WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 5 ] --

Многочисленные исследования показали, что материнская депривация (МД) в ранний постнатальный период развития является серьезным стрессогенным воздействием и вызывает негативные изменения поведения и физического развития животных. Ранее было показано, что введение аналога фрагмента АКТГ(4-10) семакса детенышам белых крыс в течение 1–3-й недель жизни приводит к эффектам, противоположным описанным в литературе эффектам неонатального стресса.

Целью работы являлась оценка возможности коррекции отставленных эффектов хронической МД у белых крыс с помощью введения семакса в течение 3–4-ой недель жизни. Каждый выводок делили на 3 группы: «контроль», «МД», «МД+сем». С 1-го по 14-й дни жизни крысята групп «МД» и «МД+сем» ежедневно на 5 часов в день помещались в индивидуальные боксы. С 15-го по 29-й дни жизни крысята группы «МД+сем» получали ежедневные интраназальные инъекции семакса в дозе 0.05 мг/кг массы тела, животные из групп «контроль» и «МД»

– инъекции воды в том же объеме. Крысят регулярно взвешивали. На 15-й и 60-й дни жизни измеряли уровень глюкозы в крови у животных, находящихся в условиях свободного доступа к пище. На 42-й день жизни оценивали пищевую мотивацию крыс и измеряли уровень глюкозы в крови после пищевой депривации.

Масса тела животных группы «МД» была достоверно ниже контроля до возраста 62 дней. У животных группы «МД+сем» также отмечалось отставание в росте по сравнению с контролем в течение первых полутора месяцев жизни, но уже на 55-й день жизни достоверных отличий от контроля не наблюдалось.



Уровень глюкозы в крови у животных группы «МД» был достоверно ниже контроля при всех измерениях. У крыс группы «МД+сем» уровень глюкозы в крови на 42-й и 60-й дни жизни не отличался у контроля. При этом у животных группы «МД+сем» отмечалось повышение пищевой мотивации по сравнению с другими группами. Таким образом, введение семакса в течение 3–4-й недель жизни частично компенсирует негативное влияние хронической МД на физическое развитие белых крыс.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК № П1057) и РФФИ (грант № 11-04-01329).

Стендовые доклады 207

АНТИДЕПРЕССАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНАЛОГА С-КОНЦЕВОГО

ФРАГМЕНТА АРГИНИН-ВАЗОПРЕССИНА –

ТЕТРАПЕПТИДА N-Ac-D-МET-PRO-ARG-GLY-NH2 Воскресенская О.Г.1, Голубович В.П.2, Каменский А.А.1 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220600, Минск -23, Академгородок, Жодинская, 5, Беларусь

E-mail: voskresenskaya05@mail.ru

Одним из поведенческих признаков, по которым можно судить о развитии у грызунов состояния депрессии, является развитие у них «поведенческого отчаяния»

(увеличения длительности иммобилизации) в тесте принудительного плавания.

Ac-D-MPRG вводили самкам интраназально в дозе 10 мкг/кг с 11 дня беременности и до родов. Мы проводили определение структуры и параметров поведения в данном тесте на 27, 40 и 70-ый день жизни потомства (29 контрольных и 39 опытных животных). Фиксировали длительность активного и пассивного плавания, длительность иммобилизации, время ее наступления и ряд других показателей.

Исследование показало, что на 27-ой день наблюдалось достоверное (p=0,01) увеличение длительности активного и пассивного плавания, иммобилизация наступала позднее, а ее продолжительность была в 2 раза меньше, чем у контрольных животных (p=0,02).





На 40-ой день у животных опытной группы достоверно снижалась длительность активного плавания и увеличивалась длительность пассивного плавания (p=0,02). Иммобилизация наступала позднее, количество актов иммобилизации было снижено (p=0,01). На 70-ый день структура и параметры плавательного поведения опытной и контрольной групп были одинаковы. Известно, что у крыс к концу внутриутробного развития вазопрессинергическая система организована так же, как у взрослых животных. По-видимому, в результате непрямого действия на эту систему Ac-D-MPRG, введенный беременным самкам, повышает способность потомства адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей обстановки, снижая уровень тревожно-фобических реакций. Наиболее ярко антидепрессантное действие Ac-D-MPRG выражено на 27–40 дни жизни, то есть до периода полового созревания потомства.

Работа выполнена в рамках соглашения о научно-техническом сотрудничестве по созданию лекарственного препарата ноотропного действия для внедрения в медицинскую практику Российской Федерации и Республики Беларусь между ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси» и кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВЫЕ ФУНКЦИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА NOGGIN:

ИНГИБИРОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ КАСКАДОВ TGF- И WNT

Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: xenopus@nm.ru Секретируемый белок Noggin (Noggin1), впервые открытый у шпорцевой лягушки Xenopus как нейральный индуктор, способен связывать белки семейства BMP (Bone Morphogenetic Proteins). Благодаря этому свойству Noggin1 выполняет функцию ингибирования BMP-сигнального каскада и играет ключевую роль во многих процессах, включая индукцию нервной ткани и скелетной мускулатуры в эмбриогенезе, развитие хрящей и дифференцировку волосяных фолликулов.

Помимо «классического» Noggin1, у позвоночных нами были найдены две другие группы белков семейства Noggin, Noggin2 и Noggin4. Нами было показано, что микроинъекция мРНК Noggin2 в вентральные бластомеры эмбрионов Xenopus laevis может вызывать формирование вторичной головы – процесс, который требует одновременного подавления BMP, Nodal/Activin и Wnt-сигнальных каскадов.

Чтобы изучить функцию белка Noggin2 и идентифицировать его молекулярные мишени, мы сравнили лиганд-связывающие свойства Noggin1 и Noggin2, экспрессированных в ранних эмбрионах Xenopus, а также их способность подавлять BMP, Nodal/Activin и Wnt-сигнальные каскады. Предварительно мы установили, что способность к трансляции мРНК Noggin1 дикого типа необычно низка, поэтому особое внимание в ходе последующих экспериментов было уделено выравниваю «транслируемости» мРНК Noggin1 и Noggin2 путем модификации их 5’-нетранслируемых областей.

В результате мы впервые установили, что Noggin1, как и Noggin2, способен связывать in vitro, помимо BMP, ряд белков Nodal/Activin и Wnt каскадов – ActivinB, Xnr2, Xnr4 и Wnt8 и ингибировать эти каскады in vivo. Однако, поскольку из-за низкой транслируемости дикого типа мРНК Noggin1 концентрация его белка в клетках чрезвычайно низка, в нормальном развитии существенную роль играет только BMP-антагонистическое свойство Noggin1, что обусловлено необычайно высокой аффинностью Noggin1 к BMP лигандам. В тоже время, одной из ключевых функций Noggin2 в эмбриогенезе является подавление активности Activin и Wnt в клетках зачатка переднего мозга.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 209

РАЗРУШЕНИЕ БИОПЛЕНОК СТАФИЛОКОККОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА

Полюдова Т.В., Лемкина Л.М., Коробов В.П.

Учреждение РАН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 Пермь, ул. Голева, 13 E-mail: korobov@iegm.ru Бактерии рода Staphylococcus обладают выраженной способностью к образованию биопленок на различных поверхностях, что представляет серьезную медицинскую проблему в связи со снижением уязвимости бактерий в этом состоянии для иммунных защитных механизмов человека и повышением устойчивости к антибактериальным препаратам. Одним из подходов к подавлению формирования и функционирования биопленок коагулазонегативных стафилококков, как показали наши исследования, является их направленное разрушение под действием низкомолекулярного катионного пептида варнерина благодаря активации аутолитических систем бактериальных клеток.

В работе использовали 25 клинических штаммов коагулазонегативных стафилококков, в разной степени способных формировать биопленки. Биопленки выращивали в полистироловых 96-луночных планшетах на жидкой среде LB. Инкубацию проводили при 37оС в течение 48 ч, после чего пленки промывали 0.9% раствором NaCl и в лунки вносили раствор варнерина в концентрации 4 мг/мл. Планшеты инкубировали при 37оС в течение 2 ч, биопленки промывали 0.9% раствором NaCl, подсушивали и окрашивали 0.1% раствором генцианвиолета. Оптическую плотность этанольных экстрактов связавшегося с пленками красителя измеряли на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus «BioRad» (США) при длине волны 570 нм.

В результате проведенных исследований обнаружено, что под действием варнерина происходит разрушение биопленок значительного числа исследованных штаммов (68%). Биомасса пленок, сформированных бактериями этих штаммов, после инкубации с варнерином снижалась более чем в 2 раза по сравнению с контролем.

Полученные результаты указывают на выраженную способность варнерина деградировать зрелые биопленки коагулазонегативных стафилококков.

Работа поддержана грантами РФФИ № 10-04-96086-р_урал_а, Программ Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» № 09-П-4-1019 и УрО РАН № 09-М-14-2002, офи-10-14-12-НАБ.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВАЦИИ АУТОЛИЗИНОВ БАКТЕРИЙ

STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS КАТИОННЫМ ПЕПТИДОМ

ВАРНЕРИНОМ И ДЕТЕРГЕНТАМИ

Филатова Л.Б., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Коробов В.П.

Учреждение РАН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 Пермь, ул. Голева, 13 E-mail: korobov@iegm.ru Широкое применение антибиотиков приводит к быстрому формированию резистентности бактерий к антибиотикам, что определяет необходимость поиска новых эффективных лекарственных соединений. Такими соединениями могут стать низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантибиотиков, обеспечивающие защиту микроорганизмов-продуцентов от ближайшего бактериального окружения. Воздействуя на связанные с пептидогликаном клеточной стенки аутолизины, катионные пептиды вызывают активацию этих гидролитических ферментов, результатом которой является лизис и гибель атакуемых бактериальных клеток.

В работе представлены данные анализа бактериолитического действия на клетки S. epidermidis 33 катионного пептида варнерина и различных детергентов – додецилсульфата натрия, цетавлона и тритона Х-100. Аутолиз инициировали внесением в клеточные суспензии S. epidermidis 33 лизирующих факторов с дальнейшей инкубацией на шейкере при 150 об/мин и 37оС в течение 3–4 ч. Оценку динамики лизиса проводили измерением оптической плотности суспензий бактерий (OD600). По окончании инкубации аликвоты проб центрифугировали и супернатанты подвергали ренатурирующему электрофорезу в ПААГе, содержащем автоклавированные клетки S. epidermidis 33. После обработки гелей метиленовым синим, краситель отмывали водой до проявления прозрачных полос зон лизиса на синем фоне и проводили анализ степени гетерогенности аутолизинов в препаратах.

Результаты экспериментов показали, что варнерин и детергенты обладают выраженным литическим действием на бактерии S. epidermidis 33. Эффект детергентов был несколько слабее действия пептида, что проявлялось в меньшей гетерогенности зон активированных гидролаз. При этом обнаружено что, препараты аутолизатов содержали помимо общих фракций, характерные только для активации каждым из использованных литических факторов. Таким образом, профили активируемых пептидом и детергентами фракций пептидогликан-гидролаз существенно различаются.

Работа поддержана грантами РФФИ № 10-04-96086-р_урал_а, Программ Президиума РАН «МКБ» № 09-П-4-1019 и УрО РАН № 09-М-14-2002, офи-10-14-12НАБ.

Стендовые доклады 211

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ АНАЛЬГЕТИЧЕСКИХ

ПЕПТИДОВ АНЕМОНЫ HETERACTIS CRISPA

Королькова Ю.В., Мошарова И.В., Андреев Я.А., Гришин Е.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Е-mail: july@ibch.ru http://www.ibch.ru/about/history/personalia/740 Современный способ направленной терапии болевых симптомов – активное воздействие на рецепторы, которые непосредственно воспринимают болевые стимулы и/или медиаторы воспаления. Открытые недавно природные пептиды APHC1из экстракта анемоны Heteractis crispa проявляют значительный анальгетический эффект в различных моделях боли in vivo. Было показано, что пептид APHC1 на 30–40% ингибируют проводимость экспрессированных в ооцитах каналов TRPV1.

Изучение действия анальгетических пептидов APHC1-3 проводилось на стабильной линии клеток CHO, экспрессирующей рецептор TRPV1. Данная линия была получена с использованием T-REx System (Invitrogene). Клетки, экспрессирующие рецептор, прокрашивались Са2+-чувствительными флуоресцентными зондами (Fluo-4), и исследовалось влияние различных концентраций пептидов на Са2+ сигналы, индуцируемые при стимуляции клеток агонистами рецепторов (капсаицин, рН, температура). Был использован метод флуоресцентной спектроскопии в комбинации с применением планшетного спектрофотометра с интегрированной автоматической системой дозирования жидкостей NOVOstar (BMG LABTECH) и прибора RT-PCR (ДНК-Технология). Было показано, что пептиды APHC1 и APHC3, в отличие от капсазепина – известного блокатора TRPV1 каналов, не вызывают значительного падения Са2+ ответа клеток при однократной активации клеток капсаицином, а также при приложении рН=6.0–5.5 и повышенной температуры (44С), однако, при применении слабого активационного стимула (рН 6.5) APHC1 и APHC3 значительно снижают кальциевый ответ на последующий капсаициновый стимул. Полученные данные свидетельствуют о более сложном механизме действия пептидов, затрагивающего различные переходные состояния рецептора во время активации-десенсетизации.

