WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 ||

«V РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ПЕТРОЗАВОДСК УДК 577.112(063) ББК 28.072 Б43 СИМПОЗИУМ ОРГАНИЗОВАН ПРИ ...»

-- [ Страница 9 ] --

Cry-токсины Bacillus thuringiensis и препараты на их основе относятся к наиболее прогрессивным инсектицидам. Они избирательно воздействуют на многих представителей отрядов Lepidoptera, Diptera, и Coleoptera, но безвредны для человека.

Исследования механизмов воздействия токсинов на насекомых важны для предотвращения адаптации насекомых к Cry-токсинам, а также для улучшения препаратов на основе Cry-токсинов. Пищеварительные пептидазы в организме чувствительных насекомых проводят ограниченный гидролиз протоксина до токсина, обеспечивая активацию и растворение. Помимо этого пептидазы могут проводить дальнейший гидролиз, инактивируя токсин.

В данной работе изучали влияние Cry3Aа на экспрессию цистеиновых и сериновых пептидаз в кишечнике личинок T. molitor, чувствительных к этому токсину.

Для анализа были использованы базы EST, полученные из кишечников двух групп личинок: контрольной группы и группы, получавшей корм с добавлением 0,1% токсина Cry3Aa. Риды были получены посредством 454-пиросеквенирования с помощью Genome Sequencer FLX System (Roche). Cборку контигов осуществляли программой GS Assembler (Roche). По каждой из баз данных отдельно был проведен поиск белков, схожих по аминокислотной последовательности с катепсинами L и B, трипсинами и химотрипсинами. Обнаружено 9 различных цистеиновых пептидаз семейства папаина. Самый высокий уровень экспрессии принадлежал катепсину L. Воздействие токсина на катепсины проявляется в небольшом понижении их экспрессии. Обнаружено 20 сериновых пептидаз семейства химотрипсина, 3 аналога и 21 неактивный гомолог сериновых пептидаз. Воздействие токсина влечет за собой существенное изменение спектра сериновых пептидаз с тенденцией к снижению уровня экспрессии. Найдены также пептидазы, высоко экспрессируемые в ответ на обработку токсином, предположительно участвующие в защите организма насекомого от интоксикации.



Работа поддержана грантами РФФИ (№№ 09-04-01449-а, 11-04-93964-ЮАР_а).

Стендовые доклады 403

ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ

Мищенко Е.С., Новиков В.Ю., Мухин В.А.

Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ПИНРО), 183038 Мурманск, ул. Книповича, 6 E-mail: mishenko@pinro.ru В лаборатории биохимии ПИНРО традиционно проводятся исследования по поиску путей утилизации белковой составляющей рыбного сырья, в том числе отходов рыбопереработки; в настоящем сообщении в качестве примера рассматривается получение белковых гидролизатов с помощью комплексных ферментных препаратов. Нами был проведен гидролиз отходов переработки трески в одинаковых условиях с использованием различных протеолитических агентов: гепатопанкреаса-сырца камчатского краба и краба-стригуна, готовых ферментных препаратов (ФП): ФП из гепатопанкреаса камчатского краба, протосубтилина Г3х, панкреатина. Исследован ряд характеристик полученных ферментативных гидролизатов, что позволило оценить эффективность гидролиза нативных белков с целью определения наиболее подходящего ФП для получения гидролизатов.

Для оценки глубины протеолиза методом колоночной хроматографии проанализированы данные по фракционному составу белковых соединений в полученных гидролизатах. Во всех случаях преобладающими (более 95,5%) были низкомолекулярные фракции (менее 4 кДа). Спектральный анализ растворов в ходе проведения гидролиза выявил сходную кинетику этого процесса для всех исследуемых протеолитических агентов.





Существенные отличия наблюдались при оценке эффективности протеолиза субстрата по соотношению общего и аминного азота в образцах, а также по перераспределению сухого вещества между осадком и раствором после проведения гидролиза. Например, при использовании протосубтилина, степень гидролиза составила 24,5%, что примерно в 1,5 раза ниже, чем в случае использования ФП из гепатопанкреаса камчатского краба. Повторный ферментолиз осадков позволил повысить степень гидролиза более, чем на 10%. Показано, что для гидролиза исследуемого сырья при данных условиях из трех исследованных протеолитических агентов наиболее эффективен ФП из гепатопанкреаса камчатского краба.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ КАДМИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ У ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Репкина Н.С.

Учреждение РАН Институт биологии КарНЦ, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: ntr9@ya.ru Важную роль в защитных реакциях растений на действие различных неблагоприятных факторов среды, в том числе тяжелых металлов, играют протеолитические ферменты, участвуя в деградации белковых молекул и реакциях ограниченного протеолиза. Однако данных по экспрессии генов протеиназ при действии тяжелых металлов в настоящее время недостаточно. Учитывая это, в данной работе изучали изменения уровня экспрессии генов протеолитических ферментов при действии одного из наиболее токсичных тяжелых металлов – кадмия. Эксперименты проводили в камерах искусственного климата на семидневных проростках яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Ленинградская, которые подвергали действию сернокислого кадмия (100 мкМ) в течение четырех суток. Уровень экспрессии генов, кодирующих сериновые хлоропластные протеиназы (Clp), цистеиновые протеиназы (Сys), сериновые протеиназы митохондрий и хлоропластов (Lon1), а также ингибитор цистеиновых протеиназ (incys) в листьях пшеницы анализировали методом ПЦР в режиме реального времени.

В ходе исследований установлено, что под влиянием 1-часового воздействия кадмия изменение экспрессии всех исследуемых генов не происходит, однако уже при 5-часовой экспозиции отмечено значительное увеличение экспрессии генов Clp, Lon1 и inСys (в 2, 4 и 10 раз соответственно) по сравнению с исходным уровнем. При более длительном воздействии (3 суток) экспрессия генов Clp, Lon1 снижается в 1,5 раза, а inСys в 7 раз. При последующем воздействии (через 4 суток) отмечено снижение экспрессии указанных генов практически до исходного уровня. В отличие от этого, на протяжении всего времени воздействия кадмия отмечено ингибирование экспрессии гена Cys.

На основании полученных данных об увеличении экспрессии генов протеиназ в листьях проростков пшеницы можно предположить их участие в защитных реакциях растений в начальный период действия кадмия.

Стендовые доклады 405

НОВАЯ СЕКРЕТИРУЕМАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА

BACILLUS PUMILUS 3-19 Рудакова Н.Л., Валеева Л.Р., Балабан Н.П., Шарипова М.Р.

Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 E-mail: natalialrudakova@gmail.com В структуре геномной ДНК B. pumilus 3-19 идентифицирован ген секретируемой металлопротеиназы mprBp. Ген фермента клонирован на плазмиде pSA1 в протеазодефицитный штамм B. subtilis BG2036.

Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis выделена метллопротеиназа MprBp и очищена до гомогенного состояния при помощи хроматографии на гидрофобных сорбентах.

Методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и деградации по Эдману установлена аминокислотная последовательность зрелой металлопротеиназы.

Анализ структуры белка показал наличие двух консервативных последовательностей:

продленного мотива активного центра и структуру Met-поворота, являющихся маркерными для клана метцинкинов. Особенности структуры этих консервативных последовательностей позволили отнести металлопротеиназу MprBp к семейству адамализинов/репролизинов этого клана, который состоит из эукариотических белков высших млекопитающих и змей. Установлено, что фермент также имеет характерные структурные особенности, сближающие его с представителями семейства астацинов.

Поиск гомологичных белков в Международных базах данных позволил обнаружить 7 бациллярных белков, идентичных по структуре MprBp на 76–100% и представляющих собой адамализиноподобные ферменты с особенностями структуры астацинов. Однако, эти белки не выделены в чистом виде и их аминокислотные последовательности являются конвертированными из последовательностей соответствующих генов бацилл.

Таким образом, полученная новая секретируемая металлопротеиназа MprBp является первым представителем семейства адамализинов/репролизинов у прокариот в целом и у бацилл в частности. Возможно, смешение признаков двух семейств клана метцинкинов являются ключевой особенностью бациллярных адамализиноподобных эндопептидаз.

Работа выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009– 2013 гг.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПРИСУТСТВИЕ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА БЕЛКА,

СВЯЗЫВАЮЩЕГОСЯ С АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИМ

ФЕРМЕНТОМ

Савельев М.И., Биневский П.В., Кост О.А.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ГСП-1, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 E-mail: foresign@gmail.com Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) – цинк-зависимая пептидил-дипептидаза, состоящая из двух гомологичных доменов в составе одной полипептидной цепи – участвует в регуляции давления крови, воспалительном ответе, репродуктивной функции и др. Одним из важных клинических диагностических параметров является содержание АПФ в биологических жидкостях. Существуют данные о присутствии в биологических жидкостях человека эндогенных ингибиторов АПФ, маскирующих истинную активность фермента.

Исследования проводили на образцах сыворотки крови человека, не содержащих экзогенных ингибиторов АПФ, которые потенциально могут присутствовать при приеме донорами лекарственных препаратов. Анализ активности фермента в пуле образцов сыворотки с использованием домен-специфичных субстратов АПФ указал на возможное присутствие в нем лабильного ингибитора АПФ, обладающего преимущественно С-домен-специфичной ингибирующей активностью.

При пропускании сыворотки крови через аффинную колонку на основе иммобилизованного АПФ активность фермента в сыворотке крови по неспецифическому субстрату возросла. Определение активности АПФ с использованием домен-специфичных субстратов показало, что возрастание активности достигается в большей степени за счет увеличения вклада C-домена фермента. Анализ белков сыворотки крови, связавшихся с иммобилизованным АПФ, методом электрофореза указал на присутствие полосы с молекулярной массой около 80 кДа, которая отсутствует в смеси белков, неспецифически связавшихся с контрольной матрицей, не содержащей АПФ.

