WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 6 ] --

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: ATRegister@mail.ru Замена N-концевой аминокислоты в молекуле семакса на аланин ([Ala1]-Sem), глицин ([Gly1]-Sem), треонин ([Thr1]-Sem) и триптофан ([Trр1]-Sem) значительно сужает спектр ноотропного действия или приводит к полной потере ноотропной активности данных пептидов. Это дает основание предположить, что замена метионина на другие аминокислоты в семаксе может заметно модифицировать их взаимодействие с ферментным комплексом тканей головного мозга, ответственным за их деградацию. Для проверки этой гипотезы в качестве ферментов использовались основные классы пептидаз области носа и мозга крысы: лейцинаминопептидаза, карбоксипептидазы B и Y, дипептидилпептидаза, пепсин, микросомальная фракция мозга крысы (МФМК), а также гомогенат целого мозга крысы (ГЦМК). Исследовался набор продуктов протеолиза этих пептидов. Обнаружено, что степень деградации семакса и его аналогов для разных протеиназ существенно различается. Наибольший протеолиз наблюдается в присутствии карбоксипептидазы B у [Thr1]-Sem, в присутствии карбоксипептидазы Y у [Trр1]-Sem, а в присутствии дипептилпептидазы – у [Ala1]-Sem и семакса. Установлено, что аналоги семакса более устойчивы к протеолизу, чем семакс.

Обнаружено принципиальное отличие протеолиза семакса и его аналогов под действием водорастворимых и мембранносвязанных протеиназ (МФМК). Вероятно, это связано с особенностями взаимодействия данных пептидов с мембранными протеиназами.



При работе с ГЦМК показано, что влияние на ход протеолиза карбоксипептидаз выше, чем это наблюдалось в случае использования МФМК. При анализе продуктов протеолиза, образующихся под действием ГЦМК, оказалось, что из [Ala1]Sem, [Gly1]-Sem, [Thr1]-Sem и семакса образуется единственный метаболит HisPhe-Pro-Gly-Pro (Sem-5), а в случае [Trp1]-Sem через 30 минут от исходного пептида остается около 1%, Sem-5 образуется 33%, Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (Sem-6) – 45%, а Trp-Glu-His-Phe – 21%.

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная клеточная биология», программой поддержки ведущих научных школ РФ НШ-3438.2010.4 и грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-2375.2009.4 Стендовые доклады 255

–  –  –

Создание новых лекарственных средств V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕПТИДОВ

C ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: landr@img.ras.ru Изучению физиологически активных пептидов уже в течение многих лет уделяется большое внимание ввиду возможности создания на их основе новых лекарственных препаратов, а также с учетом роли этих веществ в механизмах фармакологических эффектов.

Экспериментальной основой всей работы являлись структурно-функциональные исследования новых синтезированных пептидов. Излагается разрабатываемая нами концепция создания пептидов с заданными физиологическими свойствами на основе структурно-функционального анализа природных пептидов. Приводятся данные по синтезу пептидов – структурных аналогов селанка и исследования их противовирусных свойств, которые позволили выделить фармакофор с противовирусной активностью Gly-Pro.





Проведены исследования влияния стереоспецифичности аминокислотных последовательностей на механизм их действия на примере синтезированных С-концевых последовательностей дерморфина. На основе фрагмента нейротензина -Pro-Tyr- синтезирована и охарактеризована большая группа пептидов. Проведенный структурно-функциональный анализ этой группы пептидов позволил отобрать наиболее эффективные пептиды с нейролептической активностью для дальнейших комплексных исследований с целью создания на их основе новых лекарственных препаратов с нейролептической активностью. С целью конструирования новых пептидов с нейротропными свойствами, не уступающих пептиду семакс проведен синтез и исследования фрагментов АКТГ4-10. Проведенные структурно-функциональные исследования пептидов на основе фрагмента АКТГ4-10 показали, что они имеют фундаментальное значение с точки зрения подтверждения концепции о наличии в функциональных пептидах фармакофоров и возможность пролонгирования их действия. Проведение комплексных структурно-функциональных исследований являются необходимым при создании новых лекарственных препаратов на основе пептидов.

Работы выполнены при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ № НШ-3438.2010.4, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, ГК № 14.740.11.0179.

Стендовые доклады 257

ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ПЕПТИДОВ

В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ КРЫСЫ

Безуглов В.В., Назимов И.В., Грецкая Н.М., Дейгин В.И., Акимов М.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: vvbez@ibch.ru Гидролиз пептидных препаратов в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) является основным препятствием для применения пероральных лекарственных форм. Нами разработаны тест-системы с использованием фрагментов желудка и тонкого кишечника крысы, которые позволяют более адекватно оценить гидролитическую стабильность соединения по сравнению с обычно используемыми искусственными смесями ферментов. В данных системах изучена гидролитическая стабильность пептидов, имеющих терапевтическое значение: даларгина, стемокина и ряда других, в том числе модифицированных ибупрофеном и аспирином циклических производных 2,5-дикетопиперазиновых аналогов трипептидов. Исследована также стабильность оптических и химических изомеров пептида Glu-Trp, содержащих все возможные комбинации L- и D-энантиомеров обеих аминокислот, соединенных пептидной связью через - или -карбоксильную группу глутаминовой кислоты, а также производных пироглутамил-триптофана. Установлено, что устойчивы к гидролизу дикетопиперазины любой структуры, а также трипептиды на их основе, и линейные формы D-D-дипептидов. Даларгин и стемокин устойчивы к действию пепсина, но расщепляются фрагментами ЖКТ. Линейный L-L-дипептид гидролизовался фрагментами кишки полностью; его аналог со связью через -карбоксильную группу был более устойчив (42% гидролиза).

Для гидролиза дипептидов, соединенных через -карбоксильную группу, определяющей оказалась конфигурация первой аминокислоты: L-Glu-(D-Trp) – 57% гидролиза, D-Glu-(L-Trp) – 0%.

Таким образом, показано, что для некоторых пептидов использование искусственного желудочного или кишечного сока, содержащего ограниченный набор ферментов, может приводить к ошибочным результатам, завышающим стабильность пептидных препаратов. Предложенные нами тест-системы с использованием фрагментов желудка и кишечника крысы могут быть применены с фрагментами желудка и кишечника других видов животных, включая человека.

Работа частично поддержана грантом Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 14.740.11.0116).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ГИДРОЛИЗА ФАРША

МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА,

ОБЛАДАЮЩЕГО ВЫСОКОЙ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Крупнова М.Ю.1, Немова Н.Н.1, Мухин В.А.2 Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, Петрозаводск Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича, Мурманск

E-mail: mukrupnova@rambler.ru

Морские беспозвоночные и пресноводные рыбы привлекают внимание исследователей в качестве источника необычных по химическому строению и биологической активности природных соединений. Работы такого рода проводятся, в основном, на морских видах, в то время как исследований, в которых в качестве сырья, используют гидробионты пресноводных водоемов, крайне редки, при этом на долю малоценных видов рыб (ерш, корюшка, уклея) приходится более половины вылова.

Целью данной работы было сравнение условий гидролиза фарша из различных источников, а именно, беспозвоночных Баренцева моря и «потенциально-ресурсных» видов гидробионтов из водоемов Республики Карелия.

На основании полученных данных можно отметить, что предподготовка материала для проведения гидролиза идентична вне зависимости от источника получения гидролизата, а именно: 3 часа при температуре 50–55о в количественном соотношении белоксодержащего субстрата и ферментного препарата 100 г: 0,5–0,7 г и гидромодуле от 0,5 до 1,5. При этом процесс гидролиза можно проводить двумя способами, вводя в гидромодуль единый рассчитанный объем (0,75 мл) препарата протеиназ, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба, а в другом случае, он же добавляется порционно (1/3 объема в час). Так, по данным Мухина (Мухин, Новиков, 2001) при кратном введении препарата протеиназ в фарш морских беспозвоночных гидролиз проходит более интенсивно, в то время как при добавлении препарата в фарш пресноводных рыб оптическая плотность гидролизатов практически идентична (корюшка) или несколько снижена (уклея, ерш). Максимальное поглощение продуктов гидролиза белков у исследуемых малоценных видов пресноводных рыб (корюшки, ерша, уклеи) происходит при 300 нм, в то время как у морских беспозвоночных максимальное поглощение продуктов гидролиза белков происходит при 280 нм (Мухин, Новиков, 2001).

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Отделения биологических наук РАН «Биологические ресурсы России: фундаментальные основы рационального использования».

Стендовые доклады 259

КОРТАГЕН КАК НЕЙРОПРОТЕКТОР

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНСУЛЬТЕ У КРЫС

Гаврилова С.А.1, Шрам С.И.2, Новицкая Ю.А.3, Гранстрем О.К.3 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, Москва ООО «Герофарм», С.-Петербург

E-mail: sgavrilova@mail.ru

Целью исследования являлось изучение нейропротекторных свойств синтетического тетрапептида (AEDP) кортаген.

Методы. Работу выполняли на самцах крыс популяции Вистар весом 230– 250 г, 150–170 г, 300–350 г. в разных сериях экспериментов. Ишемический инсульт моделировали электрокоагуляцией средней мозговой артерии с необратимой перевязкой ипсилатеральной сонной артерии (ОСМА). Размер некроза оценивали в срезах окрашенных трифенилтетразолием хлоридом как % пораженной ткани к общему размеру коры ипсилатерального полушария мозга. Неврологические нарушения, смертность и динамику веса исследовали в модели неполной глобальной ишемии мозга (необратимая перевязка двух сонных артерий – НГИ) по бальной шкале Саркисовой и в модели фотоиндуцированного тромбоза (ФИТ) методом Limb-placingtest. Кортаген вводили внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, интраназально в дозах 1, 10, 100, 150, 1000 мкг/кг курсом в течение 3, 5 или 7 дней в разных сериях экспериментов. Контрольные животные получали физиологический раствор эквивалентно.

Результаты. Наиболее яркий защитный эффект при развитии ишемического поражения мозга кортаген оказывал в дозе 10 мкг/кг при внутривенном или внутрибрюшинном введении. Кортаген, примененный в острую стадию развития ишемического инсульта в модели ОСМА, значимо, на 20%, снижал размер некроза коры головного мозга крыс по сравнению с контролем. Оценка неврологического состояния крыс показала более быстрое восстановление координации и двигательной активности лап крыс с ФИТ, получавших кортаген. В модели НГИ препарат значимо увеличивал число животных с легким неврологическим дефицитом, снижал суточную смертность и ускорял нарастание веса в течение 10 суток после операции, улучшая общее состояние крыс. Внутримышечный способ введения был неэффективен.

Заключение. Синтетический тетрапептид (AEDP) кортаген обладает нейропротекторными свойствами. Примененный в острую стадию развития ишемии, пептид снижает тяжесть неврологического статуса, уменьшает суточную смертность, уменьшает размер некроза в модели инсульта, улучшает общее состояние животных.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

ПРОСТАТРОПНОГО ПЕПТИДНОГО ПРЕПАРАТА «ПРОСТАМАКС»

Пахомова А.В.1, Румпель О.А.1, Гранстрем О.К.2, Боровская Т.Г.1 Учреждение РАМН НИИ фармакологии СО РАМН, 634028 Томск, пр. Ленина, 3 ООО «ГЕРОФАРМ», С.-Петербург

Е-mail: repropharm@yandex.ru

Неинфекционные простатиты и доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) являются в настоящее время наиболее широко распространенными урологическими патологиями. Число пациентов, страдающих данными заболеваниями, с течением времени не снижается. Это побуждает к поиску новых способов терапии данной урологической патологии. К числу перспективных в этом плане лекарственных средств, принадлежит пептидный препарат «Простамакс». В экспериментальных исследованиях установлено, что он задерживает развитие атрофических и склеротических процессов у животных с хроническим воспалением предстательной железы, препятствует развитию ДГПЖ. В плане дальнейшего изучение простатотропного действия препарата представляется целесообразным изучение его влияния на диурез, противовоспалительных, обезболивающих свойств.

Учитывая, что ДГПЖ связана с андрогенезацией организма, целесообразно исследование влияния препарата на уровень андрогенов.

Эффективность препарата оценивалась при введении его животным (крысы, мыши) репродуктивного возраста в двух дозах: 20 и 40 мкг/кг. Противовоспалительное действие изучали на модели каррагенинового отека, анальгетическое действие – на модели «уксусные корчи», антиандрогенная активность оценивалась по изменению весовых коэффициентов органов-мишеней у половозрелых крыс, влияние на диурез – в условиях 5 часового диуреза с 5% водной нагрузкой.

Установлено, что препарат «Простамакс» в дозе 20 мкг/кг обладает противовоспалительными свойствами. Масса отека статистически значимо снижалась по сравнению с контролем. Исследование обезболивающего действия показало, что препарат в обеих дозах обладает анальгетической активностью. Болевая чувствительность угнеталась на 54–60%. Препарат «Простамакс» обладает антиандрогенной активностью в обеих дозах. Так, весовые коэффициенты семенных пузырьков снижались на 23,5–42,9%. Наиболее выраженный эффект отмечен в дозе 20 мкг/кг. При изучении влияния препарата на диурез обнаружено, что препарат «Простамакс» в дозе 40 мкг/кг увеличивает диурез. Объем мочи увеличился на 84%.

