WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 |

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 8 ] --

Проведенные исследования показали, что общее содержание глутатиона в неморфогенном каллусе (НК) было несколько большим, чем в МК. Однако в НК преобладала окисленная форма глутатиона, т.е. соотношение GSH/GSSG всегда было ниже 1, а в морфогенном каллусе (МК) соотношение GSH/GSSG колебалось от 1.5 до 2.5. При воздействии АТ общее содержание глутатиона в обеих культурах снижалось уже через 1 сут культивирования, а его увеличение наблюдали только на 7 сут культивирования. При этом увеличение общего глутатиона в НК было меньше максимального значения в контроле, а в МК – выше, чем в контроле. Влияние АТ выражалось также в снижении показателя GSH/GSSG в обеих культурах уже через 1 сут культивирования. Но при дальнейшем культивировании, если в НК этот показатель падал к 3 сут почти до 0, то в МК он увеличивался до 2.5, что коррелировало в МК с ранней активацией глутатионредуктазы (на 1–3 сут). Некоторое увеличение соотношения GSH/GSSG в НК на 7 сут культивирования (до 0.5), вероятно, было обусловлено как активацией синтеза глутатиона, так и значительным увеличением активности глутатионредуктазы (возможно вследствие синтеза нового изофермента). Следует подчеркнуть, что содержание окисленной формы глутатиона в НК всегда было выше восстановленной формы, как в контроле, так и в опыте. В МК, напротив, как в контроле, так и в опыте, содержание восстановленной формы глутатиона превышало окисленную. Принимая во внимание данные по жизнеспособности, которая снизилась в НК за 7 сут культивирования на 20%, тогда как в МК – всего на 10%, можно утверждать, что изменение редокс-статуса глутатиона отражает адаптационные возможности культуры и согласуется с ранее полученными данными о большей чувствительности неморфогенных культур к различным стрессовым факторам.



Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-97039р_Поволжье_а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АКТИВНОСТЬ ЦИТОХРОМ С ОКСИДАЗЫ И УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ

ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦ COX I И COX IV В БЕЛЫХ МЫШЦАХ

АТЛАНТИЧЕСКИХ ЛОСОСЕЙ (SALMO SALAR L.)

РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ

Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: mchurova@yandex.ru Цитохром с оксидаза (ЦО) – важнейший фермент дыхательной цепи митохондрий, состоит из 13 субъединиц: 3 основных каталитических (COX I, II, III), кодируемых митохондриальным геномом, и 10 минорных, которые кодируются ядерным геномом. Предположительно функции ядерных субъединиц связаны с регуляцией активности цитохром c оксидазы, а также определяют тканевую специфичность фермента. В частности, субъединица IV является необходимой для сборки структуры и аллостерической регуляции активности фермента. В связи с этим, большой интерес представляет собой изучение механизма регуляции активности фермента на уровне экспрессии генов различных субъединиц.

Исследовали уровень экспрессии генов митохондриальной субъединицы I (COX I), ядерной субъединицы IV (COX IV) и уровень активности ЦО в белых мышцах лососей различных возрастов (0+, 1+, 2+). Показано, что с возрастом снижались активность ЦО и уровень экспрессии мРНК COX IV, а уровень экспрессии гена каталитической субъединицы COX I не изменялся. Взаимосвязь активности ЦО с экспрессией мРНК COX IV была сильнее, чем с мРНК COX I, при этом значение коэффициента корреляции увеличивалось с возрастом лососей. Эти наблюдения позволяют сделать предположение о том, что одним из механизмов регуляции активности цитохромоксидазы является изменение уровня экспрессии ядерных субъединиц, в частности субъединицы IV (COX IV), при этом с возрастом роль этого способа регуляции возрастает.





Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ НШРФФИ № 11-04-00167_а, проекта программы ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 гг.».

Стендовые доклады 355

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ «СТЕМОКИНА®»

И ЕГО АНАЛОГА НА ОСНОВЕ 2,5-ДИКЕТОПИПЕРАЗИНА

Шевченко А.С.1, Лузянина А.А.1, Семин Ю.А.1, Изместьева О.С.1, Жаворонков Л.П.1, Дейгин В.И.2 Федеральное государственное бюджетное учреждение МРНЦ Минздравсоцразвития РФ, 249032 Обнинск, Московская обл., ул. Королёва, 4 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

E-mail: ashevchenko87@mail.ru

Проведен сравнительный анализ влияния на гемопоэз двух пептидных соединений: фармакопейного препарата «Стемокин®» – трипептид Ile-Glu-Trp и созданного на его основе циклического производного 2,5-дикетопиперазина cyclo{Glu(IleNH2)-Glu(Trp)}. Биологическую активность пептидов определяли в тесте селезёночных экзоколоний (КОЕ-С) в двух экспериментальных моделях: 1 – на облучённых in vitro клетках костного мозга с последующим их введением облученным реципиентам для определения радиомодифицирующих свойств; 2 – в модели in vivo определяли активность соединений по отношению к костному мозгу интактных мышей. Животные получали препараты внутрибрюшинно, перорально, подкожно и внутривенно, в диапазоне доз 10–10000 мкг/кг (0,2–200 мкг/мышь). Результаты экспериментов свидетельствуют, что циклический пептид в широком диапазоне доз ослабляет повреждающее действие радиации на КОЕ-С при введении его мышам-реципиентам как внутрибрюшинно, так и перорально вслед за облученным in vitro костным мозгом. «Стемокин®», для которого также характерно радиотерапевтическое действие, обладает более узким диапазоном эффективных доз, при этом стимулирует восстановление клеток костного мозга только при парентеральном введении. При введении циклопептида интактным донорам за 48 часов до извлечения костного мозга регистрируется выраженная стимуляция популяции КОЕ-С как при инъекционном, так и при per os введении, в отличие от «Стемокина®», который не влияет на костный мозг интактных животных и стимулирует восстановления гемопоэза только после воздействия повреждающих факторов. В работе показано что циклические аналоги обеспечивают стабилизацию линейных предшественников без потери функциональных свойств.

Высокая стабильность производных 2,5-дикетопиперазина делает возможным их пероральное применение, а также позволит изучить спектр их действия на систему кроветворения при различных путях введения в организм.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

НЕОБХОДИМОСТЬ ВЗАМОДЕЙСТВИЯ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L25

С 5S рРНК ДЛЯ РАБОТЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО АППАРАТА ТРАНСЛЯЦИИ

Аникаев А.Ю., Коробейникова А.В., Корепанов А.П., Никонов С.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: anikaev.al@rambler.ru Рибосомный белок L25 и его гомологи являются особенностью рибосом бактерий.

Отсутствие этого белка в рибосоме Escherichia coli приводило к снижению эффективности ее функционирования. По совокупности биохимических и кристаллографических данных белок L25 взаимодействует в рибосоме только с двумя молекулами – 5S рРНК и белком L16. Ранее нами было изучено взаимодействие данного белка с 5S рРНК in vitro. Было показано, что белок с одиночной заменой (Y31A или H88F) в его РНК-связывающем модуле не образовывал комплекса с изолированной 5S рРНК. Мы решили проверить, будут ли такие мутантные формы белка L25 встраиваться в рибосому in vivo. Соответствующие изменения были внесены непосредственно в хромосомный ген белка. Оказалось, что клетки мутантных и контрольного штаммов не отличаются по скорости роста, а мутантные формы белка L25 эффективно встраиваются в рибосому in vivo. Вероятно, одиночные изменения в РНК-связывающем модуле белка L25 не полностью исключили его взаимодействие с 5S рРНК в рибосоме. Для создания стерического препятствия, исключающего образование плотного контакта между белком L25 и 5S рРНК в рибосоме, мы внесли несколько массивных аминокислотных остатков в область взаимодействия этого белка c РНК. Оказалось, что одно из внесенных изменений в белок L25 (S17L/Y31L/H88F) по эффекту на рост клеток и функционирование аппарата трансляции было сравнимо с нокаутом гена данного белка (L25 штамм). Другая мутантная форма белка (S17L/I29F/D90Y) оказывала меньший эффект на рост клеток и обнаруживалась в рибосоме. Однако высокие концентрации этих мутантных форм белка при экспрессии их генов in trans в клетках L25 штамма значительно восстанавливали рост клеток. При этом обе мутантные формы белка обнаруживались в рибосоме, но слабо удерживались в ней. Таким образом, впервые продемонстрирована необходимость специфического контакта белка L25 с 5S рРНК для функционирования бактериальной рибосомы в клетке.

Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00459-а и Программой «Молекулярная и клеточная биология» РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АГРЕГАЦИЯ БЕЛКОВ, ИНДУЦИРУЕМАЯ АМФИФИЛЬНЫМИ ПЕПТИДАМИ

Артемова Н.В., Штейн-Марголина В.А., Гурвиц Б.Я.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп. 33, к.2 E-mail: ximikk@gmail.com Исследования молекулярных механизмов взаимодействия пептидов с нативными или развернутыми в денатурирующих условиях белками и образования надмолекулярных структур, обладающих биологической активностью, становятся особенно актуальными при решении медицинских и биотехнологических задач.

В настоящей работе на основании изучения кинетики агрегации нативной дрожжевой алкогольдегидрогеназы, а также -лактальбумина коровьего молока и лизоцима куриного яйца, денатурированных дитиотреитолом, с использованием методов динамического лазерного светорассеяния, турбидиметрии, флуориметрии и спектрометрии кругового дихроизма обнаружен феномен агрегации белков, индуцируемой амфифильными лигандами. При исследовании кинетики дитиотреитол-индуцированной агрегации модельных белковых субстратов показано, что в присутствии амфифильных лигандов происходит ускорение процесса агрегации.

Данный эффект проявляется, главным образом, в значительном сокращении продолжительности лаг-периода. Показано торможение лиганд-индуцируемой агрегации белков в присутствии известного шапероноподобного белка -кристаллина, а также аргинина.

С помощью электронной и атомно-силовой микроскопии показано, что при агрегации -лактальбумина и лизоцима, индуцированной под действием противоположно заряженных пептидов Arg-Phe и Asp-Phe соответственно, происходит образование надмолекулярных структур, состоящих из глобулярных частиц диаметром 2–5 нм, способных выстраиваться в нитевидные цепочки длиной около 200 нм. В отсутствие пептидов наблюдалось формирование лишь аморфных агрегатов (20–50 нм).

Полученные данные, затрагивающие молекулярные механизмы агрегации белков, индуцируемой амфифильными низкомолекулярными пептидами, могут быть использованы при разработке эффективных добавок с целью оптимизации процесса рефолдинга рекомбинантных белков, а также при формировании белковых наноструктур с заданными свойствами.

Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 11-04а), а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (государственный контракт № 02.740.11.0765).

Стендовые доклады 359

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ

ТРАНСЛЯЦИИ 2 С ФРАГМЕНТОМ мРНК

Архипова В.И., Столбоушкина Е.А., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: avalenti@rambler.ru У эукариот и архей гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) в ГТФ-связанной форме доставляет инициаторную метионил-тРНК на рибосому.

Кроме того, e/aIF2 способен связывать мРНК. В эукариотических клетках с мРНК взаимодействует -субъединица eIF2. Архейный фактор инициации трансляции 2 тоже способен образовывать комплекс с мРНК, но только посредством -субъединицы. При этом aIF2 связывается с 5'-концом мРНК и защищает такие мРНК от 5'-3' направленной деградации. Нами ведутся исследования фактора инициации трансляции 2 из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus.

Центральная -субъединица aIF2 является G-белком, и ее домен I (или G-домен) содержит нуклеотид-связывающий сайт, с которым могут связываться либо ГТФ, либо ГДФ.

В нашей лаборатории был обнаружен второй (неканонический) сайт связывания ГТФ на поверхности домена II aIF2. Мы предполагаем, что обнаруженный нами неканонический сайт связывания ГТФ может являться местом взаимодействия белка с 5'-концом мРНК, потому что в наших экспериментах ГТФ и мРНК конкурируют между собой за связывание с -субъединицей aIF2.

Кристаллизация и определение структуры комплекса aIF2 с мРНК позволят выявить расположение цепи мРНК относительно белка и ответить на вопрос, является ли дополнительный ГТФ-связывающий сайт aIF2 местом связывания 5'конца мРНК. Ранее мы уже пытались закристаллизовать комплекс aIF2 с фрагментом мРНК, но получили только несовершенные микрокристаллы такого комплекса. Поэтому для кристаллизации комплекса с мРНК мы решили использовать мутантные формы -субъединицы aIF2, содержащие мутации в области неканонического сайта связывания ГТФ и, тем не менее, способные связывать мРНК. Такое решение было принято, поскольку сами по себе мутантные формы aIF2 кристаллизуются лучше, чем белок дикого типа. В результате впервые были получены кристаллы комплекса одной из мутантных форм aIF2 с фрагментом мРНК. Однако кристаллы оказались нестабильными и чувствительными к температуре. В настоящее время, мы оптимизируем условия кристаллизации, чтобы получить стабильные кристаллы комплекса.

Работа финансировалась Программой МКБ РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ ДОМЕНА I

БАКТЕРИАЛЬНОГО РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1

Баженова М.В., Корепанов А.П., Костарева О.С., Тищенко С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: mvbaz@rambler.ru Рибосомный белок L1 в комплексе со специфическим участком 23S рРНК формирует L1-выступ рибосомы, который способствует высвобождению тРНК из Е-сайта. Кроме того, в Escherichia coli белок L1, связываясь со специфическим участком на мРНК, ингибирует трансляцию L11 оперона, в котором находится его собственный ген и ген рибосомного белка L11. Ранее в нашей группе были определены кристаллические структуры двухдоменного рибосомного белка L1 как в изолированном состоянии, так и в комплексе со специфическими фрагментами рРНК и мРНК. На моделях кристаллических структур комплексов видно, что белок L1 взаимодействует с РНК в основном за счет своего первого домена. Был получен первый домен белка L1 из Thermus thermophilus и определена его пространственная структура как в изолированном состоянии, так в комплексе со специфическим фрагментом мРНК. Целью данной работы является исследование регуляторных свойств домена I рибосомного белка L1 в системе in vivo.