Таким образом, получены данные, указывающие на возможность присутствия в сыворотке крови не описанного ранее эндогенного ингибитора, проявляющего селективность к ингибированию С-домена, и обнаружено присутствие в сыворотке крови не описанного ранее белка, связывающегося с АПФ, имеющего молекулярную массу около 80 кДа.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 11-04-01923-а.

Стендовые доклады 407

ОЧИСТКА И ИЗУЧЕНИЕ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ

ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ IV ИЗ ЛИЧИНОК БОЛЬШОГО МУЧНОГО

ХРУЩАКА TENEBRIO MOLITOR

Смирнова Ю.А.1, Кулемзина И.А.2, Гоптарь И.А.1, Дунаевский Я.Е.2, Белозерский М.А., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н.

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.40

E-mail: yulya_82@list.ru

В нашей лаборатории при изучении пищеварительного комплекса личинок вредителя запасов зерновых культур Tenebrio molitor впервые среди насекомых была обнаружена пролинспецифичная пептидаза (ПСП), гидролизующая субстрат APpNA. Фермент не обладал активностью по отношению к субстратам других ПСП – ZAPpNA (субстрату пролилолигопептидазы (ПОП), пролилэндопептидазы (ПЭП) и пролилкарбоксипептидазы (ПКП) и ZPF (субстрату ПКП).

С использованием трех стадий очистки: гель-фильтрации на сефадексе G-150, ионообменной хроматографии на MonoQ и гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе был получен высокоочищенный препарат ПСП. Фермент проявлял активность при рН 5,0–10,0 с максимумом при рН 7,9, наибольшая стабильность ПСП наблюдалась на участке рН 5,0–7,2 (2 ч, 37оС). Ингибиторный анализ показал, что активность фермента подавлялась ингибиторами сериновых пептидаз, диизопропилфторфосфатом и фенилметилсульфонилфторидом.

Ингибиторы цистеиновых, аспартильных и металлопептидаз (L-транс эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино)бутан, пепстатин и EDTA, соответственно), не влияли на активность фермента, также как и бестатин, ингибитор аминопептидаз. Специфический ингибитор ПОП ZP-prolinal снижал активность пептидазы на 40%. HgCl2, неспецифический ингибитор SH-зависимых ферментов, существенно снижал, а дитиотреитол повышал активность пептидазы на 10–20%. Таким образом, исходя из полученных свойств, выделенная и исследованная ПСП была отнесена к дипептидилпептидазам (ДПП) IV (КФ 3.4.14.5). Показано, что выделенный фермент является секретируемой пищеварительной пептидазой – 60% активности ДПП IV сосредоточено в содержимом передней части средней кишки.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 09-04а, 09-03-01007-а, 11-04-93964-ЮАР_а).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОТЕАЛИЗИНА ПРИ ИНВАЗИИ

БАКТЕРИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

Цаплина О.А.1, Ефремова Т.Н.1, Демидюк И.В.2, Хайтлина С.Ю.1 Учреждение РАН Институт цитологии РАН, 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: olga566@mail.ru

Условно-патогенные бактерии Serratia proteamaculans, синтезирующие актин-специфическую металлопротеиназу протеализин, способны проникать в эукариотические клетки (Цаплина и др., 2009). При введении гена протеализина способность к инвазии в эукариотические клетки приобретают и неинвазивные бактерии E. coli (Bozhokina et al, 2011). Инвазия может быть вызвана проникновением протеиназы в эукариотические клетки, а также активацией других ферментов в самой бактерии или во внеклеточной среде. Вне клетки бактериальные протеиназы могут напрямую приводить к деградации внеклеточного матрикса или активировать матриксные металлопротеиназы (ММП). Ранее мы показали, что по данным зимографии протеализин может быть активатором ММП-2 (Цаплина и др., 2009). С другой стороны, актин специфически расщепляется протеализином, что может обеспечивать перестройки актинового цитоскелета в эукариотической клетке, необходимые для интернализации бактерий (Цаплина и др., 2009, 2011). Поэтому задачей работы было определение локализации протеализина при бактериальной инвазии. С помощью конфокальной микроскопии с поликлональными антителами к протеализину протеиназа была обнаружена при инвазии бактерий S.

proteamaculans во внеклеточной среде и внутри клеток 3T3 Balb SV40. При инвазии рекомбинантных бактерий E. coli, синтезирующих протеализин, фермент был обнаружен не только во внеклеточной среде и внутри эукариотических клеток, но и была выявлена совместная локализация бактерий-продуцентов с протеализином.

Добавление протеализина во внеклеточную среду вызывает нарушение структуры цитоскелета, но не приводит к проникновению неинвазивных бактерий E. coli внутрь эукариотических клеток, несмотря на то, что активность протеиназы сохраняется до конца срока инкубации эукариотических клеток с бактериями. Таким образом, протеализин, по-видимому, способствует инвазии бактерий, оказавшись внутри эукариотической клетки, и его наиболее вероятной мишенью является актин.

Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00393 и Программой РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Стендовые доклады 409

–  –  –

Создание новых лекарственных средств V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ RHODOSPIRILLUM RUBRUM

Покровский В.С.1, Покровская М.В.1, Александрова С.С.1, Андрианов Р.М.2, Жданов Д.Д.1, Омельянюк Н.М.1, Соколов Н.Н.1 Учреждение РАМН Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

E-mail: vadimpokrovsky@yandex.ru

Сконструирован стабильный штамм-продуцент [Е. coli BL21 (DE3)/pET23a/RrA], характеризующийся высоким выходом рекомбинантной L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum (RrA). После ультразвукового разрушения клеток фермент выделяли последовательно на колонках с Q-sepharose и DEAE-Toyopearl. От применяемой в клинической онкологии L-аспарагиназы E. coli (ЕсА) RrA отличается внутриклеточной локализацией, в 2 раза более короткой аминокислотной последовательностью (172 аминокислотных остатка) и низкой гомологией (менее 45%).

Km RrA для L-аспарагина составляет 0,22 мM, Vэфф. 5,32 мМ/мин (при концентрации фермента в реакционной смеси 2,1 мкМ). Температурный оптимум действия RrA 54–55 °C, при 36–37°С активность составляет не менее 72% от максимальной. Зависимость активности фермента от температуры аналогична таковой для препаратов, применяемых в клинической практике. Оптимум pH 9,2, при физиологических значениях рН7,4 активность составляет 20–30% от максимальной.

Активность RrA максимальна при ионной силе в диапазоне концентрации КСl от 750 мМ до 1250 мМ (натрий-фосфатный буфер, рН 8,0). Уменьшение ионной силы (0 мМ KCl) приводит к снижению активности на 30%, увеличение (3000 мМ KCl) – к снижению более чем в 2 раза. L-глутаминазная активность составляет не более 0,1% от L-аспарагиназной. К температурной денатурации RrA несколько более устойчива, чем EcA: инкубация в течение 3 мин при 60°С приводит к практически полной инактивации EcA (8% от активности, наблюдаемой при 37°С) при сохранении активности RrA на уровне 27%. Резкое падение активности начинается для RrA при инкубации 3 мин при температуре выше 57°С. Значимой ренатурации при понижении температуры не происходит. При 37°С активность RrA сохраняется более суток. Инкубация RrA в течение 1 ч с 0–3 М мочевиной продемонстрировала несущественное снижение активности (сохраняется не менее 70% от исходной), дальнейшее повышение концентрации мочевины приводит к полной инактивации.

Полученные данные позволяют считать, что при условии подтверждения противоопухолевой активности рекомбинантная RrA может стать интересным для дальнейшего изучения противоопухолевым ферментом с перспективой разработки на ее основе лекарственной формы.

Стендовые доклады 411

ПОЛУЧЕНИЕ, ОЧИСТКА И ПРОВЕРКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АКТИВНОСТИ ХИМЕРНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА

КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Байков И.К., Матвеев А.Л., Матвеева В.А., Бабкина И.Н., Леванов Л.Н., Рихтер В.А., Тикунова Н.В.

Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8 E-mail: ivan_baykov@mail.ru Вирус клещевого энцефалита является актуальной проблемой для жителей Урала, Сибири и Дальнего Востока. Основным способом борьбы с этим заболеванием является вакцинация, однако доля людей, не прошедших вакцинацию, достаточно велика. В таких случаях предотвратить развитие вирусной инфекции можно путём введения в организм пациента иммуноглобулинов человека против вируса клещевого энцефалита. Противовирусный иммуноглобулин, который производят в России в настоящее время, получают из крови доноров. Поскольку такой препарат является и дефицитным, и небезопасным, актуальна задача получения рекомбинантных антител человека против вируса клещевого энцефалита.

Химерное антитело создавали на основе последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие домены мышиного моноклонального антитела, способного нейтрализовать вирус клещевого энцефалита. Были сконструированы две плазмидные ДНК, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепь химерного антитела и содержащие гены устойчивости к двум различным антибиотикам. Обе плазмиды использовали для одновременной трансфекции эукариотических клеток CHO-K1.

Эта линия характеризуется приемлемым уровнем продукции белков и является аттестованной для получения рекомбинантных терапевтических препаратов. После того, как было установлено, что клетки продуцируют необходимое антитело, произвели хроматографическую очистку антитела с использованием белок А-сефарозы в качестве аффинного сорбента. Далее была исследована функциональная активность полученного препарата химерного антитела в реакции связывания с рекомбинантным аналогом поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита и произведена оценка константы связывания антитела с этим белком.

Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «У.М.Н.И.К.»

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕЙРОТЕНЗИНПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ

С ДОФАМИНОВОЙ СИСТЕМОЙ

Батищева Е.Ю.1, Мешавкин В.К.1, Кост Н.В.1, Беляева М.Л.1, Андреева Л.А.2, Золотарев Ю.А.2, Мясоедов Н.Ф.2 Учреждение РАМН Научный центр психического здоровья РАМН, 115522 Москва, Каширское шоссе, 34 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2

E-mail: batishcheva@gmail.com

Ранее нами в экспериментах на животных было показано, что олигопептиды, содержащие фармакофор нейротензина (Pro-Tyr) и названные нейротензинподобными пептидами (НТП), обладают свойствами, характерными для антипсихотиков. В частности, в поведенческих тестах с использованием дофаминомиметика апоморфина НТП проявили себя в качестве фармакологических антагонистов дофамина.

Для выяснения молекулярного механизма дофаминблокирующего действия НТП результаты поведенческих экспериментов были сопоставлены с данными радиолигандного анализа вытеснения пептидами селективного антагониста D2 и D3 дофаминовых рецепторов сульпирида и агониста D3 и D2 рецепторов 7-OH-DPAT из мембран клеток стриатума крыс. Предполагается, что НТП, конкурирующие с сульпиридом за места специфического связывания, способны непосредственно взаимодействовать с дофаминовыми рецепторами. В то время как на связывание 7-OH-DPAT НТП могут влиять за счет прямой конкуренции, либо аллостерической модуляции аффинности агониста к рецепторам, как это описано в литературе для самого нейротензина. Проведенное исследование выявило НТП, взаимодействующие с D2 рецепторами как по конкурентному, так и по аллостерическому механизмам. Причем в большинстве случаев способность НТП влиять на связывание лигандов дофаминовых рецепторов in vitro совпадала с их эффективностью в тестах «вертикализация» и «зевание», поведенческие проявления которых индуцированы апоморфином. Полученные данные позволяют предполагать, что один из механизмов антипсихотического действия НТП опосредован центральными дофаминовыми рецепторами. Для подтверждения этого предположения, однако, необходимы фармакокинетические исследования распределения и скорости гидролиза НТП в тканях мозга.

Стендовые доклады 413

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ФАКТОРА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ (44-77) ПРЕПЯТСТВУЕТ РАЗВИТИЮ

ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ РОГОВИЦЫ

Бейрахова К.А.1, Чупова Л.А.1, Лихванцева В.Г.2, Степанова Е.В.3, Есипов Р.С.1 Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Учреждение РАН Центральная клиническая больница РАН, Москва ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

E-mail: esipov@mx.ibch.ru

Фактор дифференцировки пигментного эпителия (pigment epithelial-derived factor, PEDF), секретируемый гликопротеин размером 50 кДа, входит в ряд сильнейших эндогенных ингибиторов ангиогенеза. Фрагмент PEDF (44-77) обладает антиангиогенными свойствами полноразмерного белка и представляет собой потенциальный препарат для лечения заболеваний органов зрения, сопровождающихся патологической неоваскуляризацией.

В данной работе мы предлагаем эффективный масштабируемый биотехнологический способ получения фрагмента PEDF (44-77) в составе гибридного белка (ГБ) с интеином SspDnaB. ГБ получали в бактериальных клетках E. coli в виде телец включения, солюбилизировали и подвергали автокаталитическому расщеплению с образованием свободного фрагмента PEDF (44-77) (выход реакции 87%).

Целевой пептид отделяли от интеина с помощью тангенциальной ультрафильтрации. Окончательную очистку PEDF (44-77) производили с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выход целевого пептида (чистота 99%) составил 38 мг с 1 л культуры.

Антиангиогенная активность полученного пептида была подтверждена in vitro с использованием культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10. Выявлена способность препарата в дозе 1 нМ подавлять пролиферацию эндотелиальных клеток на 53%, а также ингибировать образование трубочкоподобных структур эндотелиальными клетками. На экспериментальной модели неоваскуляризации роговицы кролика была показана способность полученного рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77) блокировать начальные этапы ангиогенеза (пролиферацию, миграцию эндотелиальных клеток, формирование капилляроподобных структур) при одновременном введении с индукторами ангиогенеза.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

СИНТЕЗ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ВЫСОКОАФФИННОГО

РЕЦЕПТОРА FcR1 ИММУНОГЛОБУЛИНА Е, ОБЛАДАЮЩИХ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Грибовская О.В.1, Мартинович В.П.1, Янченко В.В.2, Голубович В.П.1, Новиков Д.К.2 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141 Минск, ул. Ак. Купревича, 5/2, Беларусь Витебский государственный медицинский университет, 210602 Витебск, ул. Фрунзе, 27, Беларусь

E-mail: olgamel@iboch.bas-net.by

Высокоаффинный рецептор FcRI является ключевым соединением, участвующим в IgE-зависимых аллергических реакциях немедленного типа. Методами компьютерного моделирования был определен минимальный участок структуре FcR1 рецептора, принимающий участие в связывании с С3 и С4-фрагментом иммуноглобулина, (последовательность Arg111-Asn112-Trp113-Asp114).

В качестве возможных аналогов высокоаффинного рецептора FcRI, способных связываться с Fc-участком IgE, был предложен ряд пептидных соединений, содержащих последовательность Arg-Asn-Trp-Asp. Синтез пептидов осуществляли классическим методом в растворе с использованием водородолабильных защит для блокирования боковых функциональных групп и трет.бутилоксикарбонильной защиты – для -аминогрупп. В качестве конденсирующего агента при образовании пептидной связи использовали диизопропилкарбодиимид, в качестве противорацемической добавки – 1-оксибензотриазол. Идентификацию целевых соединений выполняли методами количественного аминокислотного анализа и масс-спектрометрии, гомогенность подтверждали методами ТСХ и аналитической ВЭЖХ.

Биологические исследования соединений показали, что они обладают иммуномодулирующим эффектом и способны связываться с IgE. Доказана способность пептидов связывать специфические антитела Е класса к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus из раствора сывороток больных аллергической бронхиальной астмой. На экспериментальной модели аллергической бронхиальной астмы показано иммуносупрессивное действие одного из синтезированных соединений на развитие IgE-зависимой аллергии, что подтверждает специфическую активность и эффективность данного потенциального лекарственного средства, на основе которого можно создать универсальный препарат для предотвращения I типа аллергических реакций.

Обсуждаются возможности применения данных соединений в диагностике и лечении IgE-зависимых аллергопатологий.

Работа выполнена при поддержке гранта БРФФИ №Х09М-017.

Стендовые доклады 415

ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА PRO-GLY-PRO НА ПОТРЕБЛЕНИЕ ЭТАНОЛА

И ПОВЕДЕНИЕ САМЦОВ БЕЛЫХ КРЫС СО СФОРМИРОВАННОЙ

АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТЬЮ

Ефимова Е.В., Ловать М.Л.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва E-mail: e.v.efimova@mail.ru Известно, что трипептид PGP обладает способностью оказывать противострессогенное влияние на поведение у крыс. В препарате Семакс, эффективность которого была нами показана при терапии алкогольной зависимости, данный трипептид присоединен в качестве стабилизирующего фрагмента и, таким образом, может отвечать за часть терапевтических эффектов препарата.

Целью настоящей работы было изучить действие PGP на алкогольную мотивацию и поведение предварительно алкоголизированных крыс.

Работа была выполнена на самцах белых крыс (n=73), которые были алкоголизированы по методике свободного выбора между 15% раствором этанола и водой в течение 6 месяцев. Уровень потребления чистого этанола у животных составлял около 1 мл/сут. Затем, начиная со второго дня депривации от этанола, животным интраназально ежедневно, в течение 5 дней вводили PGP в дозе 50 мкг/кг в день.

На фоне алкогольной депривации производилась оценка поведения животных в тесте открытое поле, крестообразный приподнятый лабиринт, закрытый крестообразный лабиринт, тест Порсольта. После 10 дней депривации животным снова предоставляли доступ к 15% этанолу и измеряли его потребление при свободном выборе.

Введение PGP приводило к статистически значимому повышению (на 49,5%, р0,05) уровня потребления этанола в течение первой недели предоставления алкоголя после депривации, что сходно с действием Семакса в высокой дозе (200 мкг/кг). Однако, введение PGP выраженного влияния на параметры поведения не оказывало, в то время как введение Семакса оказывает положительный эффект на поведенческие параметры, повышая локомоторную активности и снижая депрессивность. Введение Семакса вызывает повышение уровня дофамина и его метаболитов в стриатуме мозга алкоголизированных животных, в то время как введение PGP такого эффекта не оказывало.

Таким образом, трипептид PGP оказывал влияние на алкогольную мотивацию, однако, в отличие от препарата Семакс, выраженного эффекта на поведенческие параметры не имел. Следовательно, механизмы, лежащие в основе поведенческих эффектов Семакса и его влияние на потребление этанола могут иметь разную природу.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН КАК РЕГУЛЯТОР АКТИВНОСТИ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Зубкова Е.С.1, Семенкова Л.Н.2, Дудич Е.И.2, Парфенова Е.В.1, Меньшиков М.Ю.1 НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» Минздравсоцразвития РФ, Москва ОАО «Институт инженерной иммунологии», пос. Любучаны, Чеховский р-н, Московская обл.