Стендовые доклады 261

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ПЕПТИДНОГО ПРЕПАРАТА «КОРТАГЕН» ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИ

ОБУСЛОВЛЕННЫХ СНИЖЕНИЯХ КОГНИТИВНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ

Румпель О.А.1, Пахомова А.В.1, Гранстрем О.К.2, Боровская Т.Г.1 Учреждение РАМН НИИ фармакологии СО РАМН, 634028 Томск, пр. Ленина, 3 ООО «ГЕРОФАРМ», С.-Петербург

Е-mail: repropharm@yandex.ru

В клиническую практику последних пяти лет внедрен новый пептидный препарат кортексин, обладающий выраженными ноотропными и нейропротекторными свойствами. Показано, что кортексин является высокоэффективным корректором функционально-метаболических нарушений головного мозга при хронической ишемии. Выявлена его эффективность при когнитивных расстройствах у постинсультных больных, а также у подростков, употребляющих психоактивные препараты. Целью настоящего исследования явилось экспериментальное изучение эффективности препарата «Кортаген», представляющего собой последовательность наиболее тканеспецифически значимых аминокислот (Ala-Glu-Asp-Pro), входящих в состав кортексина, при генетически обусловленных снижениях когнитивных способностей.

Эффективность «Кортагена» оценивалась при его введении в течение 7 дней в дозах 10 мкг/кг, 100 мкг/кг и 1000 мкг/кг крысам (самцам и самкам, возраст 2 мес)

– потомство, характеризующегося генетически обусловленным снижением способности к обучению. Последнее моделировалось однократным введением в МПД крысам-самцам ингибитора топоизомеразной активности – этопозида за 3 мес до спаривания с интактными крысами-самками. Способность потомства (F 1) к обучению оценивали в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ).

Проведенные исследования показали, что количество животных контрольной группы (потомство интактных самок и самцов, получавших этопозид) с выработанным УРПИ составило 40–55% от такового у интактных крыс. Процент крысят с выработанным УРПИ во всех экспериментальных группах статистически значимо не отличался от такового в группе интактных животных. Наиболее выраженный эффект отмечался у крысят-самок при введении «Кортагена» в дозе 100 мкг/кг, у крысят-самцов – при введении во всех исследуемых дозах. Таким образом, препарат «Кортаген» является эффективным средством коррекции генетически детерминированных когнитивных нарушений у экспериментальных животных.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ АНКСИОЛИТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ СЕЛАНКА

ПРИ СОВМЕСТНОМ ВВЕДЕНИИ С БЕНЗОДИАЗЕПИНАМИ

Мешавкин В.К.1, Балашов А.М.1, Ларионова А.В.2, Кост Н.В.1, Терещенко О.Н.1, Беляева М.Л.1, Мешавкина М.А.1, Хрущова О.Н.2, Мясоедов Н.Ф.3 Учреждение РАМН Научный центр психического здоровья РАМН, 115522 Москва, Каширское ш., 34 ГОУ Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, 117997 Москва, ул. Островитянова, 1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: Meshavkin@yandex.ru

Бензодиазепины – наиболее распространенные во всем мире и достаточно эффективные анксиолитики. При этом им свойственны побочные эффекты, связанные с развитием толерантности и зависимости (основная проблема хронического приёма), с седативным и миорелаксирующим действием. В настоящее время разработан пептидный анксиолитик селанк, отличающийся высокой степенью безопасности. Это открывает перспективу сочетанного применения бензодиазепинов и селанка с задачей добиться уменьшения скорости формирования и выраженности негативных побочных эффектов транквилизаторов при сохранении высокой терапевтической эффективности.

Белым беспородным мышам-самцам раз в сутки на протяжении 45 дней вводили диазепам (в/б в 0,2 мл дистиллированной воды) в дозах, постепенно возрастающих от 1 до 25 мг/кг и, на фоне тех же доз диазепама (Д), селанк (600 мкг/кг).

Контрольным животным эквивалентно вводили дистиллированную воду. Через 2 дня по окончании хронических инъекций животным вводили Д в тестовых дозах 1, 3 и 10 мг/кг и через 30 мин оценивали их поведение в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). В контроле (хронические инъекции воды) Д дозозависимо оказал противотревожный эффект. При хроническом введении Д снижалась базовая тревожность животных. На этом фоне существенно уменьшалась их чувствительность к анксиолитическому действию малых доз Д (1 и 3 мг/кг), введение препарата в высокой дозе (10 мг/кг) снизило количество выходов в открытые рукава ПКЛ и время нахождения в них мышей, т.е. по-видимому, Д оказывал седативное действие. При хроническом введении транквилизатора совместно с селанком сохранялось снижение базовой тревожности и чувствительности к тестовым дозам Д. Таким образом, селанк, при совместном хроническом введении с Д, не снижал его терапевтическую эффективность.

Работа поддержана РФФИ (грант № 11-08-01327-а).

ШКОЛА МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ

–  –  –

ЗАЩИТНЫЕ ПЕПТИДЫ ОДУВАНЧИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО

(TARAXACUM OFFICINALE WIGG.)

Астафьева А.А., Рогожин Е.А., Егоров Ц.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: a-sanya@mail.ru mailto:vmlipkin@mx.ibch.ru Ценным, но пока еще мало изученным источником антимикробных пептидов являются дикорастущие виды растений. Целью данной работы было выделение и характеристика пептидов из одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.), который является злостным сорняком, распространенным в средней полосе России, высоко устойчивым к патогенам и вредителям.

Предварительно были разработаны условия экстракции пептидов из цветков и семян этого вида растений органическими и неорганическими кислотами и их разделения с использованием различных типов хроматографии.

В результате в семенах одуванчика было иденцифицировано 8 пептидов с молекулярными массами от 2,6 до 9,3 кДа. Среди них 2 новых гомологичных пептида с мол. массами 4916 и 5054 Да, содержащих 8 остатков цистеина. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей этих пептидов позволило отнести их к семейству дефензинов растений.

В цветках одуванчика иденцифицировано 18 пептидов с молекулярными массами от 3 до 9,5 кДа. Определена полная аминокислотная последовательность 3-х 6-Cys пептидов с мол. массами 4357, 4817 и 4608 Да и показано, что они обладают новым цистеиновым мотивом, ранее не описанным для растительных АМП. Показано, что они ингибируют рост ряда фитопатогенных грибов и оомицетов в микромолярных концентрациях и подавляют развитие возбудителя фитофтороза. В цветках обнаружены также 2 новых гомологичных гликозилированных пептида, не содержащих остатков цистеина. Определены их N-концевая аминокислотная последовательность и аминокислотный состав. Показано, что они содержат 50% пролина и гидроксипролина. Масс-спектрометрическим анализом показано, что они имеют в своем составе 10 и 5 остатков пентоз соответственно. Установлено, что они обладают антимикробной и антифунгальной активностью. При действии на фитопатогенные грибы был отмечен частичный плазмолиз мицелия.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России». Госконтракт № 16.740.11.424.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФАКТОР

ТРАНСКРИПЦИИ КАИЗО

Байкалова Е.А., Женило С.В., Прохорчук Е.Б.

Учреждение РАН Центр «Биоинженерия» РАН, 117312 Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп.1 E-mail: baykalovaelena@gmail.com Каизо – это метил-ДНК-связывающий белок, который относится к BTB/POZ семейству белков. Известно, что белок Каизо вовлечен в развитие опухолей кишечника у мыши. Он отличается от других метил-ДНК связывающих белков по двум причинам. Во-первых, он узнаёт как минимум два симметрично метилированных динуклеотида в контексте 5’-мCpGpmCpGp-3’ или неметилированную последовательность CTGCNA. Во-вторых, для связывания метилированной ДНК служит домен «цинковые пальцы», вместо MBD-домена. Ранее было показано, что Каизо является компонентом N-CoR комплекса. Однако по нашим данным только минорная часть Каизо вовлечена во взаимодействие с N-CoR комплексом. Одной из проблем при очистке комплекса с Каизо является значительное снижение количества белка по мере очистки комплекса. Для решения данной задачи был разработан следующий подход: провести очистку белкового комплекса из мышиных фибробластов дикого типа и фибробластов с генетическим нокаутом гена Каизо. Использование нокаутных фибробластов в качестве контроля позволяет идентифицировать только специфичные взаимодействия других белковых факторов с Каизо. Разработана модифицированная методика выделения ядерных экстрактов в присутствии ингибитора SUMO-протеаз NEM, что позволяет значительно увеличить количество белка Каизо в экстрактах. Далее происходит очистка комплекса на основе гель-фильтрации и ДНК-аффинной хроматографии: фракции после гель-фильтрации, содержащие белок Каизо, будут использованы на аффинной колонке со смолой BrCN-сефарозой, к которой была пришита в качестве лиганда неметилированная или метилированная последовательность ДНК. Колонка с неметилированным лигандом снижает неспецифические взаимодействия при дальнейшей очистке.

По литературным данным известно, что при исследовании белковых комплексов, содержащих поликомб-белок Ring1b/Rnf2, был обнаружен Каизо.

Ring1b/Rnf2 входит в состав PRC1-комплекса. Одним из ключевых компонентов этого комплекса является Bmi1. Мы показали, используя модифицированный нами метод приготовления экстрактов, что Bmi1 и Каизо ко-иммуноперципитируют in vivo.

Стендовые доклады 267

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХИТОЗАНА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ

-ЛАКТОГЛОБУЛИНА ИЗ СМЕСИ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ МОЛОКА

Бакулин А.В.1, Гавриленко Н.В.2, Червяковский Е.М.2, Курченко В.П.2, Варламов В.П.1 Учреждение РАН Центр «Биоинженерия» РАН, 117312 Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп.1 Белорусский государственный университет, 220030 Минск, Беларусь

E-mail: alexanderbakulin@mail.ru

Сыворотка молока является побочным продуктом, образующимся при производстве сыра и казеина. Сывороточные белки богаты незаменимыми аминокислотами и являются, таким образом, наиболее биологически ценной частью белков молока.

Однако их использование, зачастую, затруднено из-за высокого сенсибилизирующего потенциала. При этом наибольшими аллергенными свойствами обладает лактоглобулин. В связи с этим, нами был предложен метод удаления -лактоглобулина из сыворотки молока с использованием хитозана. В процессе работы было установлено, что в определенных условиях хитозан способен селективно связывать -лактоглобулин из смеси белков молочной сыворотки, образуя при этом нерастворимый комплекс. Целью данной работы было изучение взаимодействия хитозана с -лактоглобулином. Установлено, что наиболее эффективно связывание

-лактоглобулина хитозаном происходит при рН 6,0–6,2. Показано, что с ростом молекулярной массы полисахарида (Мv от 20 до 200 кДа), выделение целевого белка проходит более эффективно. Удаление -лактоглобулина из молочной сыворотки в виде нерастворимого осадка на 95% происходит, лишь в определенной области концентраций хитозана, которая составляет 0,5–0,7 мг/мл. Изучено влияние ионной силы раствора и концентрации ионов Ca2+, оказывающих существенное влияние на процесс формирования комплекса белок-полисахарид. Кроме того, были определены энтропия и энтальпия процесса комплексообразования. Исходя из расчетов термодинамических параметров, показано, что -лактоглобулин имеет один сайт связывания с хитозаном. При этом каждая субъединица белка образует 6 центров связывания с молекулой хитозана с константой связывания 7,6х104 М-1.

Посредством метода динамического светорассеивания определен размер сформированного комплекса, который составил порядка 1,5 М. Основываясь на полученных результатах исследований, была разработана технология переработки сыворотки молока с использованием хитозана, позволяющая выделять -лактоглобулин на 95%, без больших временных затрат и применения специального оборудования. При этом данный подход предусматривает получение двух функционально важных продукта: молочную сыворотку со сниженным сенсибилизирующим потенциалом и -лактоглобулин в индивидуальном виде.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ MYCOPLASMA HOMINIS PG37 НА СТРЕССОРЫ:

СЕКРЕЦИЯ МЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ И РЕОРГАНИЗАЦИЯ ПРОТЕОМА

Баранова Н.Б., Медведева Е.С., Музыкантов А.А., Горшков О.В., Шаймарданова Г.Ф., Чернов В.М., Чернова О.А.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: natalja-b@yandex.ru Mycoplasma hominis, одна из наиболее распространенных микоплазм, ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями человека, является контаминантом клеточных культур. Решение проблемы инфекций, вызываемых M. hominis, связывают с успехами изучения механизмов выживания бактерии в стрессовых условиях. Определение особенностей протеома, а также ультраструктуры клеток M. hominis PG37, образующихся в неблагоприятных условиях (изменение температуры и голодание), явилось задачей нашей работы.

Для анализа белков микоплазмы использовали 2D-DIGE, MALDI-TOF/TOF и программу Mascot. Ультраструктуру клеток бактерии исследовали с помощью трансмиссивной электронной микроскопии.