Был получен штамм E.coli, в котором отсутствует ген белка L1 (L1 штамм) В хромосоме данного штамма находится «слитый» ген, состоящий из регуляторной области L11 оперона и репортерного гена -галактозидазы. Таким образом, мы оценивали регуляторные свойства белков L1 по уровню синтеза -галактозидазы (в условиях регулируемой экспрессии соответствующих генов in trans).

Нами было показано, что домен I белка L1 L1 из E. сoli и T. thermophilus как и целый белок, ингибирует синтез репортерного белка, что свидетельствует о способности домена I регулировать in vivo экспрессию генов оперона L11 E.coli.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук и программы МКБ Президиума РАН.

Стендовые доклады 361

ВЛИЯНИЕ ДЕЗОКСИХОЛАТА НАТРИЯ НА АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ

CANDIDA RUGOSA

Богданова Л.Р., Идиятуллин Б.З., Ермакова Е.А., Зуев Ю.Ф.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: chemli@mail.ru Липазы – ферменты, катализирующие гидролиз водонерастворимых субстратов, содержащих сложноэфирную связь и функционирующие на поверхности раздела фаз вода-масло. Существенное влияние на процесс гидролиза оказывают амфифильные соединения, способные образовывать в водных растворах надмолекулярные структуры и модифицировать границу раздела фаз.

В настоящей работе исследовано влияние амфифильного дезоксихолата натрия на активность липазы Candida rugosa в реакции гидролиза п-нитрофенилового эфира лауриновой кислоты. Методом триптофановой флуоресценции показано, что в присутствии амфифила происходят изменения структуры фермента. Методом ЯМР-самодиффузии и солюбилизационной емкости показано образование смешанных агрегатов дезоксихолата натрия и субстрата.

На основе анализа температурных зависимостей параметров уравнения Михаэлиса-Ментен для буферного раствора и для растворов дезоксихолата натрия определены константы скорости и энергии активации элементарных стадий каталитической реакции (образование фермент-субстратного комплекса (k1), распад фермент-субстратного комплекса (k-1) и ацилирование фермента (k2)). Установлено, что амфифил оказывает преимущественное влияние на процесс распада фермент-субстратного комплекса, существенно ускоряя его.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТРУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ В РАСТВОРАХ ГЕМИНАЛЬНЫХ

ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Валиуллина Ю.А., Файзуллин Д.А., Ермакова Е.А., Зуев Ю.Ф.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: valiullina@mail.knc.ru Для изучения молекулярных механизмов функционирования ферментов необходимо использование систем, моделирующих их комплексы с различными лигандами. В работе исследовано влияние амфифильных лигандов (алкиламмонийных геминальных поверхностно-активных веществ (ПАВ)), различающихся строением головных групп, длиной спейсерного фрагмента и алкильных радикалов, на структуру и каталитическую активность сериновых протеиназ: трипсина и альфахимотрипсина.

Использовали геминальные ПАВ следующего строения:

[CmH2m+1(СН3)RN+ – (CH2)n – N+R(СН3)CmH2m+1] 2Br, где m=10, 12, 16, n= 6, 10, 12, а в качестве R использовались метильные и гидроксиэтильные радикалы.

Каталитическую активность ферментов контролировали по реакции гидролиза специфических субстратов в присутствии различных концентраций геминальных ПАВ. Методом молекулярного докинга определены наиболее вероятные комплексы ферментов с геминальными ПАВ. Определены кинетические параметры исследуемых реакций. Изменение структурного состояния ферментов под действием структурных модификаторов контролировали методами флуоресценции триптофановых остатков и ИК-спектроскопии.

Показано, что при добавлении геминальных ПАВ в случае трипсина наблюдается небольшое ингибирование активности фермента. В случае альфа-химотрипсина наблюдается как ингибирование, так и значительная активация действия фермента в зависимости от строения геминальных ПАВ. Проведенные ИК-спектрометрические исследования показали, что трипсин и альфа-химотрипсин взаимодействуют с молекулами геминальных ПАВ в растворе, что вызывает различные по интенсивности изменения в состоянии белков – от частичной дегидратации до частичной денатурации. Выполнен сопоставительный анализ структурных изменений белков и их каталитической активности и предложена модель действия геминальных ПАВ на структуру и функциональную активность ферментов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-03-00778а).

Стендовые доклады 363

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

НА СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ КЛЕТОК МОЗГА

Вьюнова Т.В., Андреева Л.А., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: p2@list.ru Огромный интерес к нейропептидам, возникший еще в прошлом столетии, приобретает сегодня всё большую практическую направленность. Проблема создания высокоэффективных, не вызывающих побочных эффектов лекарственных препаратов на основе пептидных регуляторов становится одним из приоритетных направлений в области биологии и медицины. Несмотря на успешное клиническое применение уже существующих препаратов, механизм действия последних до конца не ясен. Ключевыми моментами данного молекулярного механизма являются протеолиз пептидов в различных биологических средах под действием комплексов протеолитических ферментов, а также специфические взаимодействия регуляторных молекул на плазматических мембранах клеток-мишеней мозга.

В представленной работе было показано влияние ряда синтетических регуляторных пептидов на специфическое связывание радиоактивно меченых эффекторных молекул с их рецепторами. В качестве лигандов были использованы радиоактивно меченые (тритием) соединения: неселективные агонисты CB1 и CB2 рецепторов [3H]CP-55,940 и [3H]WIN 55,212-2, агонист ванилоидных рецепторов дигидрокапсаицин [3H]2HCapsaicin, неселективный агонист дофаминовых рецепторов [3H]Dopamine и ряд других молекул. В качестве исследуемых биологически активных пептидов были использованы синтетические аналоги эндогенных нейропептидов, принадлежащих к нескольким различным группам: глипролины меланокортинового ряда, глипролины (Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro и др.), производные тафтсина (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro и др.), аналоги нейротензина (Met-ProTyr-Trp-OCH3 и др.), производные дерморфина (Tyr-(D)Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-SerNH3, Tyr-Pro-(L,D)Ser и др.), некоторые пептиды, не относящиеся к указанным типам. Представленное исследование является одним из первых шагов на пути к созданию модели, позволяющей охарактеризовать важнейшие межмолекулярные процессы, происходящие на поверхности клеток-мишеней мозга в присутствии биологически активных пептидов.

Работа поддержана Грантом Президента Российской федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МК-282.2011.4.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ХАРАКТЕРИСТИКА ДИВИНИЛЭФИРСИНТАЗЫ LuDES ЛЬНА –

НОВОГО ПРЕДСТАВИТЕЛЯ НЕКЛАССИЧЕСКИХ ЦИТОХРОМОВ Р450

ПОДСЕМЕЙСТВА CYP74B

Горина С.С., Топоркова Я.Ю., Гоголева Н.E., Мухтарова Л.Ш., Чечеткин И.Р., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н.

Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 E-mail: luzdeamor@yandex.ru Ключевое место в растительном липоксигеназном каскаде метаболизма жирных кислот занимают ферменты уникального семейства CYP74 цитохромов Р450: алленоксидсинтазы (АОС), гидропероксидлиазы (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС). Результатом их деятельности является образование биоактивных соединений – оксилипинов.

Ранее в листьях льна-долгунца нами были выявлены новые оксилипины, в том числе дивиниловый эфир – (5Z)-этероленовая кислота, – и было показано, что синтез данного соединения происходит при участии одного из малоизученных ферментов – дивинилэфирсинтаз. Последовательность установленного нами функционального гена ДЭС льна опубликована в базе данных GenBank (идентификационный номер HQ286277.1 (GI: 310687282)). Новый фермент был отнесен к данному подсемейству и получил название LuDES (CYP74B1). Ранее подсемейство CYP74B включало лишь 13-специфичные ГПЛ. Характеристика каталитических свойств рекомбинантного белка подтвердила его принадлежность к ДЭС, но в отличие от большинства изученных ДЭС, обладающих 9-региоспецифичностью, LuDES обладает 13-региоспецифичностью. Для определения гипотетических детерминант катализа LuDES методом биоинформационного анализа был выбран ряд достоверно различающихся аминокислотных остатков в центральном домене I-спирали (IHCD), соответствующем кислород-связывающему домену классических монооксигеназ Р450, который, как было ранее нами показано, участвуют не в связывании кислорода, а непосредственно в катализе. Методом сайт-направленного мутагенеза была проведена замена глутаминовой кислоты (E) в 292 позиции на глицин (G), характерный для ГПЛ и АОС. В результате инкубации мутантного фермента LuDES Е292G с 13-гидроперекисью -линоленовой кислоты вместо ожидаемого продукта ДЭС реакции был обнаружен продукт, характерный для ГПЛ реакции.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-04-00915-а и ГК 16.740.11.0197.

Стендовые доклады 365

ИНГИБИРОВАНИЕ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

КОРОТКИМИ ГИДРОКСИПРОЛИН-СОДЕРЖАЩИМИ ПЕПТИДАМИ

Данюкова Т.Н.1, Биневский П.В.2, Шрам С.И.1, Кост О.А.2 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

E-mail: danyukova_tn@mail.ru

Ферментные гидролизаты различных белков пищи обладают некоторым гипотензивным действием, что может быть связано со способностью содержащихся в них пептидов ингибировать ангиотензин-превращающий фермент (АПФ; КФ 3.4.15.1). При пероральном введении гидролизатов коллагена и желатина в крови обнаруживаются, главным образом, гидроксипролин(Hyp)-содержащие ди- и трипептиды со структурой Xxx-Hyp и Хxx-Hyp-Gly. Однако исследований ингибиторной активности подобных пептидов в отношении АПФ ранее не проводилось.

В данной работе мы сравнивали АПФ-ингибиторную активность ряда коротких синтетических пептидов (2-4 а.о.), содержащих на С-конце остаток Pro или Hyp.

Исследования проводили на очищенном ферменте, выделенном из легких быка. Ингибиторную активность пептидов оценивали по их способности замедлять скорость гидролиза синтетического субстрата Нippuryl-His-Leu при 37oC. Показано, что ингибиторная активность пептидов снижается в ряду: Hyp-Gly-ProGlyProLeu-Pro-Gly-ProLeu-Pro-Gly-HypGly-Pro-ProGly-HypPro-Gly-ProacetylPro-Gly-ProPro-ProGly-Pro-HypPro-Gly-HypPro-Hyp. При этом в концентрации 100 мкМ перечисленные пептиды (за исключением трех последних) подавляли активность АПФ на 25–85%. Нужно отметить, что ингибиторная активность пептидов с С-концевым остатком Pro была всегда выше активности их Hyp-аналогов. Таким образом, в результате проведенного исследования выявлены важные взаимосвязи между АПФ-ингибиторной активностью и структурой пептидов, содержащих остатки Pro и/или Hyp.

Работа выполнена при частичной поддержке проектов РФФИ (гранты №№ 08а и 09-04-13813-офи_ц).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЦИТОСКЕЛЕТНЫЙ БЕЛОК ЗИКСИН ВЗАИМОДЕЙСТВУЕТ

С ТРАНСКРИПЦИОННЫМ ФАКТОРОМ Gli1

В РАННЕМ РАЗВИТИИ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ

Ермолина Л.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: lutiklutik@mail.ru В результате поиска белковых партнёров LIM-доменного цитоскелетного белка зиксина у шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) при помощи двугибридной дрожжевой системы мы идентифицировали транскрипционный фактор Gli1, являющийся основным эффектором сигнального каскада, запускаемого белками семейства Hedgehog. Данный каскад является одним из ключевых каскадов, контролирующих клеточную дифференцировку в эмбриогенезе. В частности, Hedgehog сигнализация необходима для нормальной дорсо-вентральной регионализации нервной трубки и сомитов. Связывание зиксина с Gli1 в клетках развивающихся эмбрионов лягушки было показано методом ко-иммунопреципитации. Для локализации областей взаимодействия этих белков были созданы делеционные мутанты Gli1 и проанализировано их связывание с тремя LIM-доменами зиксина (455а.о.) в дрожжевой двугибридной системе, соосаждением на глутатион-сефарозе и ко-иммунопреципитацией. В результате установлено, что за связывание с зиксином отвечает область Gli1, содержащая пять доменов типа «цинковые пальцы» (242-415 а.о.). С помощью люциферазной репортерной системы на эмбрионах шпорцевой лягушки мы показали, что зиксин подавляет транскрипционную активность Gli1. Следовательно, зиксин может быть одним из факторов, которые регулируют экспрессию генов – мишеней Hedgehog каскада. Как известно, основная функция зиксина – регуляция динамики актинового цитоскелета и морфогенетических движений клеток. Однако в некоторых случаях зиксин может перемещаться в ядро и модулировать экспрессию специфических генов. Таким образом, можно предположить, что обнаруженное взаимодействие зиксина с Gli1 является звеном механизма координации морфогенетических движений и клеточной дифференцировки.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 367

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ

ГОМОЛОГИЧНЫХ ГОМЕОБОКСОВЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМАХ ЧЕЛОВЕКА

РАЗУМНОГО, ДОМОВОЙ МЫШИ И ПЛОДОВОЙ МУШКИ

С УЧЁТОМ ДНК-СПЕЦИФИЧНОСТИ ГОМЕОДОМЕНОВ

Желтухин Е.И.1, Сивожелезов В.С.2, Полозов Р.В.1 Учереждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3 Учереждение РАН Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3

E-mail: orthoptera@iteb.ru

На сегодняшний день гомеобоксовые гены обнаружены в геномах всех представителей эукариот. Многие из них имеют по несколько ортологов сходной архитектуры гена, сходного расположения в хромосомах, сходной структуры гомеобокса (гомеодомена). Во многих работах отмечена высокая степень подобия среди гомеобокс-содержащих генных кластеров HOX и POU в геномах мыши и мухи. Для некоторых гомеобоксов установлены паралоги в геномах млекопитающих, членистоногих, нематод, растений и грибов.