E-mail: zubkova@cardio.ru

Повышение эффективности клеточной терапии связано с поиском факторов, усиливающих жизнеспособность клеток после их трансплантации в поврежденную ткань. Особое внимание привлекают к себе белковые и пептидные молекулы, вовлеченные в процессы эмбрионального развития. В этой связи выглядит перспективным использование альфа-фетопротеина (АФП), основного белка сыворотки, выявляемого на ранних стадиях эмбриогенеза и при развитии раковых опухолей.

АФП имеет в своем составе ряд регуляторных эпитопов, определяющих его участие в регуляции иммунитета, клеточной пролиферации, опухолевой активности и ряде других процессов. АФП является противовоспалительным фактором, рецептор к АФП обнаружен на моноцитах и лимфоцитах человека.

Нами получен рекомбинантный гликозилированный АФП человека, экспрессирующийся в дрожжевой системе, и разработана схема его очистки.

Исследования на первичной культуре стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ) показали, что АФП усиливает пролиферацию и секрецию ими фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF). Связывание АФП с клетками запускает сигнальные пути, опосредуемые митоген-активируемыми протеинкиназами (МАПкиназами) ERK1/2, кроме того, ФИТЦ-меченный АФП интернализуется в СКЖТ по клатрин-опосредованному механизму в течение часа. АФП оказывает также воздействие на активность воспалительных клеток, стимулируя инвазию моноцитов THP-1 в Матригеле и образование в них матриксной металлопротиназы-9, опосредуемое активацией МАП-киназных каскадов ERK1/2, p38, JNK и активацией фактора транскрипции NFB.

На экспериментальной модели ишемии нижней конечности мыши мы показали, что СКЖТ, культивированные с АФП в дозе 100 мкг/мл, способствуют улучшению восстановления кровотока по сравнению с нестимулированными СКЖТ.

Таким образом, рекомбинантный АФП является перспективным кандидатом для повышения эффективности клеточной терапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МНТЦ, проект № 3808.

Стендовые доклады 417

БИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА СУРФАКТАНТ

C-ИНТЕРФЕРОНКузнецова Н.Р., Антипова Н.В., Болдырев И.А., Шахпаронов М.И., Завалова Л.Л.

Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: natalia@lipids.ibch.ru Эффективное использование интерферона- (IFN) в терапевтических целях в виде ингаляции ограничивается его высокогидрофильными свойствами и как следствие низкой биодоступностью. Ранее на основе конструкции, включающей в себя части генов, кодирующих белок IFN и белок сурфактанта С, SpC, был получен рекомбинантный химерный белок IFN-SpC*. Фрагмент SpС представляет собой

-спираль, содержащую 10 остатков валина, и призван удерживать химерный белок в гидрофобных матрицах. С целью подтверждения функциональности каждой из двух частей гибридный белок вводили в состав липосом и определяли эффективность включения, а также нативность структуры домена IFN.

Модельные флуоресцентномеченные липосомы (L) состава яичный фосфатидилхолин (PC)-BODIPY-PC**, 9.99:0.01, среднего размера ~100 нм готовили стандартным методом экструзии (1 мг/мл PBS). IFN-SpC (2 нмоль) добавляли (а) на стадии гидратирования липидной пленки либо (б) к свежеприготовленным липосомам (инкубация при 37С в течение 2 ч). Полученные суспензии IFN-SpC-L анализировали с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75. За элюцией липосом следили по флуоресценции BODIPY-PC. Количество IFN-SpC во фракциях определяли параллельно по флуоресценции Trp и по методу Лоури. Показано, что гибридный белок количественно встраивается в липидный бислой липосом независимо от способа приготовления.

Активность IFN в молекуле химерного белка подтверждали иммуноферментным анализом (ИФА) c использованием поликлональных антител к полноразмерному IFN по стандартной методике на планшетах Pierce HisGrab (Thermo Scientific). По результатам ИФА образцы IFN-SpC и IFN-SpC-L взаимодействовали с антителами к полноразмерному IFN, то есть фрагмент IFN в составе IFNSpC экспонирован на поверхности липосом и способен проявлять биологическую активность.

________ * Гибридный белок сурфактант-интерферон для медицинского применения, патент № 2391403.

** BODIPY-PC, 1-пальмитоил-2-[-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)гептаноил]-sn-глицеро-3-фосфохолин.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ ХЕМОКИНОВОГО ДОМЕНА ФРАКТАЛКИНА:

ВЛИЯНИЕ НА МИГРАЦИЮ МОНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Кухтина Н.Б., Сидорова М.В., Азьмуко А.А., Беспалова Ж.Д., Красникова Т.Л.

Институт экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ, 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а E-mail: kukhtina@cardio.ru Фракталкин (CX3CL1) – единственный хемокин семейства CX3C, уникальный по своей структуре и функциям. CX3CL1 состоит из экстраклеточного хемокинового домена, трансмембранного и внутриклеточного доменов. CX3CL1 существует в мембранносвязанной форме, проявляя свойства молекулы адгезии. Под влиянием металлопротеиназ хемокиновый домен CX3CL1 отщепляется и действует как хемоаттрактант. Растворимая форма CX3CL1 вызывает миграцию моноцитов/макрофагов, Т-лимфоцитов и NK-клеток в участки воспаления. Фракталкин экспрессируется дендритными, эндотелиальными, гладкомышечными клетками и нейронами и связывается с рецептором CX3CR1 клеток иммунной системы. В экспериментах на животных показано, что взаимодействие фракталкина с рецептором играет существенную роль в атерогенезе, ревматоидном артрите и нефропатии. В связи с этим фракталкин рассматривается как потенциальная мишень для противовоспалительного воздействия.

Мы проанализировали структуру хемокинового домена фракталкина с помощью программ Peptide Companion для поиска фрагментов, соответствующих линейным эпитопам домена. Были выявлены и синтезированы целевые пептидные фрагменты 41-52, 53-60 и 60-71 последовательности хемокинового домена фракталкина. Активность пептидных фрагментов оценивали по миграции CD16+CX3CR1+ моноцитарных клеток периферической крови человека в модифицированной камере Бойдена.

Фракталкин (100 нг/мл) достоверно стимулировал миграцию моноцитов. Анализ действия пептидных фрагментов (1–100 мкг/мл) показал, что фрагмент 41-52 достоверно (на 50% по сравнению со спонтанной миграцией) стимулировал миграцию клеток. Пептиды 53-60 и 60-71 ингибировали миграцию моноцитов, стимулированную фракталкином, на 70% и 60%, соответственно. Предполагается, что пептидные фрагменты 53-60 и 60-71 последовательности хемокинового домена фракталкина являются потенциальными противовоспалительными агентами.

Стендовые доклады 419

ОТБОР СТАБИЛЬНОГО КЛОНА КЛЕТОК CHO K1,

ПРОДУЦИРУЮЩИХ ХИМЕРНОЕ АНТИТЕЛО

Матвеев А.Л.1,2, Байков И.К.1, Матвеева В.А.1, Тикунова Н.В.1 Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Ак. Лаврентьева, 8 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2

E-mail: guterus@gmail.com

Одной из важнейших задач современной биотехнологии является создание стабильных линий эукариотических клеток, способных экспрессировать терапевтические препараты с корректной четвертичной структурой и правильным гликозилированием, которые могли бы заменить препараты получаемые из донорской крови людей, из животных и бактерий. На данный момент терапия клещевого вирусного энцефалита основана на использовании гамма-глобулина из донорской крови, при которой возникает ряд осложнений. Это делает необходимым разработку новых методов лечения данного заболевания. Один из подходов – создание терапевтических антител, обладающих протективными свойствами к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) и позволяющих обезвредить вирус в организме больного человека.

Целью данной работы являлось получение клона эукариотических клеток, стабильно секретирующих химерные антитела против вируса клещевого энцефалита.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

оптимизировать условия трансфекции плазмидной ДНК эукариотических клеток;

оптимизировать условия для селективного культивирования трансфицированных клеток; отобрать клон, стабильно секретирующий химерное антитело.

В ходе работы была определена минимальная посевная доза клеточной линии CHO K1, определена минимальная летальная доза селективных антибиотиков geneticin G-418 и Hygromicin B. Выбран поликатионый липид Lipofectamine 2000 для одновременной трансфекции клеток CHO K1 двумя плазмидами, кодирующими тяжелую и легкую цепь химерного антитела человека. Показана секреция химерного антитела и через 120 часов после трансфекции клеток. Проведено клонирование и выделение стабильного клона, продуцирующего химерное антитело против вируса клещевого энцефалита. Выполнено сравнение титра антител в культуральной жидкости при нормальных и при истощающих условиях нароботки антител. Проведена наработка стабильного клона в препаративных количествах, очищено химерное антитело и подтверждена его функциональная активность.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СЕПСИСА У КРЫС

И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

С ПОМОЩЬЮ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 кДа

Остров В.Ф.1, Евгеньев М.Б.2, Мурашев А.Н.1 Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.

Учреждение РАН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

E-mail: ostrov-vladimir@yandex.ru

Несмотря на достижения науки и клинической медицины, сепсис остается одним из наиболее опасных заболеваний и является основной причиной летальных исходов в палатах интенсивной терапии. Этот патологический процесс развивается при проникновении в системный кровоток больших количеств бактерий и их компонентов. В экспериментальной фармакологии сепсис моделируют с помощью эндотоксических липополисахаридов (LPS) и липотейхоевых кислот (LTA), которые являются компонентами клеточной стенки Грам(-) и Грам(+) бактерий, соответственно. Эти молекулы взаимодействуют с Toll-like рецепторами на поверхности моноцитов, нейтрофилов. В результате происходит секреция в кровь токсических количеств цитокинов, физиологические эффекты которых и определяют клиническую картину.