Показано, что данная клеточная система может быть использована для быстрого скрининга и поиска новых активных соединений по отношению к TRPV1-рецепторам, в том числе соединений, проявляющих модулирующую активность.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ N-КОНЦЕВЫХ МОДИФИКАЦИЙ -КОНОТОКСИНА MII

НА ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

Крюкова Е.В.1, Сурин А.М.2, Струков А.С.1, Жмак М.Н.1, Кашеверов И.Е.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Научный центр здоровья детей РАМН, 119991 Москва, Ломоносовский просп., 2/62

E-mail: evkr@mail.ru

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) нейронального типа участвуют в возникновении никотиновой зависимости, нейропатическом болевом синдроме, вовлечены в процессы мышления, участвуя в обучении и памяти, а нарушения их функционирования служат причиной или сопровождают различные психические и нейродегенеративные заболевания. Химические соединения, специфически действующие на определенные подтипы нАХР, могут являться новыми лекарственными препаратами. В связи с этим актуальна идентификация в норме и при патологиях отдельных подтипов нАХР, как возможных индикаторов и мишеней заболеваний. Преимущество -конотоксинов, как инструмента для детекции нАХР, состоит в их разнообразии и возможности тонко идентифицировать различные подтипы рецепторов. -Конотоксин MII из яда моллюска Conus magnus обладает сродством в наномолярном диапазоне к 6 и 32 подтипам нейрональных нАХР и, в отличие от других конотоксинов, медленнее отмывается из комплексов с рецептором в электрофизиологических экспериментах.

Нами синтезированы два аналога -конотоксина MII, различающиеся модификациями по N-концевому остатку глицина флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и реагентом Болтон-Хантера, а также тирозиновый аналог MII-Yо. В качестве модельной системы для оценки активности полученных производных конотоксинов использованы клетки нейробластомы человека SH-SY5Y, которые экспрессируют 3, 5, 7 и 2, 4 субъединицы нАХР нейронального типа. Физиологическая активность синтезированных аналогов оценивалась по подавлению индуцированного никотином входа натрия и кальция в клетки нейробластомы SH-SY5Y.

В результате проведенных экспериментов установлено, что производное Болтон-Хантера обладает большей активностью и более пригодно для синтеза йодированных производных, чем тирозиновый аналог. Также показано, что FITC модификация значительно ослабляет ингбирующий эффект МII.

Стендовые доклады 213

РОЛЬ ИОНОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ НА РАННИХ СТАДИЯХ

ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

IN VITRO

Литвинов И.С., Мерсиянова И.В., Кирпичников М.П.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: lis@mx.ibch.ru, imers@mail.ru Организм человека поддерживает ионный гомеостаз внутренних жидкостей с поразительной точностью. Именно эти условия принято считать наиболее оптимальными для функционирования организма и клеток иммунной системы. Величина концентрации ионов внеклеточного кальция ([Ca2+]o) в периферической крови человека (ПКЧ) является важной составляющей гомеостаза. Для нее определены верхняя 1,10 мМ и нижняя 0,45 мМ границы нормы, а длительное отклонение от этих значений считается признаком патологии. Общий сепсис, СПИД, туберкулез и некоторые лейкозы, часто приводят к длительным отклонениям величины [Ca2+]o в ПКЧ от нормы.

Активация ПКЧ приводила к резкому росту доли CD4+CD69+ клеток с 12% в исходной популяции до 6580% среди всех CD4+ Т-лимфоцитов. Зависимость доли активированных CD4+CD69+ Т-клеток от значений [Ca2+]o в исследуемом интервале от 1,5 мМ до 0,1 мМ имеет два ярко выраженных максимума, различающихся по ширине и положению, а также локальный минимум между ними. Первый из них – широкий, расположен большей частью в пределах нормы для [Ca2+]o в ПКЧ и частично «заходит» в область патологических значений для этого иона.

Положение этого максимума чаще всего смещено к нижней границе нормы. Второй из них – узкий, находится в области между нижней границей нормы и минимальными физиологическими значениями для [Ca2+]o в ПКЧ. При дальнейшем снижении величины [Ca2+]o до значений ниже физиологических (0,1 мМ и меньше) в популяции уже не обнаруживалось более 13% CD4+CD69+ Т-клеток.

Активированные CD4+ Т-клетки синтезировали молекулы ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛА, ИФН- и ФНО-. Зависимость доли активированных CD4+ Т-клеток, продуцирующих эти цитокины от значений [Ca2+]o в исследуемом интервале также имеет два ярко выраженных максимума. Аналогичным же образом зависела от значений [Ca2+]o и общая продукция клетками ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛр40, ИЛ-12р70, ИЛ-17А, ИФН- и ФНО-. Скорее всего, одна из субпопуляции CD4+ Т-клеток специализируется именно на «работе» в условиях патологии.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ

РАСЩЕПЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Мухин В.А., Пискунович Д.И.

Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича, 183038 Мурманск, ул. Книповича, 6 E-mail: vmukhin@pinro.ru Степень деструкции белков – важнейшая характеристика любого белоксодержащего сырья или продукта, так как именно этот показатель, главным образом, определяет его качество и пищевую пригодность. Кроме того, этот показатель косвенно отражает активность протеолитических ферментов.

Определяющим процессом в ходе гидролиза белков является накопление низкомолекулярных продуктов белковой деградации. Перманентный распад белков происходит в процессе хранения любой белоксодержащей продукции. Как правило, происходит ферментативный распад под воздействием собственных протеиназ, а также протеолитических ферментов размножающихся микроорганизмов.

Это классические ферментативные процессы и их интенсивность зависит от температуры и рН среды, а также от ряда других менее значимых факторов.

На протяжении многолетних исследований в лаборатории биохимии Полярного Института мы оценивали степень деградации белков различными способами.

Объектом исследований являлись, главным образом, белки рыбного происхождения.

Мы использовали следующие критерии и методы: показатель степени гидролиза белков – соотношение аминного (Nам.) и общего (Nобщ.) азота; соотношение свободных аминокислот (САК) и крупных белков; показатель (Nам.)/(Nобщ.); соотношение небелкового азота к общему (Nнб.)/(Nобщ.); изменение оптической плотности растворов белковых гидролизатов при 280 нм; определение молекулярно-массового состава пептидов методом гель-фильтрации на колонке сефадекса Gа также ВЭЖХ и электрофорезом в ПААГ. Применялись и некоторые другие методы.

Каждый из упомянутых методов имеет свои недостатки и преимущества.

Вероятно, не существует универсального показателя, который единственно объективно отражал бы глубину и степень расщепления белков, поэтому мы считаем, что при детальном описании свойств белков (равно как и протеиназ) необходимо приводить данные, полученные с применением различных методов.

Стендовые доклады 215

ОТСТАВЛЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ

СОЙМОРФИН-5-АМИДА НА ОБУЧЕНИЕ

С ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ ПОДКРЕПЛЕНИЕМ

Сарычева Н.Ю.1, Иванова Е.А.1, Дубынин В.А.1, Каменский А.А.1, Калихевич В.Н.2, Ардемасова З.А.

МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12 Санкт-Петербургский государственный университет, 199034 С.-Петербург, Университетская наб., 7/9

E-mail: katya.kilgor@gmail.com

В дополнение к уже известным экзорфинам (казоморфинам, рубисколинам, цитохрофинам) недавно была открыта новая их группа – сойморфины, образующиеся при расщеплении -конглицинина сои. Это первые опиоидные пептиды растительного происхождения, для которых показана избирательная активация -типа опиоидных рецепторов. Действие сойморфинов на организм, в частности, на ЦНС, практически не изучено. Известно, что эти пептиды обладают анксиолитическим действием при внутрибрюшинном и пероральном введении [Ohinata et al., 2007].

Ранее нами было показано, что экзорфины способны изменять поведение не только при однократном, но и при хроническом введении, оказывая отставленное «программирующее» действие на созревание мозга детёнышей [Дубынин, Каменский, 2010]. В данной работе изучалось отставленное влияние сойморфин-5-амида (YPFVV-NH2) на обучение с положительным подкреплением. Пептид вводили беспородным крысам в течение первых 14 дней жизни (1 мг/кг, в/б), обучение осуществляли в лабиринте с пищевым подкреплением в возрасте 43–48 дней. Показано, что действие пептида на способность к обучению зависит от пола животных. У самцов подопытной группы количество ошибок и время нахождения подкрепления оказались меньше, чем в контроле; различия увеличились к последнему дню обучения. Напротив, у самок подопытной группы число ошибок и время реакции были больше, чем в контроле. Эти отличия также проявились сильнее в конце обучения. При переучивании в зеркальном варианте лабиринта выявлены аналогичные эффекты пептида. Можно заключить, что введение сойморфина в первые дни жизни значимо изменяет способность крыс к обучению; очевидно, это связано с действием препарата на центральные -рецепторы, следствием чего стали изменения в развитии некоторых участков мозга. Ранее подобные эффекты были описаны нами для -казоморфина-7, изменяющего, прежде всего, активность 5HT-системы в различных отделах ЦНС.

Изучение сойморфинов проводится в рамках исследования роли различных компонентов детского питания в развитии мозга новорожденных.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

УРОВЕНЬ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА В ТКАНЯХ РЫБ

КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

Суховская И.В., Смирнов Л.П., Борвинская Е.В., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: suhovska@krc.karelia.ru С помощью флуориметрического метода проведено исследование содержания восстановленного глутатиона, кофактора второго этапа биотрансформации ксенобиотиков, в печени и мышцах щуки, плотвы и сига, выловленных из оз. Каменное (Костомукшский заповедник) и хвостохранилища Костомукшского горно-обогатительного комбината (ГОК). Было показано, что концентрация глутатиона во всех исследованных тканях рыб из хвостохранилища была ниже по сравнению с рыбами из оз. Каменное. Известно, что глутатион увеличивает резистентность клеток к токсическим веществам, а также играет ключевую роль в защите от последствий окислительного стресса. При его недостатке часто фиксируются серьезные нарушения тканевых функций. Соответственно, более низкая концентрация восстановленного глутатиона в тканях исследованных рыб, выловленных в хвостохранилище Костомукшского ГОКа, по сравнению с контрольной группой указывает на снижение адаптивных возможностей организмов рыб в условиях данного типа загрязнения.

Интересно отметить, что уровень восстановленного глутатиона во всех тканях щуки был в несколько раз ниже по сравнению с другими исследованными видами.

Вероятно, это связано с экологическим статусом того или иного вида рыб. Сиг и плотва – рыбы со смешанным типом питания, тогда как щука – облигатный хищник. Обнаружена также возрастная зависимость содержания восстановленного глутатиона в тканях исследованных рыб.

Исследования различных тканей (печень, мышцы, почки, головной мозг) форели садкового содержания в возрасте 1+ показали, что наибольшая концентрация глутатиона выявлена в печени и почках рыб, тогда как в жабрах и мышцах этот показатель был наименьший. По нашему мнению, эти различия связаны с функциональным предназначением той или иной ткани.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Программы Президента РФ «Ведущие научные школы России» НШ № 3731.2010.4 и Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие» 2009–2011 гг.

Стендовые доклады 217

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ВНУТРИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ

МИКРОКАПСУЛ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ рН СРЕДЫ

Шабарчина Л.И.1, Дубровский А.В.1, Санталова И.М., Казакова Л.И.1, Мошков Д.А.1, Аполонник Н.В.2 Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская обл.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

E-mail: shabarchina@rambler.ru

Полиэлектролитные микрокапсулы, изготавливаемые методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы микроразмеров с последующим разрушением и удалением этих частиц, являются объектами новой быстро развивающийся области – полимерной нанотехнологии.

Такие микрокапсулы являются многофункциональными объектами. Они могут быть использованы в качестве микрореакторов для проведения химических и биохимических реакций в малом объёме; для инкапсулирования макромолекул, при котором оболочка микрокапсулы будет защищать их от негативного воздействия извне. Впечатляющими являются результаты по их использованию в качестве матриц для получения металлических полупроницаемых оболочек с магнитными и проводящими свойствами. В последнее время крайне перспективным является капсулирование различных ферментов, для успешного осуществления которого необходимо знать, как распределяется инкапсулированный белок внутри полиэлектролитных микрокапсул.

В работе методами конфокальной и электронной микрскопии установлено распределение белка, заполняющего объем таких микрокапсул в зависимости от рН среды. Оно возможно в двух вариантах: равномерное распределение белка по всему объему и концентрирование его агрегатов в пристенковом пространстве. Нами был закапсулирован ферритин – электронноплотный белок, который хорошо виден в электронный микроскоп. Нами было показано, что в случае, когда рН равен 5,2, (что соответствует изоэлектрической точке белка) молекулы протеина располагаются преимущественно вблизи внутренней поверхности оболочки. При смещении рН в кислую область, наблюдается равномерное распределение белка по всему объему микрокапсулы. Такое его поведение обусловлено, по-видимому, тем, что молекулы белка, заряженные преимущественно нейтрально возле изоэлектрической точки, хорошо взаимодействуют с внутренней поверхностью оболочки микрокапсулы. В случае же смещения рН в кислую область молекулы белка заряжаются положительно и отталкиваются от внутреннего полиэлектролитного слоя оболочки, который сформирован из положительно заряженного полиаллиламина.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

МЕХАНИЗМ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ СЕЛЕКТИВНОСТИ

КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Т ИЗ THERMOACTINOMYCES VULGARIS

Акпаров В.Х.1, Тимофеев В.И.2, Куранова И.П.2 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1 Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, 119333 Москва, Ленинский просп., 56

E-mail: valery@akparov.ru

Для рационального дизайна ферментов с заданной селективностью необходимо изучение природных механизмов регуляции селективности ферментов. Удобным объектом для этого является карбоксипептидаза Т (КПТ) Thermoactinomyces vulgaris. В КПТ присутствует 4 структурно связанных иона кальция, удаление которых приводит к двукратному уменьшению эффективности катализа положительно и отрицательно заряженных трипептидных субстратов с одновременным 1,5 кратным улучшением эффективности катализа гидрофобных субстратов (Гришин и др., 2008). Эти ионы кальция не входят в состав активного центра и являются дистантными детерминантами субстратной специфичности КПТ.