В данной работе мы приводим дополненый и обновлёный список гомеобокссодержащих генов в геномах человека разумного (около 350), домовой мыши (около 350) и плодовой мушки (около 100). С использованием базы данных гомологичных генов/белков HomoloGene (и других баз) найдены паралоги и ортологи аннотированных гомеобоксовых генов.

Анализ доменной архитектуры гомеобоксовых и организации генов в хромосоме (очерёдность, направление, кластеризация генов) выявил аналогичную организацию гомеобоксовых генов в рассматриваемых трёх геномах. Такой анализ позволил логически объединить несколько разноимённых ортологов в подсемейства гомеобоксовых генов со сходной архитектурой и в подсемейства гомеобелков со сходной структурной и функциональной организацией. Нами отмечено много сходного в организации гомеобоксовых генов млекопитающих и членистоногих.

Привлекая данные по классификации гомеодоменов, мы установили, что каждое из рассматриваемых подсемейств гомеодоменов образует белок-белковый (гомеодомен-содомен) комплекс, характерный только для него. Принимая во внимание характер организации многодоменных комплексов на палиндроме ДНК и специфичность гомеодоменов к мотиву нуклеотидов 5`-TNANNN мы сформулировали принцип о непререкрываемости (non-overlapping) областей узнавания.

С привлечением данных по ДНК-мотив-специфичности гомеодоменов и данных о характере образования белковых комлексов гомеодоменов с содоменами можно заключить, что каждая выявленная нами классификационная группа гомеобоксовых генов имеет характерный только для неё гомеодомен и содомены, а значит и специфичность к определённому мотиву ДНК и образуемый ими многодоменный белковый комплекс. На основании этих результатов предложена структурно-функциональная классификация гомеобоксовых генов.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

БЕЛОК GP39, КОДИРУЕМЫЙ БАКТЕРИОФАГОМ P23-45 THERMUS

THERMOPHILUS, ПОДАВЛЯЕТ ИНИЦИАЦИЮ ТРАНСКРИПЦИИ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ

Жилина Е.В.1, Кульбачинский А.В.1, Минахин Л.C.2 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Waksman Institute for Microbiology, Piscataway, NJ 08854, USA

E-mail: katerina-zhilina@rambler.ru

Бактериофаги – вирусы бактерий, – выработали эффективные механизмы, способные подчинить хозяйскую систему транскрипции своим нуждам и переориентировать ее на экспрессию собственных генов. Одним из способов такой регуляции является экспрессия специальных белков, связывающихся с бактериальной РНК-полимеразой (РНКП) и изменяющих ее транскрипционные свойства. Несмотря на огромное разнообразие бактериофагов, на сегодняшний день в мире известны механизмы действия на РНКП лишь примерно десятка подобных регуляторных белков. В данной работе мы впервые охарактеризовали белок gp39 (молекулярная масса 16,5 кДа), кодируемый бактериофагом P23-45 термофильной бактерии Thermus thermophilus и связывающийся с хозяйской РНКП в процессе инфекции.

Белок gp39 был клонирован, экспрессирован в клетках E. coli и получен в очищенном виде. Показано, что белок gp39 подавляет активность холофермента РНКП Thermus thermophilus в тестах по транскрипции in vitro. Анализа действия gp39 на разных стадиях транскрипции показал, что он подавляет стадию инициации транскрипции, вероятно, нарушая взаимодействие РНКП с промоторами. Сила ингибирующего действия gp39 зависит от структуры промотора: наибольший эффект наблюдается в случае классических -10/-35 промоторов, и зависит от силы взаимодействия РНКП с промотором, в то время как инициация транскрипции на промоторах с удлиненным -10 элементом подавляется в меньшей степени. Мутации в N- и С-концевых районах сигма-субъединицы не влияют на чувствительность РНКП T. thermophilus к белку gp39, в то время как удаление C-концевых доменов альфа-субъединиц РНКП усиливает его действие. Полученные данные показывают, что подавление взаимодействий РНКП с промоторами при помощи достаточно коротких белков является одним из эффективных способов подавления клеточной транскрипции бактериофагами.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (госконтракт № 02.740.11.5132).

Стендовые доклады 369

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИЙ ДОМЕНОВ ИНСУЛЯТОРНОГО БЕЛКА

ДРОЗОФИЛЫ dCTCF

Ивлиева Т.А., Бончук А.Н., Кырчанова О.В.

Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 34/5 E-mail: ivlieva.tatiana@gmail.com Регуляция экспрессии генов высших эукариот обеспечивается специфическими цис-регуляторными элементами активирующими (энхансеры) и репрессирующими (сайленсеры) транскрипцию, а также инсуляторами, которые изолируют активные домены экспрессии от репрессированных. dCTCF является одним из белков, обеспечивающих функциональную активность инсуляторов у Drosophila melanogaster. В его состав входят 11 цинковых пальцев, которые гомологичны соответствующему домену основного инсуляторного белка позвоночных – CTCF.

C помощью генетических методов нами было показано, что dCTCF необходим для сближения удаленных участков хроматина в ядре, что является характерным свойством инсуляторов. Мутирование сайтов связывания dCTCF в инсуляторах приводит к полной потере их функций. Однако мультиплицированные сайты связывания dCTCF не проявляют изолирующих свойств. Это указывает на существование белковых партнеров dCTCF, необходимых для формирования полноценного инсуляторного комплекса. В настоящее время описан один белок, взаимодействующий с dCTCF – это СР190. СР190 ранее был описан как компонент различных инсуляторных комплексов.

С помощью дрожжевой двугибридной системы мы протестировали dCTCF на способность к гомодимеризации, а также провели скрининг делеционных производных dCTCF для выявления домена, ответственного за это взаимодействие. Для этого был использован штамм pJ694A, имеющий два репортерных гена – HIS3 под промотором GAL1 и LacZ под промотором GAL7. С помощью обоих репортерных генов мы подтвердили способность dCTCF к гомодимеризации и выявили, что за это взаимодействие отвечает N-концевой домен белка. Способность N-концевого домена образовывать димеры была подтверждена методом белок-белковых сшивок.

Аналогичным образом был проведен поиск участка dCTCF, отвечающего за взаимодействие с CP190, и было показано, что за это взаимодействие отвечает С-концевой домен dCTCF. Данный результат был подтвержден с помощью ко-преципитационного анализа (метод GST-pulldown).

Работа выполнена при поддержке программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

КАТАЛИТИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА А.17,

ГИДРОЛИЗУЮЩЕГО ФОСФОРООРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ

Казначеева А.В.1, Куркова И.Н.1, Бобик Т.В.1, Смирнов И.В.1,2, Пономаренко Н.А.1, 1,2,3 Габибов А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва

E-mail: avkaznacheeva@gmail.com

Ранее в нашей лаборатории в результате скрининга полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната, было отобрано рекомбинантное одноцепочечное антитело А.17, ковалентно взаимодействующее с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Поскольку данные ингибиторы по механизму действия являются аналогами фосфорорганических токсинов (ФОТ), нами было сделано предположение, что антитело А.17 будет способно их связывать и, в свою очередь, являться матрицей для создания панели мутантов, обладающих улучшенными характеристиками взаимодействия с ФОТ.

На основе анализа кристалла антитела А.17 был проведен сайт-направленный мутагенез, в результате которого была создана панель мутантов, включающая в себя антитела с заменами как в легкой (Ser35Arg, Ser35His, Ser35Glu, Leu47Arg, Leu47His, Gly90Thr, Phe100Tyr), так и в тяжелой (Ile38Lys, Trp100Tyr, Asp106Ala, Asp106Glu) цепях, которые, предположительно, будут обладать улучшенными кинетическими параметрами.

В качестве системы экспрессии антител была выбрана система экспрессии Pichia pastoris, поскольку создание репертуара мутантных форм и их экспрессия в культурах клеток млекопитающих представляет собой большую практическую проблему.

На основе созданных в нашей лаборатории универсальных векторов для экспрессии Fab-фрагментов иммуноглобулинов в P. pastoris были получены экспрессионные конструкции, содержащие тяжелую и легкую цепи Fab-фрагментов антитела А.17 и панели его мутантов. В результате селекции были отобраны рекомбинантные клоны, эффективно секретирующие Fab-фрагменты соответствующих антител в культуральную среду. Препараты антител были хроматографически очищены и определена их функциональная активность.

Стендовые доклады 371

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ

МИЦЕЛЛ БЕТА-КАЗЕИНА В ВОДНО-ЭТАНОЛЬНЫХ РАСТВОРАХ

Коннова Т.А.1, Файзуллин Д.А.1, Захарченко Н.Л.1, Зуев Ю.Ф.1, Haertl T.2 Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31 Национальный институт агрономических исследований, Нант, Франция

E-mail: ktatiana333@gmail.com

Бета-казеин – один из основных молочных белков. В последнее время, в силу высокой важности мицелл бета-казеина с точки зрения функциональных свойств молочных продуктов, активно изучается их природа и структура. Этанол используется в пищевой промышленности для регуляции свойств и повышения стабильности молочных продуктов, но молекулярные основы этих процессов до сих пор мало исследованы. В данной работе мы приводим результаты структурных исследований (методами флуоресцентной спектроскопии, динамического светорассеяния и кругового дихроизма) бета-казеина в водно-этанольных растворах. Обнаружено, что стабильность коллоидных структур бета-казеина строго зависит от концентрации этанола и температуры. Введение небольшого количества этанола стабилизирует мицеллы бета-казеина, в то время как дальнейшее увеличение концентрации спирта вызывает их дестабилизацию. Показано, что при стабилизирующих концентрациях этанола во вторичной структуре бета-казеина увеличивается содержание бета-слоев, что приводит к образованию более компактного и менее доступного растворителю мицеллярного ядра. Напротив, диссоциирующие концентрации этанола способствуют непосредственному взаимодействию спирта и гидрофобных белковых групп, приводя к мономеризации казеина и вызывая повышение содержания альфа-спиральных структур. Физико-химический анализ водноэтанольных смесей показал, что, будучи макроскопическими растворами, они все же обладают некой структурированностью (клатратная организация), которая зависит от концентрации и температуры, таким образом, определяя качество растворителя. В докладе обсуждается значение данного явления для ассоциативных свойств амфифильных молекул бета-казеина.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РОЛЬ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L5 В ФОРМИРОВАНИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО

ПРОТУБЕРАНЦА БОЛЬШОЙ СУБЧАСТИЦЫ РИБОСОМЫ

Корепанов А.П.1, Коробейникова А.В.1, Шестаков С.А.1, Бубуненко М.Г.2, Гарбер М.Б.1, Гонгадзе Г.М.1 Учреждение РАН Институт белка РАН, Пущино, Московская обл.

National Cancer Institute, Фредерик, США

E-mail: kav-20@rambler.ru

Специфический комплекс 5S рРНК с несколькими рибосомными белками (в Escherichia coli – белки L5, L18 и L25) участвует в формировании центрального протуберанца большой субчастицы рибосом всех ныне живущих организмов. Недавно нами было показано, что нокаут гена рибосомного белка L5 летален для бактериальной клетки. Цель данной работы – выяснить, какой эффект оказывает на сборку большой рибосомной субчастицы отсутствие этого белка в клетках E.

coli. Для этого хромосомный ген белка L5 был нокаутирован в присутствии плазмиды, обеспечивающей регулируемую экспрессию гена этого белка. Оказалось, что в клетках полученного штамма после прекращения синтеза белка L5 появляются дефектные большие рибосомные субчастицы, количество которых со временем увеличивается. Установлено, что эти субчастицы имеют коэффициент седиментации 47S и неспособны ассоциировать с 30S субчастицами. Анализ белкового состава 47S частиц показал, что они лишены не только белка L5, но и других компонентов 5S рРНК-белкового комплекса (5S рРНК, белков L18 и L25). При этом 5S рРНК, белки L18 и L25 присутствуют в цитоплазме исследуемых клеток в форме стехиометрического комплекса. Полученные данные впервые демонстрируют, что in vivo рибосомный белок L5 необходим для встраивания в большую рибосомную субчастицу всего 5S рРНК-белкового комплекса. Кроме того, было обнаружено, что в 47S частицах количество белков L16 и L27, которые также являются компонентами центрального протуберанца, сильно редуцировано. Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса в большой субчастице рибосомы приводит к дестабилизации структуры ее центрального протуберанца. Таким образом, in vivo белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование целого структурно-функционального домена рибосомы.

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-01747-а и Программой «Молекулярная и клеточная биология» РАН.

Стендовые доклады 373

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ GО СУБЪЕДИНИЦЫ

ГЕТЕРОТРИМЕРНОГО G-БЕЛКА ИЗ ДРОЗОФИЛЫ

Костарева О.С., Тин У.Ф., Тищенко С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: zelle@rambler.ru Гетеротримерные G-белки участвуют в системе переноса сигнала от рецепторов, расположенных на поверхности клеток, к эффекторным молекулам в цитоплазме.

G-белки состоят из трех субъединиц: G, G и G. При взаимодействии с сигнальными рецепторами мембраны эукариотической клетки G субъединица связывается с ГТФ, субъединицы диссоциируют и взаимодействуют с эффекторными белками для передачи сигнала.

