WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 7 ] --

По сравнению с [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудином-1 антитромботическая активность полученных модифицированных производных, определенная в амидолитическом тесте in vitro, была снижена: для HIR активность составила 750 ATU на мг белка, для HIR-PEG2 – 560 ATU на мг белка, HIR-PSA – 60,9 ATU на мг белка. В дальнейшем планируются фармакокинетические исследования in vivo полученных пэгилированного и сиалированного [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина-1.

Стендовые доклады 305

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО MHC КЛАССА II

В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И ДРОЖЖАХ

Мамедов А.Э.1, Воробьева Н.Е.2, Белогуров А.А.1, Пономаренко Н.А.1, Габибов А.Г.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 34/5 Комплекс гистосовместимости MHC (Major Histocompatibility Complex) второго класса HLA-DRA 0101 является одной из ключевых молекул, участвующих в развитии рассеянного склероза – широко распространенного демиелинизирующего заболевания аутоиммунной природы. Комплекс располагается на мембране антиген презентирующей клетки. Связываясь с антигеном, MHC презентирует его Тклеточному рецептору, образуя тем самым тримолекулярный комплекс, что, в свою очередь, вызывает иммунный ответ.

Для наших дальнейших исследований было необходимо экспрессировать внеклеточные домены рекомбинантного HLA-DR в разных системах.



В нашей лаборатории была налажена экспрессия MHC класса II в клетках Drosophila melanogaster линии S2. Экспрессиионая система насекомых является наиболее подходящей для MHC в связи с тем, что экспрессированный в среду комплекс остается несвязанным с соответствующим антигенным пептидом. Вместе с этим, нам было необходимо иметь альтернативную систему экспрессии для создания в будущем библиотек репертуаров комплексов гистосовместимости. Для этого была налажена экспрессия MHC в дрожжевых клетках Pichia pastoris штамма GS. В ходе выполнения данной задачи были получены различные варианты конструкций экспрессионного вектора pPICZ, содержащих и цепи MHC с полигистидиновым, FLAG или c-myc эпитопами. В результате трасформации были отобраны клоны с наибольшим выходом экспрессии собранного комплекса.

Помимо экспрессии был налажен метод очистки MHC. Комплекс был эффективно изолирован с помощью аффинной хроматографии с использованием смолы с иммобилизированными моноклональными антителами L243, которые специфически связываются только с полностью собраным комплексом HLA-DR. Анализ взаимодействия HLA-DRA 0101, экспрессированного в различных системах, с пептидом основного белка миелина, подтвердил функциональную идентичность комплесков, полученных в дрожжах и клетках насекомых. Полученные данные позволят в будущем эффективно проводить селекцию и дальнейший структурнофунциональный анализ MHC второго класса в различных гетерологичных системах с полным сохранением его свойств.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ,

СПЕЦИФИЧНЫХ К ГЛИКОПРОТЕИНУ GP120 ВИЧ-1,

В ДРОЖЖЕВОЙ СИСТЕМЕ

Мокрушина Ю.А.1, Смирнов И.В.1,2, Решетняк А.В.3, Бобик Т.В.1, Пономаренко Н.А.1, 1,2,4 Габибов А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Йельский университет, Йельская школа медицины, кафедра фармакологии, Нью-Хейвен, CT 06520-8066, США Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва





E-mail: yuliana256@mail.ru

Создание протеиназ, способных узнавать и гидролизовать избранный белковый эпитоп, является одной из фундаментальных проблем современной биохимии и молекулярной биологии. На основании информации, полученной в последние годы, относительно индукции каталитических антител, а также ассоциированности спонтанного образования этих биокатализаторов с аутоиммунными патологиями предполагается, что каталитические антитела (абзимы) являются перспективной моделью для создания эпитопспецифических протеиназ. Существует вероятность, что протеолитическое расщепление специфическим абзимом поверхностного антигена вируса иммунодефицита человека gp120 в организме пациента позволит преодолеть иммунологическую мимикрию вируса, экспонировать его константные эпитопы и обеспечить возможность ликвидации инфекции ВИЧ иммунной системой пациента. Ранее в лаборатории биокатализа методами реакционной иммунизации и индукцией каталитических антител на фоне аутоиммунного заболевания были получены антитела, обладающие гидролизующей активностью к gp120 и его фрагментам.

Целью данной работы создание генетических конструкций для экспрессии описанных выше антител в дрожжевой системе. Были созданы универсальные вектора для клонирования вариабельных фрагментов изучаемых антител и экспрессии их в виде Fab-фрагментов. На основе полученных векторов были созданы генетические конструкции для экспрессии Fab-антител, специфичных к gp120.

После проведения трансфекции в клетки дрожжей линии gs115 и селекции рекомбинантных клонов нами был получен штамм-продуценты, эффективно секретирующие рекомбинантные Fab-фрагменты в культуральную среду. Полученные препараты Fab-фрагментов были хроматографически очищены и определена их функциональная активность.

Стендовые доклады 307

ВЛИЯНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА Hfq

НА ЕГО СТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ

Мурина В.Н.1,2, Селиванова О.М.2, Гарбер М.Б.2, Никонов С.В.2, Никулин А.Д.2 Пущинский филиал МГУ им. М.В. Ломоносова, Пущино, Московская обл.

Учреждение РАН Институт белка РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: thyrada@rambler.ru

Бактериальные белки Hfq относятся к семейству Sm-подобных белков, объединяются в него по наличию консервативного структурного Sm-фолда. Первичные структуры белков Hfq высококонсервативны, отличаются в основном С-концевыми участками, вариабельными по длине и аминокислотной последовательности. В растворе белки Hfq формируют четвертичную структуру в виде тороидальных гексамеров, которые далее могут олигомеризоваться в сложные фибриллярные структуры.

Нами исследовано влияние изменений в первичной структуре белка Hfq Pseudomonas aeruginosa на формирование гексамеров белка и образование фибриллярных структур. Показано, что уменьшение длины неупорядоченной вариабельной С-концевой части белка приводит к потере способности образовывать высокоупорядоченные фибриллы. При внесении замен в области консервативного Sm2-мотива укороченного белка, была получена новая форма белка, способная образовывать фибриллоподобные структуры нового типа.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК № 02.740.11.0295.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНАЛОГИ 4Cys ЗАЩИТНЫХ ПЕПТИДОВ

РАСТЕНИЙ

Опарин П.Б., Беркут А.А., Василевский А.А., Гришин Е.В., Егоров Ц.А.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: spud-13@mail.ru В ходе эволюции высшие растения выработали сложную систему защиты от неблагоприятных условий и естественных врагов. Важной составляющей этой системы являются вещества полипептидной природы, такие как ферменты, лектины, антимикробные пептиды. В последние годы из ряда растительных источников нами были выделены соединения, относящиеся к семейству так называемых «четырехцистеиновых» (4Cys) пептидов. Аминокислотные последовательности 4Cys пептидов содержат два мотива CXXXC, где X – любой остаток; в пространстве эти молекулы формируют -спиральные шпильки. Среди 4Cys пептидов находят ингибиторы сериновых протеаз и антимикробные пептиды.

В настоящее время в нашей лаборатории ведется работа по получению рекомбинантных аналогов 4Cys пептидов и их структурно-функциональному исследованию. Высокой эффективностью характеризуется бактериальная система экспрессии, основанная на получении целевых пептидов в составе химер с белкомпомощником тиоредоксином. С использованием этой системы были получены рекомбинантные аналоги ингибитора трипсина BWI-2c (41 остаток) из гречихи обыкновенной Fagopyrum esculentum, антимикробных пептидов Tk-AMP-H1 (27 остатков) из пшеницы Triticum kiharae и EcAMP1 (37 остатков) из ежовника обыкновенного Echinochloa crus-galli. Выход пептидов составил ~5 мг с 1 л культуры Escherichia coli, что позволило провести разнообразные исследования их активности. Кроме того, были получены изотопно-меченые пептиды для исследования их пространственной структуры методами спектроскопии ЯМР.

Работа поддержана грантами Минобрнауки РФ (Госконтракт № 16.740.11.0424), РФФИ (№ 11-04-00190).

Стендовые доклады 309

МУТАНТНЫЕ OmpF ПОРИНЫ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

С ДЕЛЕЦИЯМИ НАРУЖНЫХ ПЕТЕЛЬ: СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ

КОНСТРУКЦИЙ, ЭКСПРЕССИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ, РЕФОЛДИНГ

Сидорова О.В., Чистюлин Д.К., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Исаева М.П., Новикова О.Д.

Учреждение РАН Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159 E-mail: olga_ximik@mail.ru Как известно, изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно делать выводы о функциональной значимости тех или иных участков белковой молекулы. Ранее нами был клонирован и экспрессирован OmpF порин возбудителя псевдотуберкулёза Yersinia pseudotuberculosis [1], а также исследованы его структурно-функциональные и иммунобиологические свойства. Согласно литературным данным наружные петли неспецифических поринов грамотрицательных бактерий входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.

На первом этапе исследования для получения мутантных конструкций, несущих ompF ген с делециями внешних петель (L1, L2, L4-L8), была использована Pfu Turbo ДНК полимераза (Stratagene, США) с применением мутантных праймеров. Наличие делеций в экспрессионной плазмиде контролировалось при помощи секвенирования. Экспрессия целевых белков проводилась в штамме Rosetta Escherichia coli (Novagen, США). Выделение из телец включения и рефолдинг мутантных белков с делециями по петлям L1, L6 и L8 проводились по методике, отработанной для выделения рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis [1]: путем исчерпывающего диализа и ионообменной хроматографии. В результате мутантные белки получены в олигомерной форме. С помощью иммуноблоттинга и техники БЛМ показано, что в случае OmpF порина из Y. pseudotuberculosis отсутствие вышеуказанных петель в структуре белка существенно не влияет на его антигенную и функциональную активность.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-08-00823-а «Конструирование и исследование неспецифических порообразующих белков грамотрицательных бактерий с измененными структурно-функциональными свойствами» и ДВО РАН «Конструирование и структурно-функциональное исследование мутантных OmpF поринов наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis».

Литература

1. Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Исаева М.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н.

Вострикова О.П., Соловьёва Т.Ф. Биоорган. химия. (2008) 34(2), 177–184.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВОЕ МУЛЬТИГЕННОЕ СЕМЕЙСТВО АКТИНОПОРИНОВ (Hct-S)

АКТИНИИ HETERACTIS CRISPA

Ткачева Е.С., Еськов А.А., Лейченко Е.В., Исаева М.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П.

Учреждение РАН Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159 E-mail: estkacheva@gmail.com Ранее из тропической актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) было выделено и охарактеризовано четыре актинопорина, имеющих большую степень гомологии аминокислотных последовательностей и обладающих высокой гемолитической и канцерпревентивной активностями. Методами молекулярной биологии были установлены нуклеотидные последовательности генов rtx-sii и rtx-s3, кодирующих аминокислотные последовательности актинопоринов H.

crispa. На основании этих последовательностей были сконструированы праймеры, которые фланкировали последовательность участка гена, кодирующего зрелый актинопорин. В результате ПЦР-амплификации кДНК актинии H. crispa с ген-специфичными праймерами были получены фрагменты ДНК, кодирующие зрелые актинопорины. Пятьдесят клонов, содержащих корректную вставку, были проанализированы и на основании полученных нуклеотидных последовательностей генов были выведены аминокислотные последовательности восемнадцати актинопоринов, отнесенных нами к Hct-S семейству. Структурно-функциональный анализ актинопоринов семейства Hct-S показал, что они обладают высокой структурной гомологией (идентичность аминокислотных последовательностей составила от 89 до 100%) и являются, таким образом, представителями мультигенного семейства Hct-полипептидов.

Два представителя семейства (Hct-S5 и Hct-S6) были экспрессированы в E. coli Rosetta как гибридные белки, содержащие GST-белок. Рекомбинантные белки (rHct-S5 и rHct-S6) были очищены с помощью металл-аффинной хроматографии на смоле Ni-CAM в нативных условиях. Было показано, что рекомбинантные актинопорины обладают гемолитической активностью, которая на порядок ниже активности нативного актинопорина. В настоящее время проводится исследование цитотоксической и канцерпревентивной активностей рекомбинантных белков.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН № 11-III-Ви РФФИ № 10-08-00316-а.

Стендовые доклады 311

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЭСТЕРАЗ

ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ АРХЕИ THERMOCOCCUS SIBIRICUS

Черкашин Е.А.1, Тамаркин М.2 Научно исследовательский центр «Курчатовский институт», 123098 Москва, пл. Ак. Курчатова, 1 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва

E-mail: e.cherkashin@gmail.com

Липазы (эстеразы) – это ферменты, способные гидролизовать триглицериды. Их систематическое название – триацилглицерол-ацил гидролаза (E.C. 3.1.1.3). Главное различие между липазами и эстеразами заключается в форме субстрата. Липазы в качестве субстрата используют твердые или жидкие нерастворимые жиры, в то же время эстеразы, в качестве субстрата, используют растворимые жиры. Эти ферменты с каждым годом находят все большее и большее промышленное применение: пищевая, парфюмерная, фармацевтическая промышленности, тонкий органический синтез и др. все эти отрасли промышленности используют различные липазы в больших количествах. Особенно стоит отметить то, что липаза является ключевым объектом при ферментативном производстве биодизельного топлива, производство которого с каждым годом растет как, более экологичная и в некоторых случаях более дешевая альтернатива дизельному топливу. Практически все промышленно значимые липазы и эстеразы являются рекомбинантными ферментами грибного или бактериального происхождения, поскольку способны работать в широком диапазоне температур, pH, а также, обладают широкой субстратной специфичностью. Производство этих ферментов для промышленных целей на территории Российской Федерации отсутствует.

