит самополимеризация М1-белка, возможно, сходная с его полимеризацией при сборке вириона в клетке.

Работа поддержана грантами РФФИ (№№ 09-04-01160, 09-03-00469).

Литература

1. Nat.Struct.Biol., 1997, 4, 239–244.

Стендовые доклады 195

РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ОБЪЕМНОЙ БИОРЕГУЛЯЦИИ

Курзанов А.Н.

Кубанский государственный медицинский университет, 350063 Краснодар, ул. Седина, 4 E-mail: kurzanov@mail.ru Гипотеза о существовании в живой природе регуляции физиологических функций, а также патофизиологических реакций по принципу объемной биорегуляции (Курзанов А.Н., 2009, 2010) базируется на существующих представлениях о структурно-функциональной организации, а также информационных принципах функционирования живой материи. При этом роль важнейших информационных детерминант отводится пептидам. Пептидергическая сигнальная трансдукция имеет место на различных уровнях организации жизнедеятельности – генетическом, молекулярном, внутриклеточном, межклеточном, тканевом, организменном, видовом, межвидовом.

В отличие от нейромедиаторной синаптической передачи информации по «анатомическому адресу», обеспеченному контактом пре- и постсинаптических структур, дистактная пептидергическая передача информации по «химическому адресу» обеспечивается переносом молекул пептидов через кровь, ликвор, межклеточную жидкость, а также внешнюю среду (воздух, воду) и носит объемный характер. Понятие «объема» в этом смысле может включать от пространства, окружающего отдельную клетку, до пространства, в котором происходит обмен информацией через внешнюю среду между целыми организмами. Объемная передача информации посредством пептидов – важный составной элемент объемной регуляции жизнедеятельности.

Основными факторами, лимитирующими объем и эффективность пептидергической регуляции, можно считать: период существования сигнальных молекул, характер микроциркуляции биологических жидкостей, определяющий скорость транспорта пептидов от места их выброса; мощность пептидного сигнала, определяемая количеством их молекул; готовность клеток к восприятию сигнала (наличие и количество рецепторов) и трансляции его после лиганд-рецепторного взаимодействия.

Взаимодействие клеток в определенном объеме ткани, органа, обмен информацией между особями в группе с участием регуляторных пептидов обеспечивается специфичностью молекулярной структуры лигандов и их рецепторов. Уникальные возможности системы регуляторных пептидов позволяют рассматривать их в качестве универсального инструмента, обеспечивающего эффекты эволюционно наиболее древнего механизма организации жизнедеятельности – объемной биорегуляции.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ХРОМОФОР-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ

СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЖЕЛТЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ

Мартынов В.И., Пахомов А.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: vimart@ibch.ru Спектральные свойства зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов определяются структурой хромофора и различными его взаимодействиями с окружающими аминокислотами. Для изучения структурных особенностей, определяющих спектральные свойства желтых флуоресцентных белков, с помощью гомологичного моделирования и масс-спектрометрии была построена модель трехмерной структуры белка phiYFP (em = 537 nm) из медузы Phialidium sp. Масс-спектрометрический анализ хромофорсодержащего пептида показал, что химическая структура хромофора phiYFP эквивалентна таковой у GFP. Далее, для получения полной 3-х мерной модели, экспериментально определенная структура хромофора была включена в рассчитанную на основе гомологии модель белка. Эта модель на следующем этапе использовалась для определения аминокислот в окружении хромофора, которые могут влиять на фотофизические свойства белка, и по этим аминокислотам проводился направленный мутагенез. Анализ спектральных свойств полученных мутантов показал, что несколько факторов определяют фотофизические характеристики желтых флуоресцентных белков. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что - стэкинг-взаимодействия хромофора с фенольным кольцом Tyr203 вносят лишь небольшой вклад (около 10 нм) в общий сдвиг спектров в красную область. Дополнительный эффект может быть получен при введении Val в позиции 205. Также, важным фактором является образование водородной связи между Glu222 и азотом имидазолонового цикла хромофора.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 09-04-00212; 10-04-00471).

Стендовые доклады 197

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНОМАЛЬНОЙ ТЕПЛОВОЙ

АГРЕГАЦИИ GFP

Молочков Н.В.1, Мельник Б.С.2, Прохоров Д.А.1, Уверский В.Н.3, Кутышенко В.П.1 Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Московская обл.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл.

Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

E-mail: molotchkov@rambler.ru

В данной работе методом ЯМР исследуется взаимодействие с молекулами воды и тепловая денатурация cyсle-3 мутанта зеленого флуоресцентного белка. Показано, что при его тепловой денатурации происходит накопление агрегированной формы этого бека и практически отсутствует в растворе развернутый белок. Анализ экспериментальных данных по спиновой диффузии позволяет сделать вывод, что внутренняя часть бета бочонка GFP активно взаимодействует с молекулами воды, поэтому при высоких температурах происходит не разворачивание полипептидной цепи GFP, а скорее «разлом» его структуры, что, в свою очередь, приводит к усиленной агрегации и выпадению белка в осадок.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

ПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНТРОЛИРУЕМОЙ

ФРАГМЕНТАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИОНОВ

ПРИ ЭЛЕКТРОРАСПЫЛЕНИИ РАСТВОРОВ

Назимов И.В.1, Новиков А.В.2, Бубляев Р.А.2, Краснов Н.В.2 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт аналитического приборостроения РАН, 190103 С.-Петербург, пр. Рижский, 26

E-mail: nazimov@ibch.ru

Целью данной работы являлось создание отечественного приборного комплекса для хроматографического разделения компонентов смеси пептидов с on line фрагментацией в ESI-TOF молекулярных ионов компонентов смеси и последующей расшифровки аминокислотной последовательности каждого пептида.

Смеси пептидов разделялась на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02», работающем в режиме прямой стыковки с времяпролетным масс-спектрометром МХ 5311 c электрораспылительной ионизацией. Элюируемые с хроматографа пептиды детектировались масс-спектрометрически в виде их молекулярных ионов. Полученные молекулярные ионы подвергались регулируемой фрагментации в узле ввода образца, что приводило к образованию смеси первичных и вторичных фрагментных ионов пептидов.

Предложенный способ фрагментации молекулярных ионов пептидов приводит к образованию значительного числа первичных фрагментных ионов, соответствующих аминокислотному типу фрагментации. Обнаружено, что интенсивность таких ионов превышает сигнал фона в 3–100 раз, что позволяет надёжно определять аминокислотную последовательность пептидов, содержащих до 10 аминокислот.

Стендовые доклады 199

ПРОГРАММНО-АППАРАТНЫЙ КОМПЛЕКС

РАСПОЗНАВАНИЯ ФРАГМЕНТНЫХ МАСС-СПЕКТРОВ ПЕПТИДОВ

НА ОСНОВЕ ПРОТЕОМНЫХ БАЗ ДАННЫХ – PROTEOS

Назимов И.В.1, Присяч С.С.2, Фиронов С.В.2 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт аналитического приборостроения РАН, 198103 С.-Петербург, пр. Рижский, 36

E-mail: prisyatch@yandex.ru

Программно-аппаратные средства для вероятностной оценки соответствия фрагментных масс-спектров пептидов аминокислотным последовательностям из белковых баз данных становятся одним из основных инструментов биохимика-массспектрометриста. Тем не менее, потребительские качества существующих на текущий момент реализаций (Mascot) еще требуют доработки по ряду параметров:

низкая скорость обработки данных (недостаточная для множественного автоматического анализа масс-спектров), недостаточное качество оценки (значимо уступает эталонному анализу эксперта – масс-спектрометриста).

Разработанный в ИАП РАН комплекс Proteos, подобно Mascot, является клиент-серверным приложением и может предоставлять пользователям доступ посредством Интернет-обозревателя через сеть Интернет. Благодаря использованию специально разработанных алгоритмов обработки масс-спектров (Crystal Tag – разновидность peptide sequence tag и алгоритмам частичной интерпретации аминокислотной последовательности) удалось достичь качества распознавания на уровне конкурирующих разработок и на порядок увеличить скорость интерпретации данных.