При исследовании ассиметричного клеточного деления в нейробластах дрозофилы был идентифицирован белок Pins, содержащий GoLoco мотивы и относящийся группе рецептор-независимых регуляторных белков. Недавно были получены данные, свидетельствующие о том, что Pins может служить мишенью в процессе передачи сигнала от связанных с G-белками рецепторов. Такие белки, как правило, взаимодействуют с Gо/ГДФ (неактивной формой белка) и управляют активацией G-белков. Однако в клетках дрозофилы белок Pins может связываться как с Gо/ГДФ формой белка, так и с Gо/ГТФ (активная форма). Необходимым и достаточным для взаимодействия Gо и Pins является GoLoco1 фрагмент белка Pins. Определение кристаллической структуры Gо/ГДФ, Gо/ГТФ из дрозофилы в свободном состоянии и в комплексе с GoLoco1 доменом белка Pins позволило бы определить молекулярные основы этого взаимодействия.

К настоящему времени мы не смогли получить кристаллы Gо субъединицы.

Поскольку известно, что N-концевая часть белка Go в свободном состоянии неупорядочена, мы решили получить четыре мутантные формы белка Gо, в которых отсутствуют 17, 21, 24 и 32 N-концевые аминокислоты. Данные генетические конструкции были получены, белки выделены, ведётся поиск условий их кристаллизации.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант № 11-04-00859) и программы Президиума МКБ РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЗАМЕНЫ АМИНОКИСЛОТ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

ЙОТА УВЕЛИЧИВАЮТ ТОЧНОСТЬ СИНТЕЗА ДНК

Макарова А.В.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: amakarova-img@yandex.ru ДНК-полимераза йота (Pol i) человека – специализированная ДНК-полимераза Yсемейства с самой низкой точностью синтеза среди ДНК-полимераз эукариот.

Предполагается, что in vivo Pol i может участвовать в репликации и репарации поврежденной ДНК, а также соматическом гипермутагенезе генов иммуноглобулинов. Нарушения регуляции активности Pol i в организме могут быть причиной злокачественных новообразований. Недавно расшифрованые структуры активного центра Pol i позволили предположить возможный механизм катализа высоко ошибочного синтеза ДНК этим ферментом. С помощью методов сайт-направленного мутагенеза мы исследовали роль отдельных аминокислотных остатков активного центра ДНК-полимеразы, образующих контакты с матричной ДНК и встраивающихся дНТФ (Y39, Q59, K60, L62, L62, Y61, L78), а также участвующих в координации ионов металла при катализе (D126, E127). Тестирование эффективности и точности включения дНТФ вариантами ДНК-полимеразы с заменами аминокислотных остатков активного центра позволяет предположить ключевую роль аминокислот Y39 и Q59 в особенностях функционирования Pol i. Показано, что замены Y39 и Q59 на аланин приводят к резкому увеличению точности синтеза ДНК, однако полученный эффект существенно зависит от нуклеотидной последовательности матрицы.

Работа выполнения при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», 2009–2013 гг., госконтракт № П335.

Стендовые доклады 375

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

РИБОСОМНОГО БЕЛКА L5 В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ РИБОСОМЫ

Максимова Е.М., Корепанов А.П., Коробейникова А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: bridgitta2009@yandex.ru Рибосомный белок семейства L5 бактерий, архей и эукариот имеет консервативную пространственную структуру, что может свидетельствовать об универсальности выполняемых им функций. Он локализован в центральном протуберанце большой субчастицы рибосомы в непосредственной близости от ее функциональных центров. Современные кристаллографические исследования рибосом и их функциональных комплексов выявили несколько межмолекулярных контактов с этим белком. Так, петля 2-3 белка L5 контактирует с тРНК, расположенной в Ручастке рибосомы. Еще одна петля (3-4) этого белка взаимодействует с белком S13, формируя межсубъединичный мостик B1b. Цель данной работы – выяснение роли указанных межмолекулярных контактов рибосомного белка L5 в функционировании рибосомы E. coli. Нами был проведен направленный мутагенез соответствующих структурных элементов белка L5, причем изменения вносились непосредственно в его хромосомный ген. Показано, что удаление сразу нескольких аминокислотных остатков в петлях 2-3 (контакт с тРНК) и 3-4 (контакт с белком S13) белка L5 приводит к замедлению роста клеток E. coli, более того, такие клетки обладают холодочувствительным фенотипом. Таким образом, впервые выявлена важность указанных структурных элементов белка L5 для нормального роста клеток E. coli. Более того, делеция четырех или восьми остатков в петле 2белка приводит к снижению эффективности работы аппарата трансляции. С одной стороны, полный цикл трансляции (инициация, элонгация и терминация) осуществляется рибосомами мутантных и контрольного штаммов приблизительно за одинаковое время. С другой стороны, накопление активного белка в единицу времени в случае мутантных рибосом происходит в два раза медленнее. Учитывая контакт белка L5 с тРНК и полученные нами результаты, можно предположить, что внесенные в петлю 2-3 изменения приводят к увеличению частоты ошибок трансляции. В настоящее время мы устанавливаем причину сниженной функциональной активности исследуемых рибосом.

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-01747-а и Программой «Молекулярная и клеточная биология» РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ФУНКЦИИ N-КОНЦЕВОГО РАЙОНА СИГМА-СУБЪЕДИНИЦЫ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Миропольская Н.А.1, Игнатов А.В.2 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12

E-mail: acetabularia@yandex.ru

Инициация транскрипции у бактерий осуществляется холоферментом РНК-полимеразы. Для образования холофермента необходимо присоединение к кор-ферменту РНК-полимеразы фактора инициации – сигма-субъединицы. В процессе инициации транскрипции происходит узнавание и связывание промотора, плавление промоторной ДНК, связывание инициаторных нуклеотидов. В ходе инициации синтеза РНК часть коротких транскриптов диссоциирует из комплекса, в то время как РНКполимераза остается связанной с промотором. Когда РНК достигает длины 10–15 нуклеотидов, РНК-полимераза уходит с промотора и переходит к стадии элонгации транскрипции. Сигма-субъединица участвует во всех этих процессах, однако, ее роль на каждом этапе инициации транскрипции, особенно в процессе ухода РНК-полимеразы с промотора, изучена недостаточно.

РНК-полимеразы разных бактерий различаются по стабильности промоторных комплексов и эффективности ухода с промотора. Как было показано ранее, для РНКполимераз E. coli и T. aquaticus эти различия определяются сигма-субъединицей.

Предположительно, основной вклад в эти различия вносит N-концевой район сигмасубъединицы, включающий консервативные районы 1.1. и 1.2. Для выяснения роли этих районов в инициации транскрипции мы создали химерные сигма-субъединицы на основе сигма-субъединиц E.

coli и T. aquaticus, где отдельные районы (1.1 и/или 1.2) были заменены на последовательности другой РНК-полимеразы. В результате изучения транскрипционных свойств ферментов, содержащих полученные сигма-субъединицы, было показано, что оба этих района важны для стабилизации промоторных комплексов и эффективного ухода РНК-полимеразы с промотора. Таким образом, N-концевой район сигма-субъединицы, функции и структура которого до настоящего времени во многом были неизвестны, играет важную роль на разных стадиях инициации транскрипции, а межвидовые различия в структуре этого участка могут значительно изменять свойства РНК-полимеразы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых ученых (МД-618.2011.4).

Стендовые доклады 377

БОКОВОЙ P1-ВЫСТУП АРХЕЙНОЙ РИБОСОМЫ:

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ N-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА РИБОСОМНОГО

БЕЛКА P0 С ФРАГМЕНТАМИ ДОМЕНА II 23S рРНК РАЗНОЙ ДЛИНЫ

Митрошин И.В., Кравченко О.В., Габдулхаков А.Г., Никонова Е.Ю., Шкляева А.А., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: ivan-mitroshin@vega.protres.ru P1-выступ (L12-выступ) является одним из наиболее подвижных и функционально важных участков 50S субчастицы архейной рибосомы. Несмотря на успех в определении кристаллической структуры архейных рибосом, этот рибосомный выступ не удается визуализовать целиком. P1-выступ вовлечен в образование сайта связывания ГТФаз и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции. Этот боковой выступ образован комплексом рибосомных белков P0(L10) и P1(L12) и взаимодействует с доменом II 23S рРНК посредством белка P0.

Наша работа посвящена структурным исследованиям компонентов рибосомного P1-выступа из архей рода Methanococcus. Знание пространственной структуры комплекса рибосомного белка P0 со специфическим фрагментом 23S рРНК позволит уточнить структуру архейной и эукариотической рибосом и детально описать взаимодействие между белком P0 и 23S рРНК.

В прошлом году нами были получены кристаллы комплекса N-концевого фрагмента архейного рибосомного белка P0 с фрагментом 23S рРНК (74 н.о.). На синхротроне в Берлине от этих кристаллов был собран набор дифракционных данных с разрешением 3.2. Построена первая модель этого комплекса. Для получения кристаллов комплекса, отражающих рентгеновские лучи с более высоким разрешением, были выбраны фрагменты 23S рРНК различной длины (73 и 76 н.о.). Из литературы известно, что архейный рибосомный белок P0 может связывать специфический участок 23S рРНК из бактерий. В связи с этим был выбран специфический фрагмент 23S рРНК длиной 78 н.о. из гипертермофильной бактерии Thermus thermophilus для попытки улучшения качества кристаллов. В настоящее время получены первые кристаллы комплексов фрагментов 23S рРНК (73 и 76 н.о.) с N-концевым фрагментом белка P0.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и грантом РФФИ (№ 11-04-00327-а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА

ОКТАРФИНА

Некрасова Ю.Н., Садовников В.Б., Наволоцкая Е.В.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, Московская обл., просп. Науки, 6 E-mail: nekr-jul@mail.ru Известно, что эндогенный нейропептид, -эндорфин, взаимодействует с опиоидными ( и ) и неопиоидными, нечувствительными к опиоидному антагонисту налоксону рецепторами. До настоящего времени структура и функции последних остаются малоизученными.

Нами был определен фрагмент -эндорфина наименьшей длины, способный с высоким сродством связываться с неопиоидным рецептором. Им является синтетический пептид TPLVTLFK (авторское название – октарфин), соответствующий последовательности 12-19 молекулы -эндорфина.

Получен меченный тритием октарфин ([3H]октарфин, уд. активность 28 Ки/моль) и изучено его связывание с перитонеальными макрофагами мыши. Установлено, что [3H]октарфин связывается с макрофагами с высоким сродством (Kd=2,3±0,2 нМ) и специфичностью: специфическое связывание [3H]октарфина с макрофагами ингибировали немеченые -эндорфин и селективный агонист неопиоидного рецептора -эндорфина синтетический пептид иммунорфин (SLTCLVKGFY) (Ki 2,7±0,2 и 2,4±0,2 нМ) и не ингибировали немеченые налоксон, -эндорфин, -эндорфин и [Met5]энкефалин (Ki10 мкМ).

Показано, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo. При концентрации 1–10 нМ он увеличивает адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов, а также повышает их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro.

Внутрибрюшинное введение пептида (в дозе 20 мкг на животное за 7, 3 и 1 сутки до выделения клеток) приводило к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также T- и В-лимфоцитов селезенки.

Полученные данные указывают на то, что действие октарфина опосредовано через неопиоидный рецептор -эндорфина. Следовательно, участок 12-19 молекулы -эндорфина обеспечивает связывание с неопиоидным рецептором и передачу сигнала в клетку.

Стендовые доклады 379

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА-АДАПТЕРА TRIP8b С КЛАТРИНОМ

Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: popova@ibch.ru TRIP8b – цитоплазматический белок мозга, содержащий тетратрикопептидные повторы (TPR). Он был обнаружен в результате поиска белков, взаимодействующих с малой ГТФазой Rab8b. Позже было показано, что TRIP8b взаимодействует с двумя мембранными белками: HCN каналом и G-белоксопряжённым рецептором CIRL. Во всех случаях взаимодействие было опосредовано TPR-доменом TRIP8b.

Чтобы определить функцию TRIP8b, мы провели дополнительный поиск связывающихся с ним белков. Оказалось, что клатрин и субъединицы адаптерного комплекса AP-2 являются мажорными белками в элюатах с TRIP8b-Сефарозы.

Анализ аминокислотной последовательности TRIP8b выявил два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина – DLLDL и LDLD. Эксперименты по связыванию очищенного клатрина и мутантов TRIP8b, в которых аминокислотные остатки этих сайтов были заменены остатками аланина, подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания TRIP8b с клатрином.

При экспрессии в клетках эукариот TRIP8b вызывает перемещение HCN1 канала с клеточной мембраны в крупные внутриклеточные структуры, в которых также находятся TRIP8b и клатрин. С помощью внутриклеточных маркеров мы установили, что эти структуры являются лизосомами, но некоторая их часть локализуется с маркером ранних эндосом. Мутации сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b не блокируют эндоцитоз HCN1, но приводят к исчезновению в этих структурах клатрина. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие TRIP8b c клатрином и HCN1, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка: с каналом TRIP8b взаимодействует TPRсодержащей C-концевой частью, а с клатрином – с помощью двух сайтов, расположенных в N-конце молекулы.