В результате проведенных исследований было установлено, что в культуре M.

hominis PG37 помимо «типичных» клеток микоплазмы присутствуют ультрамикроформы – сферические, окруженные мембраной наноструктуры (диаметр 0,2 мкм), характерные для мембранных везикул бактерий, вовлеченных в секрецию белков и патогенез. Культивирование M. hominis PG37 в стрессовых условиях приводит к увеличению количества ультрамикроформ, переходу бактерии в некультивируемое состояние и изменению профиля растворимых белков. 53 белка, количественное содержание которых различалось у M. hominis PG37 при культивировании в оптимальных и стрессовых условиях, были идентифицированы и установлено, что ответные реакции микоплазмы на воздействие стрессоров связаны с модуляцией содержания белков, участвующих в фундаментальных клеточных процессах и вирулентности бактерии. Реорганизация протеома M. hominis в стрессовых условиях может быть обусловлена особенностями синтеза белков у бактерии в некультивируемом состоянии, а также протеолиза и трафика белков, в том числе секреции их в составе мембранных везикул, участвующих в адаптации микроорганизмов к условиям среды и реализации вирулентности.

Работа поддержана Грантом Президента Российской Федерации MK-4894.2010.4;

РФФИ 11-04-01406а.

Стендовые доклады 269

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛУТАТИОН S-ТРАНСФЕРАЗЫ ПЕЧЕНИ ЩУКИ

Борвинская Е.В., Смирнов Л.П., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, Петрозаводск E-mail: katsu@inbox.ru Глутатион S-трансферазы представляют собой древнее и мультифункциональное семейство ферментов, основная роль которых заключается в обезвреживании реактивных электрофильных соединений и в защите клетки от окислительного стресса.

Сравнительный анализ показал, что активность ГСТ в жабрах и печени щук Esox lucius заметно (в 10–92 раз) превосходит активность в тканях таких пресноводных рыб, как сиг, плотва и форель (в аквакультуре). С целью изучения структурно-функциональных особенностей ГСТ из печени щук нами была проведена очистка этого фермента по схеме, включающей последовательное применение методов гель-хроматографии, аффинной хроматографии и ультрафильтрации.

Пик активности ГСТ с универсальным субстратом 1-хлоро-2,4-динитробензолом, полученный после гель-хроматографии на носителе Sephadex G-100, соответствует кажущейся молекулярной массе 52,8±3 кДа. С аффинным носителем Glutathione Sepharose 4 Fast Flow связывается менее 23% белка, обладающего специфической активностью глутатион S-трансфераз. После процедуры SDS-электрофореза аффинно очищенная ГСТ щук дает одну белковую полосу с молекулярной массой 29,2 кДа. Аналитическое изоэлектрическое фокусирование в ПААГ показало присутствие главной формы ГСТ щуки с pI 6,6.

Таким образом, слабокислая ГСТ щуки представляет собой гомодимер с молекулярной массой субъединиц 29,2 кДа. Дальнейшего изучения требует возможность присутствия в тканях щук изоформ ГСТ, обладающих слабым сродством к аффинному носителю Glutathione Sepharose 4 Fast Flow.

Данная работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ «Ведущие научные школы Российской Федерации» НШ 3731.2010.4; программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга» на 2009–2011 гг.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ТЕПЛОВАЯ АГРЕГАЦИЯ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА

Борзова В.А.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 E-mail: koshemysh@mail.ru Методом динамического светорассеяния изучена кинетика агрегации бычьего сывороточного альбумина (БСА) в широком диапазоне концентраций белка при различных значениях рН. Исследования проводили при фиксированных температурах и в режиме нагревания с постоянной скоростью. Контроль тепловой денатурации БСА осуществляли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Показано, что термостабильность белка уменьшается при снижении pH в интервале от 7,0 до 5,5. Согласно данным ДСК величина Tmax для БСА при рН 7,0 составляет 57,9С. Установлено, что процесс агрегации БСА включает стадию образования первичных кластеров и следующую за ней стадию слипания первичных кластеров, которая протекает в диффузионно-контролируемом кинетическом режиме. Подобраны условия (температура 80С, рН 7,0, концентрация белка 0,75 мг/мл и время нагревания 2 ч), при которых могут быть получены наночастицы БСА с гидродинамическим радиусом 18–20 нм. Обнаружено, что размер таких наночастиц остается стабильным, по меньшей мере, в течение двух суток при комнатной температуре. Индекс полидисперсности для частиц, полученных в указанных условиях, составлял 0,23. Проведен подбор условий для получения стабильных наночастиц при прогревании БСА при более низких температурах (60–70С).

Полученные наночастицы БСА могут быть использованы для создания систем доставки лекарственных препаратов. Главным недостатком существующих в настоящее время методов получения наночастиц БСА является сложность дальнейшей очистки наночастиц от химических агентов, используемых в процессе их получения. Предложенные в настоящей работе методы получения наночастиц БСА лишены этого недостатка.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-00932-а), программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: гос. контракт № П1356 «Поиск и изучение механизма защитного действия искусственных и природных агентов, подавляющих агрегацию белков».

Стендовые доклады 271

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕОМА И СЕКРЕТОМА

БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА ТRAMETES HIRSUTA

ПРИ РОСТЕ НА СРЕДАХ РАЗНОГО СОСТАВА

Васина Д.В., Федорова Т.В., Королева О.В.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр.2 E-mail: d.v.vasina@gmail.com Базидиомицеты, являющиеся возбудителями белой гнили древесины, синтезируют комплекс ферментов лигнолитического действия, осуществляющих процесс делигнификации с высокой эффективностью. Несмотря на перспективность использования данных ферментов в биотехнологии, целлюлозобумажной и других отраслях промышленности, их применение ограничено отсутствием рекомбинантных штаммов с высоким уровнем продукции целевых ферментов. Очевидно, это прежде всего связано с недостаточностью знаний о путях их биосинтеза и регуляции экспрессии в клетке. В связи с этим, в настоящее время ведутся активные работы по аннотации геномов и исследованию протеомов и секретомов различных базидиомицетов.

Целью работы являлось проведение сравнительного анализа протеома и секретома базидиомицета Тrametes hirsuta – эффективного продуцента лакказы, при культивировании гриба на глюкозо-пептонной среде без добавления и с добавлением в среду CuSO4 в качестве индуктора биосинтеза лигнолитического фермента – лакказы. Разработаны протоколы пробоподготовки мицелия гриба Тrametes hirsuta для разделения белков протеома методом двумерного электрофореза (2DE), позволившие получить белковые карты хорошего разрешения.

Исследованы динамики активностей внеклеточных ферментов лигнолитического комплекса: лакказы, лигнин и марганец зависимой пероксидаз, марганец независимой пероксидазы и арилакоголь оксидазы. Установлено наличие индукции ионами меди для лакказы и марганец независимой пероксидазы. В результате сравнительного анализа белковых карт протеома, полученных при максимальной продукции лакказы Тrametes hirsuta, показаны значительные отличия в общем количестве и картине распределения белковых пятен. Обнаружено более 10 белковых пятен, соответствующих белкам с молекулярными массами в диапазоне 40– 60 кДа и значениями pI – 8.0–9.0, интенсивность которых существенно увеличивалась при разделении белков методом 2DE, выделенных из мицелия гриба при его росте в присутствии индуктора. Проводится идентификация данных белков методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-01349).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГАПОНИНА

И ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА БЫКА BOS TAURUS

Воробьева Е.Е.1,2, Костанян И.А.2, Гринкевич В.А.1, Липкин В.М.2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: e-elena777@yandex.ru

Ранее в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН из митохондриальной фракции клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека был выделен новый белок, взаимодействующий с поликлональными антителами к одной из изоформ фактора дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor). Этот белок получил название гапонин (haponin, НLDF-alike protein). Анализ аминокислотной последовательности гапонина показал, что исследуемый полипептид представляет собой гипотетический белок NP_115701.2, известный в PubMed еще под именами MGC11102 и еIF1AD. Анализ базы данных бинарных взаимодействий CCSB-HI1 показал, что гипотетический белок MGC11102 является партнером взаимодействия фактора транскрипции STAT1 (Signal Transducers and Activators of Transcription). Поиск партнеров гапонина в клетках линии CHOK1 показал, что гапонин взаимодействует с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH) – ферментом гликолиза, преимущественно локализующимся в цитоплазме клетки.

С целью уточнения клеточной локализации гапонина было проведено выделение митохондрий из сердца быка (Bos taurus), разделение митохондрий на субфракции растворимых белков, внешних мембран и субмитохондриальных частиц и иммуноблот-анализ полученных фракций с использованием поликлональных антител против рекомбинантного гапонина. Параллельно, субфракции митохондрий анализировались на присутствие GAPDH. В результате было установлено, что оба белка присутствуют в субмитохондриальных частицах. Данные иммуноблотанализа были подтверждены путём выявления исследуемых белков в соответствующих фрагментах акриламидного геля с помощью Maldi-TOF масс-спектрометрии пептидного фингерпринта, а для GAPDH – ещё и анализом N-концевой аминокислотной последовательности.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 273

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ОХАРАКТЕРИЗАЦИЯ РИЦИНА

И ПРОДУКТОВ ЕГО ДЕГРАДАЦИИ В ВОДНОЙ СРЕДЕ

Гладилович В.Д., Краснов К.А., Подольская Е.П.

ФГУН Институт токсикологии ФМБА России, 192019 С.-Петербург, ул. Бехтерева, 1 E-mail: vdgladilovich@gmail.com Рицин – белок, образующийся в касторовых бобах (Ricinus communis), является токсином, который при отравлении блокирует биосинтез белка и может вызвать летальный исход. Из-за его широкого распространения и высокой токсичности, рицин считается вероятным агентом для биотерроризма. Следовательно, чрезвычайно важной является возможность быстрого и надежного определения рицина в объектах окружающей среды, и в первую очередь в воде. Рицин – гликозилированный белок массой около 65 кДа, состоящий из 2 субъединиц массой примерно 30 кДа каждая. Поскольку масса цельного белка малоинформативна в масс-спектрометрическом анализе, необходимо проводить ферментативный гидролиз (например, трипсином), чтобы получить набор характеристичных надежно идентифицируемых пептидов. Масс-спектрометрический анализ гликозилированных пептидов чрезвычайно затруднен, поэтому необходимо оценить ряд пептидов, по которым можно достоверно определять рицин в образцах. Рицину часто сопутствует агглютинин, белок, гомологически близкий к нему (аминокислотная последовательность совпадает на 90%, близкие молекулярные массы). Соответственно, необходимо также выявить пептиды, по которым можно различить эти два белка.

Белки, как правило, нестабильны в воде, поэтому необходимо оценить время, в течение которого рицин и агглютинин можно обнаружить в образцах в неизменном виде, а также охарактеризовать продукты их распада для надежной идентификации этих белков.

В результате работы методом MALDI-TOF-TOF были определены характерные для рицина и агглютинина пептиды, по которым белки могут быть надежно идентифицированы. Наиболее интенсивными являются: для рицина YTFAFGGNYDR (МH+ 1310.58) и AGNSAYFFHPDNQEDAEAITHLFTDVQNR (МH+ 3307.50 Да), для агглютинина ENIELGTGPLEDAISALYYYSTC*GTQIPTLAR (МH+ 3516.72) и SNTDWNQLWTLR (МH+ 1533.74). С помощью метода SDS-гель-электрофореза показано, что спустя 14 дней в водных образцах, содержащих рицин и агглютинин, эти белки могут быть обнаружены в неизменном виде. Характерные пептиды также были обнаружены масс-спектрометрически. Были охарактеризованы продукты деградации рицин и агглютинина в воде и определены характерные для этих продуктов пептиды.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА БЫКА BOS TAURUS.

АНАЛИЗ БЕЛКОВ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ

Громова Е.В.1, Поляков Н.Б.2, Гринкевич В.А.1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: Danone2006@yandex.ru

Последние данные показывают, что протеомный анализ целых клеток или тканей с помощью доступных технологий может быть слишком сложным и неприемлемым для изучения белков, представленных в малом количестве копий. Относительно низкий уровень сложности митохондрий в сочетании с особой важностью функций, выполняемых в клетке (энергетический метаболизм, апоптоз, ионный гомеостаз), делают митохондрии очень привлекательными для протеомного анализа. Свою основную функцию, окислительное фосфорилирование, митохондрии выполняют во всех клетках, однако белковый состав митохондрий изменяется в зависимости от типа и состояния клетки. Протеомика может дать ключ к пониманию того, как митохондрии ведут себя в тех или иных физиологических состояниях организма. Настоящая работа является частью широкомасштабного исследования протеома митохондрий сердца быка и включает в себя идентификацию и анализ белков внутренней мембраны. Для выделения фракции внутренних мембран очищенные митохондрии обрабатывали ультразвуком. В результате такой обработки внешние и внутренние мембраны образуют замкнутые везикулы различной плотности (в случае внутренних мембран они носят название субмитохондриальных частиц – СМЧ). Так как белки внутренней мембраны митохондрий располагаются своими частями как в липидном бислое, так и вне его, был разработан подход многостадийного гидролиза белка. Это позволило получить несколько независимых выборок, а сочетание нескольких методов расщепления белков повышало достоверность идентификации при поиске белков по базам данных. В результате триптического расщепления были получены экстрамембранные фрагменты белков. Гидрофобные трансмембранные фрагменты расщепляли с помощью бромциана по остаткам метионина. Далее смесь пептидов подвергалась последовательным катионобменному и обращенно-фазовому фракционированиям, сопряженным с тандемной масс-спектрометрией. В соответствии с полученными масс-спектрами проводилась идентификация белков по различным компьютерным базам данных.

В результате было достоверно определено 298 белков, для которых был проведен анализ их локализации в клетке и выполняемых функций.