Одним из возможных путей борьбы с сепсисом являются белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70). Известно, что они также способны связываться с Toll-like рецепторами, а также в экспериментах in vitro могут взаимодействовать с молекулами LPS.

Полученные нами в последние годы данные позволяют сделать несколько выводов: 1). Превентивное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при экспериментальном сепсисе у крыс оказывает выраженное защитное действие и уменьшает токсические эффекты LPS из E.coli или LTA из S.aureus. 2). При введении rhHSP70 после LPS защитные свойства выражены значительно слабее. 3). Наблюдается зависимость защитного эффекта от дозы вводимого rhHSP70. Снижение в два раза дозы, эффективной на модели экспериментального сепсиса (266 мкг/кг), приводит к заметному ослаблению защитного действия rhHSP70. 4). Введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг крысам не влияет на изучаемые физиологические параметры гемодинамики, системы коагуляции и биохимические показатели крови животных. 5). rhHSP70 является малоопасным, умеренно токсичным и не проявляет токсического действия при однократном внутривенном введении мышам в дозе 26,6 мг/кг, которая в 100 раз превышает дозу, эффективную при экспериментальном сепсисе.

Стендовые доклады 421

ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ НА ОСНОВЕ АПТАМЕРОВ

Пупов Д.В.1, Есюнина Д.М.1,2, Кульбачинский А.В.1 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва

E-mail: danila@pupov.ru

Бактериальная РНК-полимераза (РНКП) является одной из наиболее привлекательных клеточных мишеней для создания новых антибактериальных препаратов.

Несколько известных антибиотиков, наиболее важным из которых является рифампицин, ингибируют активность РНКП и используются при лечении различных заболеваний. К сожалению, возбудители бактериальных инфекций с достаточно высокой частотой приобретают устойчивость к антибиотикам. Таким образом, очень актуальным является вопрос разработки новых ингибиторов РНКП, которые обладали бы положительными фармакологическими свойствами известных антибиотиков, но имели бы другой механизм действия на РНКП и другой сайт связывания на ферменте, что позволило бы преодолеть проблему существующей устойчивости.

Нами охарактеризованы новые лиганды к бактериальной РНКП на основе оцДНК-аптамеров, которые связываются с РНКП с высокой аффинностью и специфичностью. В частности, с использованием методов отбора in vitro получено несколько различных классов аптамеров, которые взаимодействуют с кор-ферментом, либо с холоферментом РНКП Escherichia coli. С использованием мутантных вариантов РНКП сайты связывания аптамеров локализованы в разных участках фермента. Показано, что полученные аптамеры способны ингибировать инициацию транскрипции и взаимодействие РНКП с промоторами, по-видимому, за счет конкуренции с ДНК за связывание с ферментом. Некоторые из полученных аптамеров способны также конкурировать за связывание с антибиотиком рифампицином, что указывает на перекрывание сайтов связывания данных лигандов с РНКП. В перспективе полученные ДНК-аптамеры послужат основой для разработки тест-системы, позволяющей проводить скрининг соединений, связывающихся в тех же функционально-важных районах РНКП, что и аптамеры, и ингибирующих работу фермента.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (госконтракт № 02.740.11.0771) и Гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых ученых (МД-618.2011.4).

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМАРКЕРНЫХ

ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ В КАЧЕСТВЕ БИОБЕЗОПАСНЫХ

ПРОДУЦЕНТОВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В

Пучко Е.Н., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290 Пущино, Московская обл., просп. Науки, 6 E-mail: Elena.puchko@gmail.com Целью работы стало получение безмаркерных растений с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и исследование иммуногенности полученных растений. Разработан способ получения трансгенных растений, не содержащих селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. При его использовании сокращается время отбора трансгенных растений и появляется возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена с помощью ИФА. Для трансформации растений создана плазмида pBM-Ag, содержащая ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS без селективного гена устойчивости к канамицину nptII. Разработан метод трансформации растительных эксплантов, позволяющий повысить эффективность получения трансформантов до 10–20%.

Синтезированный в растениях поверхностный антиген вируса гепатита В по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам не отличался от антигена, полученного из клеток дрожжей. На лабораторных мышах проведен анализ иммуногенности пероральной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. В эксперименте использовали три группы лабораторных аутбредных мышей NMRI. Мыши двух групп питались трансгенным картофелем, синтезирующим HBs-антиген. Одна из групп мышей получала в качестве адъюванта ГМДП. Сыворотка крови иммунизированных животных проанализирована с помощью иммуноферментного анализа. Уровень антител к HBs-антигену был значительно выше протективного (до 350 ммЕ/мл) и сохранялся в течение более года после начала иммунизации. До настоящего времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности при использовании трансгенных растений в качестве съедобной вакцины. Полученные данные показывают перспективность использования трансгенных растений в качестве субстанции для производства безопасной съедобной вакцины против вируса гепатита В.

Исследование выполнено при поддержке РФФИ (проект № 11-08-00413) и Программы Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса (У.М.Н.И.К)»-2009.

Стендовые доклады 423

ПРОТЕИНАЗА 3С ВИРУСА ГЕПАТИТА А ЧЕЛОВЕКА

ВЫЗЫВАЕТ КАСПАЗОНЕЗАВИСИМУЮ ГИБЕЛЬ РАКОВЫХ КЛЕТОК

Шубин А.В., Лунина Н.А., Рощина М.П., Демидюк И.В., Костров С.В.

Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 E-mail: shav@inbox.ru Развитие генной терапии онкологических заболеваний даёт надежду на разработку новых эффективных методов лечения рака. Одной из наиболее перспективных современных парадигм генной терапии злокачественных опухолей является введение в раковые клетки генов, которые способны индуцировать клеточную гибель. В рамках этого подхода создан ряд перспективных лекарственных средств, часть из которых находится в стадии доклинических и клинических испытаний. В то же время, в связи с разнообразием раковых опухолей не представляется возможным найти одно универсальное средство для лечения всех онкологических заболеваний. Поэтому поиск новых генов – агентов противораковой терапии остаётся чрезвычайно актуальным. В данной работе исследована возможность использования гена протеиназы 3С вируса гепатита А человека (3Cpro) в качестве потенциального противоракового геннотерапевтического агента.

Цитотоксическое действие гена 3Cpro было оценено с использованием раковых клеток лёгкого человека линий A549 и Calu-1. Тип клеточной гибели определяли по морфологическим признакам, проницаемости клеточной мембраны, активности каспаз и экспонированию фосфатидилсерина на внешней стороне цитоплазматической мембраны.

Введение гена 3Сpro вызывает гибель более 80% раковых клеток. При этом гибель клеток происходит по нескольким механизмам. Первый характеризуется активацией каспаз и другими признаками, характерными для апоптоза. Второй механизм является каспазонезависимым и сопровождается интенсивным накоплением в цитоплазме вакуолей предположительно лизосомального происхождения.

Агенты, запускающие альтернативные апоптозу механизмы клеточной гибели, рассматриваются как перспективные благодаря их способности вызывать гибель клеток, резистентных к индукторам апоптоза.

Полученные результаты позволяют считать ген протеиназы 3C перспективным агентом противораковой генной терапии.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

–  –  –

ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ

СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ АДАМАНТАНОВОГО РЯДА

В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА А H1N1v И H3N2

С ПОМОЩЬЮ АМИНОКИСЛОТНЫХ И ПЕПТИДНЫХ ОСТАТКОВ

Гараев Т.М., Шибнев В.А., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И.

ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16 E-mail: gtim@fmradio.ru В результате химического прессинга адамантансодержащих препаратов на вирусы гриппа А H1N1v и H3N2 к ним возникла резистенция достигающая 90%. Это является следствием произошедшей у этих вирусов мутации, в результате которой возникли аминокислотные замены в протонпроводящем канале, образованным белком М2. В этом случае ремантадин (Rem-) уже не влияет на транспорт протонов, обеспечивающий репликацию вируса. Одним из путей реанимации в ремантадине противовирусной активности может быть обеспечение адамантанового карбоцикла дополнительными функционально активные группами (имдазольной, гуанидиновой и др.), используя для этого аминокислоты или пептиды. К ремантадину, имеющему одну аминогруппу, их можно присоединять методом смешенных ангидридов, используя для защиты соответствующих аминогрупп аминокислот и пептидов Вос-группу. Была получена серия соединений, противовирусная активность которых была оценена методом ИФА с использованием штаммов A/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)v и А/Москва/26/2009 (H3N2), резистентных к ремантадину. Процент ингибирования вирусной активности соединениями определяли, как отношение (оптическая плотность (ОП)492 опыта минус ОП492 клеточного контроля / ОП492 вирусного контроля минус ОП492 клеточного контроля), умноженного на 100%. В зависимости от их противовирусной активности их можно разделить на две группы. Одна включает восстановленную противовирусную активность порядка 50%, другая – от 70 до 90%. К последним относятся гистидил-1-адамантоил-1-этиламин (His-Rem), 94%; ди-Вос-орнитил-1-адамантоил-1-этиламин (диВос-Оrn-Rem), 70%; Вос-саркозил-1-адамантоил-1-этиламин (Boc-Sar-Rem), 70%;

1-адамантоил-1-этил-2 аминоэтансульфоновой кислоты (тaурил-Rem), 70%; 1 адамантоил-1-этиламид--липоевой кислоты 80%; (Вос)2-Lis-Lis(Z)-1-адамантоил этиламин, 70%; бис-[метиловый эфир серина]-1,3-адамантаилдиуксусной кислоты, (1,3-Аd-(CH2-Ser(OCH3))2), 98%. Производные ди- и триглицинов, а также дии трипролинов были неактивны. Рассматривается зависимость противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А от структуры полученных соединений.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ

Т-ЛИМФОЦИТОВ У МОЛОДЫХ И СТАРЫХ ЖИВОТНЫХ

Линькова Н.С., Чалисова Н.И., Концевая Е.А., Катанугина А.С., Хавинсон В.Х.