Нами были клонированы три гена липаз из термофильной археи T.sibiricus, которая, способна расти в широком диапазоне температур 40–88°С и pH 5,8–7,3.

Полностью отсеквенированный и аннотированный геном этого организма описан.

Анализ этого генома позволил выделить три гена липаз, которые могут представлять потенциальный интерес в качестве биотехнологически значимых ферментов.

Анализ аминокислотной последовательности этих ферментов показал, что они обладают высокой степенью гомологии с ферментами которые осуществляют гидролиз растворимых жиров т.е. эстеразами. Далее была оптимизирована система экспрессии этих ферментов в клетках E.coli и получены эти рекомбинантные эстеразы.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 16.512.11.2175) V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В E.COLI ФЕРМЕНТОВ

ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ

Черкашина А.С.1, Ларина Д.С.2, Егоров М.В.3 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123098 Москва, пл. Ак. Курчатова, 1 Факультет нано-, био-, информационных и когнитивных технологий (ФНБИК), Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700 Долгопрудный, Московская обл., Институтский переулок, 9 Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, 125047 Москва, Миусская пл., 9

E-mail: Anna.S.Cherkashinavmlipkin@mx.ibch.ru

Термофильные ферменты не только находят широкое в различных биотехнологических областях, но и являются перспективным источником данных о взаимосвязи структуры и термостабильности ферментов.

В качестве объектов исследования были выбраны два фермента:

-амилаза (К.Ф. 3.2.1.1) и L-аспартат оксидаза (К.Ф.

1.4.3.16) из термофильных бактерий Thermococcus sibiricus. -амилаза широко используется при производстве биоэтанола из крахмалистого сырья и является довольно хорошо изученным ферментом. Однако детальное изучение строения, структуры и функций фермента и багаж накопленных литературных данных позволит уточнить взаимосвязь структуры и термостабильности фермента. В тоже время L-аспартат оксидаза, катализирующая окисление L-аспартата с образованием оксалоацетата и перекиси водорода является гораздо менее изученным ферментом. Этот фермент представляет интерес как один из ключевых ферментов участвующих в синтезе NAD в клетке.

В данной работе гены обоих ферментов из термофильных бактерий Thermococcus sibiricus были клонированы в клетки E.coli. Последовательности обоих генов отсеквенированы по обеим цепям. Тестовая экспрессия рекомбинантных ферментов в клетках E.coli показала преимущественное образование белков в нерастворимой форме. Была проведена оптимизация системы экспрессии ферментов по следующим параметрам: экспрессионный штамм, тип и концентрация индуктора, температура экспресии и др. После получения белка в растворимой форме система была масштабирована на экспрессию в ферментерах.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 16.512.11.2175) Стендовые доклады 313

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО СОСУДИСТОГО

ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

Ярославцева А.К., Степаненко В.Н., Есипов Р.С.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: esipov@ibch.ru Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) является одним из основных факторов, определяющих процессы ангиогенеза и неоангиогенеза в организме.

Поэтому создание экспериментальных моделей с использованием VEGF представляет большой интерес для исследований в различных областях медицины – от заболеваний органов зрения до антираковой терапии.

VEGF представляет собой гомодимер с молекулярным весом 38 кДа, с двумя межмолекулярными дисульфидными связями.

В данной работе мы предлагаем биотехнологический способ получения рекомбинантного VEGF165. Нами были получены два штамма-продуцента VEGF E.coli ER2566/pER-VEGF165 и E.coli Origami B(DE3)/pTVG-VEGF165. При культивировании первого штамма VEGF получался в нерастворимой форме, в виде тел включения, которые солюбилизировали буфером, содержащим 2 М мочевину. Затем проводили очистку экстракта с помощью тангенциальной ультрафильтрации с последующей ренатурацией VEGF в присутствии окислительно-восстановительной пары глутатион окисленный – глутатион восстановленный (1:10). После двух две хроматографии, ионообменной и гель-фильтрационной белок был получен с чистотой 95% При культивировании второго штамма-продуцента E.coli Origami B(DE3)/pTVG VEGF165 целевой белок синтезировался в составе гибридного белка (ГБ), содержащего тиоредоксин и сайт для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV протеиназой). Уровень биосинтеза гибридной конструкции достигал 40% от общего клеточного белка, при этом более 90% ГБ было получено в димерной форме. ГБ очищали с помощью ионообменной хроматографии и расщепляли TEV протеиназой. Полученный VEGF отделяли от тиоредоксина ультрафильтрацией.

В результате проведенной работы нами был получен рекомбинантный VEGF двумя способами. Биологическая активность обоих образцов VEGF была подтверждена in vitro на культуре эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ВЫРАЩИВАНИЕ КРИСТАЛЛОВ РЕКОМБИНАНТНОЙ

ТИМИДИНФОСФОРИЛАЗЫ Е. COLI И ЕЕ КОМПЛЕКСА

С ИНГИБИТОРОМ МЕТОДОМ ВСТРЕЧНОЙ ДИФФУЗИИ

В НАЗЕМНЫХ УСЛОВИЯХ И В УСЛОВИЯХ НЕВЕСОМОСТИ

Абрамчик Ю.А.1,2, Тимофеев В.И.1, Муравьёва Т.И.2, Есипов Р.С.2, Куранова И.П.1 Учреждение РАН Институт кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН, 119333 Москва, Ленинский просп., 59 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: ugama@yandex.ru

Тимидинфосфорилаза Escherichia coli (ТФ) катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза пиримидиновых нуклеозидов в бактериальных клетках. Она представляет собой белок с молекулярной массой 47.3 кДа и функционирует в форме димера. Тимидинфосфорилаза играет важную роль в росте новых кровеносных сосудов, являясь стимулятором ангиогенеза. Её уровень в опухолевых клетках повышен. В настоящее время ведется активный поиск специфических ингибиторов тимидинфосфорилазы и изучается их взаимодействие с ферментом.

Рекомбинантная тимидинфосфорилаза получена в бактериальном штамме E.coli BL21(DE3)/pER-Thy1. На первой стадии очистки супернатант подвергался двойному высаливанию сульфатом аммония. Дальнейшая очистка белка проводилась анионообменной хроматографией на сорбенте Q Sepharose HP и гидрофобной хроматографией на сорбенте Phenyl Sepharose HP.

Для последующего рентгеноструктурного исследования методом встречной диффузии в капиллярах в наземных условиях и в условиях невесомости на МКС выращены кристаллы рекомбинантной ТФ и ее комплекса с ингибитором 3'-NH2F-2',3'-ddT. Кристаллы выращивали в оборудовании японского космического агентства JAXA. Кристаллы росли из растворов ТФ в калий-фосфатном буфере.

Концентрация белка составляла 20 мг/мл, в качестве осадителя использовали сульфат аммония в цитратном буфере. Кристаллы достигали размера 0.30 х 0.30 х

0.20 мм.

От кристаллов ТФ, выращенных в условиях невесомости, на синхротроне SРring8 собраны дифракционные наборы до разрешения 1.52 (свободная ТФ) и 1.7 (комплекс с ингибитором). Все кристаллы принадлежат к пространственной группе P43212 и имеют следующие параметры элементарной ячейки: a=b=129.951, c=67.809, ===90° (свободный фермент); a=b=129.691, c=67.905, ===90° (комплекс с ингибитором).

Работа выполнена при поддержке ЦНИИМаш Роскосмоса.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СРАВНЕНИЕ ПРОЦЕССА ОБРАЗОВАНИЯ АМИЛОИДОВ

МУТАНТНОЙ ФОРМОЙ АЛЬБЕБЕТИНА В СВОБОДНОМ ВИДЕ

И В СОСТАВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА ТИОРЕДОКСИН – АЛЬБЕБЕТИН

Балобанов В.А.1, Егорова А.Г.1, Ильина Н.Б.1, Черткова Р.В.2, Долгих Д.А.2, Бычкова В.Е.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

E-mail: uralm62@rambler.ru

В данной работе проведено исследование процесса амилоидообразования искусственным белком альбебетином с аминокислотной заменой H65F. Эксперименты были проведены как с белком в свободном виде, так и составе гибридного белка.

Данный гибридный белок состоит из тиоредоксина и альбебетина, присоединённого к его C-концу через линкер. Эта конструкция первоначально была использована для увеличения уровня экспрессии альбебетина, однако, как показали опыты, такой гибридный белок способен образовывать амилоидные агрегаты.

За появлением кросс- структуры следили по возрастанию интенсивности флуоресценции красителя тиофлавина Т, скорость роста размеров агрегатов оценивалась по рассеянию света, а изменения в структуре тиоредоксина тестировались методом триптофановой флуоресценции. Показано, что альбебетин с заменой H65F в свободном виде образует амилоидные агрегаты при инкубации при 45оС в течение 2-х недель. При этом наблюдается хорошо выраженная лаг-фаза в начальной стадии процесса. В отличие от свободной формы, альбебетин в составе гибридного белка образует амилоидные агрегаты уже при 37оС в течение суток, и лаг-фаза для него не наблюдается. Тиоредоксин в свободном виде, в составе гибридного белка и в составе амилоида сохраняет способность к кооперативному разворачиванию при повышении концентрации мочевины. Это говорит о том, что он сохраняет свою структуру во всех трёх вариантах, и, следовательно, образование амилоидов гибридным белком идёт только за счет альбебетина, входящего в его состав. Таким образом, можно заключить, что искусственный белок альбебетин с заменой H65F проявляет заметную склонность к амилоидной агрегации, а присоединение к нему тиоредоксина значительно влияет на процесс амилоидообразования.

Работа поддержана программой МКБ РАН, грантами РФФИ(09-04-01348) и ФАНИ(02.770.11.0295).

Стендовые доклады 317

ПОСТРОЕНИЕ И АНАЛИЗ СТРУКТУРНОГО ДРЕВА -БЕЛКОВ,

СОДЕРЖАЩИХ 3-УГОЛКИ

Бошкова Е.А., Гордеев А.Б., Ефимов А.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: boshkova.e.a@rambler.ru Структурное древо белков – это совокупность всех разрешённых промежуточных и конечных пространственных структур, которые могут быть получены из одной стартовой структуры путём последовательного пристраивания к ней других элементов вторичной структуры в соответствии с набором правил, выведенных из известных принципов структурной организации белков. В качестве корневой структуры древа берётся соответствующий структурный мотив.

Первое структурное древо для белков, содержащих 3-уголки, было построено в 1997 году. За это время количество расшифрованных пространственных структур белков выросло в несколько раз. Обновление структурного древа для данной группы белков позволяет, во-первых, упорядочить новые белки в соответствии с их пространственной структурой, во-вторых, проверить предсказательную силу ранее построенного структурного древа, в-третьих, дает возможность разработать иерархическую классификацию белков, содержащих 3-уголки.

Целью данной работы было построение и анализ структурного древа белков, содержащих 3-уголки. Белки и белковые домены, содержащие 3-уголки, отобраны визуально из банка белковых данных PDB и системы классификации SCOP

1.75. Созданная база данных включает в себя 573 белка (из них 204 негомологичных), что составляет 2570 PDB-файлов. Построено теоретическое структурное древо, содержащее 358 укладок, из которых 65 соответствуют пространственным структурам известных белков.

На основе полученного структурного древа разработана иерархически организованная классификация белков, содержащих 3-уголки. В настоящее время ведётся работа по размещению компьютерной версии структурного древа на WEBсайте http://strees.protres.ru/.

Данная работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-00727-а и грантом Федерального агентства по науке и инновациям № 02.740.11.0295.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

НОВЫЕ СТРУКТУРНЫЕ ДЕРЕВЬЯ (АЛЬФА + БЕТА)-БЕЛКОВ

Гордеев А.Б., Ефимов А.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: gordeew@vega.protres.ru Структурное древо белков – это совокупность всех разрешённых пространственных структур, которые могут быть получены из одной стартовой структуры путём последовательного пристраивания к ней других элементов вторичной структуры в соответствии с набором правил. В качестве стартовой структуры древа берётся соответствующий структурный мотив. Количество расшифрованных пространственных структур белков с каждым годом растёт, что предопределяет необходимость построения обновлённых структурных деревьев для уже описанных групп белков, а также поиска новых структурных мотивов и построения новых деревьев на их основе. Новые структурные деревья можно использовать в качестве удобного инструмента для решения ряда научных проблем, в частности, для создания структурной классификации белков, принципиально отличающейся от других классификаций. Ранее нами был построен ряд структурных деревьев, разработана классификация для соответствующих групп белков, а результаты работы представлены в виде WEB-ресурса PCBOST.

В ходе данной работы в классе (+)-белков обнаружены белки, содержащие структуры, сходные с abCd-единицей, но отличающиеся от неё наличием одного или нескольких -тяжей, находящихся внутри укладки. Для таких белков составлена база данных, в которую вошло 485 белков и доменов, из них взаимная гомология не обнаружена в 199 белках. Всего в белках обнаружено семь структур. В случае пяти структур белки образуют от 3 до 39 различных укладок цепи, поэтому для них можно построить пять новых структурных деревьев, для которых в качестве корневых структур используются: abCdd1-структура, a1abCd-структура, a2a1abCd-структура, a3a2a1abCd-структура, a2a1abCdd1-структура. Построены соответствующие структурные деревья. Для двух наиболее распространенных групп белков на основе построенных деревьев разработана структурная классификация.

Классификация – иерархическая и включает в себя 2 Структурных дерева, 19 Уровней, 63 Укладки, 367 Белков и доменов и 1749 PDB-файлов. Классификация оформлена в виде дополнения к разработанному ранее WEB-ресурсу PCBOST и свободно доступна в Интернете по адресу http://strees.protres.ru.