Стендовые доклады 275

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТАЛЛ-АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ АДДУКТОВ ГЛОБИНА КРЫСЫ

Дубровский Я.А.1, Гладилович В.Д.2, Краснов И.А.2, Мурашко Е.А.1, Подольская Е.П.2, Бабаков В.Н.1, Гончаров Н.В.1 ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, г.п. Кузьмоловский, ст. Капитолово, корп. № 93 Учреждение РАН Институт аналитического приборостроения РАН, 190103 С.-Петербург, Рижский просп., 26

E-mail: jar.chem@mail.ru

Перспективными долгоживущими биомаркерами интоксикации для сернистого иприта являются алкилированные ковалентные аддукты с сывороточным альбумином и гемоглобином. Определение нестандартных посттрансляционных модификаций белков крови и определение аминокислотного сайта модификации с использованием масс-спектрометрии позволяет создать метод ретроспективной диагностики отравлений опасными химикатами.

Основной проблемой при выявлении модификаций является очень небольшое количество модифицированного белка (пептида) по отношению к немодифицированному. Поэтому возникает необходимость в разработке методов выделения и обогащения модифицированных белков и пептидов. Нами была предложена методика с использованием метода металл-аффинной хроматографии с хелатированными ионами Cu2+, которая позволяет увеличить чувствительность анализа и может быть успешна применена для выявления посттрансляционных модификаций глобина сернистым ипритом.

В данном исследовании изучалась возможность применения металл-аффинной хроматографии при работе с глобином крысы, инкубированным с сернистым ипритом. Сернистый иприт способен алкилировать глобин крысы в бета-субъединице по С-93 и С-126, а в альфа-субъединице по Е-27. На основании принципа жестких и мягких кислот и оснований Пирсона, было сделано предположение, что пептиды, модифицированные сернистым ипритом, могут образовывать устойчивые комплексы с Cu2+.

Хроматографическое разделение гидролизата глобина крысы, инкубированного с HD, проводили с помощью хелатирующей мембраны, содержащей ионы Cu2+, в формате твердофазной микроэкстракции. После элюирования с сорбента 0,5% пиперидином, с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра (Axima Perfomance, Shimadzu/Kratos Analytical, Великобритания) удалось обнаружить сигнал с массой MH+ 1444,62 Да. Данный сигнал соответствует пептиду EFTPCHDAQAAFQK который входит в состав бета-субъединицы глобина крысы, модифицированной сернистым ипритом по С-126.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРОТЕОМНЫЙ ОТВЕТ КОРНЕЙ ГОРОХА НА ДЕЙСТВИЕ

САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И МЕТИЛЖАСМОНАТА

Егорова А.М., Яковлева В.Г.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30 E-mail: aevtinaegorova@gmail.com Салициловая (СК) и жасмоновая кислоты (ЖК) являются стрессовыми фитогормонами растений, участвующими в защитном ответе на действие абиотических и биотических стрессоров. СК принимает участие в индукции иммунитета растений к биотрофным патогенам, тогда как ЖК эффективна в защите от некротрофов.

СК- и ЖК-индукция иммунитета определяется комплексом изменений в метаболизме растений, многие из которых зависят от адаптивных изменений экспрессии генов и синтезе антипатогенных белков. Мы использовали протеомный подход, чтобы проанализировать, какие изменения происходят в белковом спектре корней гороха при действии СК и метилжасмоната (МеЖК).

Так как СК и МеЖК являются индукторами иммунитета, то можно было ожидать, что оба сигнальных соединения вызовут изменения в содержании части защитных белков. Действительно, такие белки были обнаружены, в том числе аскорбатпероксидаза. Обнаружена и значительная специфика в изменении протеомов в ответ на СК и МеЖК. Наиболее заметные изменения под влиянием СК происходили в кислой области, где повышалось содержание ряда белков, которые являются маркерными при действии СК на корни гороха. Также, СК вызывала изменение содержания 14-3-3 белка, полиубиквитина, шапернонина60, глютатион-Sтрансферазы и др. МеЖК также вызывала изменение содержания белков, среди которых сильно индуцировались белки в кислой области, но с меньшей молекулярной массой, чем СК-индуцируемые маркерные белки. В отличие от СК-индуцируемых, основная часть МеЖК-индуцируемых белков имела относительно небольшие молекулярные массы – от 16 до 22 кДа. МеЖК вызывала изменение содержания профукозидазы, ABR17 (АБК-зависимый белок) семейства патоген-индуцируемых белков PR 10.

СК и МеЖК вызывают изменения протеома корней гороха, причем, есть белки, индуцируемые обеими сигнальными молекулами и белки, являющиеся характерными на действие того или другого соединения, что объясняет специфику ответа растений на действие биотрофных и некротрофных патогенных микроорганизмов.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01281 и грантом Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ НШСтендовые доклады 277 СЕРПИН H1, ПРОДУКТ ГЕНА SERPINH1, –

ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ БИОМАРКЕР РАКОВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

В ЭПИТЕЛИОПОДОБНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ ЧЕЛОВЕКА

Иванов А.В.1, Еремина Л.С.1, Лисицкая К.В.1, Хряпова Е.В.2, Торопыгин И.Ю.2, Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Шишкин С.С.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва

E-mail: kovalyov@inbi.ras.ru

Серпин H1 человека – продукт гена SERPINH1, известный также как белок теплового шока 47 (HSP47) и коллаген-связывающий белок 2 (CBP2), считается представителем большого семейства серин-аргинин протеазных ингибиторов (serinearginine protease inhibitor – serpin), в которое объединены на основе структурного сходства белки, как обладающие ингибиторными свойствами, так и без ингибиторных свойств [Silverman G.A. et al. 2001; P50454 UniProt]. В настоящее время серпин H1 и некоторые другие члены семейства серпинов активно исследуется для выяснения их роли в процессах трансформации клеток и метастазирования раковых опухолей.

В данной работе был проведен сравнительный протеомный анализ ряда эпителиоподобных клеточных линий человека простаты (PZ – норма, BPH-1 – аденома, LNCaP, PC3 и DU145 – рак) и молочной железы (184А1 – норма, MCF, T47 – рак), а также в линиях клеток рабдомиосаркомы RD и A-204. В ходе выполненных исследований по результатам MALDI-TOF масс-спектрометрии во всех изучавшихся клеточных линиях удалось идентифицировать белковую фракцию, принадлежащую серпину H1 – продукту гена SERPINH1. При этом с помощью компьютерной денситометрии было выявлено резкое снижение содержания серпина H1 в раковых клеточных линиях (от 20 до 100 раз) в сравнении с немалигнизированными клетками, включая клетки аденомы (доброкачественной опухоли). Однако в клетках обеих линий рабдомиосаркомы серпин H1 присутствовал в количествах, сопоставимых с его содержанием в немалигнизированных клетках и простаты, и молочной железы. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что резкое падение содержания серпина H1 в раковых клетках, вероятно, связано с процессом малигнизации именно эпителиоподобных клеток человека и указанный белок можно рассматривать как потенциальный биомаркер такой трансформации.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОГО ХИТИНАЗОПОДОБНОГО БЕЛКА КРЫСЫ

В МОДЕЛИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ

Ильницкая Е.В., Радченко В.В., Родионова А.С., Шуваева Т.М., Липкин В.М.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: ilnitskaya@mx.ibch.ru Слизистая оболочка обонятельного эпителия является барьерной тканью, контактирующей с окружающей средой, и осуществляет неспецифическую иммунную защиту организма. Целью нашей работы было исследование новых белков, чей синтез и длительное нахождение в ткани способствует появлению хронического воспаления, лежащего в основе развития старения, злокачественных и аутоиммунных процессов.

В одном из опытов при электрофоретическом анализе белкового экстракта обонятельной выстилки крыс с системным воспалением был обнаружен новый, не описанный в литературе «хитиназоподобный» белок (М ~ 43 кДа), родственный YM-1 мыши и названный нами, в соответствии с местом локализации (epithelium olfacctorium), YM-1olf. Для исследования нового белка была выбрана модель животных с острым эндотоксикозом. Крысам внутрибрюшинно вводили дозу липополисахарида E.coli штамма О26:В6 в количестве 1,5 мг/кг и через сутки животных выводили из эксперимента.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего новый белок YM-1olf крысы и участки его 5`- и 3`-нетранслируемых областей. Впервые представлена последовательность полноразмерной кДНК белка YM-1olf (включающая 1545 п.о.), экспрессирующейся в обонятельной выстилке крыс с острым эндотоксикозом.

Установлена последовательность предшественника зрелой формы YM-1olf крысы. Полноразмерный белок YM-1olf содержит 380 аминокислотных остатков и имеет молекулярный вес 42986 Да. Получена конструкция, обеспечивающая продукцию рекомбинантного аналога, и осуществлен синтез YM-1olf в прокариотической системе. Нами показано резкое увеличение уровня экспрессии гена данного белка в обонятельной выстилке крыс в моделях с острым эндотоксикозом и болезнью Альцгеймера. Изучена взаимозависимость экспрессии генов YM-1olf и защитного липидпереносящего белка rSec45 в клетках обонятельного эпителия крыс в модели острого воспаления.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (В.М. Липкин) и гранта РФФИ № 11-04-00761.

Стендовые доклады 279

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРЛЕКАНА

ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА

Комарова М.С., Ермакова И.И.

Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий просп., 4 E-mail: marrgosha@inbox.ru mailto:marrgosha@inbox.ru Протеогликаны (ПГ) – важнейшие компоненты внеклеточного матрикса, базальных или плазматических мембран, а также секреторных гранул клетки. ПГ состоят из корового белка, ковалентно связанного с цепями гликозаминогликанов (ГАГ). Пристальное внимание уделяется изучению перлекана – модулярного ПГ, коровый белок которого имеет сложное мультидоменное строение, а углеводные цепи представлены 3–10 гепарансульфатами и/или хондроитинсульфатами. Перлекан обладает широким спектром биологических свойств, многие из которых до конца не изучены: регулирует активность цитокинов/факторов роста, адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеток, стимулирует ангиогенез, играет важную роль в эмбриональном развитии. Перлекан выделяют из органов и тканей, богатых сосудами, например, из EHS-саркомы или плаценты. Целью данной работы было найти оптимальные условия для выделения перлекана из плаценты человека для последующего изучения его биологической активности на культурах клеток.

На первом этапе выделения из плаценты была удалена большая часть белков в результате экстракции буфером TBS. Оставшиеся ПГ экстрагировали буфером на основе 4М гуанидинхлорида. Растворенные ПГ сорбировали на Q-сефарозе, затем проводили ионообменную хроматографию в буфере, содержащем 7М мочевину.

Полученные фракции обрабатывали ферментами, расщепляющими цепи ГАГ, после чего коровые белки выявляли с помощью электрофореза в 3–15% градиентном ПААГ. Электрофоретический анализ показал, что во всех фракциях кроме перлекана присутствует еще один ПГ, электрофоретические характеристики которого соответствуют бигликану, принадлежащему семейству «SLRPs» («малых лейцин-богатых ПГ»). Для разделения модулярных и малых ПГ рекомендовано использовать гель-фильтрацию на Superdex 200 или Superose 6. Однако в данном случае эти носители оказались не эффективны: были получены плохо разрешенные пики и выявлено образование высокомолекулярных агрегатов. Использование диссоциативных условий для проведения гель-фильтрации не помогло избежать агрегации. И только применение Sephacryl S-1000 с очень высоким пределом эксклюзии позволило разделить два ПГ плаценты.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЛЕКТИН ИЗ МИДИИ MYTILUS TROSSULUS:

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Кондрашина А.С.1, Чикаловец И.В.2, Черников О.В.2 Дальневосточный федеральный университет, 690950 Владивосток, ул. Суханова, 8 Учреждение РАН Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 Лет Владивостоку, 159

E-mail: kondrashina.alex@gmail.com

Лектины – белки или гликопротеины неиммунной природы, специфически и обратимо связывающие моно-, олигосахариды и гликоконъюгаты, не вызывая их химического превращения. В эволюционном плане лектины морских беспозвоночных являются предшественниками антител и формируют примитивную иммунную систему, демонстрируют антибактериальную, цитотоксическую, противоопухолевую, митогенную, анти-ВИЧ активности. Поиск новых источников и изучение свойств и функций лектинов вносит вклад в фундаментальную науку об углевод-белковом взаимодействии и открывает новые возможности для медико-биологических исследований.

Из экстракта мантии мидии Mytilus trossulus методами аффинной хроматографии на гидролизованной сефарозе и гель-проникающей хроматографии выделен лектин (MTL) с молекулярной массой около 18 кДа. Наибольшую гемагглютинирующую активность MTL проявил при взаимодействии с трипсинизированными эритроцитами человека группы А. Методом гемагглютинации было показано, что MTL является металл-независимым лектином, проявляющим наибольшую активность в интервале pH 9-10 и полностью теряющим активность при нагреве до 60°С в течение 30 минут. Методом ингибирования гемагглютинации установлено, что MTL относится к Gal/GalNAc-специфичным лектинам и проявляет аффинитет к гликопротеинам, содержащим цепи муцинового типа: PSM и Fetuin. Ранее из мидии Crenomytilus grayanus был выделен и охарактеризован Gal/GalNAc-специфичный лектин (CGL). Cr. grayanus и M. trossulus принадлежат к одному семейству Mytilidae, выделенные из них лектины имеют сходные молекулярные массы.