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 С.-Петербург, пр. Динамо, 3 E-mail: miayy@yandex.ru Пептидная регуляция активности иммуногенеза в периферических органах иммунной системы является важным аспектом в профилактике ускоренного старения. Целью исследования явилось изучение влияния пептидов на пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов селезенки молодых и старых крыс в органотипической культуре.

Культивирование фрагментов селезенки молодых и старых крыс (37С, 5% СО2) проводили в чашках Петри в 3 мл среды (45% раствора Хенкса, 45% среды Игла, 10% FBS, глюкоза 10 мг/мл, гентамицин 0.5 мг/мл). Исследовали 8 контрольных культур и 24 культуры с введением дипептида H-Lys-Glu-OH, трипептида H-Lys-Glu-Asp-OH и тетрапептида АЕ-0 H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH в концентрации 10 нг/мл. Через 3 сут культуры фиксировали 95% этанолом для проведения иммуноцитохимии. Первыми антителами служили моноклональные мышиные антитела к недифференцированным цитотоксическим Т-лимфоцитам CD8 (1:30, Novocastra), вторыми антителами служил набор биотинилированных иммуноглобулинов. Оценку относительной площади окрашивания в % проводили на системе компьютерного анализа изображений Nikon Eclipse в программе «Видеотест-Морфология 5.0».

Площадь экспрессии CD8 в контрольных культурах селезенки у молодых крыс составила 0,69±0,19%, тогда как у старых крыс экспрессия СD8 возрастала в 9,3 раза и составила 6,40±0,45%. Под действием дипептида площадь экспрессии CD8 у молодых крыс возрастала относительно соответствующего контроля в 13,6 раза (9,38±2,80%, p0,05). У старых животных дипептид усиливал экспрессию CD8 в 4,6 раза относительно контрольной группы старых животных (29,57±0,54%, p0,05). Трипептид не влиял на экспрессию маркера цитотоксических Т-клеток у молодых крыс, но способствовал увеличению данного показателя в 4 раза у старых животных относительно контроля (25,62±3,83%, p0,05). Тетрапептид не влиял на экспрессию маркера CD8 у молодых крыс и подавлял его экспрессию у старых животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемые короткие пептиды оказывают тканеспецифическое стимулирующее действие на иммуногенез селезенки при старении организма.

Стендовые доклады 427

ВЛИЯНИЕ СЕЛАНКА НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ

КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В НЕРВНОЙ ТКАНИ КРЫС

Соловьев В.Б.1, Генгин М.Т.1, Мясоедов Н.Ф.2 Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского, Пенза, ул. Лермонтова, 37 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Ак. Курчатова, 2 В исследованиях последних лет показано, что наряду с анксиолитическим действием гептапептид селанк оказывает также целый ряд других эффектов – ноотропный, стимулирующий и стресс-протективный. Нейрохимические механизмы действия селанка до настоящего времени остаются малоизученными. Было высказано предположение о том, что психотропный эффект селанка может быть связан с его способностью ингибировать ферменты деградации энкефалинов, обеспечивая тем самым их накопление. Однако уровень регуляторных пептидов зависит не только от активности ферментов их деструкции, но от соотношения скоростей их синтеза и распада.

Целью нашей работы было изучение влияния селанка на активность карбоксипептидазы Е (КПЕ) и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП), ферментов генеза энкефалинов и других регуляторных пептидов в отделах головного мозга и надпочечниках крыс. Селанк вводили интраназально в дозе 300 мг/кг, контрольной группе вводили равный объем дистиллированной воды.

Введение селанка вызывало существенное снижение активности КПЕ в гипофизе и в гипоталамусе, сохраняющееся до 24 ч после воздействия, по сравнению с контрольной группой, у которой наблюдалось повышение активности КПЕ, вызванной введением дистиллированной воды. Полученные результаты свидетельствуют о стресс-протективном действии селанка путем ингибирования гипоталамогипофизарной системы и уменьшения секреции и образования стресс-пептидов при его введении. В стриатуме активность КПЕ повышалась через 4 ч после инстилляции препарата, в то время как в надпочечниках активность фермента превышала значения контрольной группы на протяжении всего времени исследования. В надпочечниках было отмечено также повышение активности ФМСФ-КП через 0,5, 4 и 24 ч после введения селанка.

Стриатум и надпочечники являются отделами, в которых синтезируется большое количество нейропептидов, в том числе Met- и Leu-энкефалины, обладающие выраженным стресс-протективным действием. Таким образом, повышение активности ферментов процессинга этих пептидов может опосредовать анксиолитический и стресс-протективный эффект селанка.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

КОРОТКИЕ ПЕПТИДЫ СТИМУЛИРУЮТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА HSPA1A

БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА У ЛЮДЕЙ

Трофимова С.В., Линькова Н.С., Трофимов А.В., Дудков А.В., Хавинсон В.Х., Горчаков А.А.

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 С.-Петербург, пр. Динамо, 3 E-mail: miayy@yandex.ru Многолетний опыт применения пептидных биорегуляторов, разработанных в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН позволил предположить, что их многочисленные эффекты проявляются на всех уровнях организации живого, в том числе и на уровне генов. В связи с этим, целью исследования явилось изучение влияния коротких пептидов на экспрессию гена белка теплового шока HSPA1A у человека.

Объектом исследования служили 20 молодых женщин, разделенных на 2 равные группы – контрольную, не получавшую пептиды, и опытную, получавшую короткие пептиды в виде биологически активных добавок (по 1 капсуле 2 раза в день в течение 20 дней). Всем женщинам опытной группы был назначен иммуномодулирующий пептид H-Glu-Asp-Pro-OH. В зависимости от степени выраженности риска развития различных заболеваний в комбинации с иммуномодулирующим пептидом был назначен пептид H-Lys-Glu-Asp-OH (при наличии генных мутаций, повышающих риск развития сердечно-сосудистых заболеваний – 4 человека), пептид Н-Asp-Arg-OH (при наличии генных мутаций, повышающих риск развития болезни Альцгеймера – 4 человека) и 2 женщинам с повышенным риском развития сахарного диабета был назначен пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2. Экспрессия гена белка теплового шока HSPA1A оценивалась методом ПЦР в реальном времени с использованием красителя SYBRGreen. Экспрессию определяли до и после приема пептидов и в контрольной группе (2 измерения).

В контрольной группе при первичном измерении экспрессия гена HSPA1A составила 2,30,08 и достоверно не отличалась от данных повторного измерения – 2,00,16. В опытной группе до приема пептидных препаратов экспрессия гена HSPA1A составила 1,90,13. После приема комплекса коротких пептидов экспрессия гена HSPA1A составила 4,40,15, что примерно в 2 раза выше по сравнению с исходным значением в опытной группе и контролем (p0,05). Полученные данные свидетельствуют об усилении экспрессии гена белка теплового шока под воздействием комплекса коротких пептидов, что указывает на их антистрессорный эффект, в основе механизма действия которого лежит пептидная регуляция экспрессии генов.

Стендовые доклады 429

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОГО

ФЕРМЕНТА LysK С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

Филатова Л.Ю.1, Гладилин А.К.1, Кабанов А.В.2, Клячко Н.Л.1 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.11 Durham Research Center 1036, 985830 Nebraska Medical Center, Omaha, NE 68198-5830, U.S.A.

E-mail: luboff.filatova@gmail.com

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является возбудителем тяжелых заболеваний внутренних органов, кожи, горла. Лечение антибиотиками инфекций, вызываемых Staphylococcus aureus, малоэффективно, так как почти 90% штаммов золотистого стафилококка к ним резистентны. Бактериофаги – вирусы бактерий, продуцирующие в процессе жизненного цикла ферменты, которые способны разрушать бактериальные клеточные стенки и могут рассматриваться в качестве серьезной альтернативы антибиотикам. В данной работе будет рассматриваться фермент LysK, лизирующий антибиотикорезистентные штаммы Staphylococcus aureus.

Одной из проблем, ограничивающей использование в медицине фермента, является его низкая стабильность при хранении – LysK теряет половину активности за 0.5–7 суток при 22С и за 0.05–4 часа при 37С (в зависимости от рН). Методами кинетических измерений, седиментации, электрофореза показано, что при концентрациях 0.05–0.5 мг/мл, рН 6-9, 22–40С LysK инактивируется по агрегационному механизму. Подавление агрегации (увеличение стабильности LysK) может быть достигнуто при образовании комплексов фермент-полиэлектролит.

Взаимодействие LysK с полианионами (полиакриловые кислоты 5–240 кДа, декстран сульфаты 5–500 кДа) при рН ниже изоэлектрической точки фермента (pI 8.6) и молярных соотношениях полимер/белок от 1 до 100 приводило к практически полной инактивации фермента в течение 5–10 минут после сливания растворов полимера и LysK. Причины наблюдаемых явлений обсуждаются.

Включение фермента в комплекс с поликатионом – полибреном (5 кДа) привело к увеличению стабильности LysK без изменения активности. При рН 9.0 (выше pI), молярных соотношениях полимер/фермент от 1 до 15, температурах 22–37С значения констант инактивации второго порядка уменьшались в на 1-2 порядка.