Полученные нами данные позволяют предположить, что TRIP8b участвует в нейрональном эндоцитозе путём независимого взаимодействия с мембранными белками и компонентами оболочки клатрин-покрытых пузырьков.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-01644-а), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки медицине», Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», NIH Fogarty grant 5 RO3 TW007210.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ ХРОМОСОМНОГО БЕЛКА HMGB1

ПРИ СВЯЗЫВАНИИ С ДНК КАК ОСНОВА МНОГООБРАЗИЯ

ВЫПОЛНЯЕМЫХ ИМ ФУНКЦИЙ

Родионова Т.Ю.1,2, Чихиржина Е.В.2, Поляничко А.М.1,2 Физический факультет СПбГУ, 198504 С.-Петербург, Старый Петергоф, ул. Ульяновская, 1 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4

E-mail: tatirod9@gmail.com

Структурная организация ДНК-белковых и белок-белковых комплексов зачастую определяет их функциональное назначение и играет ключевую роль в функционировании хроматина. На фоне широкой распространённости HMGB-мотива до сих пор остаётся до конца невыясненной как природа большого разнообразия выполняемых белком функций, так и механизмы взаимодействия белка с ДНК. Мы предполагаем, что разнообразие функций, выполняемых HMGB-доменным белками, может быть связано со способностью белка по-разному изменять вторичную структуру в зависимости от мишени связывания.

С помощью сочетания разнообразных физико-химических методов (круговой дихроизм (КД), поглощение в УФ диапазоне, спектрофотометрическое плавление) мы проследили за изменениями в структуре белка HMGB1 при взаимодействии с плазмидной ДНК pUC19 и высокомолекулярной ДНК тимуса теленка. Основываясь на данных КД и спектрофотометрического плавления, мы предложили модель структурной адаптации HMGB1 к особенностям вторичной структуры ДНК в месте связывания. Согласно нашей модели взаимодействие HMGB1 с высокомолекулярной ДНК тимуса теленка характеризуется наличием двух механизмов связывания – кооперативного посредством двух доменов с изменением вторичной структуры А-домена белка и некооперативного посредством одного домена без изменения вторичной структуры белка. Анализ кривых плавления ДНК-HMGB1 комплексов позволил оценить размер участка связывания HMGB1 с ДНК, который в случае кооперативного механизма взаимодействия составил 18 п.о., а в случае некооперативного связывания – в 9 п.о. Было также показано, что увеличение содержания белка приводит к увеличению термостабильности ДНК в комплексе.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 09-08и Правительства Санкт-Петербурга. Часть работ проводилась в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

Стендовые доклады 381

ОЦЕНКА ШАПЕРОНОПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ -КРИСТАЛЛИНА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМЫ, ОСНОВАННОЙ

НА АГРЕГАЦИИ ОБЛУЧЕННОГО УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ СВЕТОМ

БЕЛКОВОГО СУБСТРАТА

Роман С.Г.1,2, Чеботарева Н.А.1, Еронина Т.Б.1, Макеева В.Ф.1, Клейменов С.Ю.1, Филиппов Д.О., Курганов Б.И.

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.2

E-mail: svetabaj@gmail.com

Для испытания шапероноподобной (антиагрегационной) активности белкового шаперона, -кристаллина, предложена тест-система, основанная на агрегации УФоблученной мышечной гликогенфосфорилазы b (Phb; КФ 2.4.1.1). Эта тест-система удобна для изучения процессов агрегации тем, что под действием ультрафиолетового света Phb денатурирует, и мы имеем возможность изучать влияние шаперона исключительно на последующий процесс агрегации денатурированного белка. Поскольку в живой клетке все процессы протекают в условиях молекулярного краудинга (исключенного объема), представляет интерес изучение влияния краудинга на шапероноподобную активность -кристаллина.

Методом динамического светорассеяния показано, что при УФ-облучении Phb образуются белковые агрегаты со средним значением гидродинамического радиуса 10,4 нм. При комнатной температуре эти агрегаты стабильны в течение достаточно длительного времени. Повышение температуры стимулирует дальнейшую агрегацию УФ-облученной Phb, однако -кристаллин ее подавляет. В условиях молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 Да, триметиламин N-оксида или Фиколла 70, увеличивается скорость агрегации УФ-облученной Phb. Показано, что с повышением концентрации краудинг-агентов шапероноподобная активность -кристаллина заметно ослабевает.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 11-04-01271-а, 11-04-00932-а) и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

САМООРГАНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА GroEL/GroES

IN VITRO: ОТ КЛУБКА ДО ОЛИГОМЕРА

Рябова Н.А., Марченков В.В., Марченкова С.Ю., Котова Н.В., Семисотнов Г.В.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: nina@vega.protres.ru Белки теплового шока клеток Escherichia coli GroEL (Hsp 60) и GroES (Hsp 10) являются представителями семейства молекулярных шаперонов, принимающих участие в правильном сворачивании и олигомеризации различных белков как in vivo так и in vitro. Вместе с тем, многие шапероны сами по себе являются сложными олигомерными образованиями. В частности, GroEL и GroES состоят из 14 и 7 идентичных субъединиц соответственно, объединенных в специфические кольцевые структуры. Таким образом, ответ на вопрос, каким образом самоорганизуются молекулярные шапероны, в частности, GroEL и GroES, представляет особый интерес. В настоящей работе исследованы равновесные и кинетические процессы денатурации и ренатурации GroEL и GroES, а также влияние на эти процессы белковых лигандов и внешних условий (ионной силы и концентрации глицерина).

Показана достоверность того, что самоорганизация GroES in vitro происходит спонтанно и не требует никаких дополнительных факторов. В противоположность этому, самоорганизация GroEL на стадии олигомеризации является лиганд-зависимой, а ее эффективность зависит от природы лигандов (АДФ или АТФ или GroES) и ионной силы раствора (наиболее эффективен сульфат аммония). На стадии формирования свернутой мономерной формы GroEL (т.е. сворачивания субъединиц) лиганды и ионная сила раствора не являются необходимыми. Кроме того, показана определяющая роль ко-шаперона GroES в самоорганизации шаперона GroEL при его малых (менее 0.2 мг/мл) концентрациях. При более высоких концентрациях GroEL влияние GroES менее выражено. На основании полученных результатов предложена модель самоорганизации in vitro молекулярного шаперона GroEL/ES от клубка до олигомера.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-00768-а), при поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология»), Федерального агентства по науке и инновациям (02.740.11.0295).

Стендовые доклады 383

НОВЫЙ МОДУЛЬНЫЙ ТОКСИН OtTx ИЗ ЯДА ПАУКА OXYOPES

TAKOBIUS

Сачкова М.Ю., Василевский А.А., Козлов С.А., Гришин Е.В.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: sachkovamasha@mail.ru Пауки – ловкие охотники на насекомых, использующие в качестве оружия сложные яды, в состав которых входят разнообразные токсины. Из яда паука Oxyopes takobius (Oxyopidae) был выделен новый уникальный полипептидный токсин OtTx 1 (~12 кДа), проявляющий инсектицидную и антимикробную активности.

Комбинация методов белковой химии, масс-спектрометрии и генной инженерии позволила установить полную аминокислотную последовательность OtTx 1 из 108 остатков. Первичная структура OtTx 1 позволяет отнести его к новому семейству так называемых модульных токсинов пауков. N-концевой линейный модуль OtTx 1 соответствует «обычному» цитолитическому пептиду. С-концевой модуль содержит 5 дисульфидов и, вероятно, формирует укладку, характерную для большинства нейротоксинов пауков. С помощью экспрессии синтетических генов в бактериальной системе мы получили полноразмерный рекомбинантный токсин OtTx 1, а также его С-концевой модуль. Кроме того, путем химического синтеза был получен N-концевой модуль OtTx 1. Проведено исследование инсектицидной и антимикробной активности полноразмерного OtTx 1 и его частей, полученные данные позволяют предположить механизм действия нового модульного токсина.

Работа поддержана грантами Президиума РАН (программа фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология»), Минобрнауки РФ (Госконтракты №№ П1388 и 16.512.11.2195), РФФИ (№№ 08-04-00454 и 11-04-00706).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ОСОБЕННОСТИ СУБЪЕДИНИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

АДГЕЗИОННОГО G-БЕЛОКСОПРЯЖЕННОГО РЕЦЕПТОРА CIRL-1

Серова О.В., Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: oxana.serova@gmail.com CIRL-1 принадлежит к семейству адгезионных G-белоксопряженных рецепторов.

Данные рецепторы являются природными гибридами двух классов белков – сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. CIRL-1 состоит из двух субъединиц, внеклеточной гидрофильной субъединицы p120, содержащей модули клеточной адгезии, и трансмембранной субъединицы p85, участвующей в передаче сигнала. Для всех адгезионных G-белоксопряженных рецепторов характерно наличие GPS-домена (G protein-coupled receptor Proteolysis Site). Именно в GPS-домене происходит протеолиз молекулы предшественника с образованием двух субъединиц рецептора, которые, как предполагают, образуют нековалентно связанный комплекс на поверхности клетки. Однако для CIRL-1 была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц на клеточной мембране.

Нами показано, что малая часть комплексов рецептора CIRL-1 диссоциирует с поверхности клетки с образованием растворимого эктодомена рецептора, который представляет собой комплекс p120 субъединицы и внеклеточного фрагмента p85 субъединицы. Данная диссоциация является результатом второго протеолиза в GPS-домене рецептора между сайтом первичного протеолиза и первым трансмембранным сегментом. При экспрессии в эукариотических клетках растворимой формы CIRL-1 с небольшим N-концевым фрагментом p85 субъединицы в клеточной среде нам удалось обнаружить такие комплексы p120 с фрагментом p85. Введение сайта расщепления тромбином во внеклеточную часть p85 субъединицы полноразмерного рецептора, а также использование химерных форм CIRL-1 также позволило показать существование гетеродимерного комплекса на поверхности клеток. Таким образом, мы подтвердили, что на мембране рецептор присутствует главным образом в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц p120 и p85.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 06-04-49706-a), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», NIH Fogarty grant 5 RO3 TW007210.

Стендовые доклады 385

СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕТЕРОТРИМЕРНОГО АРХЕЙНОГО

ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2

Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение РАН Институт белка РАН, 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 4 E-mail: esmail@vega.protres.ru Гетеротримерный архейный фактор инициации трансляции 2 (aIF2) гомологичен эукариотическому фактору eIF2. Структура e/aIF2 представляет большой интерес в связи с его ключевой ролью в доставке инициаторной тРНК (Met-тРНКi) на рибосому и в регуляции этапа инициации трансляции у эукариот и архей. В 2008 году нами была впервые определена структура полноразмерного aIF2 (Stolboushkina et al., 2008), анализ которой выявил высокую подвижность в - и субъединицах фактора. К настоящему времени нам удалось также впервые получить кристаллографическую модель aIF2 в комплексе с инициаторной тРНК. Для поисков условий кристаллизации был выбран тройственный комплекс MetтРНКi•аIF2D3•ГТФ, в котором белковая составляющая представляет собой конформационно-стабильную сердцевинную часть фактора аIF2 (-субъединица и третий домен -субъединицы). Структура данного тройственного комплекса была определена нами с разрешением 3.5 А. Как мы и предполагали ранее (Nikonov et al., 2007), инициаторная тРНК напрямую взаимодействует с доменом III -субъединицы посредством уникального выступа, образованного двумя выпяченными нуклеотидами. Этот факт объясняет стабилизацию тройственного комплекса и специфическое связывание тРНК. Основная группа контактов формируется между ССА-концом тРНК и switch 1 -субъединицы. Петля switch 1 отделяет ССА-конец Met-тРНКi от молекулы ГТФ, расположенной в каноническом ГТФ-связывающем кармане аIF2. Вероятно гидролиз ГТФ приводит к изменению конформации switch 1 и нарушению контактов между ним и тРНК, в результате этого Met-тРНКi остается на рибосоме, а аIF2 уходит в раствор. Проведенная работа позволила выявить особенности узнавания инициаторной тРНК гетеротримерным фактором инициации трансляции 2 и объяснить имеющиеся биохимические данные по его функционированию. Несмотря на успех в определении структуры тройственного комплекса, мы продолжаем работу по получению кристаллов более высокого качества. Дальнейший структурный анализ тройственного комплекса должен пролить свет и на механизм взаимодействия его с рибосомой и на ряд других деталей функционирования системы инициации биосинтеза белка у архей и эукариот.

Работа финансировалась Программой МКБ РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ АНАЛОГА

ПЕПТИДИЛ-тРНК – ПРЕДСТАВИТЕЛЯ НОВОГО КЛАССА

ИНГИБИТОРОВ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА

Сумбатян Н.В.1, Терещенков А.Г.1, Головин А.В.2, Шишкина А.В. 3, Коршунова Г.А.3, 1,2 Богданов А.А.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.73 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40

E-mail: sumbtyan@belozersky.msu.ru

В рамках создания ингибиторов биосинтеза белка с использованием компьютерного моделирования осуществлен дизайн и синтез аналога пептидил-тРНК, представляющего собой ковалентный конъюгат пептидо-нуклеиновой кислоты (PNA) со «стоп»-пептидом. Такого рода соединения представляют интерес как зонды для изучения функционирования рибосомы и как вещества, на основе которых могут быть созданы антибиотики нового поколения. PNA являются аналогами нуклеиновых кислот, в которых сахаро-фосфатный остов заменен на псевдопептидную цепь с присоединенными к ней нуклеиновыми основаниями. В качестве PNA, предназначенного для адресного связывания с Р-сайтом рибосомы, выбран тетрапептид-нуклеотид, обозначенный здесь, как АССС, цитозиновые основания в котором комплементарны нуклеотидным остаткам G2251, G2252, G2253 23S рРНК, два из которых – G2251 и G2252 – используются пептидил – тРНК при специфическом связывании с Р-участком пептидил-трансферазного центра (ПТЦ), четвертый – вводился в РNA для усиления связывания. По свободной аминогруппе тетра-(PNA) присоединен «стоп»-пептид с последовательностью Ile-Phe-Val-Ile, который, будучи расположенным в рибосомном туннеле, в присутствии тетрациклина вызывает остановку трансляции сигнального полипептида, закодированного в ermC опероне.