Методом иммуноферментного анализа установлено, что перекрестная реактивность между CGL и MTL составляет 50%. Полученные результаты хорошо согласуется с литературными данными о высокой степени гомологии между лектинами, выделенными из близких видов животных или растений.

Стендовые доклады 281

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОБНАРУЖЕНИЯ АДДУКТОВ

ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ КРЫСЫ

Краснов И.А.1, Гладилович В.Д.1, Дубровский Я.А.2, Войтенко Н.Г.2, Бабаков В.Н.2, Подольская Е.П., Гончаров Н.В.

Учреждение РАН Институт аналитического приборостроения РАН, 190103 С.-Петербург, Рижский пр., 26 ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская обл., г.п. Кузьмоловский Фосфорорганические соединения (ФОС) используются как пестициды в сельском хозяйстве, антигельминты в медицине, добавки к гидравлическим жидкостям и масло для реактивных двигателей в авиации. Эти соединения токсичны для насекомых, рыб, птиц и млекопитающих. Одним из перспективных долгоживущих биомаркеров интоксикации фосфорорганическими соединениями (ФОС) является ковалентный аддукт ФОС с сывороточным альбумином.

Для идентификации воздействия ФОС на организм может служить поиск белков и пептидов внутренних сред организма, модифицированных токсичным агентом либо его метаболитами, причем наиболее удобным объектом исследования представляется сывороточный альбумин. Альбумин является мажорным компонентом белковой фракции крови, это важнейший белок-переносчик, способный транспортировать соединения различной химической природы. Известно, что многие ФОС способны образовывать прямые аддукты с этим белком, что может быть зафиксировано методами масс-спектрометрии.

При разработке масс-спектрометрической методики обнаружения аддуктов ФОС с альбумином крови был выбран в качестве объектов исследования параоксон. Предложенная методика включает следующие стадии: выделение альбумина из сыворотки крови методом аффинной хроматографии на триазиновых красителях; ферментативный гидролиз белка трипсином (при необходимости контроль прохождения гидролиза осуществляется при помощи МС-анализа гидролизата, также на этой стадии можно проводить предварительный поиск модифицированных пептидов); обогащение образца фосфорсодержащими пептидами с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих Fe3+; МС-анализ пептидов после металл-аффинной хроматографии (при необходимости идентификация модифицированных пептидов методом тандемной масс-спектрометрии).

Показано, что при применении предложенной методики подготовки пробы становится возможным обнаружение пептидов альбумина, модифицированных параоксоном, в частности, обнаружен сигнал, принадлежащий пептиду альбумина, а именно пептид RHPYFYRVXAPELLYYAEK, модифицированный параоксоном по остатку тирозина Y-150.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ИНСЕКТОТОКСИНЫ ИЗ ЯДА ПАУКА

LACHESANA TARABAEVI

Кузьменков А.И., Василевский А.А., Гришин Е.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: anteka@ya.ru Яд пауков – богатый источник разнообразных биологически активных веществ от низкомолекулярных соединений до больших многодоменных белков, а изучение его отдельных компонентов представляет большой фундаментальный интерес и может иметь практическое значение. В рамках данной работы мы исследовали пять новых полипептидов из яда паука Lachesana tarabaevi (семейство Zodariidae, пауки-муравьеды), проявляющих инсектицидные свойства.

Цельный яд L. tarabaevi подвергли разделению, используя традиционные методы эксклюзионной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, полученные фракции тестировали на личинках мясной мухи. В результате удалось получить в индивидуальном виде пять новых полипептидных инсектотоксинов (ЛД50 ~ 20 мг/кг), получивших название латартоксинов (LtTx).

Молекулярные массы выделенных веществ, по данным масс-спектрометрии, составили ~6,5–8,5 кДа. Полные аминокислотные последовательности LtTx (60–71 остатков) были установлены с помощью комбинации методов автоматического секвенирования по Эдману, масс-спектрометрии и селективного протеолиза. На основании сходства аминокислотных последовательностей LtTx объединены в два семейства, представители которых напоминают описанные ранее токсины CSTX и LSTX из яда пауков Cupiennius salei (Ctenidae) и Lycosa singoriensis (Lycosidae).

Три LtTx содержат восемь остатков цистеина и четыре внутримолекулярные дисульфидные связи, а два других отличаются наличием еще одного S-S-мостика.

Кроме того, для трех полипептидов характерно C-концевое амидирование. Интересной особенностью новых токсинов является то, что они имеют цистеин-богатый участок, характерный для множества нейротоксинов из ядов пауков, а также линейную область, напоминающую цитолитические пептиды. Предполагается, что эта линейная область обеспечивает сродство полипептидов к мембранам, затем вследствие латеральной диффузии происходит специфичное взаимодействие токсинов с белковыми рецепторами.

Работа поддержана грантами Президиума РАН (программа фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология»), Минобрнауки РФ (Госконтракты №№ П1388 и 16.512.11.2195), РФФИ (№№ 08-04-00454 и 11-04-00706).

Стендовые доклады 283

АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ: ПРОТЕОМНОЕ

ПРОФИЛИРОВАНИЕ КЛЕТОК ACHOLEPLASMA LAIDLAWII PG8,

ВЫРАЩЕННЫХ В ОПТИМАЛЬНЫХ И СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ

Медведева Е.С., Музыкантов А.А., Ефимова И.Р., Давыдова М.Н., Чернова О.А., Чернов В.М.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: elena-med@list.ru Acholeplasma laidlawii (класс Mollicutes) – «вездесущая» микоплазма, являющаяся основным контаминантом клеточных культур и возбудителем фитомикоплазмозов. Решение проблемы контроля инфекций, вызываемых A. laidlawii, связывают с успехами изучения молекулярных основ адаптации бактерии к различным условиям среды. Выявление стресс-реактивных белков A. laidlawii PG8 явилось целью нашей работы.

2D-DIGE и MALDI-TOF/TOF использовали для протеомного профилирования клеток A. laidlawii PG8, культивируемых в оптимальных и неблагоприятных условиях (окислительный стресс, снижение температуры, изменение субстрата и голодание).

В результате нашего исследования был идентифицирован 121 стресс-реактивный белок микоплазмы, вовлеченный (согласно COG) в репликацию, репарацию, рекомбинацию, транскрипцию, трансляцию, энергообразование, транспорт и метаболизм углеводов, нуклеотидов и аминокислот, а также промежуточный метаболизм, сигнальную трансдукцию и защитные механизмы, и установлено, что ответные реакции A. laidlawii PG8 на стрессоры связаны с модуляцией содержания как специфичных, так и общих, характерных для разных типов стрессов, белков.

У микоплазмы в стрессовых условия наблюдалось значительное повышение количества PNPase – глобального регулятора адаптации некоторых патогенных бактерий – и снижение содержания белков, вовлеченных в вирулентность. Адаптация A. laidlawii PG8 к стрессовым условиям сопровождалась изменением вирулентных свойств бактерии. Белки, изменение количественного содержания которых возникает у A. laidlawii PG8 в неблагоприятных условиях среды, являются элементами механизмов адаптации микоплазмы к стрессорам и потенциальными мишенями контроля инфекций, вызываемых этой бактерией.

Работа поддержана грантами Президента Российской Федерации (MKи РФФИ (№ 11-04-01406а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОГО ТРЕХПЕТЕЛЬНОГО ТОКСИНА

ИЗ ЯДРА КОБРЫ NAJA KAOUTHIA

Мещерякова А.В., Кашеверов И.Е., Крюкова Е.В., Макарова Я.В., Осипов А.В., Уткин Ю.Н.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: iozefkneht@yandex.ru Структурно-функциональная характеристика нейрорецепторов является важной задачей в связи с вовлеченностью этих рецепторов в патогенез многих заболеваний. Так называемые трёхпетельные токсины змей за счет селективности действия являются незаменимыми инструментами в исследовании нейрорецепторов.

Путем поэтапной жидкостной хроматографии нами был выделен новый трёхпетельный токсин из яда кобры Naja kaouthia. Разделение яда включало в себя гель-фильтрацию, катионообменную, анионообменную, обратнофазовую хроматографии и обессоливание после каждого этапа.

Масса выделенного токсина (а21.1) составляет 6845 Да. По первичной структуре а21.1 отнесен к трехпетельным токсинам группы ХХ (по классификации Fry et al., 2003), так называемых «орфанотоксинов», мишень действия которых на сегодняшний момент не определена.

В экспериментах по конкуренции с альфа-бунгаротоксином за связывание с ацетилхолинсвязывающим белком (АХСБ) моллюска, который является водорастворимым аналогом внеклеточной области н-АХР и других т.наз. цис-петельных рецепторов, а21.1 увеличивал связывание радиоактивно меченного альфа-бунгаротоксина с АХСБ.

В экспериментах по определению острой токсичности для мышей, при измерении цитотоксичности на линиях клеток PC12 (феохромоцитома надпочечников крысы) и HT1080 (карцинома легких человека), а также при взаимодействии с тремя подтипами н-АХР (7, 42 и мышечного подтипов) а21.1 не проявил активности в концентрациях до 10 мкМ.

Таким образом, белок из группы орфанотоксинов способен к взаимодействию с белком, обладающим структурой, подобной внеклеточной области цис-петельных рецепторов, не связываясь при этом с классическими мишенями альфа-нейротоксинов яда змей. Возможно, он действует на другой тип цис-петельных рецепторов, который теперь необходимо установить.

Стендовые доклады 285

ВЛИЯНИЕ КРАСНОГО ПИГМЕНТА НА АМИЛОИДИЗАЦИЮ

ДРОЖЖЕВЫХ БЕЛКОВ

Михайлова Е.В., Артемов А.В., Сойдла Т.Р., Невзглядова О.В.

Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4 E-mail: mikhailovaev2004@mail.ru «Протеинопатии» или «конформационные заболевания» человека и животных имеют в своей основе изменения пространственной структуры, ведущие к анормальной агрегации белков с образованием амилоидных фибрилл. Открытие прионов у одноклеточного микроорганизма дрожжей создало новые возможности для изучения конформационных заболеваний. Фракцию амилоидизированных белков, выделенную из штаммов Saccharomyces cerevisiae, несущих мутацию в гене ADE1 или ADE2 и накапливающих красный пигмент (продукт полимеризации аминоимидазолриботида), изучали, оценивая флуоресценцию красителя тиофлавина Т, селективно связывающегося с амилоидными фибриллами. Было показано, что на среде, содержащей десятикратный избыток аденина, который подавляет синтез пуринов de novo, блокируя образование красного пигмента, флуоресценция тиофлавина, связанного с амилоидом, увеличивается в несколько раз. К аналогичному эффекту приводит возникновение мутаций, блокирующих первые этапы биосинтеза пуринов и подавляющих синтез красного пигмента. Генерация мутаций в генах ADE1 или ADE2 в исходно белых прототрофных по аденину штаммах дрожжей приводит к значительному падению флуоресценции. Изучение фракции белковых полимеров посредством электрофореза в агарозном геле позволило предположить, что изменения флуоресценции действительно связаны с понижением количества амилоида в клетках, накапливающих красный пигмент. Опыты на модельных фибриллах инсулина свидетельствуют в пользу того, что красный пигмент взаимодействует с готовыми фибриллами, препятствуя их связыванию с тиофлавином Т. Данные электронной микроскопии выявляют редуцированные по размеру фибриллы инсулина в случае, когда их выращивание происходит в присутствии красного пигмента. Сравнение осадочных белков, выделенных из красных и белых изогенных штаммов в 2D-электрофорезе с последующим масс-спектроскопическим анализом, позволило идентифицировать 23 пигмент-зависимых белка. Среди них преобладают шапероны и белки, участвующие в метаболизме глюкозы, что делает их близкими по составу к прион-ассоциированным белкам, выявленным нами ранее. Предполагается, что красный пигмент, связываясь с амилоидными фибриллами, препятствует образованию прионовых агрегатов.

Работа поддерживалась грантом РФФИ (№ 09-04-00750-а) и программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2008–2012 гг.) V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЛОБИНА КРЫСЫ И ЧЕЛОВЕКА

С АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ IN VITRO:

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

АЦЕТИЛИРОВАННЫХ ЛИЗИНОВ

Мурашко Е.А.1, Шрейнер Е.В.2, Дубровский Я.А.1, Подольская Е.П.2, Бабаков В.Н.1, Гончаров Н.В.

ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ст. Капитолово, корп. № 93 Учреждение РАН Институт аналитического приборостроения РАН, 190103 С.-Петербург, Рижский пр., 26

E-mail: kate.murashko@gmail.com

Важной задачей при проведении фармакокинетических исследований является изучение связывания лекарственных препаратов с белками крови, так как лишь несвязанное компонентами крови вещество способно к проявлению терапевтического эффекта. На сегодняшний день для решения подобных задач успешно привлекаются методы масс-спектрометрии, позволяющие не только зафиксировать факт связывания (модифицирования) белка с лекарственным препаратом, но и идентифицировать модификацию.

Известно, что ацетилсалициловая кислота (АСК) способна ацетилировать не только сывороточный альбумин, но и другой мажорный белок кровеносного русла – гемоглобин.