После модификации молекул фермента янтарным ангидридом до степеней 30– 70% (для увеличения числа электростатических контактов между молекулами LysK и полиэлектролита и сдвигу значений рI в область меньших рН) удалось добиться сохранения активности фермента при 22С и рН 7.5 в течение 4 месяцев.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

ТРИПЕПТИД РЕГУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ,

КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ

Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Полякова В.О., Линькова Н.С.

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 С.-Петербург, пр. Динамо, 3 E-mail: miayy@yandex.ru Короткие пептиды обладают рядом стимулирующих эффектов, однако механизмы антиоксидантного действия пептидных биорегуляторов на уровне генома до сих пор недостаточно изучены. Целью данной работы явилось исследование пептидной регуляции генома в модели язвы желудка. Выбор указанной модели обусловлен тем, что язвенная болезнь сопровождается нарушением функционирования белков антиоксидантной системы организма.

Исследование проведено на 24 самцах крыс линии Sprague-Dawley массой 180–220 г, разделенных на 3 равные группы: 1 группа – интактные крысы, 2 группа – моделирование язвы + введение физиологического раствора и 3 группа – моделирование язвы + введение трипептида H-Glu-Asp-Gly-OH. Язву моделировали путем трехкратного введения в желудок крысы через каждые 4 часа цистаминаHCL (Aldrich, Milwannee, WI) в дозе 25 мг/100 г массы тела. Одновременно с первым введением цистамина-HCL в желудок крысы вводили культуру Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штамм Cag J117, 100 микробных клеток).

Трипептид вводили подкожно в дозе 0,5 мкг в 0,5 мл физиологического раствора ежедневно в течение 5 дней с момента возникновения язвы. Материал для исследования методом ПЦР в режиме реального времени брали из края язвы на 7 сутки.

Экспрессию матричной РНК (мРНК) определяли для антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (SOD) и циклооксигеназы Сох-2 в условных единицах (у.е.).

В контроле экспрессия мРНК SOD составила 0,05±0,009 у.е., при возникновении язвы данный показатель достоверно возраста до 0,25±0,07 у.е., а при введении трипептида снижался до нормального уровня и составил 0,07±0,009 у.е. Экспрессия мРНК циклооксигеназы Сох-2 в контроле составила 0,23±0,07 у.е, при индукции язвы этот показатель возрастал до 0,45±0,07 у.е. и после действия трипептида достоверно снижался до 0,34±0,01 у.е.

Применение трипептида при индуцированной язве желудка приводит к снижению синтеза мРНК ферментов антиоксидантной защиты SOD и Cox-2 до контрольного уровня, что свидетельствует о том, что в основе репарационного эффекта исследуемого пептида лежит его способность регулировать экспрессию генов, кодирующих белки антиоксидантной системы.

Стендовые доклады 431

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ЭВОЛЮЦИИ:

ПЕПТИДЫ РЕГУЛИРУЮТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

И УВЕЛИЧИВАЮТ РЕСУРС ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА

Хавинсон В.Х.1, Малинин В.В.1, Ванюшин Б.Ф.2 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 С.-Петербург, пр. Динамо, 3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, кор.А

E-mail: ibg@gerontology.ru

Введение коротких пептидов животным увеличивает среднюю продолжительность жизни на 30–40% и подавляет рост спонтанных, индуцированных и перевиваемых опухолей. Пептиды Glu-Trp, Lys-Glu, Ala-Glu-Asp-Gly, Ala-Glu-Asp-Pro влияют на экспрессию генов в миокарде и головном мозге при введении мышам in vivo. Введение пептидов трансгенным мышам подавляет в 2–4 раза экспрессию гена рака молочной железы HER-2/neu, что коррелирует с уменьшением размеров аденокарциномы. Пептиды у мышей и крыс повышают экспрессию генов IL-2 и c-fos в лимфоцитах и различных структурах гипоталамуса, что во многом обусловливает иммуномодулирующие, онкомодифицирующие и стресспротекторные свойства этих веществ. Впервые установлены механизмы геропротекторного действия коротких пептидов, связанные с активацией хроматина в лимфоцитах крови пациентов старческого возраста. Обработка пептидом AlaGlu-Asp-Gly фибробластов человека способствует индукции теломеразной активности и удлиняет теломеры в 2,5 раза по сравнению с контролем, что приводит к увеличению на 42,5% числа делений клеток, т.е. преодолению лимита Хейфлика.

Применение пептидов у людей пожилого и старческого возраста восстанавливает метаболизм, повышает уровень мелатонина, улучшает различные физиологические функции организма и снижает смертность у них в период 8–12-летнего рандомизированного клинического изучения на 44–49% по сравнению с контрольной группой.

Установлено, что большинство изученных пептидов связывается с дву- и одноцепочечными дезоксирибоолигонуклеотидами, содержащими CG и CNG последовательности, которые являются мишенями для метилирования ДНК у эукариот. Выявлено, что пептиды специфически модулируют in vitro действие эукариотических CG- и CNGсайт-специфических эндонуклеаз (WEN1 и WEN2) на ДНК в зависимости от статуса ДНК метилирования. В большинстве случаев пептиды значительно ингибируют гидролиз ДНК этими ферментами. Вероятно, модуляция действия эндонуклеаз на гидролиз ДНК происходит благодаря сайт-специфическому связыванию пептид-ДНК, которое защищает ДНК от ферментативного гидролиза. Предполагается, что связывание пептидов с промоторными CG или CNG сайтами ДНК делает эти сайты недоступными для ДНК-метилтрансфераз, в результате чего промотор остается неметилированным, что является решающим фактором активации большинства генов.

Таким образом, короткие пептиды распознают и взаимодействуют со специфическими последовательностями ДНК, а также проявляют свою биологическую активность в зависимости от характера метилирования ДНК. Специфические (комплементарные) пептид-ДНК взаимодействия могут эпигенетически контролировать генетические функции клеток, способствуя восстановлению гомеостаза и увеличению продолжительности жизни.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АКТИВНОСТЬ ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ-4 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКИМ

ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС

Яковлева А.А.1, Золотов Н.Н.2, Колясникова К.Н.2, Соколов О.Ю.3, Михеева И.Г.1, Корнеева Е.В., Верещагина Т.Г., Кост Н.В.

РГМУ, 117997 Москва, ул. Островитянова, 1 Учреждение РАМН НИИ фармакологии им. П.К. Закусова РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 Научный центр психического здоровья РАМН, 115552 Москва, Каширское шоссе, 34

E-mail: oleg-sokolov@yandex.ru

Дипептидилпептидаза-4 (ДПП-4, ЕС 3.4.14.5) – сериновая пептидаза, гидролизующая пролинсодержащие связи нейропептидов. Показано ее участие в регуляции нервной, а также иммунной и эндокринной систем организма. Изучение активности ДПП-4 у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением (ГИП) ЦНС ранее не проводилось и вызывает определенный интерес.

В пилотном исследовании принимали участие 13 доношенных новорожденных детей с ГИП ЦНС. Активность фермента определяли флуоресцентным методом на спектрофлуориметре LS-5b (Perkin-Elmer) при длине волны 380/460 нм.

Было показано, что у детей с ГИП ЦНС на 2–7 сутки жизни активность ДПП-4 составляет 2.23±0.20 нмоль/мин/мл. Выявлена прямая корреляционная зависимость между показателями активности ДПП-4 сыворотки крови детей с ГИП ЦНС и балльной оценкой степени тяжести при рождении по шкале Апгар (R=0,68, р0,01), обратная корреляционная зависимость между активностью фермента и массо-ростовым индексом Тура (R=-0,49, р0,05), отражающем состояние упитанности плода, активность ДПП-4 не зависела от тяжести состояния ребенка на момент обследования. Интересно отметить, что активность ДПП-4 прямо коррелировала с активностью аспартатаминотрансферазы сыворотки крови (r = 0.43, р0,05), что хорошо согласуется с данными, полученными ранее в экспериментах на животных. На фоне комплексной терапии новорожденных детей с ГИП ЦНС активность ДПП-4 к 3–4 недели жизни увеличилась до 3.04±0.19 нмоль/мин/мл, что достоверно превышает (р0,05) показатели активности фермента на 2–7 сутки жизни и не отличается от значений здоровых взрослых (3.15±0.07 нмоль/мин/мл, n=20).

Таким образом, впервые у новорожденных с ГИП ЦНС выявлена взаимосвязь активности ДПП-4 на 2–7 сутки жизни с оценкой степени тяжести при рождении, состоянием упитанности плода к концу внутриутробного развития, а также показана динамика активности фермента на фоне терапии.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01781-а.

Стендовые доклады 433

ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ-4

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

И ИХ МАТЕРЕЙ

Яковлева А.А.1, Золотов Н.Н.2, Колясникова К.Н.2, Соколов О.Ю.3, Михеева И.Г.1, Кост Н.В.