С разрешением 1,69 получена кристаллическая структура КПТ, лишенной структурных ионов кальция. Проведено её сравнение со структурой, полученной ранее (Teplyakov A., 1991) в присутствии ионов кальция. Обнаружены изменения конформации сайтов связывания кальция (поворот карбонила 313 остатка на 180 градусов, изменение подвижности пептидной цепи), с чем может быть связано уменьшение термостабильности лишенной кальция КПТ. Произошло также смещение положения бокового радикала Glu61, расположенного в другой зоне связывания кальция, и сдвиг пептидной цепи, который визуально прослеживается до 65-го остатка. Произошли изменения во вторичной структуре фермента (укорочение некоторых альфа-спиралей и бета-структур). Удалением кальция из своих сайтов в конечном итоге вызвало увеличение подвижности аминокислотных остатков в районе Glu250, что привело к появлению двух молекул кристаллизационной воды, связанной с его боковым радикалом. Произошел сдвиг кислорода пептидной группы Ala251, входящего в состав S1’-субсайта КПТ, в положение, более удобное для образования водородной связи с молекулой кристаллизационной воды № 499 непосредственно в полости S1’-субсайта. Это несколько уменьшило способность последней образовывать водородные связи с гидрофильными лигандами (например, с боковым радикалом аргинина), что может быть причиной наблюдаемого изменения субстратной специфичности КПТ.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01541.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НОВОГО АНАЛОГА ФРАГМЕНТА АКТГ

НА УРОВЕНЬ ТРЕВОЖНОСТИ ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ

И НА ФОНЕ ОСТРОГО СТРЕССОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Глазова Н.Ю.1, Левицкая Н.Г.1, Атанов М.С.2, Себенцова Е.А.1, Андреева Л.А.1, Манченко Д.М., Мясоедов Н.Ф.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12

E-mail:tusy-g@yandex.ru

Многочисленные исследования показали, что меланокортины (АКТГ/МСГ-подобные пептиды) обладают широким спектром физиологической активности. Пептиды этого класса оказывают влияние на процессы памяти и обучения, сердечно-сосудистую систему, обладают нейропротекторным действием, модулируют болевую чувствительность. Также показано, что меланокортины играют важную роль в регуляции эмоционального состояния животных. Проведенные ранее исследования позволяют предположить, что присоединение последовательности PGP к различным фрагментам АКТГ приведет к увеличению выраженности их эффектов.

В работе исследовали влияние пептида, структура которого включает в себя последовательность природного фрагмента АКТГ и трипептид PGP, на уровень тревожности белых крыс в норме и после острого стрессогенного воздействия. В качестве стрессогенного воздействия использовали неизбегаемое электро-болевое раздражение. Уровень тревожности животных оценивали в тестах приподнятый крестообразный лабиринт, темная-светлая камера и О-образный лабиринт. Было показано, что пептид в дозе 50 и 250 мкг/кг вызывает снижение тревожности животных через 15 мин после введения. Через 24 часа после инъекции уменьшение тревожности отмечалось в группе крыс, получавших пептид в дозе 250 мкг/кг. Использованное стрессогенное воздействие вызывало увеличение тревожности животных как через 15 мин, так и через 24 часа после стресса относительно нестрессированного контроля. В группе крыс, получавших инъекцию пептида в дозе 50 и 250 мкг/кг, уровень тревожности был достоверно снижен относительно группы крыс, перенесших стрессогенное воздействие. Более того, введение пептида приводило к достоверному снижению тревожности по сравнению с группой нестрессированного контроля. Следовательно, новый синтетический аналог фрагмента АКТГ обладает выраженной анксиолитической активностью.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК №П1057) и РФФИ (грант № 11-04-01329).

Стендовые доклады 221

ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ И ШАПЕРОНО-ПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ

БЕТА-КАЗЕИНА

Захарченко Н.Л.1, Коннова Т.А.1, Гоголева Н.Е.1, Зуев Ю.Ф.1, Haertl T.2 Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 Национальный институт агрономических исследований, Нант (Франция)

E-mail: natasha@mail.knc.ru

В последнее время к белкам, обладающим шапероно-подобной активностью, стали относить семейство казеинов, и в первую очередь, бета-казеин, который способен предохранять от агрегации не только сывороточные белки молока, но и ингибировать образование амилоидных фибрилл. Молекулы бета-казеина амфифильны, обладают нечетко выраженной и подвижной структурой, а также демонстрируют сильную тенденцию к самоассоциации в сферические стабильные мицеллоподобные структуры.

Основной целью работы являлось исследование структуры и агрегационных свойств природной и модифицированных форм бета-казеина, а также их шапероно-подобной активности по отношению к ряду целевых белков. Для выяснения взаимосвязи структурных особенностей бета-казеина и его функциональной активности нарабатывались и исследовались рекомбинантные формы белка с минорными модификациями полипептидной цепи. А именно, в различные участки структуры вводились один или два цистеиновых остатка, что, при окислении сульфо-групп, приводило к образованию олигомерных форм белка.

В докладе рассмотрены результаты сравнительных исследований структуры и агрегационных свойств природной и модифицированных форм бета-казеина. Показано, что димерные и олигомерные формы бета-казеина существенно отличаются по своим физико-химическим свойствам от мономерных аналогов. Введение цистеина в концевую или центральную область полипептидной цепи вызывали спонтанную полимеризацию бета-казеина, кроме того, одновременная замена в двух концевых областях вела к формированию олигомеров и «кольцевой» формы белка. В работе проанализированы возможные молекулярные механизмы шапероно-подобного действия различных рекомбинантных форм бета-казеина в мономерном и полимерном состояниях. Показано, что полимеризация и формирование мицелл бета-казеина оказывают значительное влияние на шапероно-подобную активность белка.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТА КОЛЛАГЕНА НА МОРФОЛОГИЮ

И ЦИТОСКЕЛЕТ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ

Иванова В.П.1, Ковалева З.В.2, Анохина В.В.3, Сорочинская Е.И.3, Кривченко А.И.1 Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. Тореза, 44 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, С.-Петербург СПбГУ, С.-Петербург

E-mail: valet@iephb.ru

Известно, что белок-белковые взаимодействия обеспечивают контроль формирования клеточных контактов и передачу сигнала через клеточную мембрану.

Существуют опорные белки, которые, благодаря наличию в их последовательностях белок-связывающих доменов или модулей, создают основу для взаимодействий с различными полипептидами. Одним из таких белков, который взаимодействует не только с белками внеклеточного матрикса, но и со специфическими клеточными рецепторами (интегринами и др.) является коллаген. Имеются многочисленные факты, свидетельствующие о наличии в первичной структуре молекул коллагенов пептидных доменов, которые обеспечивают связывание коллагена со специфическими лигандами. Кроме лиганд-связывающих доменов молекулы коллагена содержат пептидные модули с потенциальной регуляторной активностью, которая проявляется только после выщепления этих фрагментов в ходе неполного протеолиза молекул коллагена.

Мы исследовали влияние повторяющегося трипептидного фрагмента коллагена на морфологию и актиновый цитоскелет эмбриональных фибробластов мыши линии STO. Клетки обрабатывали пептидом (10-6 М) и оценивали изменение формы клеток в течение 4 час с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для визуализации микрофиламентов окрашивали F-актин флуоресцентным красителем родамин-фаллоидином. Клетки пересевали на покровные стекла за 60 мин до начала окраски. Установлено, что наибольшее влияние на морфологию клеток пептид оказывал в течение первых 30 мин распластывания фибробластов на твердой поверхности. Пептид увеличивал скорость образования филоподий и количество актиновых микрофиламентов. По-видимому, пептид, активируя процессы полимеризации актина, способствует как ускорению формирования мембранных протрузий, так и их удлинению. Создание нетоксических лекарственных препаратов на основе природных соединений, которые обладали бы свойством ускорять или ингибировать ламеллиподиальную и филоподиальную активность клеток, остается важной задачей в связи с необходимостью иметь средства для координации направленного движения клеток с заданными свойствами в поврежденные зоны тканей и органов.

Стендовые доклады 223

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ ЭПИТАЛОНА

И МЕЛАТОНИНА НА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

КРЫС Илюха В.А.1,2, Виноградова И.А.2, Ильина Т.Н.1, Узенбаева Л.Б.1, Хижкин Е.А.1, Кижина А.Г., Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 ФГОУ ВПО Петрозаводский государственный университет, Петрозаводск НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, С.-Петербург Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, С.-Петербург

E-mail: ilyukha@bio.krc.karelia.ru

Пинеальная железа играет существенную роль в координации многих физиологических функций у млекопитающих благодаря влиянию на иммунную, нейроэндокринную систему и центральные механизмы регуляции. С возрастом происходит ослабление её функционирования, с чем связывают процесс старения организма. Введением синтетического тетрапептида эпиталона (ЭТ; Ala-Glu-Asp-Gly) или экзогенного мелатонина (МТ) можно «омолаживать» железу и опосредовано влиять на уровень гормона в сыворотке крови и тканях.

Целью нашего исследования было сравнение влияния ЭТ и МТ на состояние систем генерации и тушения активных форм кислорода, морфофункциональные особенности лейкоцитов крови крыс в процессе старения (6, 12, 18 и 24 месяца).

Исследование эффектов препарата проводилось на фоне нормального, усиленного или ослабленного функционирования эпифиза – при регулярном чередовании света и темноты (12/12), постоянной темноте и постоянном освещении, соответственно, а также при естественном фотопериоде.

Эффекты препаратов зависели от уровня эндогенного МТ, который определяется возрастом животных, световым режимом и сезоном года. У крыс, содержавшихся при постоянном и естественном освещении, отмечено максимальное количество изменений под влиянием препаратов, причём, в первом случае действие ЭТ и МТ носило преимущественно однонаправленный, а во втором – разнонаправленный характер. Функциональное усиление работы эпифиза постоянной темнотой и препараты оказывали сходное влияние на изученные параметры. Нормализующие эффекты ЭТ и МТ сильнее проявляются на фоне ослабления функционирования пинеальной железы у стареющих и старых животных.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ НШV Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВЫЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ

С НЕИЗВЕСТНОЙ ФУНКЦИЕЙ

Горбачева М.А.1,2, Ярош А.Г.1, Корженевский Д.А.1, Яковлев А.К.1, Дороватовский П.В., Липкин А.В.

НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 1 Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33., стр.2

E-mail: gorbacheva-marina@yandex.ru

В последнее десятилетие, когда каждый год выходят сиквенсы десятков геномов и расшифровываются сотни новых пространственных структур макромолекул, всё более критичным становится отставание функциональных исследований белков.

Белки с ещё не изученными функциями на сегодняшний день составляют 30–40% от общего количества белков, закодированных в любом бактериальном геноме, и даже больший процент в случае эукариотических геномов, включая геном человека. Поэтому развитие новых подходов к изучению белков с неизвестными функциями является актуальной научной задачей и имеет большое практическое значение.

Новый метод, названный кристаллографическим скринингом, будет использован для определения неизвестной функции и фармакологического потенциала белка с помощью изучения пространственной структуры самого белка и его комплексов с низкомолекулярными лигандами. Идентификации неизвестных лигандов будет проведена путём получения набора кристаллов для каждого из исследуемых белков, которые перед проведением рентгеноструктурного эксперимента будут проинкубированы с набором коктейлей, состоящих из смеси низкомолекулярных элементарных метаболитов, представляющих разные классы органических соединений: сахара, нуклеотиды и их производные, флавины и т.д. Метаболит наиболее похожий на эндогенный белковый лиганд с наибольшей вероятностью свяжется с закристаллизованным белком, и будет определён при обработке данных рентгеноструктурного анализа.

В настоящее время нами получены, выделены и очищены 15 бактериальных белков, предположительно способных связывать эндогенные лиганды. Проводится скрининг условий кристаллизации и кристаллографический скрининг метаболитов.