Целью данной работы было исследование возможности образования ковалентных аддуктов глобина крысы и человека с ацетилсалициловой кислотой с установлением сайтов ацетилирования. Для выявления аддуктов исследовали образцы очищенных глобинов человека, которые подвергали воздействию аспирина in vitro. Был проведен триптический ферментативный гидролиз этих образцов. Полученные гидролизаты в дальнейшем исследовали с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF Axima Perfomance (Shimadzu/Kratos Analytical, Великобритания). В масс-спектрах проводили поиск сигналов, соответствующих ацетилированным триптическим пептидам глобинов и имеющих сдвиг m/z в область больших масс на 42,01 Да. Было установлено, что каждый из обнаруженных пептидов содержит неконцевой лизин. Для подтверждения модификации пептиды были проанализированы методом тандемной масс-спектрометрии с фрагментацией CID.

Таким образом, в результате работы был обнаружен ряд пептидов, ацетилированных по лизину, и показано, что глобин крысы способен модифицироваться АСК по К-17 и К-57 в субъединице альфа и по К-96 в субъединице бета, а глобин человека – по К-17, К-41 и К-57 в субъединице альфа и К-18, К-121 в субъединице бета.

Стендовые доклады 287

ПЕПТИДНЫЙ АНТИБИОТИК МИКРОЦИН С (МcC): ТРАНСПОРТ McC

И РОЛЬ БЕЛКА MccE МИКРОЦИНОВОГО ОПЕРОНА В КЛЕТКЕ

Новикова М.1, Серебрякова М.2, Метлицкая А.1, Северинов К.1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10

E-mail: Novimv@mail.ru

Микроцин С (МсС) – пептидный антибиотик, который ингибирует синтез белка у представителей семейства Enterobacteriaceae. МсС представляет собой гептапептид с модифицированным посредством аминопропильной группы аденозинмонофосфатом. В цитоплазме чувствительных клеток пептидная часть антибиотика подвергается процессингу, в результате которого образуется активный ингибитор трансляции – негидролизуемый модифицированный аспартиладенилат. Это соединение является ингибитором аспартил-тРНК-синтетазы. Гены, необходимые для созревания антибиотика, а также обеспечения устойчивости клетки-продуцента к синтезируемому МсС, образуют оперон mссABCDEF.

Система транспорта МсС до конца не изучена. Нами показано, что клетки, содержащие делецию гена ompF, кодирующего один из основных поринов E. coli, частично устойчивы к антибиотику. Кроме того, идентифицирован ABC транспортёр YejABEF, находящийся во внутренней мембране E. coli, который обеспечивает транспорт МсС в цитоплазму клетки. Транспорт антибиотика из клеткипродуцента обеспечивает белок МссС. Белок TolC, который экспортирует ряд других известных микроцинов, включая МсB и McJ, не является участником системы транспорта МсС.

Продукт гена mccE микроцинового оперона представляет собой двудоменный белок, который необходим как для синтеза МсС, так и обеспечения устойчивости клетки к антибиотику. N-Концевой домен MссЕ, предположительно, имеет декарбоксилазную активность и участвует в присоединении аминопропильной группы к промежуточной форме синтеза МсС. С-Концевой домен белка является гомологом клеточного белка RimL – ацетилтрансферазы, которая ацетилирует рибосомный белок L12. Нами показано, что MccE является ацетилтрансферазой, которая присоединяет ацетильную группу на аминогруппу аспартата в составе процессированной формы антибиотика, и такая модифицированная форма процессированного МсС не ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу. Масс-спектрометрического анализом показано, что в отличие от RimL MccE не способен модифицировать Nконцевой аминокислотный остаток рибосомного белка L7.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛИПЕПТИДНЫЙ АНАЛОГ БЛОКАТОРОВ ИОННЫХ КАНАЛОВ

ИЗ ЯДА МОРСКОЙ АНЕМОНЫ HETERACTIS CRISPA

Осмаков Д.И.1, Козлов С.А.1, Кошелев С.Г.1, Козловская Э.П.2, Гришин Е.В.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток

E-mail: odi.87@mail.ru

Яды морских анемон содержат разнообразные биологически активные компоненты, большинство из которых имеют пептидную природу. Среди последних выделяют группу полипептидов, модулирующих работу ионных каналов.

Из яда морской анемоны Heteractis crispa методами гидрофобной и ионообменной хроматографии была получена фракция, ингибирующая работу протончувствительного ионного канала 3 типа (ASIC3). Данный тип канала в основном представлен в сенсорных нейронах, где он отвечает за восприятие и проведение болевого сигнала, возникающего при ацидозе в тканях, например, при воспалительном процессе.

Индивидуальный компонент из активной фракции, названный ASTX-1, был выделен с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. Анализ действия активных фракций проводился на основе детектирования изменения проводимости экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis каналов в электрофизиологических тестах. Первичная структура полученного полипептида была установлена N-концевым секвенированием по Эдману, а также С-концевым секвенированием с использованием карбоксипептидазы Y и методов масс-спектрометрического анализа. ASTX-1 имеет молекулярную массу 4537 Да и содержит в своем составе 41 аминокислотный остаток, среди которых 6 остатков цистеина, образующих между собой 3 дисульфидные связи. Ближайшими гомологами ASTX-1, найденными при помощи программы BLAST, являются пептиды из анемоны Anthopleura elegantissima APETx1 (степень гомологии 55%) (блокатор К+канала) и APETx2 (степень гомологии 53%) (единственный на сегодняшний день известный селективный блокатор ASIC3 пептидной природы). Для наработки рекомбинантного аналога полипептида в клетках E. сoli в оптимальных для дальнейших исследований количествах предполагается получить генно-инженерную конструкцию.

Данные о действии и пространственной структуре модуляторов работы рецепторов имеют не только фундаментальное значение в области изучения физиологии рецепторов, токсикологии и в разработке новых тест систем, но также являются ценным материалом для создания эффективных лекарственных препаратов направленного действия.

Стендовые доклады 289

НОВЫЙ ИНГИБИТОР ХИМОТРИПСИНА ИЗ КЛУБНЕЙ КАТРОФЕЛЯ.

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНОГО

И РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКОВ

Парфенов И.А., Валуева Т.А.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр.2 E-mail: valueva@inbi.ras.ru Белки ингибиторы протеиназ подсемейства PKPI (Kunitz-type proteinase inhibitors) включают группу белков с мол. массами от 20 до 24 кДа, встречающуюся в клубнях картофеля. Среди них присутствуют ингибиторы сериновых, цистеиновых и аспартатных протеиназ. Показано, что белки PKPI принимают участие в защитной системе картофеля при поражении фитопатогенами, а также могут контролировать in vivo активности эндогенных ферментов при его прорастании. К сожалению, взаимосвязь структуры ингибиторов и выполняемых ими функций до сих пор остается мало изученной, что не дает возможности полностью понять как механизмы их действия, так и степень их участия в патогенезе.

Из клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова) выделен новый высокоочищенный белок, обозначенный как PKCI-23 (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor). Определена N-концевая аминокислотная последовательность первых 20 остатков молекулы этого белка. Белок PKCI-23 с одинаковой степенью эффективности подавлял активность химотрипсина и трипсина и был способен образовывать с ними тройные комплексы, содержащие одновременно оба фермента. Образование таких комплексов связано с наличием в молекуле ингибитора второго реактивного центра, в составе которого локализован остаток Met154.

Сделано предположение о том, что этот центр ответствен за связывание химотрипсина. Исследована зависимость стабильности ингибитора от pH и температуры. Показано, что белок PKCI-23 в различной степени угнетает рост и развитие патогенных микроорганизмов Fusarium culmorum и Phytophtora infestans (Mont.) de Bary, поражающих картофель. Из генома этого сорта картофеля был амплифицирован фрагмент гена, кодирующий данный белок, и проведен его сравнительный анализ с последовательностями PKPI из других сортов картофеля, который показал высокую степень гомологии (от 89 до 99% идентичных остатков) между ними.

Получен продукт гетерологичной экспрессии в E. coli BL-21(DE3) с мол. массой около 23 кДа, который не обнаруживался в колониях, не несущих вставки.

Исследовано действие рекомбинантного белка на протеиназы и фитопатогены.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ ИЗ СЕМЯН И ЛИСТЬЕВ ЭФЕМЕРНОГО

РАСТЕНИЯ – ЗВЕЗДЧАТКИ СРЕДНЕЙ (STELLARIA MEDIA L.)

Рогожин Е.А.1, Слезина М.П.2, Егоров Ц.А.1, Гришин Е.В.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: rea21@list.ru

Проблемы исследования защитных пептидов растений, прежде всего, связаны с их малым содержанием в растениях. Подобные пептиды, как правило, образуют семейства гомологичных компонентов, выделение которых на фоне большого числа различных органических соединений (полифенолов, фенольных гликозидов, сапонинов, ненасыщенных лактонов, диенов и т.д.) весьма затруднительно.

Для прямой идентификации таких пептидов использование одних только методов протеомики часто не эффективно. Наиболее богатыми источниками защитных пептидов являются дикорастущие цветковые растения, которые обладают повышенной устойчивостью к стрессовым факторам внешней среды.

Для выделения пептидов из семян и листьев звездчатки была разработана методика, состоящая из двух стадий. Первая стадия заключалась в экстракции измельченного биологического материала в присутствии ингибиторов протеиназ 10%-ной уксусной кислотой с последующим осветлением суспензии и высаживанием пептидов охлажденным ацетоном. Высушенные осадки перерастворяли в 0,1%-ой трифторуксусной кислоте, полученные растворы обессоливали и концентрировали путем сорбции на носителе с обращенной фазой. На этой стадии достигается обогащение и частичное очищение пептидной фракции. На второй стадии проводили хроматографическое разделение обессоленных белково-пептидных экстрактов семян и листьев звездчатки методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сравнение хроматографических профилей выявило наличие в экстрактах семян и листьев звездчатки одного идентичного компонента с молекулярной массой 3362 Да, содержание которого в листьях было примерно в 30 раз больше, чем в семенах (в пересчете на сырую массу биологического материала). Все остальные фракции, для которых были определены молекулярные массы, являются константными, то есть они присутствуют только в определенном экстракте.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-00783-а и Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.740.11.0424).

Стендовые доклады 291

НОВЫЕ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ БАРАНА

Седов С.А.1, Белогурова Н.Г.1, Шиповсков С.В.2, Семёнова М.В.3, Гитинов М.М.4, Левашов А.В.1, Левашов П.А.1,4 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1, стр.3 Междисциплинарный центр нанотехнологии (iNANO), Университет города Орхуса, Дания, DK-8000 Aarhus C.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 117091 Москва, Ленинский просп., 33 ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс»

Минздравсоцразвития РФ, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а

Е-mail: sergey.sedov@gmail.com

Бактериолитические ферменты широко распространены в природе и вырабатываются различными организмами, от бактериофагов до высших животных и растений. Изучение данных объектов весьма важно с точки зрения понимания взаимодействия различных организмов, в частности, ряда аспектов функционирования иммунной системы высших животных. Бактериолитические ферменты представляют огромный интерес также в плане медицинского и биотехнологического применения.

В данной работе было проведено исследование различных фракций плазмы крови барана на предмет выявления белковых фракций с литической активностью по отношению к клеткам Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus lysodeikticus. Фракционирование осуществлялось гельпроникающей хроматографией, более глубокая очистка проводилась с использованием анионообменной хроматографии. Были обнаружены три ранее не описанные в литературе фермента. Два фермента оказались активными по отношению к E. coli и M. lysodeikticus и имели молекулярные массы 34±5 и 14±3 кДа, соответственно. Третий фермент, активный по отношению к E. coli и неактивный по отношению к M. lysodeikticus имел молекулярную массу 14±2 кДа. В ходе работы были получены данные о каталитических свойствах данных ферментов, в частности, зависимости активности от pH и субстратной специфичности.

Обнаруженные ферменты были подвергнуты трипсинолизу и исследованы с помощью масс-спектроскопии MALDI-TOF. Было проведено сопоставление с известными в настоящее время белками барана, представленными в белковых базах данных Swiss-Prot, NCBI, MSDB.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЦИТОХРОМЫ Р450 СЕМЕЙСТВА CYP74 КУКУРУЗЫ Топоркова Я.Ю., Горина С.С., Мухтарова Л.Ш., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: yanchens@yandex.ru В онтогенезе растений и формировании у них ответа на стрессовые факторы важная роль принадлежит ферментам липоксигеназной сигнальной системы. Ключевыми ферментами данной системы являются липоксигеназы и цитохромы Р450 семейства CYP74, а именно – алленоксидсинтазы (АОС), гидропероксидлиазы (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС). Нами был выбран модельный объект – кукуруза (Zea mays) – для получения полной характеристики семейства CYP74 внутри одного вида. Мы обнаружили восемь генов CYP74 и два гена, ранее отнесенных к семейству CYP84. Однако, транслированные аминокислотные последовательности двух последних генов очень схожи с таковыми семейства CYP74 и четко отличаются от последовательностей генов классических монооксигеназ Р450, что позволило нам предположить ошибочность классификации их как CYP84. На основании последовательностей были даны следующие обозначения: две изоформы ZmAOS1, три изоформы ZmAOS2, ZmHPL1, ZmHPL2 и две изоформы «ZmCYP84». ZmAOS1 является классической 13-специфической АОС, чьими субстратом и продуктом являются 13-гидроперекись альфа-линоленовой кислоты и окись аллена, соответственно. ZmHPL1 является ГПЛ, проявляющей предпочтение к 13-гидроперекиси альфа-линоленовой кислоты. Набор продуктов реакции данного фермента является необычным и зависит от субстрата. Два гена ZmAOS2 расположены последовательно на первой хромосоме и отличаются по нескольким сайтам, таким образом, подтверждая гипотезу происхождения всего разнообразия семейства CYP74 от единственного предка в результате дупликации генов и случайного точечного мутагенеза. Ранее нами был воспроизведен процесс появления точечных мутаций с помощью сайт-направленного мутагенеза ферментов LeAOS3, MtHPL и LuDES. Единичные замены в последовательностях консервативных доменов приводили к превращению АОС и ДЭС в ГПЛ, но не наоборот, таким образом подтверждая эволюционное происхождение существующего разнообразия ферментов CY74 от единственного предка, проявляющего гидропероксидлиазную активность.