Твердофазным методом на SASRIN-полимере осуществлен синтез псевдопептида Ac-Ile-Phe-Val-Ile-АССС-Lys-ОН с использованием Fmoc- и Bhoc/Boc-группировок для защиты аминогрупп основной и боковых цепей, соответственно.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-01187-а).

Стендовые доклады 387

ПЕПТИДЫ ФАКТОРА eRF1, СОСЕДСТВУЮЩИЕ СО СТОП-СИГНАЛОМ

В СОСТАВЕ ТЕРМИНАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА 80S РИБОСОМ

ЧЕЛОВЕКА

Хайрулина Ю.С.1, Булыгин К.Н.1, Грайфер Д.М.1, Веньяминова А.Г.1, Воробьев Ю.Н., Фролова Л.Ю., Карпова Г.Г.

Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8 Учреждение РАН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва

E-mail: ykhairulina@gmail.com

Во всех живых организмах белки синтезируются на рибосомах, которые осуществляют перевод (трансляцию) генетической информации с последовательности тринуклеотидов – кодонов мРНК в аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Заключительный этап процесса трансляции – терминация наступает, когда в А-участке рибосомы оказывается один из трех терминирующих кодонов (UAA, UAG или UGA), которые узнаются специальным фактором терминации 1-го класса. Связавшись в А-участке, эти факторы промотируют гидролиз сложноэфирной связи в пептидил-тРНК, что приводит к высвобождению синтезированного полипептида из рибосомы. У эукариот, в отличие от прокариот, все три стоп-кодона узнаются одним фактором терминации eRF1.

В настоящей работе с помощью метода аффинной модификации с использованием аналогов мРНК, несущих сшивающую группу в заданном положении, в сочетании с методологией, основанной на специфическом расщеплении полипептидной цепи модифицированного белка, установлены фрагменты eRF1, соседствующие со стоп-сигналом в составе терминационных комплексов 80S рибосом человека. Показано, что остатки А и G в составе стоп-сигнала сближены с разными районами eRF1. Так, мотив 31-GTx-33 eRF1 являлся главной мишенью модификации аналогами мРНК со сшивающей группой на остатках G во втором и третьем положениях терминирующего тетраплета, тогда как аналоги мРНК со сшивающей группой на остатках A в этих же положениях модифицировали в основном фрагмент 121-131, включающий консервативный YxCxxxF-мотив.

Сопоставление результатов по сшивкам с данными молекулярного моделирования показало, что пептидное окружение остатков G и А стоп-сигнала соответствует разным конформациям N-домена eRF1. Таким образом, данные по аффинной модификации eRF1 в составе терминационных комплексов 80S рибосом аналогами мРНК с разной природой гетероциклического основания, несущего сшивающую группу, позволили получить новое представление о механизмах распознавания остатков G и А в терминирующих тетраплетах, объясняющее способность eRF1 узнавать все три стоп-кодона.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты №№ 11-04и 11-04-00840) и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭПИТОПОВ БЕЛКА Р35

ОРТОПОКСВИРУСОВ

Хлусевич Я.А.

Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Ак. Лаврентьева, 8 E-mail: khlusevichjana@mail.ru Проникновение оболочечных вирусов в клетки опосредуется вирусными белками слияния. В этом процессе могут участвовать несколько типов молекул. Так, при проникновении в клетку вируса простого герпеса, вируса денге, адено-ассоциированного вируса 2 типа и ортопоксвирусов происходит присоединение вирионных белков к поверхностным гликозаминогликанам. Как минимум 4 ортопоксвирусных белка связывают клеточные поверхностные гликозаминогликаны. Одним из таких белков ортопоксвирусов является белок р35 – основной иммуногенный белок при развитии иммунного ответа у человека, связывающий гепаран сульфат клеточной поверхности. Антитела к р35, отобранные ранее из иммунной комбинаторной библиотеки scFv антител человека, сконструированной на основе мРНК лимфоцитов периферической крови доноров, вакцинированных осповакциной, были способны ингибировать вирусную инфекционность на эукариотических клетках. Рекомбинантный белок р35 конкурирует с вирусными частицами за связывание с эукариотическими клетками Вероятно, вируснейтрализующие антитела узнают и связывают тот же эпитоп, что и гепаран сульфат, и таким образом ингибируют проникновение вирусных частиц в клетки.

Анализ аминокислотной последовательности белка р35 (вируса оспы коров) показал наличие ряда потенциальных антигенных кластеров в N-концевой, центральной и С-концевой частях белковой молекулы. Для локализации эпитопа белка р35, с которым взаимодействуют вируснейтрализующие антитела, было сконструировано 12 делеционных вариантов р35. Исследование связывания вируснейтрализующих антител с делеционными вариантами белка р35 показало, что участок, узнаваемый вируснейтрализующими антителами, находится в С-концевой области белка. При этом, этот участок не совпадает с предсказанными ранее консенсусными гликозоаминогликан-связывающими последовательностями, выявленными в белке р35. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что сайт связывания геперан сульфата отличен от консенсуса и находится в С-концевой области, либо о том, что механизм вирусной нейтрализации не связан с перекрыванием эпитопов, узнаваемых антителами и гепаран сульфатом.

Стендовые доклады 389

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕОПИОИДНОЙ РЕЦЕПЦИИ -ЭНДОРФИНА

В ДОИМПЛАНТАЦИОННОМ РАЗВИТИИ ЭМБРИОНОВ МЫШИ IN VITRO

Чернов А.С.1, Ковалицкая Ю.А.2, Давыдова Г.А.1 Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская обл.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

E-mail: c.h.e.r.n.o.v@rambler.ru

-Эндорфин – опиоидный нейропептид, способен регулировать основные функции организма, осуществляя взаимосвязь нервной, иммунной и эндокринной систем. Установлено, что молекула -эндорфина может взаимодействовать как с опиоидными, так и с неопиоидными (не чувствительными к блокатору опиоидных рецепторов налоксону) рецепторами. Показано, что на самых ранних этапах развития, -эндорфин секретируется фолликулярными клетками, окружающими яйцеклетку, и уже на более поздних стадиях, клетками эндометрия во время имплантации эмбриона. В настоящее время нет данных о наличии -эндорфина в просвете яйцевода, и его воздействии на эмбрионы с 2-клеточной стадии и до бластоцисты. Также остается не ясным существуют ли неопиоидные рецепторы -эндорфина на ранних эмбрионах.

Нами было изучено действие -эндорфина (0,1 мкМ) на развитие 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов мыши in vitro и исследовано воздействие -эндорфина на изменение уровня внутриклеточного Са2+ у ранних эмбрионов, с использование Са2+специфичного флуоресцентного зонда (Fluo-3 AM). Также изучили пути передачи внутриклеточного сигнала под действием -эндорфина с использованием специфических блокаторов активности фосфолипазы С и аденилатциклазы.

Нами было установлено, что на 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионах мыши локализованы неопиоидные рецепторы -эндорфина. Выявленная нами способность эндорфина стимулировать процессы первичной дифференцировки у ранних эмбрионов мыши, образование зрелых бластоцист и выход их из оболочки оплодотворения дает право считать, что эти вещества играют роль неспецифических факторов роста в регуляции доимплантационного развития мыши. Показано, что

-эндорфин (0,1 мкМ) инициирует медленный (35–40 мин) выход ионов Ca2+ в цитоплазму из внутриклеточных депо у 8-клеточных эмбрионов мыши. Впервые нами было установлено, что воздействие -эндорфина на 2-клеточные эмбрионы осуществляется при участии инозитолфосфатного и аденилатциклазного сигнальных путей через опиоидные и неопиоидные рецепторы соответственно, а на 4- и 8-клеточные эмбрионы – только по аденилатциклазному пути через неопиоидные рецепторы -эндорфина.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РОЛЬ БЕЛКА CHROMATOR В РАБОТЕ Su(Hw)-ЗАВИСИМОГО

ИНСУЛЯТОРНОГО КОМПЛЕКСА

Шаповалов И.С., Головнин А.К.

Учреждение РАН Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 34/5 E-mail: igor.shapovalov.193.5@gmail.com Компактизация-декомпактизация хромосомальной ДНК и обеспечение высокоэффективной регуляции экспрессии генов эукариот осуществляется за счет активности хроматина. Вследствие сверхкомпактной упаковки ДНК в хроматине эффективная экспрессия генов обеспечивается посредством работы ряда регуляторных элементов, что способствует нейтрализации хроматин-индуцированной репрессии. Инсуляторы – регуляторные элементы ДНК изолирующие ген от воздействий окружающего хроматина. Наиболее изученными у Drosophila melanogaster являются Su(Hw)- и dСTCF-зависимые инсуляторы. Одним из основных компонентов этих инсуляторов является белок CP190. Ранее в нашей лаборатории при поиске партнёров CP190 методом двугибридной дрожжевой системе был обнаружен ранее описанный белок Chromator (Chriz), имеющий «хромодомен» на N-конце.

Chromator коиммунопреципетируется с белком Z4, участвующим в поддержании структуры бэндов политенных хромосом.

Целью работы являлось изучение роли белка Chromator в процессе регуляции транскрипции и его участие в работе Su(Hw)-зависимых инсуляторов.

Методом двугибридной дрожжевой системы были определены участки белка Chromator, обеспечивающие взаимодействие с белком Z4 и с инсуляторными белками CP190 и Mod67.2, а также участки, необходимые для димеризации белка;

была установлена роль отдельных доменов C-конца белка Chromator во взаимодействии с CP190. Определены домены белков CP190, Mod67.2 и Z4, необходимые для взаимодействия с белком Chromator. Участие белка Chromator в составе комплексов с инсуляторными белками Su(Hw), Mod67.2 и CP190 было подтверждено методом иммунопреципитации белков. Иммунное окрашивание политенных хромосом показало, что белок Chromator практически полностью колокализуется с белком CP190, однако наблюдается лишь незначительное количество сайтов колокализации Chromator с сайтами Su(Hw)-зависимых инсуляторов, маркером которых является белок Mod67.2. Это говорит о том, что белок Chromator входит в состав различных комплексов, и участвует в работе ограниченного числа Su(Hw)-инсуляторов. Примерно в половине случаев на политенных хромосомах белок Chromator колокализуется с белком dCTCF – основным компонентом dCTCF-зависимых инсуляторов.

В настоящее время исследуется функциональная активность отдельных доменов белка Chromator in vivo в модельной системе с использованием трансгенных конструкций.

Стендовые доклады 391

РЕГУЛЯТОРЫ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ

ПЕПТИДОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТРЕТЬЕЙ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ

ПЕТЛЕ РЕЦЕПТОРА ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА

Шпакова Е.А.,1 Тарасенко И.И.,1 Власов Г.П.,1 Шпаков А.О.2 Учреждение РАН Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004 С.-Петербург, Большой пр., 31 Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 С.-Петербург, пр. Тореза, 44

E-mail: eshpakova@mail.ru

Лютеинизирующий гормон (ЛГ) – регулятор функций репродуктивной системы, действие которого осуществляется через рецептор серпантинного типа. Активированный гормоном рецептор ЛГ взаимодействует с G-белком стимулирующего типа (Gs), следствием чего является стимуляция активности фермента аденилатциклазы (АЦ). Предполагается, что важную роль во взаимодействии с Gsбелком играет С-концевой участок третьей цитоплазматической петли (С-ЦП3) рецептора ЛГ. Для проверки этого нами были синтезированы пептиды, производные С-ЦП3 рецептора ЛГ крысы: NKDTKIAKK-Nle-A562-572-амид (I), L-Nle-ATNKDTKIAKK-Nle-A558-572-амид (II), пальмитоилированный и димерный аналоги пептида I – NKDTKIAKK-Nle-A562-572-K(Palm)-A-амид (III) и (NKDTKIAKK-Nle-A562-572)2-KGGC(Acm)-амид (IV), исследована их вторичная структура и изучено влияние на активность АЦ и Gs-белков в тканях крыс. Синтез пептидов проводили твердофазным методом, присоединяя аминокислотные остатки с помощью диизопропилкарбодиимида. Пальмитоилированный лизин, который использовали для синтеза пептида III, получали конденсацией пентафторфенилового эфира пальмитиновой кислоты и N-t-BOC-лизина с помощью диизопропилкарбодиимида в присутствии триэтиламина. Для получения димерного пептида IV на месте разветвления в полипептидную цепь вводили N,Ndi-t-BOC-лизин, что позволило удвоить последовательность растущего пептида.

С помощью спектроскопии КД показано, что в водных растворах и в системе трифторэтанол-вода все пептиды находятся в основном в -складчатой конформации, за исключением пептида III, доля спиральной конформации которого в щелочной среде и в присутствии 60–80% трифторэтанола составила 25 и 13%, соответственно. В микромолярных концентрациях пептиды стимулировали активность АЦ и повышали уровень ГТФ-связывания Gs-белков. В присутствии пептидов стимулирующие эффекты хорионического гонадотропина человека на активность АЦ и ГТФ-связывание снижались. Эти данные свидетельствуют о том, что основные молекулярные детерминанты, ответственные за взаимодействие с Gs-белком и активацию АЦ локализованы в С-ЦП3 рецептора ЛГ.