Работа выполняется при финансовой поддержке Министерства образования и науки Государственный контракт № 16.512.11.2175 Стендовые доклады 225

ОЦЕНКА МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ АНАЛОГА АКТГ(4-10) СЕМАКСА

НА СТРЕСС-ВЫЗВАННЫЕ АНАЛЬГЕЗИЮ И ПОВЕДЕНИЕ БЕЛЫХ КРЫС

Манченко Д.М.1, Виленский Д.А.1, Левицкая Н.Г.2, Андреева Л.А.2, Каменский А.А.1, Мясоедов Н.Ф.2 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: dashishka@mail.ru

Стресс – неотъемлемая часть нашей жизни. Длительное стрессогенное воздействие приводит к нарушению деятельности многих систем организма. В формировании стрессорного ответа принимают участие различные медиаторные системы, в том числе меланокортиновая система. Меланокортины (АКТГ/МСГ-подобные пептиды) влияют на поведение, способность к обучению и память, болевую чувствительность и др. Семакс является аналогом АКТГ(4-10) пролонгированного действия. Ранее было показано, что Семакс проявляет анксиолитическое действие в модели тревожности, вызванной введением ХЦК. Целью представленной работы стало исследование влияния Семакса на болевую чувствительность и поведение животных в различных моделях острого стресса. Эксперименты проводили на самцах белых нелинейных крыс массой 200–250 г. В качестве стрессорного воздействия использовали неизбегаемое плавание при температуре 28оС (10 мин) или 12оС (5 мин) и электроболевое раздражение (10 мин). Семакс вводили внутрибрюшинно в дозах 0,05 и 0,5 мг/кг за 15 мин до стресса. Уровень тревожности оценивали в тестах «Норковая камера» и «Приподнятый крестообразный лабиринт», болевую чувствительность регистрировали в тесте «сдавливания задней лапы». В ответ на стрессорное воздействие у контрольных крыс наблюдалось увеличение тревожности и возрастание болевого порога. Предварительное введение налоксона снижало анальгезию, вызванную электроболевым раздражением и неизбегаемым плаванием в теплой воде, что свидетельствует об опиоидной форме стрессвызванной анальгезии (СВА). Введение семакса ослабляло опиоидную форму СВА и не влияло на поведение крыс. Корреляции между изменениями поведения и выраженностью СВА зарегистрировано не было. Можно предположить, что действие семакса на болевую чувствительность и поведение зависит от природы стрессорного воздействия. Вероятно, снижение СВА связано с влиянием семакса на активность опиоидной системы, а его воздействие на поведение опосредуется другими медиаторными системами. Следовательно, в основе влияние семакса на стресс-вызванные поведение и анальгезию лежат различные механизмы.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК №П1057) и РФФИ (грант № 11-04-01329).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВЫЕ МОДУЛЯТОРЫ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ

Никольский А.С., Василевский А.А., Гришин Е.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: annikolsky@gmail.com Потенциал-зависимые натриевые каналы – важнейшие компоненты нервной системы, обеспечивающие восходящую фазу потенциала действия. Неудивительно поэтому, что эти белки являются мишенью действия разнообразных биологически активных веществ, многие из которых находят применение в медицине и биотехнологии. Общепринятая классификация лигандов натриевых каналов основана на предполагаемых местах связывания лигандов с каналом (так называемых рецепторных сайтах) и однозначно соответствующих им эффектах. В результате комплексных исследований, проводимых в ИБХ РАН, было выделено и охарактеризовано множество полипептидных модуляторов натриевых каналов из природных ядов. Например, из европейских и среднеазиатских пауков Agelena orientalis, Heriaeus melloteei и Misumena vatia были получены вещества, проявляющие различную активность (блокаторы, активаторы) в отношении различных типов натриевых каналов (млекопитающих, насекомых). Исследование механизма действия токсинов из A. orientalis выявило одновременное модулирование процессов активации и инактивации каналов насекомых. Этот и ряд других примеров показывают, что многообразие лигандов натриевых каналов не укладывается в узкие рамки существующей классификации, которая должна быть пересмотрена.

Работа поддержана грантами Президиума РАН (программа фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология»), Минобрнауки РФ (Госконтракты №№ П1388 и П818), РФФИ (№№ 10-04-90460 и 11-04-01606).

Стендовые доклады 227

РИБОСОМ-ЗАВИСИМАЯ ГТФаза В НЕАКТИВНОМ СОСТОЯНИИ

СПОСОБНА СВЯЗЫВАТЬ ГТФ

Никонов О.С., Столбоушкина Е.А., Никулин А.Н., Лазопуло А.М., Лазопуло С.М., Гарбер М.Б., Никонов С.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, 4, Московская обл.

E-mail: alik@vega.protres.ru Фактор инициации трансляции 2 эукариот (eIF2) и архей (aIF2) в комплексе с ГТФ связывает метианилированную инициаторную тРНК и доставляет ее в Р-сайт малой рибосомной субчастицы. У архей и эукариот эти факторы являются гетеротримерными белками, состоящими из, и субъединиц, каждая из которых имеет определенные функции. -субъединица aIF2 представляет собой трехдоменный белок и принадлежит к семейству рибосом-зависимых ГТФаз. Наибольшее сходство -субъединица aIF2 имеет с эукариотическим фактором элонгации eEF1A и его бактериальным аналогом EF1A (EF-Tu). Для рибосом-зависимых ГТФаз было показано существование двух функциональных состояний – активного (в комплексе с ГТФ) и неактивного (в комплексе с ГДФ). В активном состоянии эти белки могут связывать аминоацилированную тРНК и рибосому. Как считалось ранее, состояние данных белков зависит от природы связанного нуклеотида. Характеристическими особенностями активного и неактивного состояний рибосом зависимых ГТФаз являются специфические конформации двух функционально важных подвижных участков их структуры, называемых участками-переключателями. В данной работе нами определена структура комплекса -субъединицы aIF2 с ГТФ с разрешением 2,8. Асимметричная часть ячейки кристалла содержит 6 молекул комплекса. Ион магния не был найден в нуклеотид-связывающем кармане ни одной молекулы. В структуре комплекса aIF2ГТФ участок-переключатель 2 занимает положение, соответствующее неактивному состоянию белка, тогда как участок-переключатель 1 сохраняет свою подвижность, и его конформация зависит только от кристаллических контактов. Эти данные показывают, что переход -субъединицы aIF2 из неактивного состояния в активное не зависит от связывания с ГТФ. По всей видимости, этот переход осуществляется при связывании с инициаторной метианилированной тРНК. Кроме того, было показано, что для связывания ГТФ -субъединицей aIF2 ион Mg2+ не является необходимым.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы МКБ РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СВЯЗЬ ДЛИНЫ МЕЖДОМЕННОЙ ПЕРЕТЯЖКИ

С КОНФОРМАЦИЕЙ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1

Никонова Е.Ю., Шкляева А.А., Костарева О.С., Габдулхаков А.Г., Тищенко С.В., Невская Н.А., Гарбер М.Б., Никонов С.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, 4, Московская обл.

E-mail: katya_nik@vega.protres.ru Белок L1 – это первично-связывающийся рибосомный белок, который в комплексе с 23S рРНК образует один из боковых выступов большой субчастицы рибосомы. Белок состоит из двух доменов, которые соединены гибкой перетяжкой, образованной двумя противоположно направленными полипептидными цепями различной длины. Ранее было показано, что для бактериального белка L1 из Thermus thermophilus (TthL1) характерно наличие двух конформаций: закрытой (в случае изолированного белка) и открытой (в комплексе с РНК). В то же время, белки L1 из архей имеют открытую конформацию, как в изолированном, так и в РНК-связанном состоянии. Сравнение аминокислотных последовательностей архейных и бактериальных белков L1 выявило отличие в длине короткой цепи междоменной перетяжки: у бактериальных белков она состоит из 3 аминокислотных остатков, а у архейных – из двух.

Структурный анализ показал, что при укороченной перетяжке переход бактериального белка L1 в закрытую форму может быть затруднен, т.к. укорочение цепи в этом районе на один остаток может значительно уменьшить подвижность доменов. Нами была получена мутантная форма белка TthL1(А) с делецией аланина в короткой цепи междоменной перетяжки, белок был закристаллизован, его структура определена с разрешением 1.95. Мутация привела к расхождению и повороту доменов белка друг относительно друга. Кроме того, мы получили мутантную форму архейного белка L1 из Methanococcus jannaschii MjaL1(+A) c удлиненной на один аланин междоменной перетяжкой. Такой белок был закристаллизован, и его структура была определена с разрешением

3.0. В этом случае открытая конформация белка сохранилась, домены белка сблизились лишь незначительно. По всей видимости, для увеличения гибкости междоменной перетяжки и как следствие, возможности перехода MjaL1 в закрытую конформацию, необходимо удлинить цепь на глицин.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 10-04-00618) и Программы МКБ РАН.

Стендовые доклады 229

ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩИЙ ПЕПТИД (ДСИП)

И ЕГО АНАЛОГИ В КАЧЕСТВЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ПРОТЕКТИВНЫХ

СРЕДСТВ ПРИ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

ЦИТОСТАТИКОВ

Оноприенко Л.В.1, Михалева И.И.1, Прудченко И.А.1, Ефремов Е.С.1, Чикин Л.Д.1, Якубовская Р.И., Немцова Е.Р., Безбородова О.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, 2-ой Боткинский пр., 3

E-mail: onolv@mail.ru

Ранее нами при изучении онкопротективных свойств ДСИП и группы его аналогов было установлено, что ДСИП повышал противоопухолевую устойчивость животных в условиях инокуляции опухолевых клеток на фоне стрессового воздействия и тормозил метастазирование карциномы Льюиса после хирургического удаления опухоли. Исследования показали, что ДСИП и некоторые аналоги ограничивали также спонтанный канцерогенез и мутагенез при физиологическом старении. Полученные результаты свидетельствовали о перспективности использования соединений этой группы в онкологической практике. В продолжение этих работ было предпринято изучение онкопротективного потенциала ДСИП и родственных пептидов с целью выявления наиболее эффективных производных этой группы. Установлено, что пептиды в дополнение к выраженному непрямому антиоксидантному действию обладают и прямой антиоксидантной активностью на уровне эффектов витамина С и -каротина. Изучение детоксицирующего действия пептидов проведено на нескольких моделях токсикоза. На модели токсикоза, индуцированного цитостатическим препаратом цисплатином, выявлено, что ДСИП и 3 аналога способствовали выраженному снижению токсичности препарата, что выражалось в 2–1,5-кратном снижении летальности животных. Один из исследованных аналогов проявил наибольший эффект, его 4-ех кратное применение на фоне использования цисплатина приводило к 3-кратному снижению летальности Этот аналог способствовал также уменьшению гепато- и нефротоксичности цитостатика. Сочетанное применение цитостатика с ДСИП или его активным аналогом у животных с карциномой Льюис не приводило к отмене терапевтического действия цитостатика. Таким образом, проведенные исследования показали целесообразность дальнейшего изучения детоксицирующего действия на модели токсикоза, индуцированного различными цитостатическими препаратами.

Работа поддержана Правительством Москвы.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ

ПЕПТИДНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ IL-2 ЧЕЛОВЕКА

Оноприенко Л.В.1, Михалева И.И.1, Войтенков Б.О.2, Иванов В.Т.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 ООО Исследовательский центр «Комкон», С.-Петербург

E-mail: onolv@mail.ru

Ранее нами при изучении функциональных свойств модифицированных синтетических пептидов из района последовательности 59-72 интерлейкина 2 человека было показано, что следующие пептиды:

Ac-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (I) Ac-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (II) Ac-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (III) подавляют цитотоксическую реакцию и активный воспалительный ответ макрофагов in vitro, индуцированные такими стимуляторами классической активации макрофагов как, липополисахарид, 4--форбол-12--миристат-13--ацетат или бестатин. В серии экспериментов in vivo пептиды (I)-(III) проявили способность к восстановлению функции печени после ее токсического повреждения, а также стимулировали заживление кожных ран и ангиогенез.

Мы предполагаем, что возможным механизмом такой регенеративно-репаративной активности пептидов является их взаимодействие с -субъединицей рецептора интерлейкина 2 человека (IL-2R), так как современные литературные данные указывают, что пептиды (I)-(III) расположены в одном из районов связывания IL-2 с IL-2R. Нашу гипотезу о связывании пептидов (I)-(III) с IL-2R подтверждают и эксперименты с использованием клеточной линии CTLL, которая способна пролиферировать только в присутствии IL-2. В присутствии пептида (I) в диапазоне концентраций 1,6–200 мкг/мл наблюдалась стимуляция роста клеток CTLL, предварительно инкубированных без IL-2 в течение 24 ч. При этом эффект пептида (I) в оптимальной концентрации (40 мкг/мл) был в 2,7 раза слабее, чем действие самого IL-2. Вероятно, пептиды (I)-(III), конкурируя с IL-2 за связывание с IL-2R, не способны, однако, обеспечить полноценное связывание, так как они лишь частично перекрывают район взаимодействия IL-2 с IL-2R. В результате между IL-2 и пептидами (I)-(III) возможна конкуренция за связывание с ILR, приводящая к подавлению цитотоксической активности макрофагов, свойственной состоянию их классической активации и индукции у макрофагов состояния, близкого к альтернативной активации.

Стендовые доклады 231

СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНОСТЬ МУТАНТНЫХ ФОРМ

ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.COLI S149R И F71L

В РЕАКЦИЯХ АЦИЛИРОВАНИЯ AМИНОСОЕДИНЕНИЙ

Панин Н.В., Щербакова Т.А., Гуранда Д.Ф., Швядас В.К.

Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.73, к.622 E-mail: panin@belozersky.msu.ru Пенициллинацилаза из Еscherichia coli (КФ 3.5.1.11) – периплазматический гетеродимер с молекулярной массой 88 кДа, состоящий из - и - цепей, относится к семейству Ntn-гидролаз и известен, в основном, как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. Фермент обладает высокой стереоселективностью по отношению в N-фенилацетильным производным аминокислот и способен эффективно катализировать не только гидролиз N-фенилацетил-L-аминокислот, но и стереоселективный ацильный перенос на L-аминокислоты в водной среде. Эти свойства фермента могут быть использованы для разделения рацематов неприродных альфа- и бета-аминокарбоновых и аминофосфоновых кислот. При переходе к производным аминоспиртов и первичных аминов фермент дикого типа теряет стереоселективность и поэтому была предпринята попытка увеличения стереоселективности пенициллинацилазы методами белковой инженерии. При изучении мутантных форм фермента были обнаружены препараты с улучшенной стереоселективностью по отношению к данному классу аминосоединений. Так, введение мутации S149R приводила к 4-кратному увеличению стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола амидом S-миндальной кислоты по сравнению с ферментом дикого типа.