Работа поддержана грантами РФФИ №№ 09-04-00915-а и 09-04-12222-офи_м, ГК № 16.740.11.0197, грантом по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и грантом по программе «Ведущие научные школы» НШ-6992.2010.4.

Стендовые доклады 293

МОДУЛЬНЫЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ НОВЫХ АНТИМИКРОБНЫХ

ПЕПТИДОВ ПШЕНИЦЫ TRITICUM KIHARAE

Уткина Л.Л.1, Андреев Я.А.2, Пухальский В.А.1, Егоров Ц.А.2, Одинцова Т.И.1 Учреждение РАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва, ул. Губкина, 3 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: lyuba_utk@mail.ru

Антимикробные пептиды (АМП) – важные компоненты защитной системы растений. Исследование АМП необходимо для создания форм растений, устойчивых к грибным и бактериальным болезням. Также перспективно использование АМП в медицине в качестве альтернативы или дополнения к традиционным антибиотикам.

Ранее в нашей лаборатории из семян пшеницы Triticum kiharae были выделены два новых гомологичных пептида Х1 и Х2, обладающих высокой антигрибной активностью в отношении ряда патогенов.

Установлено, что пептиды Х1 и Х2 синтезируются в растениях в составе длинных предшественников, кодирующих несколько гомологичных пептидов. Было обнаружено два класса предшественников: кодирующие пять и семь пептидов, соответственно. При этом внутри каждого класса выявлено несколько форм. Каждый предшественник состоит из сигнального пептида и пяти или семи гомологичных АМП, разделенных сайтами специфического протеолиза, и С-концевого продомена. Кроме пептидов Х1 и Х2, в полученных последовательностях был найден ряд других пептидов, обнаруженных нами ранее в экстракте семян пшеницы при помощи масс-спектрометрии и N-концевого секвенирования по Эдману. Наши исследования позволили установить полную структуру этих пептидов.

Биологическое значение синтеза протяженных предшественников, состоящих из нескольких гомологичных антимикробных пептидов, возможно, заключается в том, что при индукции синтеза одного предшественника одновременно образуется несколько пептидов, по всей видимости, различающихся по спектру антимикробного действия, что повышает эффективность защитной системы растения. Исследование свойств пептидов-гомологов Х1 и Х2, входящих в состав предшественника, позволит выбрать наиболее активные в отношении фитопатогенов и, как следствие, наиболее перспективные для использования в защите растений.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогический кадры инновационной России», ГК № 16.740.11.424 и грантами РФФИ №№ 09-04-00250 и 11-04-00190.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ИЗУЧЕНИЕ МАСС-СПЕКТРОВ МЕТАСТАБИЛЬНОГО РАСПАДА

ПЕПТИДОВ НИЗИНА И ЦЕКРОПИНА

Пыцкий И.С.1, Федоткина О.С.2, Буряк А.К.1 Учреждение РАН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 31, корп.4 Химический факультет Самарского государственного университета, 443011 Самара, ул. Ак. Павлова, 1 Пептидные антибиотики это класс веществ, часть из которых находят широкое применение в медицинской, ветеринарной практике, а другая часть обладает потенциальными возможностями такого применения в различных областях человеческой деятельности (биотехнологии, сельском хозяйстве, пищевом производстве). Объектами нашего исследования служили антибактериальные пептиды: низин, используемый как консервант и в ветеринарии, а также синтетический аналог цекропина В, структурно идентичный (гомологичный) цекропинам А, В, С, D.

Низин в первичной структуре имеет две дисульфидные связи, а аналог цекропина В аминокислоту норлейцин. Данные структурные особенности позволяют предполагать различный механизм биологического действия и масс-спектрометрического поведения в режиме регистрации метастабильных ионов FAST после ионизации методом МАЛДИ. Фрагментация низина (3354 Да) затруднена из-за присутствия дисульфидных связей. В масс-спектре преимущественно наблюдаются ионы серии b, наиболее интенсивны ионы b2, b3, b22, b26, b27, b29, b30, b31, b32. Среди ионов серии у можно выделить ионы у10, у27. Интенсивная b серия обусловлена наличием концевого лизина, который является преимущественным местом локализации протона, что значительно повышает эффективность протонирования и распад пептидных связей на С-конце пептида. С использованием режима FAST установлены основные направления метастабильного распада синтетического аналога цекропина В (3728 Да). Серии ионов у и b представлены не полностью, что, по-видимому, связано с длиной пептида. Особенно интенсивен ион у26, образовавшийся после разрыва пептидной связи между С-концом глутаминовой кислоты и N-концом лизина. В масс-спектре выделяются два комплиментарных иона b12 и у22, возникшие после разрыва пептидной связи между С-концом аргинина и N-концом аспарагина.

Получение подобных масс-спектров может дать ценную информацию для изучения фрагментации и создания физико-химических основ для их анализа.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СИНТЕЗ, ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ, ПРОИЗВОДНЫХ СЕРОТОНИНОВОГО

РЕЦЕПТОРА 6-го ТИПА Шпакова Е.А.1, Тарасенко И.И.1, Шпаков А.О.2, Власов Г.П.1 Учреждение РАН Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004 С.-Петербург, Большой пр., 31 Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. Тореза, 44

E-mail: eshpakova@mail.ru

Одной из актуальных проблем современной эндокринологии является поиск и разработка селективных регуляторов гормональных сигнальных систем. Наиболее перспективным подходом для их создания является синтез пептидов, соответствующих функционально важным участкам сигнальных белков, в том числе сопряженных с G-белками рецепторов серпантинного типа. С целью создания селективных регуляторов серотониновых рецепторов 6-го типа (СР6), играющих важную роль в функционировании ЦНС, с помощью твердофазного метода были синтезированы три пептида (СР6-пептида), соответствующие по первичной структуре С-концевому участку третьей цитоплазматической петли СР6: KHSRKALKASL258-268KA-амид, его пальмитоилированный аналог KHSRKALKASL258-268K(Palm)A-амид и димер (KHSRKALKASL258-268KG)2KA, в котором два пептидных фрагмента соединены при помощи амидных связей между С-концевыми остатками глицина и - и -аминогруппами остатка лизина.

Конденсацию аминокислотных остатков проводили карбодиимидным методом, деблокирование и удаление пептидов с полимера осуществляли с помощью трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоанизола и этандитиола. Исследование вторичной структуры пептидов с помощью КД-спектроскопии показало, что как в водной среде при различных значениях pH (2, 7 и 10), так и в присутствии 10–80% спиралеобразующего растворителя трифторэтанола (ТФЭ) пептиды находятся преимущественно в -складчатой конформации. Только для пептида, модифицированного пальмитатом, в щелочной среде и в присутствии 40–80% ТФЭ наблюдалось образование -спиральной структуры. Все СР6-пептиды стимулировали активность фермента аденилатциклазы и Gs-белков, сопряженных с СР6, и прерывали передачу гормонального сигнала через СР6, не влияя на другие типы рецепторов. Наиболее активным был пальмитоилированный пептид. Полученные данные указывают на то, что пептиды, производные СР6, и их модифицированные производные могут быть использованы для создания нового поколения селективных внутриклеточных антагонистов СР.

Работа поддержана РФФИ (проект № 09-04-00746).

Стендовые доклады 297

–  –  –

Биотехнология (конструирование и получение рекомбинантных белков и пептидов) V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ

ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА

Вихрова М.А.

Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8 E-mail: vikhrova_m@mail.ru Интерферон- (ИФН-) принадлежит к семейству плейотропных цитокинов и обладает иммуномодулирующими и антипролиферативными свойствами. Этот цитокин в норме секретируется Т-лимфоцитами и фибробластами; индукторами его синтеза являются вирусы, двуцепочечная РНК, митогены, липополисахариды и прочие антигены. Рецепторы к ИФН- существуют практически на всех клетках, исключение составляют эритроциты. Одним из основных биологических эффектов ИФН- является усиление экспрессии МНС-I и МНС-II на поверхности клеток, что позволяет этим клеткам эффективнее презентировать антигены. С другой стороны, повышение концентрации ИФН- сопровождает развитие рассеянного склероза. Цель данной работы – получение и характеризация панели человеческих мини-антител к ИФН-.

В работе использовали «неиммунную» и «аутоиммунную» комбинаторные библиотеки scFv-антител человека, сконструированные на основе мРНК периферических лимфоцитов здоровых людей и больных рассеянным склерозом. Биопэннинг этих библиотек проводили независимо с использованием ИФН- человека.

Из обеих библиотек отобрали scFv-антитела, специфически связывающие ИФН-.

Были определены нуклеотидные последовательности, кодирующие отобранные антитела, проанализированы соответствующие им аминокислотные последовательности. Показано, что VH-домены антител к ИФН-, отобранных из «неиммунной» библиотеки принадлежали к VH3 семейству, в то время как из «аутоиммунной» библиотеки отбирались разнообразные антитела, принадлежащие к VH1, VH3, VH4, VH5 и VH6 семействам.

Стендовые доклады 299

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИВИНИЛЭФИРСИНТАЗЫ NTDES

ТАБАКА (NICOTIANA TOBACUM)

Ермилова В.С., Осипова Е.В., Ланцова Н.В., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420011 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: ntdes@mail.ru Важную роль в процессе защитного ответа растений играют окисленные производные жирных кислот – оксилипины. Эти соединения образуются в ходе липоксигеназного каскада, начинающегося с превращения линолевой или -линоленовой кислот в гидроперекиси при участии липоксигеназы. Образовавшиеся гидроперекиси метаболизируются рядом ферментов, в том числе ферментами семейства CYP74 цитохромов Р450: дивинилэфирсинтазой (ДЭС), алленоксидсинтазой (АОС) и гидропероксидлиазой (ГПЛ). Этим ферментам свойственна высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей, не смотря на различающиеся механизмы катализируемых реакций: ДЭС и АОС обладают дегидразной активностью, ГПЛ – изомеразной. Предполагается, что в активном центре этих ферментов имеется ряд аминокислотных остатков, играющих важную роль в механизмах катализа. На основе анализа множественного выравнивания аминокислотных последовательностей этих ферментов мы выявили каталитически важные аминокислотные остатки, по-видимому, играющие важную роль в механизме каталитической реакции при участии ДЭС табака – объекта нашего исследования.

Эти аминокислотные остатки были подвергнуты сайт-направленному мутагенезу.

В рамках дальнейшей работы мы планируем провести анализ полученных ферментов мутантного типа.

Последовательность гена ДЭС табака была получена нами в не экспрессирующем векторе pBSK. Для получения реомбинантного фермента последовательность гена была субклонирована в экспрессирующий вектор pET-32 Ek/LIC. Нами была оптимизирована система экспрессии ферментов мутантного и дикого типов в прокариотической системе, а также выделение и очистка белка.

Сотрудниками нашей лаборатории было показано участие неклассического субстрата для липоксигеназной реакции – (7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновой кислоты в липоксигеназной реакции с образованием (7S)-гидроперекиси. Впервые нами показано, что продуктом превращения (7S)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты при участии рекомбинантной ДЭС табака in vitro был дивиниловый эфир – динор-колнеленовая кислота, что предполагает участие этого соединения в гексадеканоидном липоксигеназном каскаде.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛУЧЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РЕКОМБИНАНТНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

DEINOCOCCUS RADIODURANS

Есюнина Д.М.1,2, Кульбачинский А.В.1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: es_dar@inbox.ru

РНК-полимераза (РНКП) – центральный фермент транскрипции у всех живых организмов, осуществляющий синтез РНК на ДНК-матрице. Основные данные о механизмах транскрипции у бактерий получены при исследовании РНКП Escherichia coli. В то же время, данные о пространственной структуре имеются только для РНКП термофильной бактерии Thermus aquaticus, которая неродственна E. coli и плохо изучена биохимическими методами. Однако, у T. aquaticus имеется близкий родственник среди мезофильных бактерий – Deinococcus radiodurans, чья РНКП может являться удобной моделью для структурно-функциональных исследований механизмов транскрипции. В данной работе был разработан эффективный метод получения рекомбинантной РНКП D. radiodurans. Для этого гены всех субъединиц кор-фермента РНКП (,, ', ) были клонированы в одной экспрессионной плазмиде на основе вектора рЕТ28. Выделение РНКП D.

radiodurans из экспрессионного штамма E. coli BL21(DE3) проводили в несколько стадий с использованием методов аффинной хроматографии, что позволило получить высокоочищенный препарат белка без примесей клеточной РНКП E. coli.