Данная работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-00727-а и грантом Федерального агентства по науке и инновациям № 02.740.11.0295.

Стендовые доклады 319

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ

Довидченко Н.В., Галзитская О.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: bones@phys.protres.ru Предложена общая кинетическая модель для описания процесса амилоидообразования, включающая в себя нуклеационный механизм полимеризации с последовательным присоединением мономеров к олигомеру и автокаталитический рост амилоидных агрегатов, под которым подразумеваются все типы экспоненциального роста: ветвление, дробление и рост с поверхности. Компьютерные симуляции показали, что модель корректно описывает наблюдаемые экспериментально стадии роста амилоидных фибрилл и что присутствие стадии экспоненциального роста в модели критично для моделирования образования амилоидных фибрилл.

Ключевой особенностью предложенной модели является наличие стадии экспоненциального роста агрегата. Такая стадия может описывать сразу несколько сценариев увеличения агрегата в размерах путем ветвления, дробления или роста с поверхности. На основе данных, полученных с помощью модели, сделаны выводы о значимости каждой из стадий в процессе сборки амилоидных фибрилл.

Авторы благодарны А.В. Финкельштейну за обсуждение результатов. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 08-04-00561, 11-04при поддержке Российской академии наук (программы «Молекулярная и клеточная биология» (01200959110) и «Фундаментальные науки медицине»), Фонда содействия отечественной науке и фонда Дмитрия Зимина «Династия», Федерального агентства по науке и инновациям (02.740.11.0295).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ НЕОРГАНИЧЕСКИХ СОЛЕЙ НА СТАБИЛЬНОСТЬ

БЕЛКА К РАЗРУШЕНИЮ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОМ

Дурденко Е.В., Сабурова Е.А.

Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3 E-mail: cathrine.durdenko@gmail.com В последнее время все больше выявляются мультифункциональные свойства практически всех компонентов клетки – белков, липидов, эндогенных полиэлектролитов, низкомолекулярных метаболитов, а также ионов неорганических солей.

Биологическая роль ионов неорганических солей – сульфатов, фосфатов, а также моновалентных ионов – хлоридов, аммония и др. не ограничивается только осмотическим действием, но и включает регуляцию многих метаболических процессов. Так, например фосфатный буфер имеет большее значение в таких биологических жидкостях, как кровь, моча и соки пищеварительных желез. Однако в настоящее время не всегда понятно, какой из двух видов – одно- или двузамещенный фосфат – участвует в метаболических процессах. Также мало известно о влиянии ионов фосфата на стабильность белков к различным денатурирующим воздействиям.

Настоящая работа посвящена изучению влияния моно- и дивалентных анионов солей на стабильность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в комплексе с полистиролсульфонатом (ПСС). Для того чтобы выявить особую роль фосфата в стабилизации структуры ЛДГ по сравнению с другими дивалентными анионами, аналогичные эксперименты были проведены также с сульфатом и ионом хлора. Исследования ингибиторного действия ПЭ на активность ЛДГ были выполнены при двух значениях рН буфера 6,2 и 7,0 поскольку ионы фосфата при этих рН существуют в двух ионизованных формах: [НРО42-] и [Н2РО4-].

Изучение динамики образования комплекса ЛДГ с ПСС показало, что наиболее сильный стабилизирующий эффект фосфата проявился при значении рН буфера 7,0, в то время как в присутствии ионов сульфата и хлоридов различий в скоростях тушения флуоресценции не обнаружено. Кроме того, при рН 7,0 дивалентные анионы фосфата гораздо эффективнее снимают ингибирование фермента, вызванное связыванием с ПСС.

Полученные данные интерпретируются с позиции особой роли анион-связывающих центров в межсубъединичных контактах ЛДГ – два на димер, образующих с участием дивалентного фосфата ионный кластер, стабилизирующий четвертичную структуру белка к разрушению полиэлектролитом.

Стендовые доклады 321

МЕТОДЫ ЯВНОГО УЧЁТА МОЛЕКУЛ ВОДЫ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ

СВЯЗЫВАНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛИГАНДОВ С БЕЛКАМИ

Зейфман А.А., Новиков Ф.Н., Строганов О.В., Стройлов В.С., Чилов Г.Г.

Учреждение РАН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 47 E-mail: ghermes.chilov@gmail.com В существующих на сегодняшний день алгоритмах молекулярного докинга и виртуального скрининга молекулы воды рассматриваются континуально. Проведённый нами ранее на тест-сете CSAR анализ основных ошибок предсказания энергии в молекулярном докинге показал, что около трети структур с максимальной ошибкой содержат прочно связанные молекулы воды, явный учёт которых позволил бы добиться повышения точности. Для явного учёта влияния подобных молекул воды первого слоя (прочно связанных с белком) был разработан алгоритм молекулярного докинга с последующей кластеризацией и термодинамическим усреднением поз. Данный алгоритм позволяет точно определять позиции ~80% молекул воды, присутствующих в рентгеновских структурах. Для сравнения, нулевая модель позволяет определять позиции только ~20% рентгеновской воды.

Учёт рассчитанных на основе термодинамического усреднения энергий вытесняемых лигандом молекул воды в скоринговой функции позволяет повысить сходимость молекулярного докинга в значительном количестве случаев.

Разработанные алгоритмы были применены для оптимизации найденных ранее ингибиторов поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы (ПАРП-1). Предложены структуры ингибиторов на основе 3,5,6,7-тетрагидро-4H-циклопента[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4-она, для которых ожидается значительное улучшение связывания с белком за счёт образования водородных связей с мостиковой молекулой воды либо вытеснения её группами, компенсирующими водородные связи данной молекулы.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПОСТРОЕНИЕ И АНАЛИЗ КОМПЬЮТЕРНЫХ ВЕРСИЙ

СТРУКТУРНЫХ ДЕРЕВЬЕВ ДЛЯ -МОТИВА И -МОТИВА

Каргатов А.М., Ефимов А.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: kargatov@rambler.ru Структурное древо – это совокупность всех промежуточных и конечных структур, которые могут быть получены из стартовой структуры путём последовательного добавления к ней -спиралей и -тяжей. Компьютерные структурные деревья содержат все структуры, разрешённые правилами построения. Кроме того, они являются основой системы структурной классификации белков PCBOST (http://strees.protres.ru), позволяющей не только находить белки по укладке, но и моделировать пути их сворачивания.

К четырём уже имевшимся в системе классификации деревьям (для abcd-единицы, abCd-единицы, 5S-мотива и 7S-мотива) добавлены два новых – для мотива и -мотива. Древо белков, содержащих -мотивы, имеет 6 уровней (до структур с 6 добавочными элементами включительно) и содержит 124 укладки, из которых 24 заняты реальными белками; всего в базе данных этого древа содержится 218 белков (655 PDB-файлов). В свою очередь, древо белков, содержащих -мотивы, состоит из 13 уровней (до структур с 13 добавочными элементами включительно) и насчитывает 154 укладки, из которых 25 заняты реальными белками; общее число белков в этой базе – 167 (668 PDB-файлов). Оба древа содержат все разрешённые укладки до 3 уровня включительно, а выше – только те, что приводят к существующим белкам. Таким образом, в шести структурных деревьях, входящих в систему классификации PCBOST, содержится 3847 белков (10547 PDB-файлов).

Данная работа поддержана грантами РФФИ № 10-04-00727 и Федерального агентства по науке и инновациям № 02.740.11.0295.

Стендовые доклады 323

МОЛЕКУЛЯРНО-СТАТИСТИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ

И МАЛДИ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕПТИДОВ НА УГЛЕРОДНЫХ СОРБЕНТАХ

Кузнецова Е.С., Буряк А.К.

Учреждение РАН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 31, корп.4 Е-mail: eskuznetsova8@yandex.ru В работе продемонстрирован комплексный поход для анализа аминокислот и пептидов с использованием углеродных сорбентов, включающий молекулярно-статистический расчет, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ). Аминокислоты использовали как модельные объекты для предсказания характеристик удерживания пептидов.

Проведен расчет термодинамических характеристик адсорбции (ТХА) ряда протеиногенных аминокислот и ди- и трипептидов на графитированной термической саже (ГТС). Установлено, что ТХА аминокислот и пептидов возрастают с увеличением углеродной цепи этих соединений. Выяснено, что значения константы Генри чувствительны к положению функциональных групп в аминокислоте.

Проведен сравнительный анализ рассчитанных значений ТХА аминокислот с экспериментально полученными параметрами удерживания. Показано, что рассчитанные молекулярно-статистическим методом ТХА аминокислот на ГТС коррелируют с их характеристиками удерживания на углеродном сорбенте Гиперкарбе, определенными методом ВЭЖХ.

Продемонстрирована возможность применения углеродных сорбентов с различной удельной поверхностью при идентификации аминокислот и пептидов методом МАЛДИ в варианте хромато-масс-спектрометрическом off-line режиме. В качестве углеродных сорбентов использовали: графитированные сажи – графитированную термическую сажу (ГТС) и печную сажу (ПМ-16Э) с удельной поверхностью 7.6 и 16 м2/г, неграфитированные сажи – ПМ-75 и Vulcan XC 72R с удельной поверхностью 75 и 265 м2/г. Установлено, что увеличение удельной поверхности саж приводит к резкому возрастанию интенсивности регистрируемых пиков протонированных молекулярных ионов и аддуктов с катионами щелочных металлов аминокислот различных классов и пептидов. Предложенный способ применения саж дает возможность получать пики ионов с интенсивностью, на порядок превышающей интенсивность пиков при стандартном варианте проведения эксперимента (нержавеющая сталь).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СВОЙСТВА КСИЛАНАЗЫ Е МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА

PENICILLIUM CANESCENS

Логинов Д.С., Майсурадзе И.Г., Чулкин А.М., Федорова Т.В., Поляков К.М., Королева О.В.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр.2 E-mail: d.s.loginov@inbi.ras.ru Ксиланазы – это О-гликозид-гидролазы, катализирующие гидролиз 1,4--ксилозидной связи по эндодеполимеразному механизму и участвующие в процессе биодеградации гемицеллюлоз (ксиланов), которые являются одними из наиболее распространенных полисахаридов в природе. В геноме грибов – продуцентов ксилазан показано наличие ряда ферментов, относящихся к различным семействам.

Большинство из них синтезируются в минорных количествах, и вопрос об их физиологической роли остается открытым. Поэтому целью данной работы являлось исследование роли ксиланазы xylE гриба Penicilliun canescens, не синтезирующейся грибом в существенном количестве при глубинном культивировании.

Для достижения поставленной цели с помощью гомологичной экспрессии был получен штамм P. canescens – продуцент ксиланазы xylE. Изучение свойств исследуемого фермента проводили на гомогенном препарате фермента (электрофоретическая чистота 90%). Молекулярная масса ксиланазы xylE составила 40 кДа, значение изоэлектрической точки – 6.5. Максимальную активность исследуемый фермент проявлял при pH 6.0 и температуре 70С. Значения Km и Vm при гидролизе ксилана березы составили 0.52 г/л и 1.25 мМ/(мг·сек), соответственно.

Ксиланаза xylE сохраняла более 80% активности при термостатировании в течение 6 часов при 50С и около 60% – при 60С. Исследование процесса денатурации xylE методом ДСК показало, что плавление белковой глобулы происходило при температуре 73С. Таким образом, полученные данные характеризуют ксиланазу xylE, как высокостабильный фермент. Анализ пространственной структуры, решенной с разрешением 1.5, показал наличие 3-х дисульфидных мостиков внутри белковой глобулы. Возможно, высокое значение термооптимума данного фермента объясняется стабилизацией белковой глобулы дсульфидными связями и углеводными цепями. Исходя из полученных данных, можно предположить, что синтез данного фермента в природном штамме происходит при повышении температуры среды.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (№ 11-04-01539-а); Федеральным агентством по образованию (ГК П1297) и Министерством образования и науки (ГК № 16.512.11.2150).

Стендовые доклады 325

КРОССРЕАКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ, ОТОБРАННЫХ

ИЗ ФАГ-ДИСПЛЕЙНОЙ БИБЛИОТЕКИ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ

СКЛЕРОЗОМ НА ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА С LMP1

ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР

Ломакин Я.А.1, Захарова М.Ю.1, Белогуров А.А.1, Авакян М.Э.1, Дубровская В.В.2, Пономаренко Н.А., Тикунова Н.В., Габибов А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва Исследовательский институт Скриппса, Сан-Диего, США Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск

E-mail: yasha.l@bk.ru mailto:yasha.l@bk.ru

В последнее десятилетие роль В-клеточного ответа, сопровождающегося образованием антител к собственным антигенам, приобретает все большее значение в понимании этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний. Среди патологий аутоиммунной природы особое место занимает рассеянный склероз (РС) – хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных волокон. Несмотря на огромное количество молекулярно-биологических данных и клинических наблюдений, к настоящему времени не удалось составить полную и однозначную картину механизма индукции большинства аутоиммунных заболеваний. В качестве факторов, влияющих на их возникновение, называются как наследственная генетическая предрасположенность, гормональный статус организма и даже климатические условия местности, так и бактериальные или вирусные инфекции, такие как EBV, HHV6, HSV1, VZV, JCV and Torque Teno virus. В нашей лаборатории была сконструирована фаг-дисплейная библиотека одноцепочечных антител (scFv) на основе генетического материала больных РС для дальнейшего выявления аутоантител, участвующих в развитии заболевания. Антитела, специфичные к основному белку миелина (ОБМ) – один из основных аутоантигенов миелина, отбирали путем биопэннинга на полноразмерную и частично гидролизованную молекулу ОБМ. Анализ 13 отобранных клонов выявил высокую структурную гомологию с антителами из цереброспинальной жидкости больных РС а так же с антителами к latent membrane protein 1 (LMP1) вируса Эпштейна-Барр (EBV). Для 3 scFv была показана специфичность к фрагментам ОБМ 65-92 и 130–156, что соответствует данным по связыванию сывороточных антител при РС. Один из полученных клонов Е2 показал одновременное взаимодействие с ОБМ и LMP1 в виде одноцепочечного антитела и полноразмерного IgG человека in vitro, что свидетельствует о его кроссреактивности. Таким образом, наши данные подтверждают гипотезу о молекулярной мимикрии в основе механизма развития РС. Возможно предположить, что антитела, первично образованные на LMP1 во время инфекции EBV, потенциально кроссреактивны к ОБМ и тем самым могут служить триггерами развития заболевания.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

N-КОНЦЕВАЯ ЧАСТЬ БЕЛКА ТБГ1 ГОРДЕИВИРУСА СОСТОИТ

ИЗ ДВУХ ДОМЕНОВ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ

НЕУПОРЯДОЧЕННЫХ СТРУКТУР

Макаров В.В., Добров Е.Н., Калинина Н.О.