При введении мутации F71L, наряду с 3-кратным увеличением стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола амидом R-миндальной кислоты и 5-кратным увеличением стереоселективности в реакции гидролиза N-фенилацетилфенилаланинола, наблюдали существенное (5-кратное) улучшение эффективности ферментативного ацилирования. Изученные одиночные мутанты пенициллинацилазы обладали также более высокой каталитической активностью по отношению к 2-нитро-5-[(фенилацетил)амино] бензойной кислоте и измененным профилем субстратной специфичности по сравнению с ферментом дикого типа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что каталитические свойства пенициллинацилазы дикого типа могут быть существенно улучшены путем введения мутаций и могут послужить основой для дизайна препаратов фермента с заданными свойствами.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 02.740.11.0866) V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДИСТАМИЦИНА А

С ХРОМАТИНОМ ЯДЕР ГЕПАТОЦИТОВ КРЫСЫ

И ВЛИЯНИЕ НА МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ Н1 И Н3

Смирнова Т.А.1,2, Прусов А.Н.1, Коломийцева Г.Я.1, Ванюшин Б.Ф.1,2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова 119991 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, 1, стр.40 Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва

E-mail: smirnova@belozersky.msu.ru

Известно, что пептидный антибиотик дистамицин А (Дист) взаимодействует с ДНК, встраиваясь в минорную бороздку преимущественно АТ-областей. Дист, добавленный к изолированным интерфазным ядрам печени крысы, вызывает появление пика при 325–340 нм в спектре КД ядер, свидетельствующее об образовании комплекса Дист-ДНК в хроматине. Насыщение достигается при Дист/ДНК (моль/моль нуклеотидов) = 0,11–0,12 и соответствует ~1 молекуле Дист на 6 пар оснований ДНК в хроматине, что всего на ~20–25% меньше, чем для свободной ДНК, и позволяет предполагать, что молекулы Дист могут осуществлять посадку на ДНК в ядрах в присутствии белков. При избирательной экстракции гистона Н1 полиглутаминовой кислотой (ПГ) из обработанных Дист и контрольных ядер установлено, что в условиях насыщения Дист ослабляет взаимодействие с ДНК до 95% молекул Н1. При этом электронно-микроскопический анализ не выявил каких-либо изменений в структуре хроматина обработанных Дист ядер, а также в структуре хроматина таких ядер после их обработки ПГ.

Обнаружено, что в присутствии Дист in vitro повышается уровень модификации гистонов Н1 и Н3 в ядрах эндогенной метилтрансферазой, а также эндогенной и экзогенной фосфокиназами. Изменения удельной радиоактивности определялись концентрацией Дист. В частности, при инкубации ядер с [3Н-метил]S-аденозилметионином удельная радиоактивность гистона Н1 по сравнению с контролем возрастала в 6 раз при молярном соотношении Дист/ ДНК ядер = 0,1.

Мы наблюдали также взаимовлияние метилирования и фосфорилирования гистонов в ядре. Таким образом, действие Дист на прочность связи гистона Н1 в ядре может влиять на модификационный статус гистонов и тем самым на функционирование ДНК.

Стендовые доклады 233

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЦИТОХРОМА С :

ДВА ПОДХОДА К ИЗУЧЕНИЮ САЙТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

С КОМПЛЕКСАМИ III И IV ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

Черткова Р.В.1, Островерхова Т.В.1,2, Некрасов А.Н.1, Долгих Д.А.1,2, 1,2 Кирпичников М.П.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: cherita@inbox.ru

Основная функция гем-содержащего белка цитохрома с – перенос электронов от убихинол:цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III) на цитохром с-оксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи. Известно, что ключевую роль в формировании активных комплексов цитохрома с с его редокс-партнерами играют электростатические взаимодействия между определенными остатками Lys цитохрома с и Asp/Glu редокс-партнеров. С целью максимального подавления способности взаимодействовать с комплексами III и IV нами был сконструирован ряд мутантных вариантов цитохрома с, содержащих множественные замены Lys, формирующих универсальный сайт связывания с белковыми редокс-партнерами. В ходе исследований специфической активности полученных белков было показано, что два варианта с шестью и один с восемью заменами неактивны в цитохром с-оксидазной реакции, а их способность восстанавливаться в убихинол:цитохром с-редуктазной реакции составляет не более 3% по сравнению с цитохромом с дикого типа. Полученные варианты цитохрома с могут использоваться в качестве детектора некоторых активных форм кислорода.

Второй подход к изучению активных сайтов взаимодействия цитохрома с с его редокс-партнерами основывался на методе анализа информационной структуры (АНИС). На основе данных АНИС-метода были сконструированы три варианта цитохрома с c мутациями в области остатков 76-83 («до» и «после» остатка Met-80 – лиганда гема). Исследование биологической активности полученных белков позволило обнаружить существенное снижение способности к переносу электрона в дыхательной цепи. Наибольшее снижение сукцинат:цитохром с-редуктазной активности митопластов печени крысы наблюдалось в присутствии мутантного варианта T78S/K79P (на 97%), а цитохром с-оксидазной активности – в присутствии мутантного варианта I81Y/A83Y/G84N (на 85%). Полученные данные свидетельствуют о наличии находящихся по разные стороны от Met-80 кластеров, избирательно взаимодействующих с белковыми комплексами III и IV дыхательной цепи.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ОЛИГОПЕПТИДНЫЕ АНАЛОГИ ПРОТЕИНА А:

ПРОГНОЗ, СИНТЕЗ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С IgG

Шутова И.В., Мартинович В.П., Ермола Е.М., Рудаковская А.Г., Лапко А.В., Макаревич Д.А., Голубович В.П.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, ул. Купревича, 5, к.2, Беларусь E-mail: shutova2001@mail.ru Протеин A – это белок, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, который с высокой аффинностью связывает IgG человека. Рекомбинантный протеин А широко используется как в биохимических исследованиях, так и в экстракорпоральных терапевтических методах иммуноадсорбции для избирательного удаления из крови IgG.

Целью работы являлось получение олигопептидных аналогов участка связывания протеина А с Fc-фрагментом IgG человека, способных избирательно взаимодействовать с Fc-фрагментом тяжелой цепи IgG человека.

На первом этапе с помощью разработанных авторами программных средств был выявлен участок связывания протеина A с IgG. Из банка данных ProteinDataBank была импортирована пространственная структура комплекса Bдомена протеина А с Fc-фрагментом IgG (PDB ID 1FC2) и определены ключевые аминокислотные остатки Phe124, Gln128, Gln129, Phe132 и Tyr133 протеина А, участвующие во взаимодействии с Fc-фрагментом IgG. Было предложено два структурных аналога участка связывания – тетрапептид Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe и пентапептид Phe-Gln-Gln-Phe-Tyr-OMe.

Пептиды были получены классическими методами синтеза в растворе, для пентапептида Phe-Gln-Gln-Phe-Tyr-OMe была разработана восьмистадийная cхема, для тетрапептида Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe – шестистадийная. В качестве конденсирующего агента при образовании пептидной связи применяли диизопропилкарбодиимид, в качестве противорацемической добавки – 1-оксибензотриазол. Идентификацию целевых соединений выполняли методами количественного аминокислотного анализа и масс-спектрометрии, гомогенность подтверждали методами ТСХ и аналитической ВЭЖХ.

Методом ИФА с использованием набора «IgG общий – ИФА-БЕСТ» («Вектор-БЕСТ», Россия) было показано, что полученные пептиды образуют устойчивые комплексы с Fc-фрагментом IgG. Максимальный процент ингибирования связывания IgG с мечеными антителами составлял ~30% для тетрапептида PheGln-Phe-Tyr-OMe и ~90% для пентапептида Phe-Gln-Gln-Phe-Tyr-OMe. Полученные результаты показывают, что спрогнозированные и синтезированные пептиды способны связываться с Fc-фрагментом IgG человека подобно нативному протеину А.

Стендовые доклады 235

–  –  –

Химия и биология протеолитических ферментов V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА АДАМАЛИЗИНОПОДОБНОЙ

МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS PUMILUS 3-19

Балабан Н.П., Рудакова Н.Л., Данилова Ю.В., Шарипова М.Р.

Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 E-mail: NellyBalaban@yandex.ru Получен рекомбинантный штамм B. subtilis путем трансформации в протеиназодефицитный штамм B. subtilis BG2036 плазмиды pSA1 с геном металлопротеиназы B. pumilus 3-19. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка MprBp, полученная на основании последовательности нуклеотидов секвенированного гена mprBp, позволила отнести фермент к семейству адамализинов/репролизинов клана метцинкинов.

Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень продукции металлоэндопептидазы MprBp в культуральной жидкости рекомбинантного штамма. Оптимизация питательной среды позволила повысить уровень активности фермента и продуктивность культуры в 4 раза.

Разработан эффективный способ очистки протеиназы до гомогенного состояния из культуральной жидкости, включающий две стадии: дробное фракционирование сульфатом аммония и хроматографию на гидрофобном носителе бутил-сефарозе. Получен гомогенный препарат металлопротеиназы со степенью очистки 350 и выходом 11%.

Молекулярная масса фермента 19 кДа. Km фермента по гидролизу азоказеина составила 0,06 мМ, kkat = 1213 c-1, pI фермента соответствует 5,4. Оптимум рН действия фермента – 8,0, фермент стабилен в интервале рН от 7,3 до 9,0. Температурный оптимум действия фермента – 55С, белок стабилен в интервале температур от 22С до 55С. Металлоэндопептидаза MprBp обладает широкой субстратной специфичностью по гидролизу синтетических и природных субстратов.

Исследуемая металлоэндопептидаза MprBp является первым бактериальным адамализиноподобным ферментом клана метцинкинов, полученным в гомогенном состоянии. Все известные представители данного семейства являются мультидоменными эукариотическими белками.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

Стендовые доклады 237

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ,

НЕСУЩИХ ВСТРОЕННЫЙ ГЕН ИНГИБИТОРА

СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ СЕМЯН ГРЕЧИХИ

Хадеева Н.В.1, Дунаевский Я.Е.2, Яковлева Е.Ю.1, Белозерский М.А.2 Учреждение РАН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, 119991 Москва, ул. Губкина, 3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

E-mail: mbeloz@belozersky.msu.ru

С помощью агробактериальной трансформации в растения табака, картофеля и арабидопсиса введен ген ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a из семян гречихи под контролем конститутивного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты с маркерным геном устойчивости к канамицину nptII. Целевой ген активно экспрессировался в тканях всех канамицин-устойчивых ПЦР-положительных растений и их семенного и вегетативного потомства и придавал всем тканям антибактериальную активность, свидетельствующую о синтезе функционального белка.

Получена коллекция трансгенных растений и семян арабидопсиса и табака. Индивидуальные независимо полученные трансгенные клоны различались по чувствительности к селективному агенту и степени подавления роста разнообразных бактериальных патогенов: Pseudomonas syringae, Clavibacter michiganensis, Xantomonas campestris, Ervinia carotovora. У трансгенных растений табака в ряде случаев показано снижение фертильности пыльцы и изменение качества и размеров семян. Спектр инсерционных мутаций зависел от вида растения и размеров векторной конструкции. Среди трансгенных клонов арабидопсиса обнаружено значительное число морфологических мутантов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 09-04-00955) и МНТЦ (№ 3455).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РОЛЬ АНТИОКСИДАНТОВ N-АЦЕТИЛЦИСТЕИНА

И ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ИНВАЗИИ БАКТЕРИЙ,

ПРОДУЦЕНТОВ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ

Божокина Е.С., Вахромова Е.А., Гамалей И.А., Хайтлина С.Ю.

Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр. 4 E-mail: bozhokina@yahoo.com В процессе опухолевой трансформации эукариотических клеток происходит ряд морфологических изменений, в том числе реорганизация структур цитоскелета.

Кроме того, трансформация изменяет чувствительность клеток к бактериальной инвазии (Velge et al., 1997; Gamaley et al., 2006). В частности, ранее мы показали, что обработка трансформированных клеток 3T3-SV40 антиоксидантом Nацетилцистеином вызывала разборку цитоскелета и сохраняла чувствительность клеток к инвазии непатогенными бактериями, продуцентами металлопротеиназ, а последующее удаление антиоксиданта из среды, напротив, вызывало восстановление стресс-фибрилл, свойственных нормальным клеткам, и появление устойчивости к инвазии бактериями (Гамалей и др., 2006). Однако интернализация как природных, так и рекомбинантных бактерий, синтезирующих металопротеиназу гримелизин, внутрь клетки очень низка, поэтому эффекты невозможно анализировать без количественной оценки инвазии. Задача настоящей работы состояла в количественной оценке непосредственного влияния антиоксидантов на чувствительность трансформированных клеток к бактериальной инвазии. Установлено, что бактерии S.grimesii 30063 и рекомбинантные E.coli K-12, продуценты металлопротеиназы гримелизина, инвазировали не более 10% клеток линии HeLa, как исходных, так и трансфицированных GFP-RhoA и GFP-RhoC ГТФазами. Инкубация клеток HeLa с антиоксидантами N-ацетилцистеином (NAC) или

-липоевой кислотой увеличивала их чувствительность к инвазии бактериями, продуцентами металлопротеиназ, в 2 и 3,5 раза, соответственно. Изменение инвазивности коррелировало с разрушением монослоя, значительной реорганизацией цитоскелета и отсутствием филаментов, актин был сосредоточен преимущественно в кортикальном слое. Кроме того, усиливалась экспрессия Rho ГТФаз в трансфицированных клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что антиоксиданты могут обратимо повышать чувствительность трансформированных клеток к бактериальной инвазии.