Показано, что полученная РНКП D. radiodurans полностью транскрипционно-активна и по своим свойствам идентична РНКП, выделенной непосредственно из клеток D. radiodurans. Полученный белок может использоваться для изучения детальных механизмов транскрипции РНКП D. radiodurans, а разработанная методика также будет удобна для получения мутантных вариантов этой РНКП, с их последующим биохимическим и структурным исследованием.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ (МДи ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (госконтракт № 02.740.11.5132).

Стендовые доклады 301

ЭКСПРЕССИЯ FAB-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ,

СВЯЗАННЫХ С МЕМБРАНОЙ, В ДРОЖЖАХ P.PASTORIS

Захаров А.В.1, Смирнов И.В.1, Бобик Т.В.1, Пономаренко Н.А.1, Габибов А.Г.1,2,3 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва

E-mail: a.zackharov@mail.ru

На сегодняшний день проблема терапии аутоиммунных заболеваний стоит особенно остро, вследствие их большого социально-экономического значения. Антицитокиновая терапия – один из современных подходов лечения аутоиммунных заболеваний основанный на направленном выключении воспаления посредством адресного воздействия на выбранный медиатор. ФНО (Фактор Некроза Опухолей) играет важную роль в протекании таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилоартрит. Нейтрализация его действия в большинстве случаев приводит к ремиссии заболеваний.

Направленная эволюция белков – один из способов получения новых и улучшения уже имеющихся свойств молекул. Наиболее интересно сочетание этого способа с дисплеем макромолекул, в том числе и Fab-фрагментов антител, на поверхности дрожжевых клеток. Представляет интерес применение таких методов к терапевтическим антителам, так как такой подход может значительно улучшить характеристики препарата. Такой эффект может быть достигнут как получением каталитических антител, так и изменением аффинности молекулы.

Целью настоящего исследования является создание системы дрожжевого дисплея для получения каталитических и/или высокоаффинных Fab-фрагментов антител человека к ФНО. Для этого были созданы генетически конструкции, кодирующие легкую цепь антитела к ФНО; вариабельный, первый константный домен, участок шарнирной области тяжелой цепи этого же антитела вместе с последовательностью С-концевой области дрожжевого мембранного белка AG1. В результате котрансформации и селекции были получены клоны экспрессирующие на своей поверхности Fab-фрагмент. Было показано, что экспонированный на поверхности Fab-фрагмент обладает специфичностью и связывающей способностью сходной с нативным анти-ФНО антителом. Таким образом, результаты данного исследования позволят использовать эффективное сочетание методов клеточного дисплея и направленной эволюции белков для получения терапевтических агентов, обладающих улучшенными характеристиками.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛУЧЕНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНОЙ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ

ИЗ ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНОЙ АРХЕИ THERMOCOCCUS SIBIRICUS

Зейфман Ю.С.1, Эльцина А.A.2, Черкашин Е.A.1 Научно-исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, пл. Ак. Курчатова, 1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Московская обл.

E-mail: yulia.zeifman@gmail.com

Алкогольдегидрогеназы (АДГ, КФ 1.1.1.1) катализируют реакции обратимого окисления спиртов в соответствующие альдегиды и кетоны с участием разнообразных кофакторов (NAD(P), FAD и другие). Наибольший интерес для использования в промышленных процессах представляют NAD(P)-зависимые АДГ благодаря их широкой субстратной специфичности (первичные и вторичные спирты, диолы и др.) и энантиоселективности. Однако АДГ, выделенные из мезофильных организмов, являются недостаточно стабильными при высоких температурах, в органических растворителях, и часто теряют свою активность при иммобилизации.

Одним из способов получения высокостабильных биокатализаторов является выделение ферментов из экстремофильных организмов, например, из археи.

Thermococcus Sibiricus – это термофильный микроорганизм, найденный в нефтяных резервуарах, способный расти на сложных органических субстратах и в широком диапазоне температур 40–88°С и pH 5,8–7,3. Геном этого организма был полностью отсеквенирован и аннотирован в центре «Биоинженерии» РАН. Проведенный нами анализ генома показал, что в нем содержится несколько различных генов АДГ, в том числе три гена короткоцепочечных АДГ. Ген TSIB_1998 (http://www.uniprot.org) кодирует белок, состоящий из 242 аминокислот с расчетной массой 25,9 кДа. Нами было проведено клонирование гена TSIB_1998 (http://www.uniprot.org), подобраны условия экспрессии в Escherichia coli, позволившие получить высокий выход целевого белка в растворимой форме.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 16.512.11.2175) Стендовые доклады 303

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ

НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ХИТОЗАНА С БЕЛКОМ Aspf2

Зубарева А.А.1, Свирщевская Е.В2., Парыгина Н.А.2, Варламов В.П.1 Учреждение РАН Центр «Биоинженерия» РАН, 117312 Москва, просп. 60-летия Октября, 7, к.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Разработка наноразмерных систем доставки белков и пептидов носит лавинообразный характер во всем мире, что связано с большим количеством преимуществ наносистем, таких, как направленная терапия; возможность создания мультифункциональных структур; укрупнения комплексов, дающих адъювантный эффект. Хитозан является одним из перспективных полимеров для создания таких систем, поскольку нетоксичен, биосовместим и биодеградируем. Целью нашей работы являлось получение стабильных наночастиц на основе хитозана и изучение их взаимодействия с белком Aspf2 из гриба Aspergillus fumigatus.

В ходе работы нами был оптимизирован метод получения наночастиц на основе гексаноильного производного хитозана. Установлено, что введение гидрофобных ацильных группировок в молекулу хитозана позволяет увеличить стабильность получаемых наноструктур. Размер таких частиц измеряли методом атомносиловой микроскопии, а так же методом динамического светорассеивания. Он составил около 180–200 нм, однако в суспензии имелись агрегировавшие частицы, которые мы отделяли фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм с целью получения суспензии частиц, однородных по размеру.

Следующим этапом было получение комплексов частиц с белком Aspf2. Мы обнаружили, что наночастицы хитозана эффективно сорбируют белок. Процент сорбции равен 60–90% в зависимости от условий формирования комплекса. Количество белка, связанного с носителем, определяли методом электрофореза в 10% ПААГ. Интенсивность пятен на электрофореграммах анализировали с помощью программы ImageJ. Полученные данные коррелируют с данными, полученными по методу Брэдфорд.

Устойчивость и проникновение полученных комплексов в клетке детектировали на клеточных линиях HEK и HaCaT. Установили, что комплекс наночастиц с белком локализуется на клеточной мембране, а затем проникает во внутриклеточное пространство.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009– 2013 гг., Государственный контракт № 14.740.11.0548-0724.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО [LEU1, THR2]-63ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА-1 ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

Костромина М.А., Есипов Р.С.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: esipov@mx.ibch.ru Уровень элиминации является важной характеристикой предклинического и клинического испытания пептидного или белкового фармацевтического препарата наряду с иммуногенностью и антигенностью. Одним из подходов увеличения периода полувыведения (T1/2) является создание химически модифицированных аналогов белковых препаратов. В данной работе была разработана методика пэгилирования и сиалирования [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина-1 (HIR), рекомбинантного аналога природного антикоагулянта гирудина-1 из Hirudo medicinalis.

Ранее была разработана препаративная схема выделения [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина-1 из клеточной культуры штамма-продуцента E.coli ER2566/pER-HIR. В ходе настоящей работы были получены конъюгаты HIR с альдегидами полиэтиленгликоля (5 кДа) и полисиаловой кислоты (14 кДа). Реакции модификации проводили при рН 6.0 при 4х-кратном мольном избытке модифицирующего реагента в присутствии восстанавливающего реагента (цианборгидрид натрия). Сиалирование HIR протекало при 37°С в течение 20 часов на 79%, в то время как пэгилирование происходило практически полностью на 94% за 20 часов при 10°С. Очистку конъюгатов от побочных продуктов проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и гель-фильтрационной хроматографии. На каждой стадии выделения собираемые фракции анализировались с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Конечный выход моносиалированного производного HIR-PSA составил 53% (по HIR). Пэгилирование происходило с образованием двузамещенного производного HIR-PEG2 с выходом 74%.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |
Похожие работы:

«УДК504.064.36 И. А. ШВЕДЧИКОВА, д-р. техн. наук, проф. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк;9 И. В. НИКИТЧЕНКО, асп. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЕ СИСТЕМЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПАРАМЕТРОВ ШАХТНЫХ ВОД Определены основные загрязняющие составляющие...»

«Факультет Естественных наук Медико-биологических дисциплин Биологии и экологии Выпускающая кафедра Органической и биологической химии Направление 050100 Педагогическое образование Профиль подготовки Биология и Химия Идентификацио...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ ЕВРОПЕЙСКАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ КОМИССИЯ Нью-Йорк, Женева, 1996 г. ЗАЩИТА ТРАНСГРАНИЧНЫХ ВОД Пособие для политиков и лиц, принимающих решения ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. РУКОВОДСТВО ПО МОНИТОРИНГУ И ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ТРАНСГРАНИ...»

«Проект Программа работы Фестиваля технологий, экопродукции и услуг для гармоничной жизни "ЭкоСезон-2017" 18 – 20 августа 2017 года с 10-00 до 20-00 г. Омск, выставочный парк на Королева, 20 18 августа 2017 года (пятница) Работа молодежного экологического...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафе...»

«3.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS AGROECOLOGY АГРОЭКОЛОГИЯ Красноперова Е. А., Юлдашбаев Ю. А., Гала Krasnoperova E. A., Yuldashbaev Yu. A., Galatov A. N. тов А. Н. Методологические аспекты экологиза Methodological aspects of agrarian production eco ции аграрного прои...»

«УДК 544.6 ВЛАГОПЕРЕНОС В БИКОМПОНЕНТНЫХ КОНСЕРВАЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ НА БАЗЕ НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ Н. Е. Беспалько Кафедра "Безопасность жизнедеятельности и военная подготовка", ФГБОУ ВПО "ТГТУ"; bgd@mail.nnn.tstu.ru Ключевые слова и фразы: амиды; амины; атмосферная коррозия; массоперенос воды; индустриальное масло; н-гептан; н-нонан...»

«3. 2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS РАСТЕНИЕВОДСТВО PLANT RAISING Асланов Г. А., Новрузова Г. Х. Aslanov G. A., Novruzova G. H. Влияние удобрений на урожайность хлопчатника 2 Effect of fertilizers on cotton productivity. 2 Ерошенко Л. А., Бекенова Л. В., Кузнецова Н. А., Yeroshenko L. A., Bekenova L. V., Kuznetsova N. A., Шалабаев Б. А.,...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Балашовский институт (филиал) Рабочая...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологические основы устойчивого водопользовани...»

«О.А. Белых и др.: Дикоросы как источник биотехнологического сырья для производства УДК 630.2.56.9: 643.0.524 ДИКОРОСЫ КАК ИСТОЧНИК БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И БАДОВ О.А. Белых1,...»

«03.06.01 Физика и астрономия Направления № Научное направление Коды по ГРНТИ научноисследовательс 29.35; 29.37; 29.19; Физика кой 29.33; 29.19 деятельности Университет, позиционируя себя на российском и Стратегия научномеждународном научно-образовательном п...»

«Ольга В. Таглина Илья Мечников http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=4432817 Илья Мечников.: Фолио; Харьков; 2010 Аннотация Жизнь Ильи Ильича Мечникова была необычайно насыщенной, богатой событиями и научными открытиями. Он является не только известнейшим биологом, зоологом, эпидемиологом, врачом, одним из основоположников сравнительно...»

«Ученые записки Таврического национального университета имени В. И. Вернадского Серия "География". Том 27 (66), № 2. 2014 г. С. 3–15. РАЗДЕЛ 1. ФИЗИЧЕСКАЯ ГЕОГРАФИЯ И ГЕОЭКОЛОГИЯ УДК 620.91:712.253.58 "ЗЕЛЁНАЯ" ЭНЕРГЕТИКА В САДОВО-ПАРКОВЫХ КОМПЛЕКСАХ Багрова...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 25 (64). 2012. № 4. С. 255-263. УДК 548.736+546.64+54.057 СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ КООРДИНАЦИОННОГО СОЕДИНЕНИЯ...»

«Пояснительная записка к рабочей программе по биологии для 9 класса Программа разработана на основе Федерального компонента государственного стандарта основного общего образования и Федерального базисного учебного плана, в соответствии с которым на...»

«Иванова Ольга Ярославовна УЧАСТИЕ КАНОНИЧЕСКОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РЕГУЛЯЦИИ ПЛАСТИЧНОСТИ ГИППОКАМПА Специальность 03.03.01 – "Физиология" Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научн...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и прикладного значения химии в жизни...»

«Бакшеева Юлия Витальевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫХ СВОЙСТВ СИГНАЛОВ В УЛЬТРАЗВУКОВЫХ СИСТЕМАХ ДИАГНОСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Специальность: 05.13.01 "Системный анализ, управление и обработка информации (в технике и технологиях)" Автореферат дис...»

«Министерство культуры Российской Федераци ФГБУК "Государственный историко-архитектурный и этнографический музей-заповедник „Кижи“" Карельский научный центр Российской академии наук Бюллетень экологических исследований на территории музея-заповедника "Кижи" 2013 год Петрозаводск...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 78-85. УДК 591.5:598.113.6 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ, LACERTA VIVIPARA, ГОСУДАРСТВЕННОГО ЗАПОВЕДНИКА "КОМСОМОЛЬСКИ...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.