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Белок ТГБ1 гордеивируса, кодируемый тройным блоком генов, формирует рибонуклеопротеиновый комплекс для межклеточного и дальнего транспорта по проводящей системе растения (Lim et al., 2008). Белок ТГБ1 полулатентного вируса мятлика состоит из трех доменов: N-концевого домена NTD, небольшого центрального домена ID и С-концевого домена с активностью НТФазы/хеликазы (Makarov et al., 2009). Рекомбинантные белки, соответствующие NTD, ID, и N63K, включающий в себя оба домена, были проанализированы при помощи физических и биохимических методов. NTD оказался полностью разупорядоченным доменом, в пользу чего свидетельствовали предсказания, сделанные при помощи различных вэб-сервисов, измерение спектров кругового дихроизма, аномальная подвижность в денатурирующем полиакриламидном геле и аномальный гидродинамический размер, измеренный методом динамического лазерного светорассеяния. Кроме того, NTD характеризуется низким содержанием гидрофобных и полным отсутствием ароматических аминокислот и крайне высоким содержанием лизина (19%) и серина (17%). Напротив, ID имел вторичную структуру с высоким содержанием бета-тяжей (40%) и небольшим количеством альфа-спиралей (около 10%). Однако, согласно вэб-сервису K2D2, КД-спектр ID показывает также высокое содержание неупорядоченных структур. Отсутствие пика избыточной теплоемкости, измеренной методом дифференциальной сканирующей калориметрии, и ограниченный трипсинолиз позволяют предположить, что центральная часть полипептидной цепи ID может иметь слабую третичную структуру. В целом структура ID может быть вариабельной: в присутствии 33% трифторэтанола количество альфа-спиралей в белке значительно возрастает. Но наиболее сильные изменения конформации ID вызывает РНК: при взаимодействии с ней количество бета-тяжей увеличивается до 50%, а альфа-спирали фактически полностью исчезают. N63K, несмотря на наличие ID, обладает всеми свойствами полностью неупорядоченного белка. Согласно нашим предположениям, N63K играет основную роль в структурной организации вирусного РНП-комплекса. ID обладают способностью мультимеры, визуализуемые атомно-силовой микроскопией как протяженные филаменты. Самополимеризация ID может быть индуцирована нуклеиновыми кислотами.

Эти свойства показаны и для N63K, и для полноразмерного белка. NTD и ID способны связывать РНК, взаимодействовать с друг другом и фосфорилироваться растительными киназами. Итак, лабильные неупорядоченные структуры N-концевой части белка ТБГ1 позволяют этому белку выполнять различные функции на разных этапах вирусного транспорта и взаимодействовать с различными партнерами как белковой, так и нуклеиновой природы.

Данная работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-00522а.

Стендовые доклады 327

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МОЛЕКУЛ ДИОКСАНА

НА ГИДРАТНУЮ ОБОЛОЧКУ ПОЛИПЕПТИДОВ

Макшакова О.Н., Файзуллин Д.А, Зуев Ю.Ф.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: omega12@inbox.ru Гидратация белков является одним из основных факторов, влияющих на фолдинг белков и проявление их функциональной активности. Низкомолекулярные органические соединения могут выступать как регуляторы активности ферментов, при этом возможно как непосредственное влияние органических соединений на белок через межмолекулярные контакты, так и их опосредованное действие через изменение структуры и динамики гидратной оболочки. Понимание механизмов взаимодействия белков с водой и третьим компонентом представляет собой фундаментальную задачу. В прикладном аспекте органические растворители (в том числе 1,4-диоксан) позволяют оптимизировать биотехнологические процессы, существенно повышая стабильность ферментов, обеспечивая реакционный контакт химическим соединениям различной полярности и др., что зачастую недостижимо в рамках чисто водного окружения. Гомополипептиды являются классической упрощенной моделью белка.

Мы провели исследование механизмов влияния молекул диоксана на гидратную оболочку полипептидов на основе данных ИК-спектроскопии. Сорбцию воды и диоксана проводили на пленках полипептидов с различными свойствами боковых групп и типом вторичной структуры (полиаланин, полилизин, полиглутаминовая кислота в заряженной и нейтральной форме, поли--бензил-глутамат) в области активностей воды 0–0.5, при которых происходит заполнение первого гидратного слоя биополимеров. Чтобы установить центры сорбции воды и диоксана были рассчитаны структуры комплексов полипептид – молекула растворителя на уровне теории функционала плотности DFT PBE. Показали, что абсорбция диоксана в препарате сопровождается: 1) существенным изменением гидратации полипептида, 2) существенным изменением во вторичной структуре полипептида. В присутствии диоксана вторичная структура полипептидов характеризуется увеличением доли упорядоченных структур, преимущественно -спиралей. Обнаружена корреляция между изменением гидратации и долей вторичных структур. Корреляции между изменением гидратации и количеством сорбированного диоксана обнаружено не было.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта РФФИ № 09-03-00778.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МОДЕЛИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ЛИПОКСИГЕНАЗ РАСТЕНИЙ И СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Осипова Е.В., Ермилова В.С., Ермакова Е.А., Гоглев Ю.В., Гречкин А.Н.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31

E-mail: eva-0@mail.ru

Липоксигеназный сигнальный каскад является одним из способов ответа растения на воздействия биотических и абиотических стрессоров. Липоксигеназа – ключевой фермент этого пути – катализирует регио- и стереоспецифичное диоксигенирование свободных жирных кислот, содержащих 1,4-cis,cis-пентадиеновое основание. В таких реакциях в качестве субстрата растения используют линолевую и

-линоленовую кислоты, в каждом случае продуктами реакции являются либо 13S- либо 9S-гидроперекиси. Определение специфичности действия липоксигеназ затруднено тем, что в растении содержится большое количество изоферментов, экспрессируемых на разных этапах развития растений и в связи с действием различных факторов окружающей среды. Однако вопрос определение детерминант специфичности действия липоксигеназ остается открытым. В нашей работе использованы высокоочищенная 13S-специфичная липоксигеназа-1 сои (GmLOX1) и рекомбинантная 9S-специфичная липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3). Для определения специфичности действия этих ферментов in silico построены модели взаимодействия субстратов ((9Z,12Z)-гексадекадиеновая, (7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновая, (9Z,12Z)-октадекадиеновая, (9Z,12Z,15Z)-октадекатриеновая, (11Z,14Z)эйкозадиеновая, (5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновая, (13Z,16Z)-докозадиеновая кислоты) с активными центрами липоксигеназ. Для этого использовались данные рентгеноструктурного анализа GmLOX1 и построенная на основании гомологии с имеющимися структурами модель ZmLOX3. Продукты соответствующих реакций in vitro были выделены и идентифицированы методами ВЭЖХ и ГХ-МС. Полученные данные подтверждают предложенную модель взаимодействия субстрата с активным центром фермента. Определяющими специфичность действия ферментов факторами стали длина субстрата и положение двойных связей. Так, ZmLOX3 катализировала специфичное превращение жирных кислот, имеющихся в растении ((7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновая, (9Z,12Z)-октадекадиеновая, (9Z,12Z,15Z)октадекатриеновая кислоты), хотя GmLOX1 участвовала в специфическом окислении всех имеющихся субстратов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ НШ-6992.2010.4, программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 329

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО ОКРУЖЕНИЯ

НА СИНТЕЗ ХРОМОФОРА В ХРОМОБЕЛКЕ asCP

Пахомов А.А., Мартынов В.И.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: alpah@mail.ru Для практического применения белков GFP-семейства актуально создание вариантов со спектрами, смещенными в длинноволновую область. Как правило, образование хромофора в красных флуоресцентных белках контролируется посттрансляционной химией синтеза ацилимина, а также его реакционной способностью. В хромобелке из кораллового полипа Anemonia sulcata (asCP) на финальной стадии синтеза хромофора происходит гидролиз ацилиминной группы, сопровождающийся фрагментацией основной цепи белка. В данной работе была исследована роль ряда аминокислотных остатков из окружения хромофора в реакции гидролиза ацилимина. Для выявления этих остатков было проведено сравнение пространственной структуры asCP с его близким гомологом eqFP611. Несмотря на высокую гомологию и одинаковую хромофоробразующую триаду (-Met-Tyr-Gly-), в eqFP611 синтез хромофора останавливается на стадии синтеза ацилимина. Были обнаружены аминокислотные остатки, которые могли влиять на стабилизацию конечного состояния, возникновение стерических препятствий, выполнять каталитическую функцию, а также координирующую роль в ходе реакции. Для проверки роли отдельных аминокислотных остатков был проведён сайт-направленный мутагенез по выбранным позициям и проанализированы свойства полученных мутантов. Полученные данные свидетельствуют о том, что протекание реакции гидролиза ацилимина в нативном белке определяется в основном стерическими факторами.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 09-04-00212; 10-04-00471).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФОРМ

ПРИ СОЗРЕВАНИИ ХРОМОФОРА ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО

БЕЛКА Плетнева Н.В., Лукьянов К.А., Гурская Н.Г., Горячева К.А., Мартынов В.И., Плетнев В.З.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: nadand@mail.ru Белок aceGFP (мутантный вариант нефлуоресцентного белка дикого типа acGFPL из Aequorea courelescence) с остатком Gly вместо каталитического Glu222 характеризуется яркой зелёной флуоресценцией. При замене Gly222Glu в aceGFP образуется незрелый бесцветный вариант aceGFP_G222E, который подвергается необратимой фотоконверсии в зелёное флуоресцентное состояние aceGFP_G222E_UV.

Методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения установлены пространственные структуры aceGFP, его бесцветного нефлуоресцентного варианта aceGFP_G222E и фотоконвертированного зелёного варианта aceGFP_G222E-UV.

На основе структурно обоснованного сайт-направленного мутагенеза показано, что созревание зелёного хромофора в aceGFP происходит по альтернативному механизму с участием в качестве каталитического остатка Tyr220 вместо стандартного для всех GFP-подобных белков инвариантного Glu222. Установлено, что хромофор бесцветного нефлуоресцентного aceGFP_G222E представляет собой промежуточное незрелое состояние с неокисленной связью С-С тирозина и некопланарным расположением имидазолонового и фенольного циклов. Облучение незрелого aceGFP_G222E приводит к завершению созревания хромофора в конечное зелёное флуоресцентное состояние.

Стендовые доклады 331

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА СОРБЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ApoAI

НА ПОВЕРХНОСТИ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНОЙ ЭМУЛЬСИИ,

СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ПРОКСАНОЛОМ 268

Покусаева В.О., Жалимов В.К., Склифас А.Н., Кукушкин Н.И.

Учреждение РАН Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3 E-mail: student-iam@rambler.ru Ранее нами была показана сорбция различных белков плазмы крови человека на поверхности перфторуглеродной (ПФУ) эмульсии, стабилизированной проксанолом 268. Одним из идентифицированных нами белков оказался ApoAI. Этот белок играет важную роль в метаболизме липидов, а также ответственен за развитие атеросклероза. Нами установлено, что удаление липидов из плазмы при помощи F-113 приводит к увеличению сорбции ApoAI на 210%. Также мы установили, что раствор чистого ApoAI, не связанный в комплексы с липидами, не теряет способности к сорбции на поверхности эмульсии. Из этого можно сделать вывод, что способностью к сорбции могут обладать только не вошедшие в состав HDL комплексов белки. Методом отмывки эмульсии водными растворами веществ, конкурентно замещающих сорбированные белки, мы установили, что сорбция ApoAI основывается на гидрофобном взаимодействии. Однако в настоящий момент остается неизученным, как происходит первичный контакт поверхности эмульсии с белком, гидрофобные группы которого в фосфатном буфере (исходя из наших исследований спектров триптофановой флуоресценции ApoAI) хорошо экранированы от воды (пик приходится на 339нм).

Для исследования структурных изменений в молекуле ApoAI в сорбированном состоянии мы исследовали спектры флуоресценции этого белка.