Работа поддержана грантами РФФИ (№№ 11-04-00393, 09-04-00467) и Программой РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 239

ЭКСПРЕССИЯ КАСПАЗ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

ПРИ ОБРАБОТКЕ КОМБИНАЦИЯМИ ЦИТОСТАТИКОВ

С СИСТЕМНЫМИ КОРТИКОСТЕРОИДАМИ

Волкова Т.О., Багина У.С., Курмышкина О.В., Немова Н.Н.

Петрозаводский государственный университет, 185910 Петрозаводск, пр. Ленина, 33 E-mail: VolkovaTO@yandex.ru В настоящее время перспективными внутриклеточными мишенями для действия цитостатиков рассматриваются белки и ферменты, играющие центральную роль в передаче сигналов при индукции пролиферации, дифференцировки и апоптоза.

Важной группой таких регуляторных молекул являются клеточные каспазы. Каспазы синтезируются в виде зимогенов и активируются путем протеолиза или образования димерных/олигомерных комплексов, что при действии проапоптотического сигнала приводит к деструкции, нарушению и полной дезинтеграции клеточных компартментов. В данном исследовании изучено изменение экспрессии генов каспаз-3, -6 и -9, а также активности ферментов, в эритромиелолейкозных клетках К562 при обработке 5-фторурацилом (5-ФУ), цитозинарабинозидом (ЦА), дексаметазоном и преднизолоном. Оценена степень индукции дифференцировки и апоптоза клеток.

Обработка клеток К562 2 мМ ЦА (или 5-ФА) в течение 2 суток приводила к усилению экспрессии каспазы-3 и активности фермента, каспазы-6 и -9 не индуцировались. Апоптоз регистрировался к 4 суткам на фоне повышения активности каспазы-9, активность каспазы-6 не отличалась от таковой в контрольных клетках. Количество GpA+ клеток в культурах возрастало в 3,2–3,5 раза. Дексаметазон (10 мкМ) достоверно повышал количество CD11c+ и CD14+ клеток к 4 суткам обработки: 36,7±1,9 и 45,81,7, соответственно (в контрольных клетках – 24,4±1,3 и 36,31,9, соответственно). В данных условиях также индуцировались каспазы-3, и выраженная фрагментация ДНК. При совместном внесении в культуры дексаметазона и ЦА (или 5-ФУ) на 2 сутки обработки наблюдалось изменение активностей каспаз по сравнению с ЦА-обработанными клетками: повышалась активность каспаз-6 и -9, активность каспазы-3 была снижена, индуцировался апоптоз. Аналогичный эффект регистрировался с преднизолоном. Таким образом, при индукции различных путей дифференцировки клеток активируются разные каскады каспаз. Апоптоза при этом может не наблюдаться. Обработка клеток комбинацией индукторов приводит к перераспределению функциональной активности каспаз. Данный факт необходимо учитывать при разработке препаратов нового поколения, специфически ингибирующих каспазы.

Работа выполнена при финансовой поддержке НШ-3731.2010.4.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ДЕЙСТВИЕ ЭНДОГЕННОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ

ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА

НА КУЛЬТУРЫ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Голышев С.А.1, Кузнецов С.А.2, Куранова И.П.2, Руденская Г.Н.3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40 Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

E-mail: gnruden@genebee.msu.ru

Новый эндогенный ингибитор (Mr=67kDa) выделен с помощью аффинной хроматографии на грамицидин-силохроме и ёгельфильтрации на Сефадексе G-100 из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camchaticus. Ингибитор подавляет активность сериновых протеиназ (трипсина, химотрипсина, субтилизина, тромбина, сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба) и папаина, но не действует на плазмин и глутамилэндопептидазу. Было исследовано влияние ингибитора на прикрепление к субстрату и распластывание клеток HeLa в системе in vitro. Клетки суспензировали в среде культивирования (c эмбриональной телячьей сывороткой) с добавлением препарата ингибитора и осаждали на шестилуночные планшеты и на чашки Петри со стеклянным дном. Контролировали прикрепление микроскопически. Для количественной оценки измеряли площади индивидуальных клеток на различные сроки после рассева (100 кл. на каждую экспериментальную точку). Параллельно осуществляли прижизненные наблюдения, используя микроскоп, оснащенный термостатируемым предметным столиком.

Показано, что присутствие ингибитора в среде культивирования не влияет на скорость и эффективность прикрепления клеток как к пластику, так и к стеклу. Ингибитор существенно замедляет распластывание клеток. Эффект дозозависимый (площадь клеток через три часа составляет 69% и 74% и 62% 60% от контроля для концентрации 0,25 и 0,5 мг/мл на 90 и 180 минут от рассева соответственно). Эффект перестает выявляться по достижении клеточной популяций субконфлюэнтной плотности. Эффект пролонгируется при замене среды с ингибитором на «свежую» с тем же содержанием ингибитора. Эти данные указывают на то, что ингибитор расходуется при выполнении своих функций или метаболизируется клетками. Ингибитор не запрещает деление клеток. Показан синергический эффект подавления распластывания при совместном содержании в среде ингибитора (0,5 мг/мл) и гепарина (1 мкг/мл). В условиях непрерывных прижизненных наблюдений, в присутствии ингибитора (субстрат – стекло) распластывания клеток блокировано в течение как минимум шести часов. Спустя 24 часа наблюдается цитотоксический эффект, связанный, вероятно, с полной блокировкой распластывания клеток в условиях поставленного эксперимента.

Стендовые доклады 241

ПРОПЕПТИД ПРОТЕАЛИЗИНА ВЫПОЛНЯЕТ ФУНКЦИЮ

ФОЛДИНГ-АССИСТЕНТА

Громова Т.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: tgromova81@mail.ru Протеализин является прототипом новой подгруппы термолизинподобных протеиназ (ТПП). При существенном сходстве каталитических доменов с классическими представителями ТПП протеализинподобные протеиназы имеют характерное строение пропептида. Это делает ТПП хорошей моделью для исследования механизмов регуляции функциональной активности белков пропептидами. Ранее мы установили пространственную структуру пропротеализина, анализ которой показал, что пропептиды протеализинового типа, блокируют активный центр фермента и, по-видимому, являются внутримолекулярными ингибиторами. Кроме того, мы показали, что удаление пропептидов протеализинового типа, приводящее к формированию зрелого активного белка, в отличие от классических пропоследовательностей ТПП, может происходить только межмолекулярно. Данная работа направлена на изучение способности пропептида протеализина участвовать в формировании активного белка.

Для исследования шаперонных функций пропептидов протеализинового типа был использован подход, заключающийся в исследовании возможности сворачивания фермента без пропептида и с пропептидом не связанным ковалентно. В рамках этого подхода были созданы три экспрессионные системы: для полноразмерного предшественника (система in cis), для зрелого протеализина и для совместной экспрессии зрелого протеализина и пропептида в отсутствии ковалентной связи между ними (система in trans). Протеолитическую активность протеализина детектировали только при наличии пропептида как в составе предшественника, так и ковалентно не связанного. В обоих случаях активация протеализина происходила постепенно после разрушения клеток. Вероятно, это связано с тем, что пропептид в системе in trans также как в системе in cis связывается с активным центром фермента, а постепенное увеличение активности обусловлено постепенным расщеплением пропептида активным протеализином.

Полученные данные демонстрируют, что пропоследовательность протеализина функционирует in vivo в качестве фолдинг-ассистента; пропептид, связываясь с активным центром протеализина, позволяет ферменту находиться в неактивном состоянии внутри клетки и что удаление пропептида является ключевым событием на пути реализации функций протеиназ группы протеализина.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПЕПТИДАЗЫ ГРИБОВ И ИХ СВЯЗЬ С ПАТОГЕННОСТЬЮ

Дунаевский Я.Е.1, Дубовенко А.Г.2, Семенова Т.А.3, Белозерский М.А.1, Элпидина Е.Н.

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва Изучение факторов, влияющих на количественные и качественные изменения в составе внеклеточных пептидаз ряда мицелиальных грибов, относящихся к различным экологическим группам, показало, что секреция пептидаз индуцируется или стимулируется присутствием белкового субстрата в культуральной среде. Изменение концентрации белка в среде оказывало различное влияние на уровни различных внеклеточных ферментов. Обнаружены также заметные различия во времени достижения максимального уровня секреции различных внеклеточных пептидаз. Полученные данные позволили предположить, что секреция трипсин-подобных ферментов характерна для фитопатогенных грибов, но не сапротрофов.

Для проверки этого предположения в публично доступных геномах грибов и связанных базах данных проведен поиск последовательностей пептидаз, сходных с трипсином по консервативным мотивам, включающим аминокислотные остатки в районе активного центра. Среди 75 исследованных геномов 30 видов Ascomycota содержали гены подобных пептидаз и их гомологов. Почти все найденные виды грибов оказались патогенами растений, животных или грибов. Сравнение первичных структур гомологичных белков, включая остатки, ответственные за связывание субстрата и специфичность фермента, выявило три группы гомологичных последовательностей, включающих трипсин-подобные, химотрипсин-подобные и сериновые пептидазы с неизвестной субстратной специфичностью. Анализ полученных данных показал, что присутствие трипсин-подобных пептидаз у грибов может являться маркером грибной фитопатогенности.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 10-04-00739) и МНТЦ (№ 3455).

Стендовые доклады 243

МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОТЕОЛИЗА ФИБРИНОГЕНА ТРОМБИНОМ

Завьялова Е.Г., Копылов А.М.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/3 ООО «АПТО-ФАРМ», 142784 Московская обл., Ленинский район, д. Румянцево, 1 E-mail: zlenka2006@rambler.ru Протеолиз фибриногена тромбином – ключевая реакция, обеспечивающая свертывание крови. В результате протеолиза фибриноген, крупный гликопротеид массой 340 кДа, превращается в фибрин, образующий протяженные фибриллярные ассоциаты. Тромбин отщепляет четыре N-концевых пептида (два фибринопептида А, 14 а.к.о. и два фибринопептида В, 16 а.к.о.). Известно, что накопление фибринопептид А происходит экспоненциально, а фибринопептида В – сигмоидно, что обусловлено эффективным отщеплением фибринопептида В только от ассоциированных интермедиатов реакции. Протеолиз фибриногена и ассоциация фибрина интенсивно изучались многие годы, однако достоверное описание отщепления фибринопептида В не было осуществлено из-за трудностей при описании ассоциации продуктов реакции.

С помощью метода поверхностного плазмонного резонанса измерены кажущиеся константы ассоциации и диссоциации комплекса тромбин-фибриноген и показано, что в используемом далее концентрационном диапазоне скорость образования фермент-субстратного комплекса на порядок выше скорости его диссоциации и каталитического превращения. Таким образом, впервые показана необходимость применять квазиравновесное приближение вместо традиционного квазистационарного.

Из экспериментальных кривых накопления фибринопептида А в квазиравновесном приближении рассчитана каталитическая константа kA=7,8±1,0 c-1. А использование упрощенной модели ассоциации интермедиатов реакции позволило описать сигмоидный характер кривой накопления фибринопептида В, каталитическая константа составила kB=1,7±0,5 c-1, а расчетная степень ассоциации фибрина

– =0,5±0,2. Для независимого определения степени ассоциации фибрина использовано динамическое светорассеяние, результаты которого хорошо коррелируют с расчетным значением: =0,54±0,02.

Осуществлено успешное моделирование протеолиза фибриногена тромбином, учитывающее как димерную природу фибриногена, так и сложную природу ассоциации продуктов реакции.

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ, государственный контракт № 16.512.11.2009, а также грантом РФФИ № 11-04-02084.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

L-КАТЕПСИН ИЗ КИШЕЧНИКА ЛИЧИНКИ DERMESTES MACULATUS

Калиберда Е.Н., Барановская А.Ю., Румш Л.Д.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: elena.kaliberda@ibch.ru Методами ионообменной и гель-хроматографий выделен белок из кишечника личинки жука-кожееда Dermestes maculatus, который является протеиназой со специфической активностью по хромогенному субстрату с остатком аргинина на С-конце. Активность с хромогенными пептидными субстратами по Р2 положению снижается в ряду PheProGly. Полученная протеиназа проявляет максимум активности при температуре 37–40оС и рН-оптимуме 4.0 и имеет молекулярную массу 25 кДа.

Полное подавление активности этой протеиназы сулемой (10-2 М), PMSF и йодацетатом в концентрациях 10-4 М, а также проявление максимума активности в слабокислой области рН позволяет отнести ее к L-катепсиноподобным, цистеинзависимым протеиназам. Выделенная нами L-катепсиноподобная протеиназа не расщепляет нативные белки, но быстро расщепляет природные пептиды: желатин и мелиттин. Преимущественные сайты расщепления находятся межу двумя положительно заряженными (Arg, Lys) и алифатическими (Ala, Ile, Leu) аминокислотными остатками. Определены кинетические параметры расщепления данной протеиназой хромогенного пептида Z-Ala-Phe-Arg-pNa: КМ 212 мкМ, kcat 156 сек-1.

Определена N-концевая аминокислотная последовательность выделенной протеиназы: Gly-Val-Pro-Asp-Met-Phe-Gln-Trp-Met-Arg-Ala. Эта последовательность аминокислот в значительной степени подобна N-концевым аминокислотным последовательностям L-катепсинов из кишечника Dermestes frischi и овцы (50% и 30%, соответственно).