По предварительным испытаниям на тестовой выборке смесей пептидов вхождение пептидов, образовавших исследуемый фрагментный масс-спектр, в 200 результатов с наивысшей оценкой наблюдается примерно в 65% случаев. При исследовании фрагментных масс-спектров очищенных пептидов, заведомо имеющихся в используемых базах данных аминокислотных последовательностей, искомый пептид занимает 1–2 место в результатах оценки. Скорость обработки достигает 1 000 спектров в секунду.

В настоящее время начато практическое использование программно-аппаратного комплекса Proteos совместно с ИБХ РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ЗАМЕНЫ ПРО11-АЛА11

НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БУФОРИНА 2:

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ

Науменкова Т.В.

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1-12 E-mail: tnaumenkova@gmail.com Среди известных на сегодняшний день антимикробных пептидов буфорин 2 является одним из наиболее активных. Он обладает чрезвычайно широким спектром противомикробного действия, оказывает эффект в низких концентрациях и даже в концентрациях, в десятки раз превышающих эффективные, не проявляет токсических свойств. Однако, обладая всеми структурными характеристиками -спиральных катионных пептидов, буфорин 2 не является мембраноактивной молекулой.

Предположительно, его биологический эффект реализуется за счет взаимодействия с внутриклеточной мишенью.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что аминокислотная замена Про11-Ала11 придает замещенному аналогу буфорина 2 способность специфически взаимодействовать с мембранами микробных клеток. Предложенная замена способствует выпрямлению характерного пролинового изгиба в центре пептида. Замещенный аналог не взаимодействует с модельной мембраной эукариотических клеток, но связывается с поверхностью модельной мембраны клеток прокариот, тогда как нативный буфорин 2 не способен удерживаться на поверхности любых клеток. Группа из четырех молекул аналога, размещенная на поверхности модельной мембраны прокариот, вызывает деформацию бислоя и приводит к нарушению избирательной проницаемости мембраны.

Проведено также исследование стабильности трансмембранных тороидальных пор, образованных четырьмя молекулами буфорина 2 и его аналога. Показано, что пора, в состав которой входят молекулы нативного буфорина 2, разрушается в первые нс эксперимента, при этом в молекулах пептида образуются характерные изгибы. Пора, содержащая молекулы аналога, остается стабильной на протяжении всего времени моделирования.

Оба пептида способны к связыванию со специфическим участком ДНК.

Биохимические и токсические свойства предложенного аналога требуют дальнейшего изучения, однако полученные нами данные дают основание утверждать, что Про11-Ала11-буфорин 2 является перспективным терапевтическим агентом.

Стендовые доклады 201

КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА L1-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ

С РАЗРЕШЕНИЕМ 2.0 Невская Н.А., Сарских А.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Габдулхаков А.Г., Тищенко С.В., Гарбер М.Б., Никонов С.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: nevskaya@protres.ru L1-выступ 50S рибосомной субчастицы участвует в высвобождении деацилированной тРНК из Е сайта. Рибосомный белок L1, кроме связывания с рРНК, связывается со специфическим участком на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи». Ранее было показано, что минимальный участок специфического связывания белка L1 на 23S рРНК включает спираль 77 (Н77) с двумя прилегающими петлями, и была определена структура комплекса белка L1 из Sulfolobus acidocaldarius с соответствующим фрагментом рРНК, содержащим 55 нуклеотидов. Кроме того, были определены структуры нескольких комплексов белка L1 с фрагментами матричной РНК. Эти структуры не могли в полной мере объяснить различие в кинетических параметрах связывания белков L1 дикого типа и их мутантных форм с рибосомной и матричной РНК. В данной работе мы определили структуру комплекса рибосомного белка L1 из бактерии Thermus thermophilus с фрагментом 23S рРНК, содержащим 80 нуклеотидов и включающим, кроме минимального участка связывания, полную спираль 78. Оказалось, что Н78 контактирует с первым доменом белка L1, образуя второе, удаленное от специфического, место связывания с белком. Ранее нами было показано, что наличие разнесенных мест связывания более существенно повышает сродство белка к РНК, чем увеличение площади единственного места контакта. Таким образом, можно сделать вывод, что причиной большей стабильности рибосомных комплексов L1-рРНК по сравнению с комплексами с L1-мРНК, является взаимодействие белка L1-именно со спиралью 78. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание структурных основ регуляции трансляции.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-00618).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ УЧАСТКА СВЯЗЫВАНИЯ

АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА БЕЛКОМ HFQ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Никулин А.Д.1, Гарбер М.Б. 1, Никонов С.В. 1, Мурина В.Н.1,2 Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, 4, Московская обл.