Однако мы выяснили, что в сорбированном состоянии флуоресценция ApoAI полностью потушена. Поскольку эмульсия является многокомпонентной системой, возник вопрос, (1) не является ли отдельные составляющие эмульсии тушителями флуоресценции белков, (2) не является ли светорассеяние на поверхности мелкодисперсных частиц или (3) присутствие растворенного в ПФУ кислорода причиной отсутствия флуоресценции белка. Мы выяснили, что: (1) проксанол не оказывает тушащего эффекта на свободный ApoAI, а также на раствор чистого триптофана, (2) светорассеяние на поверхности частиц эмульсии снижает сигнал флуоресценции на 30%, но не подавляет его полностью, (3) удаления кислорода не оказывает влияния на флуоресценцию сорбированного ApoAI. Исходя из этого, мы считаем, что при сорбции на эмульсии ApoAI входит в непосредственный контакт с поверхностью фторуглеродного ядра, что сопровождается значительными конформационными изменениями в молекуле белка.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

IN SILICO ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

КУНИТЦ-ТИПА КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ АКТИНИИ

HETERACTIS CRISPA С БОЛЕВЫМ ВАНИЛЛОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ

TRPV1 Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Зелепуга Е.А., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П.

Учреждение РАН Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159 E-mail: tabval@piboc.dvo.ru Методами молекулярной биологии установлены структуры 36 генов актинии Нeteractis crispa, кодирующих группу полипептидов, структурно гомологичных ингибиторам протеиназ семейства Кунитца, которые имеют точечные замены в аминокислотных последовательностях, что указывает на их принадлежность к мультигенному семейству. GS-полипептиды, представляющие собой комбинаторную библиотеку Н. crispa, имеют высокую степень гомологии с последовательностями известных представителей семейства Кунитца актиний.

С помощью расчетных методов получены пространственные структуры всех известных на сегодняшний день полипептидов комбинаторной библиотеки Н.

crispa. Анализ электростатических характеристик позволил разделить полипептиды на три группы. Одна из групп включает полипептиды APHC1, APHC2, APHC3, известные тем, что помимо трипсинингибирующей активности они обладают уникальным свойством ингибировать in vitro болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 и оказывать анальгетическое действие in vivo [1, 2]. Однако механизмы ингибирования рецептора и купирования боли до сих пор не установлены. Мы in silico исследовали взаимодействие полипептидов APHC1-3 с TRPV1 в его открытом и закрытом состоянии. Молекулярный докинг позволил установить пространственную структуру комплексов и характер связывания с рецептором: по-видимому, происходит увеличение времени релаксации рецептора за счет связывания молекулой полипептида двух его цепей. Это нарушает функционирование TRPV1, что объясняет неполное ингибирование передачи болевого сигнала, обнаруженное ранее [1]. Показано, что аминокислотные остатки Thr14, Tyr16, Phe17, Glu38 и Arg/His48 полипептидов участвуют во взаимодействии с TRPV1 рецептором.

Можно предположить, что остальные представители группы обладают аналогичной функциональной активностью по отношению к TRPV1.

Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-01179-а.

Литература

1. Y.A. Andreev, S.A. Kozlov, S.G. Koshelev, E.A. Ivanova, M.M. Monastyrnaya, E.P. Kozlovskaya, E.V. Grishin. J. Biol. Chem. (2008) 283(35), 23914-23921.

2. Я.А. Андреев, С.А. Козлов, А.Н. Мурашев, Д.И. Скобцов, И.А. Дьяченко, Е.В. Гришин.

Биоорг. химия (2009) 35(6), 789–798.

Стендовые доклады 333

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФОСФОПАНТЕТЕИН

АДЕНИЛИЛТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

В АПО-ФОРМЕ И В КОМПЛЕКСЕ С КОФЕРМЕНТОМ А

И С ДЕФОСФОКОФЕРМЕНТОМ А

Тимофеев В.И.1, Смирнова Е.А.1, Чупова Л.А.2, Есипов Р.С.2, Куранова И.П.1 Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: tostars@mail.ru

Фосфопантетеин аденилилтрансфераза Mycobacterium tuberculosis (РРАТ Mt) катализирует предпоследнюю реакцию пятистадийного синтеза коэнзима А (СоА) – образование дефосфокофермента А (ДФСоА). Конечный продукт синтеза – CoA является также природным конкурентным ингибитором PPAT Mt: при избытке СоА в клетке, он образует комплекс с РРАТ, ингибируя действие фермента. CoA необходим для жизнедеятельности туберкулезной бактерии, поэтому РРАТ Mt, регулирующая биосинтез СоА, является подходящей мишенью для синтеза антитуберкулезных лекарств. Данные о пространственной структуре РРАТ Mt и комплексов фермента важны как для понимания механизма функционирования фермента, так и для дизайна ингибиторов PPAT – потенциальных антитуберкулезных лекарств.

Рекомбинантный микобактериальный фермент получен в клетках E. сoli с использованием сконструированного бактериального штамма-продуцента и очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Кристаллы фермента выращены методом встречной диффузии в капиллярах в условиях невесомости в оборудовании японского космического агентства JAXA, в экспериментальном модуле Kibo [1]. От выращенных кристаллов на синхротроне SРring8 собраны дифракционные наборы до разрешения 1.6 (свободный РРАТ Mt) и 1.5 (комплексы РРАТ Mt/СоА, PPAT Mt/ДФСоА).

С использованием полученных наборов методом молекулярного замещения решены структуры PPAT Mt в апо-форме и в комплексах с лигандами. Структуры уточнены при разрешении 1.69, 1.59 и 1.59, Rf составили 0.1704, 0.1611 и 0.1627, Rfree – 0.2195, 0.2108 и 0.2115 соответственно для апо-формы, комплекса с СоА и комплекса с ДФСоА.

В полученных структурах определены места связывания лигандов, охарактеризовано их окружение, прослежены конформационные изменения, сопровождающие связывание лигандов.

Работа выполнена при финансовой поддержке ЦНИИМаш Роскосмоса.

Литература

1. Tanaka, H., Inaka, K., Sugiyama, S., Takahashi, S., Sano, S., Sato, M., Yoshitomi, S.

J. Synchrotron. Rad. (2004) 11, 45–48.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРИМЕНЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДНЫХ ПРОДУКТОВ

Федоткина О.С.1, Пурыгин П.П.1, Буряк А.К.2 Самарский государственный университет, 443011 Самара, ул. Ак. Павлова, 1 Учреждение РАН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина, 119991 Москва, Ленинский просп., 31, корп.4

E-mail: elektromodel@mail.ru

Ранее нами сообщалось, что в процессе изучения антибактериальных пептидов, индуцированных организмом Galleria mellonella в ответ на микробную инфекцию (E. сoli, Bacillus сereus) мы идентифицировали известные и новые пептиды. Исследование проводили физико-химическими (ВЭЖХ, МАЛДИ-МС/МС) и микробиологическими методами (тестирование антибактериальных свойств пептидов на культурах воздействующих бактерий). В результате дальнейшей работы изучены различные варианты иммунизирующего воздействия, включающие бактерии E.

coli или Bacillus сereus, их совокупность, а также 1.1-диметилгидразин и его производное с ацетоном. Пробоподготовку пептидных продуктов проводили, используя твердофазную экстракцию. Хроматографирование пептидных смесей осуществляли с помощью трех вариантов ВЭЖХ: обращенно-фазового, катионообменного и на пористом графитированном углероде. Полученные пептидные фракции масс-спектрометрически изучали в линейном режиме в случае МАЛДИ-МС и в режиме рефлектрона в случае МАЛДИ-МС/МС.

В результате проведенных исследований разработаны хроматографические режимы, позволяющие эффективно разделять исследуемые пептидные продукты на сорбентах: Zorbax Eclipse XDB-C18 и Zorbax SCX-300. C сорбента Hypercarb удалось осуществить элюирование только анионного пептида лебоцина. Среди всех детектированных пептидных продуктов идентифицированы двадцать известных антимикробных пептидов. Детектирован ряд новых пептидов с антибактериальными свойствами, и для некоторых из них, применяя алгоритмы секвенирования de novo, установлены предполагаемые аминокислотные последовательности. Показано, что введение 1.1-диметилгидразина и его производного также вызывает биосинтез антибактериальных пептидных продуктов, поскольку в излучаемых пептидных смесях обнаружены все известные для исследуемого организма антибактериальные пептиды, а также часть не описанных ранее и детектированных нами после иммунизации бактериями. Проведенные исследования показали эффективность и перспективность комплексного использования сочетания физико-химических методов и подходов к разделению и идентификации антибактериальных пептидных продуктов.

Стендовые доклады 335

КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИСПЛАТИНА С ДНК

В ПРИСУТСТВИИ БЕЛКА HMGB1

Феофилова М.С.1,2, Огарков М.А.2, Чихиржина Е.В.1, Поляничко А.М.1,2 Физический факультет СПбГУ, 198504 С.-Петербург, Старый Петергоф, ул. Ульяновская, 1 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4

E-mail: maria.feofilova@gmail.com

Белок HMGB1 – один из наиболее распространённых негистоновых белков хроматина. HMGB1 принадлежит к семейству белков, содержащих структурно-функциональный домен – HMGВ-домен. Отличительной особенностью HMGВ-белков является их способность избирательно связываться с неканоническими структурами ДНК, такими, как хиазма Холлидея и аддукты, образованные различными противоопухолевыми препаратами.

Препараты на основе координационных соединений платины являются одними из самых успешных и широко используемых в настоящее время противоопухолевых средств. Один из самых эффективных препаратов этой группы – цисплатин (цис-диаминдихлорплатина(II) или цис-ДДП). Его действие основано на связывании с ДНК с образованием внутри- и межнитевых сшивок (аддуктов). Существует предположение, что транспорт данного соединения в клетке может быть связан со способностью препарата взаимодействовать с серосодержащими аминокислотными остатками белковых молекул. Одним из наиболее перспективных кандидатов для образования промежуточных комплексов ДДП-белок является негистоновый белок хроматина HMGB1.

Наши исследования посвящены изучению кинетических аспектов взаимодействия белка HMGB1 с ДДП и аддуктами ДДП на ДНК. Используя УФ-спектроскопию, электрофорез, кинетический и термодинамический подходы, мы исследовали взаимодействия ДНК-ДДП и HMGB1-ДДП. Используя хемометрический подход к анализу кинетических данных, нами были определены главные константы скоростей основных протекающих реакций.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 09-08и Правительства Санкт-Петербурга. Часть работ проводилась в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АСИММЕТРИЯ ГИДРОФОБНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ –

ОСОБЕННОСТЬ -МЛЕКОТОКСИНОВ СКОРПИОНОВ

Чугунов А.О.1, Коромыслова А.Д.2, Василевский А.А.1, Полянский А.А.1, Гришин Е.В.1, Ефремов Р.Г.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: batch2k@yandex.ru

Потенциал-чувствительные натриевые каналы (ПЧНК) играют важнейшую роль в проведении нервного импульса и являются мишенью множества нейротоксинов.

Полипептидные -токсины из яда скорпионов, замедляющие инактивацию ПЧНК и продлевающие потенциал действия, различаются селективностью: «классические» -токсины («млекотоксины») преимущественно действуют на млекопитающих, инсектотоксины – на насекомых, а «-подобные» токсины – на оба класса животных. Поиск особенностей -токсинов, определяющих эту селективность, не только важен для фундаментальной нейробиологии, но и открывает путь к созданию новых безопасных инсектицидов.

-Токсины скорпионов образованы двумя «доменами»: консервативной «сердцевиной», включающей -мотив, и так называемым RC-доменом, состоящим из скрепленных дисульфидной связью N-концевой петли и C-конца. Вариабельный RC-домен предположительно отвечает за селективность взаимодействия токсинов с разными ПЧНК. В этой работе мы изучали гидрофобную организацию и конформационную подвижность -токсинов скорпионов при помощи методов молекулярной динамики и расчета молекулярного гидрофобного потенциала. Для «млекотоксинов» была обнаружена асимметрия: RC-домен у них существенно гидрофильнее, нежели консервативная «сердцевина». Уровень гидрофобной «асимметрии» сохраняется в филогенетической группе «млекотоксинов» и коррелирует с высокой токсичностью этих соединений по отношению к млекопитающим. Для двух других групп токсинов такого различия между «доменами» не наблюдалось. Кроме того, у «млекотоксинов» RC-домен конформационно пластичнее в сравнении с другими группами -токсинов. Эти особенности молекулярной организации помогут выявить основы селективности действия -токсинов скорпионов и лягут в основу дизайна их биоинженерных аналогов, селективно связывающихся с разными ПЧНК.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК № П818).

Стендовые доклады 337

–  –  –

Биологическая активность.

Методы тестирования V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

БЕЛОК ЯДРЫШКА ФИБРИЛЛАРИН

КАК МАРКЕР ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Барыкина Н.В., Зацепина О.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: oleeinar006@rambler.ru Известно, что окислительные повреждения различных клеточных структур играют большую роль в развитии некоторых нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, в последнее время растет количество данных в пользу активного участия ядрышка и его белковых компонентов в осуществлении клеточной реакции на разнообразные виды стрессов, включая вирусную инфекцию, тепловой шок и гипоксию [1]. Специфический белок ядрышка фибрилларин – это ядрышковая метилтрансфераза, необходимая для метилирования 28S, 5.8S и 18S рРНК, которая, исходя из первичной структуры, может являться специфической мишенью окислительного стресса в клетках человека.

Цель настоящей работы – изучение реакции белка ядрышка фибрилларина на окислительный стресс, индуцированный 1–100 мМ перексида водорода (Н2О2) в клетках культуры НеLa. Исследования с использованием методов клеточной и молекулярной биологии показали, что изменения в состоянии фибрилларина, такие как электрофоретическая подвижность белка на иммуноблотах и динамические свойства белка (доля мобильной фракции и время полувосстановления фибрилларина-EGFP) в живых клетках, изученные методом FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), проявляются уже через 1–15 мин после начала обработки клеток пероксидом водорода. Через два часа после воздействия выявляются отчетливые изменения в локализации белка, проявляющиеся в его миграции из ядрышковых фокусов в нуклеоплазму. Эти изменения сопровождаются дополнительным замедлением электрофоретической подвижности фибрилларина, что может свидетельствовать о его фосфорилировании в условиях окислительного стресса. Аналогичные изменения в расположении фибрилларина при других стрессовых воздействий на клетки HeLa в литературе на сегодняшний день не описаны.