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 10-04-01381.

Стендовые доклады 245

ЭВОЛЮЦИОННАЯ МОДЕЛЬ СЕКРЕЦИИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ У ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Кудрявцева Н.Н., Гвоздева Е.Л., Иевлева Е.В., Ревина Т.А., Софьин А.В., Валуева Т.А.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп. 33, стр.2 E-mail: valueva@inbi.ras.ru На примере патогенных грибов Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum и оомицета Phytophthora infestans Mont. de Bary показано, что состав секретируемых ими протеолитических ферментов зависит от рН и температуры культивирования, и для эффективной деградации белков эти параметры должны соответствовать условиям среды обитания патогенов.

Установлено, что независимо от состава среды культивирования оомицет P.

infestans и аскомицет F. culmorum секретировали трипсино- и субтилизиноподобные экзопротеиназы. Оказалось, что состав экзопротеиназ, продуцируемых базидиомицетом R. solani, зависит от природы источника азота в культуральной среде.

Так, при росте в среде, содержащей в качестве единственного источника азота только термостабильные белки картофеля, гриб продуцировал преимущественно трипсиноподобные протеиназы, которые и определяют его патогенность. При внесении в среду 1%-го дрожжевого экстракта подавлялась секреция трипсиноподобных и увеличивалась – субтилизиноподобных ферментов, которая характерна для сапрофитов, обитающих на растительных остатках. Имеются все основания предполагать, что патоген R. solani, в зависимости от условий культивирования может изменять свои свойства.

Показано, что разнообразие протеиназ, секретируемых патогенными грибами и оомицетом, относящимся к различным филогенетическим трибам, вне зависимости от положения на филогенетическом древе определяется с одной стороны той естественной экологической нишей, в которой обитает данный патоген (pH и температура), а с другой – растением, с которым он вступает в мутуалистические отношения. При этом наибольшее сходство состава этих ферментов наблюдалось у аскомицета и оомицета, чем у аскомицета и базидиомицета.

Таким образом, есть все основания предполагать, что поражение картофеля фитопатогенными грибами осуществляется по единому механизму с участием секретируемых ими экзопротеиназ с трипсино- и субтилизиноподобной специфичностью действия. Эти экзоферменты являются той метаболической мишенью, на которую направлено действие природных ингибиторов протеиназ, локализованных в клубнях.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

УЧАСТИЕ Са2+-АКТИВИРУЕМЫХ И ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ПРОТЕИНАЗ

И ПЕПТИДАЗ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЛОСОСЯ SALMO SALAR SEBAGO

Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: hela_kaiv@mail.ru Этапы эмбрионального развития рыб характеризуются быстрой чередой биохимических, морфологических преобразований и построений. Регуляция этих процессов осуществляется на уровне клеточного метаболизма, включающего комплекс отдельных биохимических реакций внутриклеточного протеолиза. В лабораторных условиях проанализирована активность протеолитических ферментов, таких как Са2+-активируемые протеиназы (кальпаины I и II), лизосомальные катепсины В и D, пептидазы, использующие в качестве субстратов содержащие хромогенный компонент п-нитроанилин пептиды L-alanin-p-NA, L-pro-p-NA, L- Arg-p-NA, NBzl-L-Arg-p-NA, L-Phe-p-NA, N-Glt-L-Phe-p-NA, Z-Gly-Pro-p-NA, в икре лосося Salmo salar sebago на разных стадиях эмбриогенеза: от образования бластодиска до вылупления. Изменение активности исследуемых протеиназ и пептидаз коррелирует со стадиями развития зародыша. «Всплеск» активности исследуемых ферментов на стадии поздней бластулы-ранней гаструлы может быть связан с активацией белкового обмена на этой стадии вследствие интенсивной деградации белков желтка до пептидов и свободных аминокислот и миграции их в зародышевые клетки развивающейся икры, где они используются в процессах синтеза вновь образующихся белков. Следующее увеличение активности исследуемых ферментов наблюдается на стадии пигментации глаз, на которой, как известно, происходит процесс дифференцировки головного мозга перед выклевом зародышей из оболочек. Процесс вылупления зародыша из оболочки связан с деятельностью желез вылупления, которые выделяют вещества, относящиеся к группе протеолитических ферментов типа трипсина и пепсина, с чем, возможно, связано наблюдаемое в эксперименте заметное увеличение активности трипсиноподобной пептидазы, расщепляющей N-Bzl-L-Arg-p-NA. Наблюдаемые изменения в активности исследуемых протеиназ и пептидаз, запасенных в яйцеклетках в ходе оогенеза, по-видимому, свидетельствуют об их активном участии в процессах, сопровождающих эмбриональное развитие оплодотворенной икры лосося вплоть до вылупления, и отражают процессы интенсификации белкового обмена, связанные с дифференцировкой, формообразованием и ростом зародыша.

Работа выполнялась при поддержке гранта Программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-3731.2010.04.

Стендовые доклады 247

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ PROTEUS MIRABILIS

Марданова А.М., Бондырева Н.М.

Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 Е-mail: Mardanovaayslu@mail.ru Условно-патогенные энтеробактерии Proteus mirabilis – возбудители различных гнойно-воспалительных процессов – обладают различными факторами вирулентности, к которым относятся и внеклеточные протеиназы. Однако, роль внутриклеточных протеиназ этих бактерий в патогенезе не известна, не исследованы особенности их биосинтеза. Целью настоящей работы было исследование протеолитической активности во внутриклеточном экстракте P. mirabilis. В качестве субстратов использовали Z-Glu-pNa и Z-Ala-Ala-Leu-pNA – специфические хромогенные субстраты для глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобных протеиназ соответственно, казеин, азоказеин и скелетно-мышечный актин, выделенный из ацетонового порошка мышц кролика. Активность по отношению к актину определяли электрофоретически.

Культуру P. mirabilis выращивали на среде LB с аэрацией. Для получения внутриклеточного экстракта использовали 16 часовую культуру клеток, находящихся в стационарной фазе роста. В клеточном экстракте, полученном методом замораживания-оттаивания, определяли общую и специфическую протеолитическую активность. Активность по отношению к казеину, азоказеину и специфическим хромогенным субстратам в экстракте не обнаружена. Однако показано, что в экстракте содержится протеиназа, ограниченно расщепляющая актин с образованием 36 кДа фрагмента. Характер протеолиза актина похож на расщепление его протеиназой Serratia grimesii (Хайтлина, 2009).  Исследование динамики появления специфической активности в клеточном экстракте показало, что синтез внутриклеточной протеиназы, ограниченно расщепляющей актин, начинается на 4 час роста культуры и эта активность присутствует в клетках на всех стадиях роста.

Показано, что синтез фермента не ингибируется в присутствии глюкозы или глицерина и таким образом не регулируется по типу углеродной катаболитной репрессии. По-видимому, фермент является конститутивным.

Ингибиторный анализ с использованием о-фенантролина и PMSF показал, что расщепление актина с образованием 36 кДа фрагмента полностью подавляется офенантролином и не подавляется PMSF. Согласно полученным данным, исследуемая протеиназа является металлопротеиназой.

Работа выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009– 2013 гг.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РОЛЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ N И АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО

ФЕРМЕНТА В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА ОНКОЛОГИЧЕКИХ БОЛЬНЫХ

Постнова Т.Ю., Генгин М.Т.

Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского, 440026 Пенза, ул. Лермонтова, 37 E-mail: tatyana_postnova@mail.ru Онкологические заболевания – недуг, борьба с которым – задача современного общества. Опухоль оказывает воздействие на все обменные процессы в организме, при этом могут происходить нарушения в системе гемостаза, приводящие к различным патологиям. В функционировании системы гемостаза немаловажная роль принадлежит вазоактивным пептидам, в обмене которых принимают участие ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) и карбоксипептидаза N (КПN).

Целью нашей работы было изучение роли КПN и АПФ в системе гемостаза у онкологических больных.

У больных со злокачественными новообразованиями в почках активность КПN в сыворотке крови достоверно ниже по сравнению с пациентами с опухолями желудочно-кишечного тракта и легких.

Активность АПФ у больных урологического отделения достоверно выше по сравнению с пациентами абдоминального и торакального отделений.

По данным корреляционного анализа обнаружена положительная корреляция KПN с протромбиновым индексом (R=0,2762*) и уровнем плазминогена (R=0,5773*). Основные карбоксипептидазы крови модулируют процесс фибринолиза путем отщепления концевых остатков аргинина и лизина от частично деградированного фибрина. В раннем послеоперационном периоде активность КПN положительно коррелирует с активностью АПФ (R=0,7035*). Возможно, КПN компенсирует участие АПФ как компонента фибринолитической системы. Активность АПФ отрицательно коррелирует с тромбиновым временем (R=-0,6976*).

АПФ вовлекается в физиологический контроль за циркуляцией крови в послеоперационном периоде, регулируя калликреин-кининовую систему. Вероятно участие АПФ в конечных этапах свёртывания крови.

Полученные результаты могут свидетельствовать об участии КПN и АПФ в гемостазе онкологических больных.

Стендовые доклады 249

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ОЛИГОМЕРА Lon-ПРОТЕИНАЗЫ E. COLI

РОЛЬ N-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТИ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОЦЕССИВНОГО

ПРОТЕОЛИЗА

Морозкин А.Д.1, Ротанова Т.В.2 Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, Институт экспериментальной кардиологии, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: andreymorozkin@yandex.ru

АТР-зависимая Lon-протеиназа E. coli состоит из пяти доменов: N-концевого (N, остатки 1-123), -спирализованных (nН, 124-302 и Н, 491-584), нуклеотид-связывающего (NB, 303-490) и протеолитического (Р, 585-784), соединенных согласно схеме N-nН-NB-Н-Р. Домены NB и Н формируют АТР-азный компонент Lon, относящийся к ААА+-белкам и обладающий анфолдазной активностью. Р-Домен представляет серин-лизиновую эндопептидазу, nН-домен содержит характеристическую область (173-280) с coiled-coil (CC)-конформацией. Вторичная структура Lon сформирована 27 -спиралями и 27 -тяжами. Трехмерное строение фермента не известно, хотя определена кристаллическая структура его Р- и Н-доменов, а также фрагмента (1-245). Lon-протеиназа активна в форме гомоолигомера (предположительно, циклогексамер).

Постулируется, что в мономере Lon nH-домен, имеющий вытянутую конфигурацию, ориентирован антипараллельно фрагменту фермента, сформированному доменами NB, Н и Р, а подвижный N-домен располагается над Р-доменом. Периодическое притяжение-отталкивание боковых карбоксилов спирализованных участков (124-185) и (495-562) nН и Н-доменов, обусловленное связыванием-высвобождением ионов магния между ними, вызывает механические колебания блока N-nH с отклонением до 2 нм для N-домена, что приводит к периодическому маскированию района активного центра Р-домена. Центр колебаний формируется взаимодействием неполярных кластеров (207-221) и (286-299) nН и NB-доменов.

Олигомеризации Lon может способствовать предварительное образование комплексов мономер-полифосфат/фрагмент ДНК с участием кластеров NB-домена с высоким содержанием положительно заряженных боковых групп. Самосборка таких комплексов приводит к образованию жесткой циклогексамерной структуры длиной ~16 нм, с поперечником ~12 нм и каналом вдоль оси цилиндра диаметром

1.6 нм. Процессивный протеолиз обеспечивается многоточечным связыванием белка-субстрата с ферментом, в котором участвуют N-домен(ы) и образованная шестью Р-доменами дистальная поверхность Lon, несущая активные центры. При этом энергия колебаний N-доменов используется ферментом для конформационного изменения («разворачивания») субстрата.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 11-04-01015).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЭКСПРЕССИЯ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ –

ММП-1, ММП-2, ММП-9 И ИХ ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ

ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЕ ШЕЙКИ МАТКИ

Рыжакова О.С.1, Завалишина Л.Э.2, Андреева Ю.Ю.2, Соловьева Н.И.1 Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10, корп.Б ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росздрава, Москва

E-mail: Nina.Solovyeva@ibmc.msk.ru

Матриксным металлопротеиназам (ММП) отводится ключевая роль в развитии процессов инвазии и метастазирования при канцерогенезе. Цель работы – выяснение особенностей экспрессии ММП – ММП-1, ММП-2, ММП-9 и их эндогенных тканевых ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2 при плоскоклеточной карциноме шейки матки. Работа проводилась на послеоперационных образцах карцином и образцах прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани (контроль). Изучение экспрессии ММП и их тканевых ингибиторов проведено на уровне мРНК (RT-PCR) и белка (иммуногистохимический анализ), а также энзимологической активности. Выраженное увеличение экспрессии мРНК в опухолях на 86%, 66% и 58% обнаружено для ММП-1, ММП-2 и ММП-9 соответственно. В случае ингибиторов наблюдалось снижение экспрессии мРНК – на 60% и 90% для ТИМП-1 и ТИМП-2, соответственно. Исследование экспрессии ММП и их ингибиторов в зависимости от наличия (11образцов) и отсутствия метастазов (13 образцов) были проведено иммуногистохимическим методом. Во всех образцах с метастазами была обнаружена экспрессия ММП-1, причем в большинстве случаев на высоком уровне, в образцах без метастазов экспрессия была в основном низкая или отсутствовала. Такая же картина наблюдалась в случае ММП-9. В случае ММП-2 выраженных отличий в образцах с метастазами и без метастазов обнаружено не было.