Работа поддержана РФФИ (проект № 09-04-00746).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПСИХРОТРОФНОГО КАТЕПСИНА L

ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА

PARALITHODES CAMTSCHATICA

Балашова М.В.1, Руденская Г.Н.2, Шагин Д.3, Исаев В.А.4 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва ЗАО Евроген, Москва НПП Тринита, Москва

E-mail: lemon_m23@mail.ru

В последнее время все больший интерес для биотехнологии представляют психрофильные и психротрофные протеолитические ферменты членистоногих, в частности, ракообразных. К сожалению, механизмы холодовой адаптации ферментов до сих пор слабо изучены. В нашей лаборатории был выделен и охарактеризован новый психротрофный катепсин L из гепатопанкреаса камчатского краба (Paralithodes camtschatica), относящийся к клану С1 протеиназ по классификации MEROPS. Анализ кДНК гена и транслированной аминокислотной последовательности показал, что профермент содержит 324 аминокислотных остатка, рассчитанная молекулярная масса 35,4 кДа. Зрелый фермент содержит 220 аминокислотных остатков (23,78 кДа, pI=4,82). Аминокислотная последовательность исследуемого катепсина содержит консервативный мотив GCNGG, характерный для большинства цистеиновых протеиназ. В нашем случае, Asn заменен на Gly, что, вероятно, связано с психротрофностью фермента и увеличивает его лабильность. Также, катепсин L камчатского краба содержит мотив X3RX2(V/I)FX2NX3IX3N), характерный для всех представителей подсемейства катепсинов L. Однако, Phe заменен на Tyr. Активный центр образован каталитической тетрадой Gln22, Cys28, His167, Asn187.

Также были исследования энзиматические свойства нового катепсина L. Оптимум pH=8,0, что может указывать на то, что данный фермент является секретируемым, а не лизосомальным. Т оптимум = 25С, более того, фермент сохраняет высокую активность при Т = 4С, что говорит о его психротрофности. Исследуемый катепсин L эффективно гидролизует ряд синтетических субстратов, а также природные пептиды (меллитин, А и В цепи инсулина, гемоглобин) и коллаген X и VI типов. В положении Р1 предпочитает Arg (замена Arg на Lys в положении P1 уменьшает уровень гидролиза на 27%), в Р2 – гидрофобные аминокислотные остатки (особенно Leu, Val, Ile, Phe).

Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00545.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРОТЕАСОМЫ В РАЗВИТИИ ЦНС У КРЫС

Богатырев М.Е., Люпина Ю.В., Карпова Я.Д., Астахова Т.М., Абатурова С.Б., Шарова Н.П.

Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 E-mail: michael.bogatyrev@gmail.com Целью настоящей работы было изучение пула протеасом в развивающемся мозгу у крыс. Исследованы химотрипсин-подобная активность (ХПА) и каспаза-подобная (КПА), общий уровень протеасом и содержание иммунных протеасом в различных отделах ЦНС: коре (К), стриатуме (СТР), медиабазальном гипоталамусе (МБГ) мозжечке (М), стволе мозга (С)) у крыс в эмбриогенезе (ЭР) и в период постнатального развития (ПР). Показано, что ХПА и КПА различаются в зависимости от исследуемой структуры мозга и периода ЭР и ПР. ХПА на 15–17-е дни ЭР, а также в период с 15-го по 25-й дни ПР в К была выше по сравнению с таковой в каудальных отделах мозга (М и С). На 21-й день ЭР было отмечено повышение ХПА в МБГ по сравнению с другими изученными структурами мозга. Повышение ХПА и КПА в 1-й день ПР наблюдалось во всех исследованных структурах. ХПА падает во всех исследованных структурах на 3-й день ПР, а КПА на 5-й день ПР.

На 7-й день ПР во всех исследованных структурах кроме К происходило повышение ХПА, а на 12-й день ПР во всех исследованных структурах КПА увеличивалась. В ЭР в исследованных структурах менялось соотношение иммунных протеасом к общему уровню протесом. Содержание иммунных протеасом на 15-й день ЭР в каудальной части мозга было выше, чем в К. Напротив, на 18-й и 21-й дни ЭР содержание иммунных протеасом в К и МБГ было выше, чем в других отделах мозга, а в 1-й день ПР увеличивалось содержание иммунных протеасом в каудальных отделах мозга. Не было обнаружено достоверных изменений в тотальном уровне протеасом в исследованных структурах у крыс на различных стадиях ЭР и ПР. При исследовании распределения иммунных субъединиц в клетках ЦНС у крыс было обнаружено, что субъединицы иммунных протеасом содержатся не во всех клетках-предшественниках нейронов или глиальных клеток и не во всех нейронах или глиальных клетках. ГАМК-ергические нейроны содержат субъединицы иммунных протеасом. Изменение пула протеасом в исследованных структурах ЦНС связано с процессами нейрогенеза и дифференцировки.

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04а).

Стендовые доклады 395

ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОТЕАСОМ В РАЗВИТИИ

ПОРТАЛЬНОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У КРЫС ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

Богомягкова Ю.В.1, Карпова Я.Д.1, Божок Г.А.2, Люпина Ю.В.1, Астахова Т.М.1, Легач Е.И.2, Бондаренко Т.П.2, Шарова Н.П.1 Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина

E-mail: jullietta89@yandex.ru

Протеасомы, «вездесущие» протеолитические комплексы, выполняют регуляторную функцию в клеточных процессах, активируя или устраняя белки и образуя биологически активные пептиды. Среди множественных форм протеасом млекопитающих уникальная роль принадлежит иммунным протеасомам, содержащим иммунные протеолитеские субъединицы LMP7, LMP2 и LMP10 и участвующим в Т-клеточном иммунном ответе на разных этапах его развития. Особый интерес представляет вопрос об особенностях функционирования иммунных протеасом в противоположном по смыслу процессе – формировании иммунологической толерантности. Ключевая роль в осуществлении этого процесса принадлежит печени, органе с собственной локальной иммунной системой. При введении донорских клеток в печень через портальную вену формируется донор-специфическая толерантность (ДСТ) и значительно увеличивается приживаемость тканевых трансплантатов. Цель данной работы – выявить изменения в пулах протеасом печени и трансплантата в развитии ДСТ у взрослых крыс при приживлении неонатальных тканей яичника под капсулу почки. Показано, что в печени крыс с индукцией ДСТ увеличено количество мононуклеарных клеток, обогащенных LMP2, и снижено количество клеток, обогащенных LMP7. Эти изменения сопровождаются возрастанием каспазаподобной, но не химотрипсинподобной активности протеасом. Различия в экспрессии иммунных протеасом выявлены также для клеток трансплантатов яичника у разных групп животных. Иммунные протеасомы, содержащие LMP7, преобладают в отторгающихся трансплантатах. По-видимому, увеличение их содержания связано с активным участием этого типа иммунных протеасом в представлении антигена и развитии полноценной иммунной реакции на чужеродную ткань. Иммунные протеасомы, содержащие LMP2, напротив, преобладают в приживающихся трансплантатах. Можно полагать, что этот тип иммунных протеасом проявляет «неиммунные» функции и является необходимым для успешного приживления ткани. Перспективы связаны с поиском ингибитора активности LMP7, применение которого могло бы продлить жизнь трансплантата.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-04-00077а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

МЕХАНИЗМ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗ БАЦИЛЛ И КОККОВ

Вайчюлионис Т.С.1, Гасанов Е.В.2 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 119571 Москва, просп. Вернадского, 86 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: why4ulionis@gmail.com

Изучение механизмов функционирования биологических молекул – одна из актуальных задач современной науки. Одним из важнейших направлений является исследование механизма распознавания и связывания молекулы субстрата ферментом. Наша работа направлена на изучение механизмов, определяющих специфичность протеаз, в первую очередь способность к распознаванию заряженного субстрата и проводится на модели бактериальных глутамилэндопептидаз (ГЭП). Эти ферменты с высокой специфичностью гидролизуют связи, образованные отрицательно заряженными остатками дикарбоновых аминокислот, в первую очередь, глутаминовой. Механизм распознавания субстрата ГЭП при этом до сих пор неясен.

Анализ пространственной структуры ГЭП Bacillus intermedius (BIGEP) и протеиназы V8 Staphylococcus aureus показал, что субстратсвязывающий район ГЭП бацилл и кокков содержит два элемента, теоретически способных распознавать и компенсировать отрицательный заряд субстрата: остаток His213 и -аминогруппу N-концевой аминокислоты (Val/Ser1). Генноинженерная замена His213, как показано ранее, не изменяет предпочтения зрелой BIGEP к остаткам глутаминовой кислоты. Следовательно, была выдвинута гипотеза о ключевой роли -аминогруппы N-концевой аминокислоты ГЭП в распознавании заряда субстрата. Однако, осуществленный нами анализ созревания BIGEP in vitro, наряду с данными, полученными для родственных ферментов, показал, что ГЭП способны распознавать заряженные остатки дикарбоновых аминокислот до формирования свободной аминогруппы зрелого фермента. Предшественники ГЭП, в которых Val/Ser1 ковалентно связан с N-концевым пропептидом и не имеет компенсирующего положительного заряда, автокаталитически расщепляют пропептид по остаткам глутаминовой кислоты. Это позволило нам предположить, что специфичность предшественников и зрелых ГЭП определяется различными элементами: His213 в случае профермента и -аминогруппой Val/Ser1 для зрелого белка. Для проверки этой гипотезы нами получен предшественник BIGEP с заменой His213/Thr и дополнительным остатком глутаминовой кислоты в пропептиде (Glu(-1)). Анализ созревания мутантной BIGEP позволит пролить свет на механизмы, лежащие в основе специфичности глутамилэндопептидаз.

Стендовые доклады 397

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ АКТИВНОСТЬЮ

АМИЛОИД-ДЕГРАДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ

И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ТКАНИ МОЗГА

Васильев Д.С., Багрова Д.И., Морозова А.Ю., Дубровская Н.М.

Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, С.-Петербург E-mail: dvasilyev@bk.ru Снижение активности амилоид-деградирующего фермента – неприлизина (НЕП) было выявлено у старых крыс с нормальным эмбриогенезом и у взрослых крыс, перенесших пренатальную гипоксию (7% О2, 3 ч, Е14). У этих животных также было отмечено снижение количества лабильных синаптоподин-позитивных дендритных шипиков в нервной ткани новой коры и гиппокампа, сопровождаемое нарушением кратковременной памяти. Полученные данные позволили нам выдвинуть предположение о возможной взаимосвязи активности амилоид-деградирующих металлопептидаз, в частности неприлизина, и изменений количества лабильных аксодендритических контактов в нервной ткани. У животных с экспериментально измененной активностью НЕП было исследовано количество лабильных шипиков в молекулярном слое новой коры мозга. Для восстановления сниженного уровня активности НЕП взрослым крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, проводили i.p. инъекции вальпроата натрия (200 мг/кг, в течение месяца). У таких животных наблюдалось повышение (на 17,8±7,6%) количества лабильных шипиков в коре мозга и восстановление нарушенной памяти. Введение в кору мозга ингибитора НЕП – фосфорамидона (1,18 мкг/1 мкл) в течение месяца при помощи осмотических минипомп приводило к снижению (на 18,9±6,8%) количества лабильных шипиков и нарушение памяти. Предполагается, что изменение уровня активности амилоид-деградирующих ферментов, сопровождаемое снижением числа лабильных межнейронных контактов, вовлечено в молекулярные механизмы когнитивных расстройств при патологии развития.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 10-04-01156), Программы «Фундаментальные науки медицине».

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА

ПОСТГЛУТАМИНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЕПТИДАЗЫ

ИЗ ЛИЧИНОК НАСЕКОМОГО-ВРЕДИТЕЛЯ TENEBRIO MOLITOR

Воротникова Е.А.1, Семашко Т.А.2, Гоптарь И.А.1, Смирнова Ю.А.1, Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40

E-mail: greenfire06@gmail.com

Большой мучной хрущак Tenebrio molitor является вредителем запасов зерновых культур и продуктов их переработки. Главными пищевыми белками T. molitor являются Gln- и Pro-богатые белки пшеницы проламины, которые также присутствуют в диете большинства людей. Ранее мы показали, что состав пищеварительного комплекса T. molitor существенно отличается от человеческого, т.к. начальные этапы переваривания белков у насекомого осуществляют цистеиновые пептидазы. Эти различия могут быть использованы в медицине для лечения аутоиммунного заболевания целиакии, которое диагносцируется у 2% населения. Целиакия вызывается воспалительной реакцией на иммуногенные глутамин- и пролин-богатые пептиды проламинов злаковых, не гидролизуемые пищеварительными ферментами человека. Лекарств от этого заболевания в настоящее время нет.

Используя субстрат Z-Ala-Ala-Gln-pNA (Z – бензилоксикарбонил, pNA – пнитроанилид), мы выявили значительную постглутаминспецифическую активность в пищеварительном комплексе личинок T. molitor. Фермент, обладающий этой активностью, был выделен и частично очищен с использованием гель-хроматографии на сефадексе G-100 и аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе. Хроматографические свойства, рН-зависимость активности, чувствительность к ингибиторам, а также электрофоретическая подвижность фермента были практически идентичны со свойствами главной пищеварительной цистеиновой пептидазы T. molitor. Изучено действие фермента на ряд пептидных субстратов цистеиновых пептидаз, Эффективность гидролиза субстратов снижалась в ряду Z-PheArg-pNA Z-Arg-Arg-pNA Glp-Phe-Ala-pNA Z-Ala-Ala-Gln-pNA Glp-Val- Ala-pNA.

Ферментный препарат предположительно может быть использован в качестве лекарственного препарата для лечения целиакии.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 09-04а, 09-03-01007-а, 11-04-93964-ЮАР_а).