Пущинский филиал МГУ им. М.В. Ломоносова, Пущино, Московская обл.

E-mail: nikulin@vega.protres.ru mailto:vmlipkin@mx.ibch.ru

Hfq – небольшой термостабильный РНК-связывающий белок, являющийся глобальным регулятором экспрессии генов в бактериях. Белок Hfq образует характерную для него четвертичную структуру в виде тороидального гексамера. На поверхности белка выявлено два места связывания РНК: участок связывания мРНК и малых регуляторных РНК с одной стороны гексамера (проксимальная сторона белка), и участок связывания полиА РНК с противоположной стороны гексамера (дистальная сторона). Кроме того, было показано, что Hfq способен связывать не только полиА РНК, но и отдельные молекулы ATФ.

Нами впервые была определена пространственная структура белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa в комплексе с нерасщепляемым аналогом АТФ ADPNP.

ADPNP располагается в дистальном сайте связывания на поверхности белка Hfq, образуя водородные связи с аминокислотными остатками Thr61, Gln52 и Gly29 и стэкинг с боковой цепью Tyr25. В отличие от комплексов белка Hfq с полиА РНК не было зафиксировано нахождение ADPNP в соседнем месте связывания аденина, которое было предложено как существенное для узнавания полиА РНК.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»

ГК № 02.740.11.0295.

Стендовые доклады 203

БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОБЪЯСНЕНИЮ

АЛЛОРЕАКТИВНОСТИ КАК ПРОЯВЛЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОЙ

РЕАКТИВНОСТИ Т-КЛЕТОК С ВИРУСНЫМИ БЕЛКАМИ

Новоселецкий В.Н.1, Абрамов В.Ю.2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова, 123182 Москва, ул. Щукинская, 1

E-mail: valeryns@mail.ru

При пересадке органов человека основной причиной прекращения функции трансплантата является отторжение, возможность развития которого обусловлена генетически детерминированными различиями в строении молекул тканевой совместимости (HLA) реципиента и донора. Для объяснения острого отторжения аллотрансплантата было высказано предположение, что оно является проявлением анамнестического иммунного ответа, который обусловлен перекрестной реактивностью лимфоцитов (клеток памяти) реципиента, перенесшего ранее те или иные вирусные заболевания, с аллогенными молекулами HLA донора. В пользу этого предположения говорит и тот факт, что белок UL18 цитомегаловируса человека (HCMV) не только имеет сходство по последовательности и структуре с HLA-А2, но и способен функционировать сходным образом, обеспечивая тем самым мимикрию инфицированных клеток под здоровые и предотвращая иммунный ответ хозяина (Bjorkman et al., 2008). Нами было выполнено сравнение последовательностей молекул HLA класса I и последовательностей вирусных белков. Было обнаружено, в частности, что последовательность молекулы HLA-А2 имеет заметное сходство с последовательностями белков ряда вирусов. В частности, идентичность с последовательностью упомянутого белка UL18 составила 26%. Интересно, что идентичные остатки не только распределены по последовательности вирусных белков, но и образуют несколько участков по 8-10 остатков, локальная идентичность в которых достигает 100%. Предполагая важность такой идентичности для функционирования вирусов, мы оценили склонность идентичных участков к связыванию с молекулам HLA-DR, которое является важным этапом иммунного распознавания. С помощью веб-интерфейса к базе данных SYFPEITHI, содержащей информацию о связывании пептидов с молекулами HLA различных классов, было обнаружено, что эти участки локального сходства имеют повышенное сродство к молекулам HLA-DR. В ближайшее время мы планируем выяснить биологическую роль этого явления.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ

НА СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПРОДИГИОЗИНА

Андреева И.Н., Рязанцева И.Н., Захарченко Н.Л., Огородникова Т.И.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: Andreyeva@mail.knc.ru Продигиозин – линейный трипиррол – пигмент, образуемый Serratia marcescens и придающий растущей культуре характерную красную окраску; продигиозин в клетке находится в составе пигмент-белкового комплекса и локализован в ее оболочке. В наших исследованиях показана способность пигментированного штамма S.marcescens АТСС 9986 запасать световую энергию, что вызывает интерес к изучению первичных фотореакций, происходящих в пигмент-белковом комплексе, а также спектральных свойств продигиозина и влиянию на них белкового окружения.