Преимущественно слабая экспрессия ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2 была обнаружена в опухолях как с метастазами так и без метастазов Спектр и активность ММП-2 и ММП-9 исследовали методом зимографии. Работа проводилась на 19 образцах карцином и 15 образцах прилегающих к опухоли тканей (норма). Выраженное увеличение экспрессии ММП-9 наблюдалась в 94% образцов опухолей.

Активность ММП-2 обнаружена как в опухоли, так и в норме. Полученные данные свидетельствуют о том, что основной вклад в деструктивный (инвазивный) и метастатический потенциалы карцином шейки матки вносит увеличение экспрессии ММП-1 и ММП-9, а также низкая экспрессия ингибиторов – ТИМП-1 и ТИМП-2 и в меньшей степени – увеличение экспрессии ММП-2.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 10-04-01573а.

Стендовые доклады 251

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФИТОГОРМОНОВ НА АКТИВНОСТЬ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА

ПРИ ХОЛОДОВОЙ АДАПТАЦИИ ПШЕНИЦЫ

Титов А.Ф., Фролова С.А., Таланова В.В., Венжик Ю.В.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: titov@krc.karelia.ru Известно, что активность протеолитических ферментов и их ингибиторов под влиянием на растения неблагоприятных факторов среды, включая низкие температуры, может существенно изменяться. Нами установлено, что в листьях проростков пшеницы уже в начальный период действия (первые часы) температуры 5С (близкой к оптимальной для их холодовой адаптации), происходит усиление активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. В дальнейшем активность амидаз и ингибиторов трипсина снижалась до исходных значений, тогда как активность цистеиновых протеиназ оставалась на повышенном уровне на протяжении всего периода (7 сут) воздействия холода. Очевидно, указанные изменения активности протеиназ, участвующих в деградации белковых молекул и регуляции физиолого-биохимических процессов посредством реакций ограниченного протеолиза, связаны, прямо или косвенно, с формированием повышенной холодоустойчивости пшеницы.

Экзогенные фитогормоны – абсцизовая кислота (АБК, 0.1 мМ) и цитокинин (в форме его синтетического аналога 6-бензиламинопурина – БАП, 0.01 мМ) вызывали в условиях действия на проростки пшеницы низкой температуры значительные изменения в активности протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в их листьях. Причем воздействие АБК и БАП (являющихся антагонистами в отношении ростовых процессов и биосинтеза белка и действующих однонаправленно в отношении устойчивости растений) на активность протеиназ и ингибиторов оказалось разнонаправленным. В частности, обработка проростков АБК приводила к значительному повышению активности протеолитических ферментов (особенно цистеиновых протеиназ) и ингибиторов трипсина, тогда как в присутствии БАП активность протеиназ и ингибиторов трипсина, наоборот, заметно снижалась.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышение холодоустойчивости растений озимой пшеницы под влиянием экзогенных АБК и цитокининов в условиях действия на них низкой температуры сопряжено с определенными изменениями в активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, по-видимому, носящими защитно-приспособительный характер.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 10-04-00650а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ЛЕЙ5-ЭНКЕФАЛИН-АРГ6 НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В МОЗГЕ КРЫС

Фирстова Н.В., Сметанин В.А., Бардинова Ж.С., Стёксова Н.А., Латынова И.В., Генгин М.Т.

Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского, 440026 Пенза, ул. Лермонтова, 37 E-mail: nfirst@yandex.ru Изучено влияние про-энкефалина – лей5-энкефалин-арг6, на активность ферментов обмена регуляторных пептидов – карбоксипептидазы N (КПN, Кф 3.4.17.10) и фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП) в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме крыс. Предлагаемое исследование может способствовать выяснению механизмов функционирования энкефалинов, пониманию биологической роли изучаемых ферментов и представляет интерес для выяснения механизмов регуляции активности ферментов in vivo. Исследуемые ферменты катализируют реакции отщепления остатков основных аминокислот – аргинина и лизина с С-конца про-пептидов, превращая их в активные формы. После введения про-энкефалина, в дозе 20 мкг/кг веса, животных декапитировали через 0,5, 4, 24 и 72 часа. Активность КПN и ФМСФ-КП определяли флуориметрически, с использованием дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг, соответственно.

Статистически значимое по сравнению с группой контроля повышение активности КПN обнаружено через 0,5 часа после введения про-пептида в гиппокампе и стриатуме. Через 4 часа активность фермента снижалась во всех структурах мозга и к 72 часам не отличалась от уровня контроля. В то же время, наиболее существенная активация ФМСФ-КП наблюдалась в гипоталамусе, гипофизе и стриатуме. Через 4 часа после введения пептида обнаруживалась тенденция к снижению активности фермента, но в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге она оставалась выше контрольных величин. К 24 часам активность ФМСФКП у животных, получавших предшественник энкефалина, не отличалась от таковой у контрольных. Таким образом, динамика изменений активности ФМСФ-КП при инстилляции лей-энкефалин-арг6 была очень сходной с таковой в случае КПN, но степень активации была выше, чем степень активации КПН.

Лей5-энкефалин-арг6 in vitro подавлял активность КПN, но оказывал действия на активность ФМСФ-КП. Вероятно, in vivo действие пептидов на активность ферментов опосредовано, что предполагает существование механизмов регуляции их активности с участием лей-энкефалин-арг6.

Стендовые доклады 253

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СЕКРЕТИРУЕМОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ

B.PUMILUS 3-19 Шарипова М.Р., Сабирова А.Р., Шагимарданова Е.И., Черемин А.М.

Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru Протеолитические белки вовлечены во все основные физиологические процессы и являются стратегическими ферментами клеток бактерий. Геном B. subtilis содержит 62 гена протеолитических белков, среди которых 35 генов кодируют внутриклеточные, 8 секретируемые, 13 – мембраносвязанные и 6 генов – протеиназы, локализованные в клеточной стенке. Многие из белков, соответствующих этим генам, пока не выделены, их физиологические функции не установлены. Научно-практический интерес представляют ранее не идентифицированные белки протеолитического спектра, что обусловлено необходимостью расширения общих представлений об эволюционном развитии этой группы гидролаз и выявления новых, практически значимых ферментов с полезными свойствами. Цель работы – поиск, изоляция и характеристика гена новой металлоэндопептидазы (mprBр) из фрагмента ДНК B. pumilus и изучение его экспрессии.

В ДНК B. pumilus 3-19 впервые у бацилл выявлен и охарактеризован ген, кодирующий гомолог эукариотических адамолизинов клана метцинкинов (AN EU678894). Экспрессия гена модулируется различными регуляторными системами в период постэкспоненциального роста. Установлено, что белки транспорта аммония GlnK и AmtB совместно с глобальным фактором транскрипции TnrA участвуют в контроле экспрессии гена. Двухкомпонентная система DegS-DegU, ответственная за синтез ферментов биодеградации, оказывает позитивное влияние на экспрессию mprBр. Установлено отсутствие регуляторной взаимосвязи между экспрессией mprBр и споруляцией. Показано, что активность гена контролируется механизмами углеродной и азотной катаболитной репрессии. В клетках эукариот адамализины выполняют защитную функцию, будучи агрессивными компонентами змеиных ядов. По аналогии бактериальные адамализиноподобные протеиназы бактерий могут выполнять защитную функцию. Бациллы, сталкиваясь с неблагоприятными условиями среды, начинают синтезировать металлопротеиназу как фактор агрессии. Таким образом, экспрессия гена металлопротеиназы является одним из адаптационных ответов в постэкспоненциальный период роста спорообразующих бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009– 2013 гг.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕОЛИЗА НЕКОТОРЫХ АНАЛОГОВ СЕМАКСА

Шевченко К.В., Вьюнова Т.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |
Похожие работы:

«Вестник Тюменского государственного университета. 20 Экология и природопользование. 2016. Т. 2. № 4. С. 20–32 Павел Евгеньевич КАРГАШИН1 Платон Сергеевич ЯСЕВ2 УДК 528.87+528.94 КАРТОГРАФИРОВАНИЕ ПРОМЫШЛЕННОГО ОСВОЕНИЯ ХОХРЯКОВСКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ кандидат географических наук, доцент кафедры картографии...»

«Пояснительная записка к рабочей программе по биологии для 9 класса Программа разработана на основе Федерального компонента государственного стандарта основного общего образования и Федерального базисного учебного плана, в соответствии с которым на изучение би...»

«НАЗАРЕНКО Александр Владимирович СИСТЕМА ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КОМПЕТЕНТНОСТНО-ОРИЕНТИРОВАННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образован...»

«Приказ Минздрава России от 15.11.2012 N 927н Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пострадавшим с сочетанными, множественными и изолированными травмами, сопровождающимися шоком (Зарегистрировано в Минюсте России 21.01.2013 N 26634) Документ предоставлен Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки....»

«Всероссийская научно-практическая конференция "Экология и безопасность в техносфере: современные проблемы и пути решения" ванные системы по управлению пожарно-спасательными формированиями, прогнозированию опасных факторов...»

«Номер: KZ61VCY00072512 Дата: 15.07.2016 АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ МИНИСТЕРСТВО ЭНЕРГЕТИКИ ЭНЕРГЕТИКА МИНИСТРЛІГІ РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН МНАЙ-ГАЗ КЕШЕНДЕГІ КОМИТЕТ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ЭКОЛОГИЯЛЫ РЕТТЕУ, РЕГУЛИРОВАНИЯ, КОНТРОЛЯ И БАЫЛАУ ЖНЕ МЕМЛЕКЕТТІК ГОСУДАРСТВЕННОЙ ИНСПЕКЦИИ ИНСПЕКЦИЯ КОМИТЕТІ В НЕФТЕГАЗОВОМ КОМПЛЕКСЕ АТЫРАУ О...»

«Межгосударственная кластерная интеграция. Санкт-Петербургский Кластер Чистых технологий для городской среды. Interstate cluster integration. Saint-Petersburg Cleantech Cluster for urban environment. Миссия Кластера Mission of the Cluster Cделать Санкт-Петербург Making St. Petersburg экологичным...»

«РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ НА ЮГЕ АРЕАЛА В ПОВОЛЖЬЕ Г.В. Епланова Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти eplanova_ievb@mail.ru Живородящая ящерица Zootoca vivipara (L...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом...»

«Песков В.Н., Тарасенко М.О., Франчук М.В. 82 Изменчивость линейных размеров. птенцов обыкновенного жулана УДК 598.292:591.3 ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ, ПРОПОРЦИЙ ТЕЛА И ПЕРИОДИЗАЦИЯ РАЗВИТИЯ ПТЕН...»

«Бакшеева Юлия Витальевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫХ СВОЙСТВ СИГНАЛОВ В УЛЬТРАЗВУКОВЫХ СИСТЕМАХ ДИАГНОСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Специальность: 05.13.01 "Системный анализ, управление...»

«Тотальный вторжение, 2001, Anton Belozerov, МФ [с.н.], 2001 Опубликовано: 12th September 2011 Тотальный вторжение СКАЧАТЬ http://bit.ly/1cgXAGl Днепровская тарань биология, уловы и состояние запасов,...»

«Институт медико-биологических проблем Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Научно-исследовательская лаборатория "Динамика" ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ СЕРДЕЧНОГО РИТМА: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ Москва Санкт-Петербург 2002 г...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 78-85. УДК 591.5:598.113.6 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ, LACERTA VIVIPARA, ГОСУДАРСТВЕННОГО ЗАПОВЕДНИКА "КОМСОМОЛЬСКИЙ" © 2009 О.Г. Лазарева Ивановский государственный универс...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Балашовский институт (фили...»

«УДК504.064.36 И. А. ШВЕДЧИКОВА, д-р. техн. наук, проф. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк;9 И. В. НИКИТЧЕНКО, асп. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЕ СИСТЕМЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПАРАМЕТРОВ ШАХТНЫХ ВОД Определены основные загрязняющие составляющи...»

«ПОЛИТБЮРО 2.0: реновация вместо демонтажа Август 2017 Перечень докладов о Политбюро 2.0 21.08.2012 Большое правительство Владимира Путина и "Политбюро 2.0" 21.01.2013 Политбюро 2.0 накануне перезагрузки элитных групп 22.05.2013 Год Правительства Дмитрия Медведева: итоги и перспективы 23...»

«Topical issues of law: theory and practice. №26. 2013 вопорядка как объективную необходимость развития государства и общества. Охарактеризованы особенности правоохранительной деятельности по обеспечению внутренней безопасности страны, присущая взаимодействию правоохранительных органов различных ветвей власт...»

«ЗАРУБЕЖНЫЙ ОПЫТ УДК 349.6 ББК 67.407 С.Н. ОВЧИННИКОВ Таможенно-правовые средства охраны природы: опыт АСЕАН Рассматриваются экологические аспекты таможенного регулирования в странах АСЕАН: защита видов животных и растений, находящихся под угрозой исчезновения, сохранение биологического разнообразия и охрана окружающей пр...»

«1 Зелная палочка. №2 Февраль 2013 МБОУ—гимназия №3 г. Тулы МБОУ— 2013 год объявлен Президентом Российской Федерации Годом охраны окружающей среды. Однако вопросами охраны окружающей среды нужно заниматься не только в...»

«УДК 544.6 ВЛАГОПЕРЕНОС В БИКОМПОНЕНТНЫХ КОНСЕРВАЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ НА БАЗЕ НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ Н. Е. Беспалько Кафедра "Безопасность жизнедеятельности и военная подготовка", ФГБОУ ВПО "ТГТУ";...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.