Таким образом, наши наблюдения впервые показали, что фибрилларин специфичным образом реагирует на действие пероксида водорода и может являться мишенью окислительного стресса в клетках HeLa.

Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 08-04-00854).

Литература

1. Severine Boulon, Belinda J. Westman, Saskia Hutten, Francois-Michel Boisvert, and Angus I.

Lamond. «The Nucleolus under Stress», Molecular Cell, 40.

Стендовые доклады 339 ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТА АВП(6-9) И АНАЛОГА АВП(6-9) – Ac-D-SPRG –

НА ОБУЧЕНИЕ С ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ И ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ

ПОДКРЕПЛЕНИЕМ

Белякова А.С., Угрина А.П., Воскресенская О.Г., Каменский А.А.

МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 E-mail: alixletter@yandex.ru Целью нашего исследования являлось изучение влияния фрагмента аргинин-вазопрессина АВП(6-9) и оригинального структурного аналога АВП(6-9) – Ac-DSPRG – на выработку условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя (УРАИ) и выработку условной пищедобывательной реакции на место. Работа проводилась на половозрелых самцах нелинейных белых крыс массой 220– 250 г. Препараты вводили интраназально в объеме 1 мкл/10 г массы тела в дозах 10.0, 1.0, 0.1 и 0.01 мкг/кг за 30 минут до начала тестирования. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды.

Обучение животных в сложном пищевом лабиринте показало, что введение АВП(6-9) приводило к ускорению выработки условной реакции на место. Время реакции достоверно уменьшалось по сравнению с контрольной группой. Наиболее эффективной была доза 10 мкг/кг. Выработанный навык сохранялся во всех группах. Выработка УРАИ показала, что число выполненных реакций в опытной группе достоверно выше, чем в контрольной уже на первый день опыта. Однако к четвертому дню количество выполненных реакций значимо превышало контрольные показатели только в группе животных, получавших пептид в дозе 0,1 мкг/кг.

Навык сохранялся во всех опытных группах.

Ac-D-SPRG в указанных дозах не оказывал значительного влияния на выработку условной пищедобывательной реакции на место. При выработке УРАИ введение Ac-D-SPRG в первый день опыта приводило к достоверному увеличению количества выполненных реакций у животных, получавших препарат в больших дозах (1 и 10 мкг/кг). Во второй день обучения количество выполненных реакций значимо возрастало во всех опытных группах, на третий день – у животных, которым вводили Ac-D-SPRG в дозах 1 и 10 мкг/кг, на четвертый день – 10 мкг/кг. Навык сохранялся во всех группах.

Работа выполнена в рамках соглашения о научно-техническом сотрудничестве между ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси» и кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и при поддержке ФЦП «Научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК №П1057).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПРОЛИЛ-ГЛИЦИЛ-ПРОЛИНА (PGP) НА РАЗВИТИЕ

ПАТОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВЕЩЕСТВОМ 48/80

Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Гусева А.А.

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 E-mail: n.s.bondarenko@gmail.com Ранее показано, что регуляторные пептиды семейства глипролинов, в частности, пептид PGP, обладают противовоспалительным действием, сопровождающимся снижением секреторной активности тучных клеток (ТК). Мы предположили, что стабилизирующее действие пептида на ТК может быть одним из механизмов его противовоспалительного действия. В опытах in vitro было показано, что PGP препятствует активирующему действию на ТК эндогенного активатора – фрагмента АКТГ1-24 – синактена. Однако при активации ТК неселективным экзогенным активатором – веществом 48/80 – стабилизирующий эффект отсутствовал. В то же время in vivo PGP облегчал течение и снижал смертность мышей при анафилактоидной реакции, вызванной введением вещества 48/80 (внутрибрюшинно, 8 мг/кг), а также предотвращал и уменьшал нарушения сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс (вещество 48/80 внутримышечно, 1 мг/кг). В экспериментах на модели локального воспалительного отёка лапы крыс, вызванного подкожным введением гистамина (0,2 мг в объёме 0,1 мл), каолина (0,1 мл 10% раствора) или вещества 48/80 (0, 05 мг в объёме 0,1 мл) мы сравнивали действие пептида с известным нестероидным противовоспалительным препаратом диклофенаком (1 мг/кг). Оказалось, что оба вещества в равной степени достоверно уменьшали отёк, вызванный гистамином или каолином, но значительно меньше изменяли величину отёка, вызванного веществом 48/80. Это наводит на мысль о сходстве механизмов противовоспалительного действия PGP и диклофенака. Однако этот вопрос требует дальнейших исследований.

Возможность пептидной коррекции нарушений, вызванных веществом 48/80, может свидетельствовать о наличии в защитных свойствах пептида механизмов, не связанных со стабилизацией тучных клеток.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-04-00669-а).

Стендовые доклады 341

ДЕЙСТВИЕ НОВЫХ АНАЛОГОВ НОЦИЦЕПТИНА

НА ДВИГАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ БЕЛЫХ КРЫС

Иванова Е.А.1, Сарычева Н.Ю.1, Дубынин В.А.1, Каменский А.А.1, Андреева Л.А.2, Мясоедов Н.Ф.2 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/12 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: katya.kilgor@gmail.com

Ноцицептины – относительно недавно обнаруженное семейство пептидов, родственных опиоидам, лиганды рецептора ORL1. Они участвуют в регуляции многих физиологических процессов, в том числе разных видов поведения; в ряде случаев механизмы действия ноцицептинов рассматриваются как антиопиоидные. При однократном введении i.c.v. природный ноцицептин NC(1-17) снижает двигательную активность у мышей и крыс. Ранее нами было изучено влияние амида NC(1FGGF-NH2, на поведение крыс. Было установлено, что этот пептид, как и NC(1-17), влияет на двигательную активность и уровень тревожности (направленность изменений зависит от многих факторов, в частности, от пола и возраста животных).

В представленной работе были исследованы новые устойчивые к пептидазам аналоги ноцицептина FGGFPGP и FGGFVGP. Пептиды вводили взрослым самцам белых беспородных крыс (1 мг/кг, в/б). Поведение животных исследовали в тестах «открытое поле» и «О-лабиринт» (модификация «приподнятого крестообразного лабиринта»). У крыс, которым был инъецирован пептид FGGFVGP, достоверно уменьшился пробег в «открытом поле». В «О-лабиринте» у животных этой же группы было значимо меньше выходов на открытые участки лабиринта, чем у контрольных. У крыс, получивших FGGFPGP, существенных изменений поведения не обнаружено. Таким образом, показано, что FGGFVGP, но не FGGFPGP, способен подавлять локомоторную активность экспериментальных животных. Уменьшение числа выходов на открытые участки «О-лабиринта» с учётом результатов «открытого поля» объясняется скорее снижением подвижности, чем изменением уровня тревожности. Отсутствие эффектов от введения FGGFPGP связано, очевидно, с тем, что первичная структура этого пептида затрудняет его присоединение к рецептору ORL1. В то же время более гибкая молекула FGGFVGP способна взаимодействовать с данным рецептором, запуская изменения поведения, схожие с эффектами природного лиганда. В дальнейшем планируется исследовать возможность использования пептидов этой группы для ослабления гиперактивности животных при некоторых типах нейропатологии и наркотической зависимости.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 ИНГИБИРУЕТ ИНДУЦИРОВАННУЮ LPS

ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ NK-КЛЕТКАМИ ЧЕЛОВЕКА

Каневский Л.М., Коваленко Е.И.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: lmkanevski@rambler.ru К настоящему времени было обнаружено, что экзогенный белок теплового шока 70 кДа (Hsp70) оказывает активирующее действие на натуральные киллеры (NKклетки) человека. Однако не исключено, что стимулирующий эффект Hsp70 может быть вызван примесью бактериальных липополисахаридов (LPS), содержащихся в препаратах рекомбинантного белка. Целью данной работы было оценить действие LPS и Hsp70, очищенного от LPS, на продукцию цитокинов NK-клетками человека.

NK-клетки выделяли из фракции мононуклеаров периферической крови здоровых доноров путём магнитной сепарации. Фенотип клеток определяли методом проточной цитометрии; уровень продукции IFN- и TNF- оценивали методом иммуноферментного анализа. В опытах использовали рекомбинантный человеческий Hsp70. LAL-тест показал, что такой белок содержит высокий уровень примесей LPS, порядка 25000 ед./мг белка. Hsp70 был очищен от LPS с помощью колонки с полимиксином В; содержание LPS в очищенном белке было около 30 ед./мг.

NK-клетки инкубировали с Hsp70, Hsp70low lps (5 мкг/мл) и LPS из E.coli (1 мкг/мл) в течение 18 ч в присутствии IL-2, после чего проводили анализ цитокинов в супернатантах.

Чистота популяции NK-клеток (CD3-CD56+-лимфоцитов) составляла не менее 97%. Как неочищенный Hsp70, так и LPS заметно стимулировали продукцию цитокинов (эффект составлял 30–90% по сравнению с клетками, стимулированными только IL-2), в то же время Hsp70low lps не проявлял стимулирующего действия.

Более того, при инкубации NK-клеток одновременно с Hsp70low lps и LPS наблюдалось снижение продукции цитокинов по сравнению с действием только LPS.

Таким образом, было показано, что активирующее действие экзогенного Hsp70 на NK-клетки зависит от присутствия примесей бактериальных липополисахаридов.

Рецептор LPS – TLR4 – практически отсутствовал (0,1–0,3% TLR4+ клеток) на поверхности NK-клеток. Возможно, Hsp70 способен связывать и тем самым инактивировать LPS. Полученные данные позволяют говорить об антисептическом действии Hsp70.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», проект № 16.740.11.0200.

Стендовые доклады 343

КОРРЕКЦИЯ «ТИМОГЕНОМ®» ИЗМЕНЕНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ

В КРОВИ КРЫС ВОЗДЕЙСТВИЕМ АНТИОРТОСТАТИЧЕСКОЙ

ГИПОКИНЕЗИИ И НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ -ОБЛУЧЕНИЕМ

Лузянина А.А.1, Шевченко А.С.1, Изместьева О.С.1, Семин Ю.А.1, Жаворонков Л.П.1, Дейгин В.И.

Федеральное государственное бюджетное учреждение МРНЦ Минздравсоцразвития РФ, 249036 Обнинск, Московская обл., ул. Королёва, 4 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: a.luzyanina@mail.ru

При исследовании последствий пролонгированного воздействия на крыс низкоинтенсивного -облучения (мощность дозы 5 мкГр/мин, суммарная поглощенная доза 4,8 мГр) и антиортостатической гипокинезии (АНОГ) показано, что каждый из этих факторов вызывает развитие у животных стрессорных реакций, о чем свидетельствует, в частности, изменения в антиоксидантной системе (АОС) и системе красной крови. Для лекарственной коррекции нарушений, вызываемых совместным воздействием на крыс АНОГ и -облучения, был применен фармакопейный иммуномодулятор «Тимоген®», созданный на основе синтетического дипептида Glu-Trp. Препарат вводили облученным животным, находящимся в состоянии гипокинезии, внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг в 0,25 мл физиологического раствора четырехкратно с интервалом в сутки, сразу после последнего сеанса облучения. Анализ состояния крови с помощью метода кислотных эритрограмм, подсчета количества ретикулоцитов и определения активности ферментов АОС проводили до начала воздействия, после окончания облучения до введения «Тимогена®», а затем через 1, 6 и 15 суток после последней инъекции иммуномодулятора. Анализ эритрограмм показал, что через 6 суток после последнего введения «Тимогена®» происходит резкое омоложение состава эритроцитов, при этом в крови отсутствуют функционально незрелые, аномально стойкие эритроциты. Количество ретикулоцитов в крови животных, получавших «Тимогена®» статистически значимо возрастает по сравнению с группой контроля в два раза, что также свидетельствует об активации кроветворения. По-видимому, как следствие омоложения состава эритроцитов в периферической крови, на 6 сутки возрастает активность супероксиддисмутазы, которая нормализуется концу срока наблюдения на 15 сутки. Таким образом, помимо «Тимогена®» и, возможно, другие пептидные иммуномодуляторы могут быть использованы для коррекции нарушений, вызываемых в организме животных совместным действием АНОГ и пролонгированным -облучением с малой мощностью дозы.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА КИОТОРФИНА

НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ У МЫШЕЙ

Мартынов А.А.1, Попова С.C.1, Шумилов А.С.2, Захарова Н.М.2 Филиал МГУ им. М.В. Ломоносова, Пущино, Московская обл.

Учреждение РАН Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3

E-mail: Aleksey.Martynov@mail.ru

Пептид киоторфин (КТ) был исходно выделен из тканей головного мозга быка (Takagi et al., 1979) и позднее обнаружен в мозге других млекопитающих. В дальнейшем, было показано, что КТ обладает не только анальгетическим эффектом, но также оказывает влияние на температуру тела и, возможно, является ингибитором сердечной деятельности и дыхания в процессе гибернации (Емельянова и др., 1992, Игнатьев и др., 2009). Представления о механизмах действия КТ на настоящий момент являются не однозначными (Закуцкий и др., 2008). Предполагается, в частности, что тормозящее влияние КТ на ЦНС реализуется через серотонинергическую (5-НТ) систему мозга (Kolaeva et al., 2000).