Стендовые доклады 399

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ СТАТИСТИЧЕСКИМ

АНАЛИЗОМ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОВ ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА

Драчевская М.И., Еремеев Н.Л.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 E-mail: mary-shat2@mail.ru Метод изучения первичной специфичности протеолитических ферментов статистическим анализом масс продуктов протеолиза белковых субстратов не требует прямого определения аминокислотной последовательности этих продуктов. Для проведения исследования белок-субстрат с известной аминокислотной последовательностью подвергают гель-электрофорезу в восстанавливающих и денатурирующих условиях. Полосу субстрата инкубируют с изучаемой протеиназой с последующим получением МАЛДИ масс-спектра реакционной смеси. Поскольку в методе МАЛДИ образуются практически только однозарядные ионы, то обработка полученного масс-спектра дает массы продуктов протеолиза. С помощью программы FindPept можно теоретически найти все пептиды белкового субстрата, обладающие конкретной массой в пределах той или иной ошибки измерения. Месторасположение этих пептидов в первичной аминокислотной последовательности субстрата позволяет выделить для каждого из них две аминокислоты, после которых потенциально произошел гидролиз. Для каждой экспериментально определенной массы в масс-спектре проводят такую процедуру, в результате чего получают набор произошедших событий. Первичная специфичность протеиназы проявляется в максимальной частоте встречаемости той или иной аминокислоты при статистическом анализе полученного набора.

В работе теоретически изучены возможности и ограничения данного метода.

Выбраны оптимальные диапазоны задаваемых ошибок измерения масс пептидов для получения статистического набора произошедших событий и форма представления статистических данных. Показано, что предлагаемый метод может быть применен лишь для протеиназ с относительно узкой первичной специфичностью (две-три аминокислоты). Исследовано влияние аминокислотного состава белкасубстрата на эффективность проявления специфичных для конкретной протеиназы аминокислот при статистической обработке набора масс продуктов протеолиза. Проведена экспериментальная верификация сделанных теоретических выводов на протеиназах с известной первичной специфичностью – трипсине и глутамилэндопептидазе.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЗАИМОСВЯЗЬ АКТИВНОСТИ Cа2+-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНАЗ

С СОДЕРЖАНИЕМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЖАБРАХ МИДИЙ

MYTILUS EDULIS ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ КАДМИЕМ

Канцерова Н.П., Фокина Н.Н., Лысенко Л.А., Немова Н.Н.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ РАН, 185610 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: nkantserova@yandex.ru Кадмий – один из основных поллютантов среды обитания живых организмов. Как и большинство тяжелых металлов, даже в очень низких концентрациях он токсичен для всего живого. Токсичность Cd2+ определяется его сродством к SH-группам биомолекул и способностью конкурировать с Са2+ в Са2+-регулируемых процессах. Так, мишенью для Cd2+ являются Ca2+-зависимые цистеиновые протеиназы цитозоля (кальпаины), испытывающие двоякое действие: с одной стороны, Cd2+ ковалентно модифицирует Cys активного центра фермента, лишая его каталитической активности, с другой – угнетает транспорт ионов Cа2+ в клетку за счет снижения кальмодулин-зависимой активации Ca2+-АТФаз.

В аквариальном эксперименте по изучению ответной реакции мидий Mytilus edulis L. на действие ионов Cd2+ в различных концентрациях (10, 100 и 500 мкг/л или 1ПДК, 10ПДК и 50ПДК, соответственно) показана корреляция содержания арахидоновой кислоты (АК) и уровня активности кальпаинов в органах моллюсков. Так, наблюдаемое по истечении первых суток воздействия значительное повышение активности Ca2+-зависимых протеиназ в жабрах моллюсков сопровождается повышением доли АК в составе общих липидов жабр мидий. Напротив, при более длительном (72 часа) воздействии исследуемых концентраций Cd2+ в среде у M. edulis наблюдается угнетение активности Ca2+-зависимых протеиназ на фоне сниженного содержания АК в составе общих липидов жабр. Отмеченная корреляция биохимических показателей, по видимому, объясняется эффекторной ролью АК и фосфатидилинозитидов по отношению к селективным и неселективным Ca2+-каналам. Избыточный синтез АК и трансформация фосфатидилинозитола до ИФ3 приводят к повышению уровня цитоплазматического Cа2+ (Mignen et al., 2003; Shuttleworth et al., 2007; Caro, Cederbaum, 2007) – основного регулятора активности кальпаинов. Так, в эксперименте продемонстрирована тесная связь обмена тканевых липидов и белков с центральным связующим звеном – Са2+, а также их участие в развитии метаболических перестроек, направленных на компенсацию негативного действия загрязнителей среды обитания.

Работа выполнена при поддержке проекта ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (ГК №14.740.11.1034), программы президента РФ «Ведущие научные школы»

(НШ-3731.2010.4), гранта РФФИ № 11-04-00167 и Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

Стендовые доклады 401

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ИММУНОПРОТЕАСОМЫ В ПРОТЕОЛИЗЕ

ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ

ЦНС Кузина Е.С.1, Белогуров А.А.4, Бачева А.В.1, Кононихин А.С.2,3, Харыбин О.Н.5, 4 2,3,5 1,4 Пономаренко Н.А., Николаев Е.Н., Габибов А.Г.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 Учреждение РАН Институт энергетических проблем химической физики РАН, Москва Учреждение РАН Институт биохимической физики РАН, Москва Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Учреждение РАМН Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва

E-mail: kat.kuzina@gmail.com

Протеолитическая деградация аутоантигенов имеет важнейшее значение в современной биохимии и иммунологии. Предметом настоящей работы является сравнительное исследование особенностей деградации одного из основных нейроантигенов, основного белка миелина (ОБМ), протеиназами, активируемыми при развитии патологического демиелинизирующего процесса, и протеасомой, выделенной из различных источников. Для изучения протеолиза ОБМ 26S протеасому выделяли из головного мозга мышей линии BALB/c, мышей линии SJL, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), и мышей линии SJL, больных ЕАЕ. Продукты деградации ОБМ рядом протеиназ, а также протеасомой головного мозга мышей различных линий, были проанализированы на тандемном хромато-масс-спектрометре. Протеиназы, ассоциированные с рассеянным склерозом, расщепляют пептидные связи в ОБМ чаще всего в соответствии со своей специфичностью. В продуктах деградации ОБМ протеасомой из мозга мышей было обнаружено значительное количество пептида ENPVVHFF, который является частью энцефалитогенного фрагмента ОБМ. Был проведен количественный анализ содержания этого пептида в продуктах гидролиза на тандемном хромато-масс-спектрометре с применением изотопно меченного аналога ENPVVHFF* (F*=13C9H915NO), синтезированного химически. Выявлено, что при действии протеасомы из мозга мышей линии SJL, больных аутоиммунным энцефаломиелитом, этого пептида образуется в 5 раз больше, чем при действии протеасомы из мозга мышей линии BALB/c и из мозга неиммунизированных мышей линии SJL. При введении LMP2-специфического ингибитора мышам линии SJL, больным EAE, тяжесть заболевания заметно снижалась по сравнению с контрольной группой животных. Этот факт указывает на возможную связь между протеолитической активностью иммунопротеасомы и развитием данного заболевания, а также на перспективность специфических ингибиторов иммунопротеасомы как потенциальных лекарственных средств.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВОЗДЕСТВИЕ ТОКСИНА Cry3Aa BACILLUS THURINGIENSIS

НА ЭКСПРЕССИЮ ПЕПТИДАЗ КИШЕЧНИКА БОЛЬШОГО МУЧНОГО

ХРУЩАКА TENEBRIO MOLITOR

Мартынов А.Г.1,2, Элпидина Е.Н.1, Опперт Б.3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.73 Центр исследований зерна и здоровья животных, Служба с/х исследований Министерства сельского хозяйства США, Манхэттэн 66502, Канзас, США

E-mail: agmart@mail.ru



Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 |
Похожие работы:

«ГБОУ ВПО ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И. М. Сеченова МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПЕДИАТРИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ кафедра гигиены детей и подростков ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ ПО ГИГИЕНЕ ПИТАНИЯ Часть II ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ, ДОБРОКАЧЕСТВЕН...»

«1.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Санжарова Н. И., Молин А. А., Козьмин Г. В., Ко Sanzharova N. I., Moline A. A., Koz’min G. V., Ko бялко В. О. Радиационные агробиотехнологии: byalko V. O. Radiation agricultural biotechnologies: приоритетные направления развития и коммер priori...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижневартовский государственный университет" Факуль...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологические основы у...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Н.В.Сорокина ТЕРИОЛОГИЯ Учебно-методический комплекс. Рабочая прогр...»

«Классный час Покормите птиц зимой! Цель: Вызвать сочувствие к зимующим птицам. Научить проявлять заботу к ним. Расширить знания детей о птицах.Задачи: Формирование экологического представления детей об окружающем мире. Обобщить и расширить представления детей о зимующих птицах. Воспитывать и развивать единую экологическую зад...»

«ГЕОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И БИОСФЕРА, 2015, T. 14, № 3, с. 81–98 УДК 57.042 ЭКРАНИРОВАНИЕ В БИОЛОГИИ И БИОФИЗИКЕ: МЕТОДОЛОГИЯ, ДОЗИМЕТРИЯ, ИНТЕРПРЕТАЦИЯ © 2015 г. Б.М. Владимирский, Н.А. Темурьянц Крымский федеральный университет им. В.И...»

«Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 1 (67). 2015. № 3. С. 49–55. УДК 579.64:581.14(653.63) ВЛИЯНИЕ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА "ЭМБИКО" НА ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН ОГУРЦОВ (CUCUMIS SATIVUS L.) СОРТОВ КОНКУРЕНТ И ФЕНИКС Татаренко...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Н.В. Сорокина Систематика млекопитающих Учебно-методический комплекс. Ра...»

«ЗАРУБЕЖНЫЙ ОПЫТ УДК 349.6 ББК 67.407 С.Н. ОВЧИННИКОВ Таможенно-правовые средства охраны природы: опыт АСЕАН Рассматриваются экологические аспекты таможенного регулирования в странах АСЕАН: защита видов животных и растений, находящихся под угрозой исчезновения, сохранение...»

«Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 151 УДК 502.34 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ Влияние эксплуатации опасных производственных объектов на современное состояние экологии в России Х...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 77–97 УДК [597.6+598.1](571.1) Л.А. Эпова1, В.Н. Куранова2, С.Г. Бабина1 Государственный природный заповедник "Кузнецкий Алатау" (г. Междуреченск) Томский государственный университет (г. Томск) ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ...»

«Экологическое общество "Зеленое спасение" Республика Казахстан, Алматы, 2008 К Третьему совещанию сторон Орхусской конвенции For the Third Meeting of the Parties to the Aarhus Convention The Ecological Society Green Salvation The Republic of Kazakhstan, Almaty, 2008 ББК 20.1 К 11 Электронные версии публикаций Экологического обще...»

«Гандзюра В.П., Гандзюра Л.А., 2008. Подходы к оценке качества вод и состояния экосистем в условиях антропогенной нагрузки //М-лы Междунар. конф. по водной токсикологии и гидроэкологии "Антропогенное влияние на водны...»

«Станякина Маргарита Владимировна ВЛИЯНИЕ ПРЕНАТАЛЬНЫХ, НАТАЛЬНЫХ И ПОСТНАТАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ НА ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ ДЕТЕЙ СТАРШЕГО ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА 19.00.02 – Психофизиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Архангельск – 2007 Работа выполнена на кафедре...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 12. 10. 2016 457 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Выдача справки об отсутствии (наличии) задолженности по арендной плате за земельный участок" В...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУД...»

«ПОЛИТБЮРО 2.0: реновация вместо демонтажа Август 2017 Перечень докладов о Политбюро 2.0 21.08.2012 Большое правительство Владимира Путина и "Политбюро 2.0" 21.01.2013 Политбюро 2.0 накануне перезагрузки элитных груп...»

«198 Matters of Russian and International Law. 2017, Vol. 7, Is. 4A УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ Особенности и специфика объекта экологического правонарушения Митякина Надежда Михайловна Кандидат юридических наук, доцент...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА Vladimir Ya. Levanidov’s Biennial Memorial Meetings Вып. 5 ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЕ ФЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ САМОК И САМЦОВ СЕВЕРООХОТОМОРСКОЙ ГОРБУШИ ONCORHYNCHUS GORBUSCHA (WALBAUM) Г.А. Агапова Институт биологических проблем...»

«УДК 338.48-6:502/504 С.М. НИКОНОРОВ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ СУЩНОСТЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ТУРИЗМА Ключевые слова: туристская конкурентоспособность, рейтинг туристской конкурентоспособности, совокупный рейтинг конкурентоспособности страны, критерии туристской конкурентоспособности, потенциал экотуризма, компоненты экотуризма, туристско-рекреа...»

«Special material. Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 191 УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ О понятии и классификации видов экологического терроризма Алексеева Анна Павловна Кандидат юридических наук, доцент, профессор, к...»

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 95–100. УДК 615.32 + 582.565.2 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СОКА КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ (CALLISIA FRAGRANS WOOD.) И ЕГО АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ (IN VITRO) * Д.Н. Оленников 1, И.Н. Зилфикаров2, А.А. Торопова1, Т.А. Ибрагимов3 © Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН,...»

«АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях 03.02.03.микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Маянский Ник...»

«Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВО О РЫБОЛОВСТВЕ И СОХРАНЕНИИ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ В ВОПРОСАХ И ОТВЕТАХ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Руководитель авторского коллектива кандидат юридических наук Д.О. Сиваков Москва ИНФРА-М УД...»

«УДК504.064.36 И. А. ШВЕДЧИКОВА, д-р. техн. наук, проф. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк;9 И. В. НИКИТЧЕНКО, асп. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЕ СИСТЕМЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПАРАМЕТРОВ ШАХТНЫХ ВОД Опред...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ И...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ"...»

«Министерство культуры Российской Федераци ФГБУК "Государственный историко-архитектурный и этнографический музей-заповедник „Кижи“" Карельский научный центр Российской академии наук Бюллетень экологических исследований на территории музея-заповед...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.