РГМУ, 117997 Москва, ул. Островитянова, 1 Учреждение РАМН НИИ фармакологии им. П.К. Закусова РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 Научный центр психического здоровья РАМН, 115552 Москва, Каширское шоссе, 34

E-mail: oleg-sokolov@yandex.ru

Ранее нами была установлена взаимосвязь концентрации экзогенных опиоидных пептидов казоморфинов с уровнем психомоторного развития детей первого года жизни. Основным ферментом, регулирующим уровень казоморфинов в крови, является дипептидилпептидаза-4 (ДПП-4, ЕС 3.4.14.5). Изучение фермента у здоровых новорожденных и их матерей ранее не проводилось и поэтому представляет несомненный интерес. На этапе родильного дома обследовано 32 здоровые матери и их новорожденные дети. Средний возраст матерей – 26,4±0,9 лет. Беременность и роды протекали физиологически. Все новорожденные родились через естественные родовые пути. Оценка по шкале Апгар при рождении у всех детей составила 7,7±0,1, через пять минут – 8,4±0,1 баллов. Средняя масса тела при рождении – 3422,9±60,3 г, средняя длина тела при рождении – 51,9±0,4 см. Активность фермента определяли флуоресцентным методом на спектрофлуориметре LS-5b (Perkin-Elmer), измерение вели при 380/460 нм.

Активность ДПП-4 в пуповинной крови новорожденных детей составила 3,32±0,39 нмоль/мин/мл. У их матерей за 3–6 часов до родов она была достоверно выше (р0,05) и составила 5,54±0,42 нмоль/мин/мл. Выявлена обратная корреляционная зависимость (r = -0,51, р0,05) между активностью ДПП-4 и временем до окончания родоразрешения. Через 3 дня после родов активность ДПП-4 у родильниц достоверно (р0,05) снижалась до 4,29±0,49 нмоль/мин/мл. При этом активность фермента у родильниц до и после родов прямо коррелировала между собой (r = 0,42). Значения активности ДПП-4 в сыворотке крови матерей, как до, так и после родов, достоверно (р0,001) превышали показатели здоровых женщин-доноров (3,15±0,07 нмоль/мин/мл, n=20). Интересно отметить, что какой-либо зависимости между показателями активности ДПП-4 в пуповинной крови детей и венозной крови их матерей до и после родов в данном исследовании нами не выявлено.

Таким образом, впервые показано, что ДПП-4 принимает активное участие в реализации стресса, связанного с родами, причем, по-видимому, исследуемая ферментная система новорожденного функционирует автономно от матери.

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01781-а.

V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

АВТОРСКИЙ ИНДЕКС

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 ||
Похожие работы:

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 25 (64). 2012. № 4. С. 255-263. УДК 548.736+546.64+54.057 СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ КООРДИНАЦИОННОГО СОЕДИНЕНИЯ НИТРАТА ЛАНТАНА(III) С 4,4,10,10-ТЕТРАМЕТИЛ-1,3,7,9ТЕТРААЗОСПИ...»

«ЭЛЕКТРОТЕХНИЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ МЕАНДР МР 19.0316.01 ПС V03.04.16 Устройства защиты многофункциональные УЗМ-51МД ТУ 3425-003319288072014 Наличие функции детектирования аварийной электрической дуги Защита от скачков и длительных перенапряжений Встроенная варист...»

«Биология. 7 класс Пояснительная записка Рабочая программа составлена на основе Закона об образовании Российской Федерации от 29.12.1012 приказ №273/ФЗ, Федерального государственного образовательного стандарта основного общего образования, Фе...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом факультете кафедрой гуманит...»

«Небанковская кредитная организация акционерное общество "НАЦИОНАЛЬНЫЙ РАСЧЕТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ" Руководство пользователя WEB-кабинет Системы управления обеспечением WEB-кабинет Системы управления обеспечением Список изменений № верДата подготовКраткое описание сии ки вер...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологические основы устойчивого водопользования/2 года ОФО; 05.04.06 Экология и Учебный план: природопользование: Геоэкологически...»

«АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях 03.02.03.микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Маянский Николай Андреевич Москва 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Приказ Минздрава России от 15.11.2012 N 927н Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пострадавшим с сочетанными, множественными и изолированными травмами, сопровождающимися шоком (Зарегистрировано в Минюсте России 21.01.2013 N 26634) Документ предоставлен Ошибка! Н...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 574 496 C1 (51) МПК G08G 1/01 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014127098/11, 03.07.2014 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Давыдов Юрий Львович (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия...»

«О.А. Белых и др.: Дикоросы как источник биотехнологического сырья для производства УДК 630.2.56.9: 643.0.524 ДИКОРОСЫ КАК ИСТОЧНИК БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И БАДОВ О.А. Белых1, А.Н.Петров2, А.Г.Еникеев3 ГОУ ВПО "Иркутский государственный педагогический университет" 664...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 78-85. УДК 591.5:598.113.6 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ, LACERTA VIVIPARA, ГОСУДАРСТВЕННОГО ЗАПОВЕДНИКА "КОМСОМОЛЬСКИЙ" © 2009 О.Г. Лазарева Ивановский государственный университет, г. Иваново (Россия) herpet.log@mail.r...»

«8.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ПОЧВОВЕДЕНИЕ SOIL SCIENCE Воропаев В. Н., Астахов Ю. А. Мониторинг содер Voropaev V. N., Astakhov Yu. A. Monitoring of the жания меди в почвах реперных участков. 2 copper content in reference sites of soils. 2 Хамидов М. Х., Жураев У. А. Влияние орошения Khamidov M., Jurayev U. A. Influence of irri...»

«Ученые записки университета имени П.Ф. Лесгафта, № 9 (91) – 2012 год учебное пособие / Д.Н. Давиденко, А.И. Зорин, В.Е. Борилкевич ; отв. ред. Д.Н. Давиденко ; С.-Петерб. гос. ун-т. – СПб. : Изд-во СПб ГУ, 2001. – 208 с.3. Данилин, Д.А. Изу...»

«Классный час Покормите птиц зимой! Цель: Вызвать сочувствие к зимующим птицам. Научить проявлять заботу к ним. Расширить знания детей о птицах.Задачи: Формирование экологического представления детей об окружающем мире. Обобщить и расширить представления детей о зимующих птицах. Воспитывать и развивать единую экологическую задачу: помочь...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ И...»

«РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ НА ЮГЕ АРЕАЛА В ПОВОЛЖЬЕ Г.В. Епланова Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти eplanova_ievb@mail.ru Живородящая ящерица Zootoca vivipara (Lichtenstein, 1823) – вид с обширным транспалеарктическим ареалом. Она распространена в северной половине Евразии от Ирландии и Пиренейс...»

«Светлова Марина Всеволодовна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ПРИМОРСКИХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 25.00.36 – Геоэкология (Науки о Земле) ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Песков В.Н., Тарасенко М.О., Франчук М.В. 82 Изменчивость линейных размеров. птенцов обыкновенного жулана УДК 598.292:591.3 ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ, ПРОПОРЦИЙ ТЕЛА И ПЕРИОДИЗАЦИЯ РАЗВИТИЯ ПТЕНЦОВ ОБЫКНОВЕННОГО ЖУЛАНА LANIUS COLLURIO COLL...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Н.В.Сорокина ТЕРИ...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Юргинский технологический институт Напр...»

«Андреева Юлия Викторовна МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАЛЕАРКТИЧЕСКИХ ВИДОВ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА "ANOPHELES MACULIPENNIS" (DIPTERA, CULICIDAE) 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВО О РЫБОЛОВСТВЕ И СОХРАНЕНИИ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ В ВОПРОСАХ И ОТВЕТАХ НАУЧНО-ПР...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 13. 10. 2016 461 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Расторжение договора аренды, безвозмездного пользования земельным участком" В соответствии с Земельным кодексом Российской Федерации, Федеральным законом от 03.07.2016 № 334-ФЗ "О внесении измен...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, 5, с. 550-560 УДК 633.11:631.52:575.167 doi: 10.15389/agrobiology.2015.5.550rus АГРОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И СЕЛЕКЦИОННЫЕ РЕЗЕРВЫ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЕВ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР В РОССИИ В.П. ЯКУШЕВ,...»

«1 ХИМИЯ. БИОЛОГИЯ. МЕДИЦИНА 1. Актуальные проблемы сохранения биоразнообразия растительного и животЕ0 ного мира Северной Фенноскандии и сопредельных территорий : док. Междунар. А437 конф., Апатиты, 26-28 нояб. 2002 г. / РАН, Кольский науч. центр, Полярно-альп. ботан. сад-институт им. Н. А. Аврорина ; от...»

«198 Matters of Russian and International Law. 2017, Vol. 7, Is. 4A УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ Особенности и специфика объекта экологического правонарушения Митякина Надежда Михайловна Кандидат юридических наук, доцент, кафедра трудового и...»

«Конференция учащихся муниципальных образовательных учреждений города Калуги "СТАРТ В НАУКУ" Секция: Экология Если не мы, то кто же? (Спасение лесной орхидеи) Автор: Мозгин Тихон, ученик 2 "А" класса МБОУ "Средняя общеобразовательная школа № 13" г. Калуги Научный руководитель: у...»

«ISSN 1994-0351. Интернет-вестник ВолгГАСУ. Сер.: Политематическая. 2014. Вып. 2 (33). www.vestnik.vgasu.ru _ УДК 504.056 И. К. Яжлев МЕХАНИЗМ ГАРАНТИРОВАННОЙ ЛИКВИДАЦИИ НАКОПЛЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО УЩЕРБА ПРИ РЕОРГА...»

«УДК 612.017.1:616-097 КОЛИКОВА ЮЛИЯ ОЛЕГОВНА АУТОАНТИТЕЛА К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2003 Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета Нау...»

«42 1141 ТЕРМОПРЕОБРАЗОВАТЕЛИ СОПРОТИВЛЕНИЯ ТСМ И ТСП МЕТРАН-200 Руководство по эксплуатации 203.01.00.000 РЭ Челябинск 454138 г. Челябинск, Комсомольский проспект, 29 Промышленная группа "Метран": тел.(351) 798-85...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.