Целью настоящей работы является исследование влияния КТ на фоне активации 5-HT-системы мозга линейных мышей (BALB/c) на жизненные показатели:

частоту дыхания (ЧД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и насыщение кислородом крови в процентах функционального артериального гемоглобина. Измерения сделаны с помощью системы MouseOx (Starr Life Science, USA), которая позволяет проводить неинвазивную регистрацию в режиме реального времени. КT («Sigma», 50 мкг/кг), прекурсор серотонина – 5-гидрокситрептофан (5-ГТ) («Fluka», 2 мг/кг) и дистиллят (контроль) вводили интраназально. Предварительно, с помощью фальш – зажимов все мыши адаптировались к сенсорному датчику, помещаемому для регистрации показателей на воротниковую зону. В результате проведенных экспериментов выявлено, что введение КТ через 10 минут после предварительной инъекции 5-ГТ вызывает достоверное устойчивое понижение содержания кислорода в крови мышей (на 2%) и подавляет ЧСС на 12%. Изменение частоты дыхания не наблюдается. КТ, 5-ГТ или дистиллят сами по себе не вызывают достоверных изменений данных показателей.

Таким образом, можно предположить, что эффекты КТ в наших экспериментах опосредованы взаимодействием с 5-НТ-системой мозга.

Стендовые доклады 345

ВЛИЯНИЕ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

НА АКТИВНОСТЬ РЕЦЕПТОРНЫХ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ У КРЫС

С НЕОНАТАЛЬНЫМ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВЫМ ДИАБЕТОМ

Мойсеюк И.В., Шпаков А.О., Деркач К.В., Чистякова О.В., Бондарева В.М.

Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. М. Тореза, 44 E-mail: sun787@mail.ru В условиях сахарного диабета (СД) и его осложнений меняется функциональная активность гормональных сигнальных систем и их чувствительность к регуляторному действию гормонов. Нами изучена регуляция натрийуретическими пептидами ANP и CNP активности рецепторных форм гуанилатциклазы (рГЦ) в тканях самок крыс с неонатальным стрептозотоциновым СД 2-го типа продолжительностью 240 дней и влияние на нее интраназального введения инсулина и серотонина (6 недель, суточная доза 0.48 IU инсулина или 20 мкг серотонина на крысу). У диабетических крыс наблюдалось повышение базальной активности рГЦ в миокарде и ее снижение в матке и яичниках, в то время как в мозге заметных отличий от контроля выявлено не было. Введение диабетическим крысам инсулина снижало базальную активность рГЦ в миокарде и восстанавливало ее до нормального уровня в яичниках. Введение серотонина вызывало менее выраженное в сравнении с инсулином снижение базальной активности рГЦ в миокарде и незначительно повышало ее в мозге. Натрийуретические пептиды стимулировали базальную активность ГЦ во фракциях плазматических мембран тканей крыс, причем ANP был наиболее эффективен в миокарде (10-6 M ANP, +106%), CNP – в яичниках и матке (10-6 M CNP, +89 и +73%). В миокарде диабетических крыс ослаблялся стимулирующий ГЦ эффект ANP и, напротив, усиливался эффект CNP, в яичниках отчетливо снижался стимулирующий ГЦ эффект CNP и, в меньшей степени, соответствующий эффект ANP. В матке и мозге диабетических крыс чувствительность рГЦ к гормонам практически не менялась. Введение инсулина диабетическим крысам вызывало повышение эффекта ANP в миокарде до его значений в контроле и снижало эффект CNP, а также частично восстанавливало эффект CNP в яичниках. Введение серотонина вызывало некоторое усиление эффектов ANP и CNP в мозге контрольных и диабетических крыс. Таким образом, в условиях СД 2-го типа в миокарде и тканях репродуктивной системы крыс меняется функционирование рГЦ, чувствительной к натрийуретическим пептидам, причем интраназальное введение инсулина в значительной степени восстанавливает активность рГЦ.

Работа поддержана Программой «Фундаментальные науки – медицине» (2009– 2011 гг.).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АКТИВИЗАЦИЯ СИНТЕЗА ГЛИАЛЬНОГО ФИБРИЛЛЯРНОГО

КИСЛОГО БЕЛКА В АСТРОЦИТАХ СЕТЧАТКИ ПРИ РАЗВИТИИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ У КРЫС

Недорубов А.А.1, Недзвецкий В.С.2, Шрам С.И.1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара, Днепропетровск, Украина

E-mail: scienceAN@rambler.ru

Диабетическая ретинопатия – одно из осложнений сахарного диабета, характеризующееся поражением сосудов сетчатки, а также дегенеративными изменениями в нейрональных слоях сетчатки. Ключевую роль в генезе ретинопатии играют астроциты. В модели сахарного диабета исследовали влияние хронической гипергликемии на морфологические показатели и состояние промежуточных филаментов, характеризующие уровень астроглиоза в сетчатке.

Эксперименты проводились на самцах крыс Вистар весом 220–250 г. Хроническую гипергликемию вызывали однократным внутрибрюшинным введением животным стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг. Уровень сахара в крови крыс с гипергликемией составлял 26,0±3,4 ммоль/л, а в контрольной группе – 7,8±0,5 ммоль/л. Через 12 недель после введения стрептозотоцина содержание гликозилированного гемоглобина у крыс с гипергликемией достигало 10,2±0,7%, тогда как в контрольной группе – 4,8±0,4%. Гистологический анализ и окрашивание срезов методом TUNEL выявили значительные изменения нейродегенеративного характера в сетчатке крыс, подвергшихся 12-недельной гипергликемии. Иммуногистохимическое окрашивание сетчатки на маркер астроглии, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), выявило значительное увеличение плотности и размеров астроцитов у крыс с гипергликемией по сравнению с контрольными животными. Количественная оценка растворимой и нерастворимой форм GFAP в сетчатке методом иммуноблоттинга показала, что содержание этих форм белка у крыс с гипергликемией было примерно в 3 раза выше, чем у контрольных животных. Более того, у крыс с длительной гипергликемией наблюдали значительное возрастание низкомолекулярных фрагментов GFAP (49кДа), что свидетельствует об активной перестройке цитоскелета и развитии астроглиоза.

Полученные результаты подтверждают наличие значительных цитологических изменений в астроглии при хронической гипергликемии, и указывают на необходимость проведения более подробного изучения функции астроцитов в процессах нейродегенерации и репарации сетчатки при диабетической ретинопатии.

Стендовые доклады 347

РОЛЬ АНТИТЕЛ К ДЕСМОГЛЕИНАМ И ДЕСМОКОЛЛИНАМ

В АКАНТОЛИЗЕ ПРИ ПУЗЫРЧАТКЕ

Прохоров А.В., Свирщевская Е.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: sashapro2006@yandex.ru Белки кадгеринового семейства десмоглеины (ДСГ) 1-4 и десмоколлины (ДСК) 1формируют межклеточный контакт десмосомальных бляшек многослойного эпителия кожи и слизистых оболочек. В эпидермисе кожи десмосомы формируются преимущественно ДСГ1, 3 и ДСК1, 3. Появление в сыворотке крови больных антител к ДСГ1 и 3 приводит к развитию аутоиммунной патологии – пузырчатки, которая клинически проявляется в формировании внутриэпидермального расслоения – акантолиза. Целью данной работы был анализ роли антител к ДСГ и ДСК, а также типирование потенциальных патогенных эпитопов ДСГ3.

Для анализа кожу здорового донора помещали в лунки планшета и добавляли:

смесь моноклональных антител к ДСГ1-4; к ДСК1-3; IgG от больных пузырчаткой; IgG здоровых доноров; антисыворотки кроликов, иммунизированных ДСГ3 пептидами: 25-37, 78-90, 89-98, 54-73 и 148-158, а также сыворотку здорового кролика. Эксплантаты кожи инкубировали 24 ч, после чего фиксировали параформальдегидом и заливали парафином. Парафиновые срезы окрашивали геманоксилин-эозином.

IgG больных, но не здоровых, доноров вызывали полное отслоение эпидермиса от базальной мембраны. Аналогичное действие оказывали пулы антител к ДСГ и ДСК. Для анализа патогенности пептиды выбирали из функционально значимых участков молекулы ДСГ3, принимающих участие в транс- и цис-взаимодействии.

Кроликов иммунизировали пептидами в ПАФ. Продукцию антител оценивали с помощью ИФА и конфокальной микроскопии. Только антисыворотка против пептида 25-37 вызывала выраженный акантолиз.

Впервые показано, что антитела к ДСК могут вызывать акантолиз кожи. Среди потенциальных эпитопов ДСГ3 наиболее патогенным явился пептид 25-37, принимающий участие в транс-взаимодействии ДСГ3 соседних клеток. Таким образом, при добавлении в культуру антител к любым десмосомальным кадгеринам наблюдается акантолиз, что свидетельствует о нарушении структуры десмосом.

Следовательно, формирование антител к ДСГ3 при пузырчатке является следствием генетической предрасположенности, а не преимущественной патогенности антител к ДСГ3 и 1.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (Госконтракт № 14.740.11.0454) и Регионального общественного Фонда содействия отечественной науке.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ PRO-GLY-PRO И ACETYL-PRO-GLY-PRO

НА ТРАНСКРИПЦИЮ ЦИТОКИНОВ ПРИ ЭТАНОЛОВОМ

И СТРЕССОРНОМ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ЖЕЛУДКА У КРЫС

Сангаджиева А.Д.,1 Бакаева З.В.,1 Самонина Г.Е.,1 Мезенцева М.В.2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва

E-mail: sanganna@mail.ru

Целью данной работы является изучение влияния глипролинов – Pro-Gly-Pro (PGP) и acetyl-Pro-Gly-Pro (acPGP) – на экспрессию генов ряда цитокинов при этаноловом и стрессорном язвообразовании.

Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс (этаноловая модель) и самцах крыс линии Wistar (стрессорная модель). Животным опытных групп за час до проведения эксперимента интраназально вводили PGP или acPGP в дозе 3,7 мкм/кг в объеме 10 мкл/200 г, контрольной группе – физиологический раствор в том же объеме. Этаноловые повреждения слизистой оболочки желудка (СОЖ) вызывали внутрижелудочным введением 96о-го этанола (1 мл/200 г веса).

Стресс вызывали 30 -минутным плаванием в «холодной воде» при температуре 21оС. Площадь язвенных повреждений СОЖ (мм2) рассчитывали с помощью бинокулярной лупы с окуляр-микрометром. Статистическую обработку результатов рассчитывали по критериям Стьюдента и Манна-Уитни. Для определения активности мРНК 11 цитокинов в мононуклеарах периферической крови использовали методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

Этанол и стресс вызывали повреждения СОЖ, площадь которых в среднем составила 144,46 мм2 и 0,88 мм2, соответственно. Противоязвенный эффект (ПЭ) PGP на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования был равен 52% и 76%, соответственно. АcPGP не проявил противоязвенного действия. Введение этанола сопровождалось угнетением транскрипции интерлейкина (ИЛ)-12. Нами показаны некоторые механизмы действия пептидов при язвообразовании. На фоне PGP и acPGP этаноловые повреждения сопровождались достоверным понижением уровня транскрипции ИЛ-12. Также наблюдались следующие тенденции: угнетение транскрипции ИФН- у животных, получавших PGP, активация транскрипции интерферона (ИФН)- – при AcPGP. Стресс вызывал у крыс активацию экспрессии гена противовоспалительного цитокина ИЛ-4 (p0,05) и гена ИЛ-12, а также угнетение экспрессии генов ИЛ-1, ИЛ-18. PGP активировал транскрипцию ИЛ-4 и угнетал экспрессию ИЛ-6. AcPGP подавлял экспрессию гена ИЛ-1.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-04-00669-а).

Стендовые доклады 349

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА

70 кДа НА МОДЕЛИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОГО СЕПСИСА У КРЫС

Сапронова А.А., Остров В.Ф., Мурашев А.Н.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

Сепсис – инфекционная болезнь, обусловленная различными возбудителями, которая развивается у лиц с резко сниженными защитными силами организма. Сепсис может быть вызван различными микроорганизмами преимущественно бактериальной природы. В случае грамположительных бактерий ведущим звеном патогенеза являются молекулы тейхоевых и липотейхоевых кислот, которые являются структурными компонентами бактериальной клеточной стенки. Липотейхоевая кислота (ЛТК) является суперантигеном и способна стимулировать иммунный ответ организма. Также она связывается с TLR-рецепторами (Toll_like receptor) на поверхности моноцитов и нейтрофилов и стимулирует выброс в кровоток провоспалительных цитокинов. Один из возможных путей борьбы с септическими патологиями – блокирование бактериальных молекул агрессии. Таким средством могут являться белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, которые могут конкурировать с ЛТК за TLR-рецепторы на клетках-мишенях. Внутриклеточные БТШ70 являются универсальной защитой клетки от стрессовых воздействий. Однако, при выходе во внеклеточное пространство экзогенные БТШ70 способны стимулировать неспецифический иммунный ответ.

Целью данной работы явилось изучение протекторного действия БТШ70 на организм животных при моделировании у них грамположительного сепсиса.

Предварительное введение БТШ70 оказывает выраженное защитное действие и уменьшает токсические эффекты ЛТК. Выживаемость животных увеличивается с 50% в группе с ЛТК до 90% в группе, животные в которой предварительно получали БТШ70. Введение БТШ70 за 10 минут до ЛТК предотвращает паление артериального давления, депрессию гемокоагуляции и нарушения в фибринолитической системе. Введение БТШ70 здоровым животным не оказывает влияния на изучаемые параметры крови.