Продигиозин растворим в полярных и неполярных органических растворителях и не растворим в воде, но может быть переведен в водную фазу в составе пигмент-белкового комплекса обработкой биомассы детергентами (додецилсульфатом натрия и Тритоном Х-100); молекулярный вес входящего в его состав белка – 105,5 КДа.

Продигиозин имеет две спектральные формы: красную (макс.погл.535 нм) и желтую (макс.погл. 460–470 нм) в зависимости от рН среды. Растущая культура S.marcescens содержит обе формы продигиозина, причем желтая форма либо более фотоактивна, либо количественно преобладает. Абсорбционная кривая клеточной суспензии перекрывает область поглощения обеих форм пигмента, но кроме выраженного пика при 535 нм имеет еще один – 500 нм.

В щелочных условиях продигиозин в спиртовом растворе и в составе пигментбелкового комплекса дает широкий максимум поглощения (460–470 нм). В кислой среде продигиозин в спиртовом растворе и в комплексе с денатурированным белком имеет один пик с максимумом поглощения 535 нм. Кривая абсорбции продигиозина в комплексе с нативным белком в кислой области совпадает с таковой интактных пигментированных клеток (два пика, 500 и 535 нм); возможно, при этом сохраняются связи продигиозина с белковым окружением подобные существующим in vivo.

Обе формы продигиозина флуоресцируют в области 560–580 нм, как в спиртовом растворе, так и в составе пигмент-белкового комплекса, однако, в клетке выявляется преимущественно флуоресценция красной формы пигмента (дл.волны возб. 535 нм), что может указывать на их функциональные различия в метаболизме бактериальной клетки.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВВЕДЕНИЕ СЕМАКСА В ТЕЧЕНИЕ 3–4 НЕДЕЛЬ ЖИЗНИ КРЫС

ОСЛАБЛЯЕТ НЕГАТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ

ХРОНИЧЕСКОЙ МАТЕРИНСКОЙ ДЕПРИВАЦИИ

Володина М.А.1, Глазова Н.Ю.2, Себенцова Е.А.2, Манченко Д.М.1, Левицкая Н.Г.2, Андреева Л.А., Каменский А.А.

МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: mariavolodina@yandex.ru



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 9 |
Похожие работы:

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ ЕВРОПЕЙСКАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ КОМИССИЯ Нью-Йорк, Женева, 1996 г. ЗАЩИТА ТРАНСГРАНИЧНЫХ ВОД Пособие для политиков и лиц, принимающих решения ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. РУКОВОДСТВО ПО МОНИТОРИНГУ И ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ТРАНСГРАНИЧНЫХ РЕК Документ подготовлен гру...»

«Том 8, №2 (март апрель 2016) Интернет-журнал "НАУКОВЕДЕНИЕ" publishing@naukovedenie.ru http://naukovedenie.ru Интернет-журнал "Науковедение" ISSN 2223-5167 http://naukovedenie.ru/ Том 8, №2 (2016) http://naukovedenie.ru/index.php?p=vol8-2 URL статьи: http://naukovedenie.ru/PDF/28EVN216.pdf DOI: 10.1...»

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 95–100. УДК 615.32 + 582.565.2 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СОКА КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ (CALLISIA FRAGRANS WOOD.) И ЕГО АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ (IN VITRO) * Д.Н. Оленнико...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Учебная ознакомительная практика студентов II курса, специализирующихся на кафедре молекулярной биологии, является составной частью учебного процесса и направлена на подготовку квалифицированных специалистов в области м...»

«АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях 03.02.03.микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и прикла...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт Кафедра эко...»