Таким образом, можно сказать, что БТШ70 является перспективным антисептическим средством и может быть рекомендован для дальнейшего изучения.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ АНАЛОГА АВП(6-9) – Ac-L-MPRG – НА ДЕПРЕССИВНЫЕ

СОСТАВЛЯЮЩИЕ ПОВЕДЕНИЯ БЕЛЫХ КРЫС

Синюшин А.А., Белякова А.С., Воскресенская О.Г., Каменский А.А.

МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 E-mail: alixletter@yandex.ru Ноотропное действие аргинин-вазопрессина (АВП) было продемонстрировано в различных поведенческих тестах на животных разных видов и в настоящее время не вызывает сомнения. Под действием пептидаз АВП распадается в организме на несколько линейных фрагментов, включающих с 4-го по 9-ый аминокислотные остатки. На основании конформационного анализа был синтезирован тетрапептид N-Ac-L-Met-Pro-Arg-Gly-NH2 (Ac-L-MPRG). Нами исследовалось влияние острого введения Ac-L-MPRG на ориентировочно-исследовательское поведение, уровень тревожности и степень депрессивности белых крыс. Препарат вводили интраназально в объеме 1 мкл/10 г массы тела за 5 мин до тестирования в дозе 10,0 мкг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя.

Аc-L-MPRG не оказывал влияния на ориентировочно-исследовательское поведение и уровень тревожности животных, однако обладал выраженным антидепрессантным действием. В тесте «принудительное плавание» введение Аc-LMPRG оказало влияние практически на все исследуемые показатели. Было зарегистрировано достоверное увеличение как продолжительности первого периода активного плавания, так и суммарного времени активного плавания; увеличение суммарного времени и средней продолжительности периода пассивного плавания;

суммарное время иммобилизации и количество ее периодов снижалось.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что замена аминокислотного остатка Cys6 в молекуле АВП(6-9) на L-Met привела к потере влияния пептида на ориентировочно-исследовательское поведение и уровень тревожности животных, однако этот тетрапептид обладал выраженным антидепрессантным действием.

Работа выполнена в рамках соглашения о научно-техническом сотрудничестве между ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси» и кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и при поддержке ФЦП «Научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (ГК №П1057).

Стендовые доклады 351

ИНТРАНАЗАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ ИНСУЛИНА

ВОССТАНАВЛИВАЕТ ДОЛГОВРЕМЕННУЮ ПАМЯТЬ

У КРЫС С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-го ТИПА

Сухов И.Б., Чистякова О.В., Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Шпаков А.О.

Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. Тореза, 44 E-mail: suhov_ivan88@mail.ru Инсулин регулирует метаболические и ростовые процессы не только в периферических тканях, но и в ЦНС. Нарушения в инсулиновой сигнальной системе, возникающие при сахарном диабете 2-го типа (СД2), для которого характерна резистентность тканей к инсулину, вызывают нейродегенеративные процессы в ЦНС, что является причиной развития когнитивного дефицита. Цель работы состояла в изучении влияния интраназально введенного инсулина на формирование и сохранение пространственной памяти у крыс с неонатальной моделью СД2. Для изучения когнитивных функций был использован водный тест Морриса, который позволяет быстро провести обучение животных, оценить формирование и консолидацию у них пространственной памяти. Интраназальное введение инсулина (ежедневно, 0.48 IU на крысу) начинали за неделю до обучения и продолжали в процессе тестирования. Для проверки формирования пространственной памяти тест повторяли ежедневно на протяжении 5 дней (1-ая серия) и через месяц оценивали консолидацию пространственной памяти (2-ая серия). Диабетические животные в 1-ой серии затрачивали на поиск платформы в два раза больше времени, чем контрольные крысы. Во 2-ой серии и латентный период и динамика снижения его продолжительности у диабетических крыс были в 3–4 раза ниже, чем в контроле.

Эти данные указывают на ухудшение показателей пространственной памяти у крыс с СД2. Интраназальное введение инсулина диабетическим крысам в три раза сокращало латентный период в обеих сериях экспериментов. Это свидетельствует о том, что интраназальное введение инсулина улучшает показатели долговременной пространственной памяти у диабетических крыс, приближая их к таковым у здоровых животных. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что крысы с неонатальным СД2 могут быть использованы в качестве перспективной модели для изучения процессов формирования памяти в условиях толерантности к глюкозе, а методически доступный интраназальный способ введения инсулина может быть применен для исследования роли этого гормона и других полипептидных гормонов в функционировании ЦНС.

Работа поддержана Программой «Фундаментальные науки – медицине» (2009– 2011 гг.) и РФФИ (проект № 09-04-00746).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ ФЕРМЕНТОВ

Тихоненко С.А.1, Шабарчина Л.И.1, Сабурова Е.А.1, Аполонник Н.В.2 Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3

E-mail: tsa83@rambler.ru

Изучение взаимодействия ферментов с полиэлектролитами имеет огромное прикладное значение для биотехнологии, медицины, так и фундаментальное значение для понимания механизмов внутриклеточной регуляции, биологических феноменов выживания организмов и происхождения некоторых патологических явлений в высших организмах.

Целью настоящей работы было исследовать влияние полиэлектролитов, различных по знаку заряда и структуре мономера на каталитические и структурные свойства уреазы и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) для выявления параметров ферментов, определяющих их способность к комплексообразованию со структурными компонентами клеток, а также для выявления условий сохранения их функций в этих комплексах.

Показано, что из четырех исследованных нами полиэлектролитов – двух отрицательно заряженных – полистиролсульфонат (ПСС) и декстрансульфат (ДС), и двух положительно – полиаллиламингидрохлорид (ПАА) и полидиаллилдиметиламмонийхлорид (ПДАДМАХ), только ПАА является сильным ингибитором уреазы: 0,5 мкг/мл ПАА вызывает 50% ингибирование фермента при нейтральных значениях рН. При этом методами собственной флуоресценции белка и методом кругового дихроизма показано, что ингибирование уреазы в комплексе с ПАА не ведет к разрушению -спиральной структуры. Кроме того, показано, что ингибирование уреазы полиэлектролитом ПАА обратимо и это ингибирование снимается в растворах соли, при этом механизм снятия ингибирования у одновалентных и двухвалентных солей отличался.

В случае с ЛДГ сильным ингибитором фермента является ПСС, При этом ингибирование сопровождалась разрушением вторичной структуры фермента. Однако в присутствии солей при комплексообразовании ингибирование фермента снижается. Рост активности может быть объяснен ослаблением электростатических взаимодействий между заряженными группами белка и ПЭ за счет экранирования зарядов противоионами соли. Об основном вкладе электростатических взаимодействий в этот эффект свидетельствует совпадение кривых для моно- и дивалентных солей, если их представить как функцию от ионной силы.

Стендовые доклады 353

РЕДОКС-СТАТУС ГЛУТАТИОНА КАК ПОКАЗАТЕЛЬ АДАПТАЦИОННЫХ

ВОЗМОЖНОСТЕЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

Хаертдинова Л.Р., Сибгатуллина Г.В., Румянцева Н.И.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/3 E-mail: nigmatullinalili@mail.ru В животных клетках трипептид глутатион играет роль окислительно-восстановительного буфера и отношение содержания его восстановленной формы к окисленной форме (показатель GSH/GSSG) отражает изменение редокс-статуса клеток и является индикатором стресса. В нормальных условиях (при отсутствии стресса) этот показатель значительно смещен в сторону восстановленной формы. В своей работе мы попытались оценить возможность использования редокс-статуса глутатиона для оценки адаптационной возможности каллусных культур с разной морфогенной способностью при индукции окислительного стресса. Окислительный стресс индуцировали введением в среду культивирования клеток 3-амино-1,2,4триазола (АТ) – специфического ингибитора каталазы – основного фермента, разрушающего пероксид водорода. Каллусные культуры гречихи татарской выращивали на среде с ингибитором в течение 7 сут.



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |
Похожие работы:

«УДК 577.152.193 ВЭЖХ-АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ ПСЕВДОПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВ МЕТГЕМОГЛОБИНОМ Е.В. Бондарюк, В.В. Сенчук Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь Флавонолы – природные биологически активные полигидроксипроизводные 2фенил)-хромен-4-она [1]. Ряд флавонолов относится к незам...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@water.tu-chel.ac.ru (1), diff@...»

«Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинск...»

«1 Зелная палочка. №2 Февраль 2013 МБОУ—гимназия №3 г. Тулы МБОУ— 2013 год объявлен Президентом Российской Федерации Годом охраны окружающей среды. Однако вопросами охраны окружающей среды нужно заниматься не только в специальный год, а ежедневно и ежечасно. Это большая задача, связанная с обеспечением эко...»

«1.2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Новрузов В. С., Исаева Ф. М. Novruzov V. S., Isaeva F. M. Лишайники — биоиндикаторы атмосферного за Lichens are biological indicators of atmospheric po грязнения...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 13. 10. 2016 461 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Расторжение договора аренды, безвозмездного пользования земельным у...»

«Институт медико-биологических проблем Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Научно-исследовательская лаборатория "Динамика" ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ СЕРДЕЧНОГО РИТМА: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ПР...»

«Пояснительная записка к рабочей программе по биологии для 9 класса Программа разработана на основе Федерального компонента государственного стандарта основного общего образования и Федерального базисного учебного плана, в соответствии с которым на изучение биологии в 9 классе выделено 68. (2 ч. в недел...»

«"ПЕДАГОГИКО-ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ И СПОРТА" Электронный журнал Камского государственного института физической культуры Рег. № Эл №ФС77-27659 от 26 марта 2007 г. №7...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, 3 УДК 633.11+633.3:631.559:631.524 О ВЗАИМОСВЯЗИ УРОЖАЙНОСТИ С СОДЕРЖАНИЕМ БЕЛКА В ЗЕРНЕ У ЗЕРНОВЫХ И БОБОВЫХ КУЛЬТУР (обзор литературы) О.В. КРУПНОВА Рассмотрено современное состояние исследований и причины отрицательной корреляции между величиной урожая и белковостью зерна. О...»

«Экосистемы. 2016. Вып. 6. С. 100–106 СЕЛЕКЦИЯ И ДЕКОРАТИВНОЕ РАСТЕНИЕВОДСТВО УДК: 582.973:631.526.32 ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕКОРАТИВНЫХ СОРТОВ И ФОРМ ЖИМОЛОСТИ (LONICERA L.) В...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 12. 10. 2016 457 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Выдача справки об отсутствии (наличии) задолженности по арендной плате за земельный участок" В соответствии с Земельным кодексом Российской Федерации, Федеральным законом от 03.07.2016 № 334-...»

«Биология. 7 класс Пояснительная записка Рабочая программа составлена на основе Закона об образовании Российской Федерации от 29.12.1012 приказ №273/ФЗ, Федерального государственного образовательного стандарта основного общего образования,...»

«2015 Географический вестник 2(33) Экология и природопользование ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ УДК 004.6:581.55 П.Н. Бахарев, В.В. Семенов, Д.Н. Андреев27 ГЕОИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА ДАННЫХ ТЕРРИТОРИИ ЗАПОВЕДНИКА "ВИШЕРСКИЙ" В...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и прикладного значения химии в ж...»

«Convention on Protection and Use of Transboundary Watercourses and International Lakes SEMINAR ON ENVIRONMENTAL SERVICES AND FINANCING FOR THE PROTECTION AND SUSTAINABLE USE OF ECOSYSTEMS Geneva, 10-11 October 2005 ДОКЛАД ПО ЭКОЛОГИЧЕСКИМ УСЛУГАМ И ФИН...»

«Известия высших учебных заведений. Поволжский регион УДК 592.173 В. О. Козьминых ЖУЖЕЛИЦА СИБИРСКАЯ CARABUS SIBIRICUS F.-W. (COLEOPTERA, CARABIDAE) – ОХРАНЯЕМЫЙ ВИД ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ ПОВОЛЖЬЯ И УРАЛА1 Аннотация. Приведены да...»

«03.06.01 Физика и астрономия Направления № Научное направление Коды по ГРНТИ научноисследовательс 29.35; 29.37; 29.19; Физика кой 29.33; 29.19 деятельности Университет, позиционируя себя на российском и Стратегия научномеждународном научно-образовательном пространстве исследовательс как центр образования, науки и культуры, став...»

«1. ЦЕЛИ ОСВОЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ В курсе экология человека раскрывается биосоциальная природа человека, основные законы его развития в природной и социальной среде. Цель курса – раскрыть особенности взаимног...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" Утверждено на заседании Ученого совета университета от 30.03....»

«3. 2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS РАСТЕНИЕВОДСТВО PLANT RAISING Асланов Г. А., Новрузова Г. Х. Aslanov G. A., Novruzova G. H. Влияние удобрений на урожайность хлопчатника 2 Effect of fertilizers on cotton productivity. 2 Ерошенко Л. А., Бекенова Л. В., Кузнецова Н. А., Yeroshenko L. A., Bekenova L. V., Kuznetsova N. A., Шалабаев Б....»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Балашовский институт (филиал) Кафедра биологии и экологии ФИТОИНДИ...»

«НИКУЛИН АРТУР ЮРЬЕВИЧ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ OROSTACHYS SPINOSA (L.) SWEET (CRASSULACEAE J.ST.-HIL.) ПО ДАННЫМ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОCТЕЙ МЕЖГЕННЫХ СПЕЙСЕРОВ ЯДЕРНОЙ И ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК 03....»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 25 (64). 2012. № 4. С. 255-263. УДК 548.736+546.64+54.057 СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ КООРДИНАЦИ...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.