«Гандзюра В.П., Гандзюра Л.А., 2008. Подходы к оценке качества вод и состояния экосистем в условиях антропогенной нагрузки //М-лы Междунар. конф. по водной токсикологии и гидроэкологии "Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы. Кри...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом факул...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на с...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины" ГИДРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕК БАССЕЙНА ДНЕПРА (В ПРЕДЕЛАХ ГОМЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ) Гомель 2008 УДК 574.5 (476.2, 282.2 Днепр) ББК 28.082 (4 БЕИ – 4 Гом, 2 Днепр) Г 464 Авторы:...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологичес...»

«Иванова Ольга Ярославовна УЧАСТИЕ КАНОНИЧЕСКОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РЕГУЛЯЦИИ ПЛАСТИЧНОСТИ ГИППОКАМПА Специальность 03.03.01 – "Физиология" Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Владимир Александрович Маркевич Москва 2017 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗ...»

«НТП И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДСТВА УДК 621.301. Н. П. КУНДЕНКО, доктор технических наук, ХНТУСХ им. П. Василенко, г. Харьков Л. Н. МИХАЙЛОВА, кандидат технических наук, доцент ПАТУ, г. Харьков e-mail: n.p.kundenko@inbox.ru ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНЫХ АКУСТИЧЕСКИХ КОЛЕБАНИЙ В ПРОЦЕССЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ Предложено...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" Утверждено на заседании Ученого совета университе...»

«1. ЦЕЛИ ОСВОЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ В курсе экология человека раскрывается биосоциальная природа человека, основные законы его развития в природной и социальной среде. Цель курса – раскрыть особенности взаимного влияния человека на среду своего обитания и этой среды на человека. Он посвящн познанию законо...»

«Чайник электрический RK-M134 АНТИ АР Г Я М В ЕС ЯЦЕ РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ УВАЖАЕМЫЙ ПОКУПАТЕЛЬ! Благодарим вас за то, что вы отдали предпочтение бытовой технике компании REDMOND. REDMOND — это новейшие разработки, качество, надежность и внимательное отношение к потребностям наших покупателей. Надеемся, чт...»

«ИЛЬИНА ЕЛЕНА ПЕТРОВНА НЕЗАКОННАЯ ДОБЫЧА (ВЫЛОВ) ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ (ПО МАТЕРИАЛАМ КАМЧАТСКОГО КРАЯ) 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2014...»

«Номер: KZ61VCY00072512 Дата: 15.07.2016 АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ МИНИСТЕРСТВО ЭНЕРГЕТИКИ ЭНЕРГЕТИКА МИНИСТРЛІГІ РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН МНАЙ-ГАЗ КЕШЕНДЕГІ КОМИТЕТ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ЭКОЛОГИЯЛЫ РЕТТЕУ, РЕГУЛИРОВАНИЯ, КОНТРОЛЯ И БАЫЛАУ ЖНЕ МЕМЛЕКЕТТІК...»

«2015 Географический вестник 2(33) Экология и природопользование ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ УДК 004.6:581.55 П.Н. Бахарев, В.В. Семенов, Д.Н. Андреев27 ГЕОИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА ДАННЫХ ТЕРРИТОРИИ ЗАПОВЕДНИКА "ВИШЕРСКИЙ" В статье приведены результаты сбора, подготовки и внесения пространственных данн...»

«1.2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Новрузов В. С., Исаева Ф. М. Novruzov V. S., Isaeva F. M. Лишайники — биоиндикаторы атмосферного за Lichens are biological indicators of atmospheric po грязнения Кожаева Д. К., Жантеголо...»

«Песков В.Н., Тарасенко М.О., Франчук М.В. 82 Изменчивость линейных размеров. птенцов обыкновенного жулана УДК 598.292:591.3 ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ, ПРОПОРЦИЙ ТЕЛА И ПЕРИОДИЗАЦИЯ РАЗВИТИЯ ПТЕНЦОВ ОБЫКНОВЕННОГО ЖУЛАНА LANIUS COLL...»

«ООО "ИНСТИТУТ РЕСТАВРАЦИИ, ЭКОЛОГИИ и ГРАДОСТРОИТЕЛЬНОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ" Муниципальный заказчик: Комитет архитектуры и градостроительства администрации городского округа "Город Калининград". ДОКУМЕНТАЦИЯ ПО ПЛАНИРОВКЕ ТЕРРИТОРИИ Проект планировки с проектом межевани...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.