WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:   || 2 |

«ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОЙ ЛАКТОФЛОРЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Уральский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Зорников Данила Леонидович

ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОЙ

ЛАКТОФЛОРЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗА

ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА

03.02.03 – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Ворошилина Е.С.

Екатеринбург – 2017

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….5 Глава 1. Обзор литературы…………………………………………………...15 Роль макроорганизма в формировании вагинального 1.1 микробиоценоза……………

1.2 Роль лактобацилл в противоинфекционной защите влагалища и поддержании стабильности вагинального микробиоценоза……………….18

1.3. Молекулярно-генетические методы в изучении вагинального микробиоценоза: новые взгляды на микробиоту влагалища………………26

1.4. Нарушения и методы коррекции вагинального микробиоценоза…….29

1.5. Влияние хлоргексидина на микроорганизмы и применение кавитированных антисептических растворов в акушерстве и гинекологии

Глава 2. Материалы и методы исследования………………………………41 2.

1. Характеристика обследованных групп женщин и дизайн исследования…………………………………………………………………..41

2.2. Методы исследования……………………………………………………43 2.2.1. Микроскопическое исследование…………………………………..43 2.2.2. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для оценки микробиоценоза влагалища…………………………………………………………………...44 2.2.3. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для генотипирования вагинальных лактобацилл…………………………………………………48 2.2.4. Статистические методы……………………………………………..50 Глава 3. Видовой состав вагинальных лактобацилл у женщин репродуктивного возраста с различными вариантами микробиоценоза влагалища…..……………………………………………………………………51

3.1. Частота выявления и доминирования отдельных видов лактобацилл во влагалище у женщин репродуктивного возраста с нормоценозом и дисбиотическими нарушениями…………………………………………….51

3.2. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании отдельных видов лактобацилл……………………………………………….53 3.2.1. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus crispatus……………………………………………………...56 3.2.2. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus iners……………………………………………………….….57 3.2.3. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus gasseri…………………………………………………….…..58 3.2.4. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus jensenii……………………………………………………..…60 Глава 4. Изучение изменений качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза после обработки влагалища кавитированноым низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина………………….………………………………………………….62

4.1. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на количество и долю лактобацилл в вагинальном микробиоценозе……………………………….62





4.2. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на видовой состав лактофлоры……………………………………………………………………67 Глава 5. Оценка эффекта последовательного применения обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% водным раствором хлоргексидина и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые Lactobacillus crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирущего вида лактобацилл…………………………………………………………………...…69 ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………...80 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………..87 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………..88 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………...89 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………...90

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности В настоящее время огромное внимание исследователей и практикующих врачей уделяется женскому репродуктивному здоровью. Последнее определяется множеством факторов, одним из которых является вагинальная микрофлора.

Микроорганизмы, населяющие преимущественно влагалище женщины, защищают ее репродуктивный тракт от инфицирования многими патогенными микробами. Это обеспечивается как напрямую, за счет конкуренции с патогенными микробами, так и опосредованно, через модуляцию местного иммунитета. Кроме того, вагинальная микрофлора способствует нормальному протеканию беременности и обеспечивает первичную колонизацию новорожденного в случае естественных родов [103].

На протяжении долгого времени считалось, что влагалище женщин в норме населяют представители рода Lactobacillus, которые и обеспечивают колонизационную резистентность биотопа, во многом за счет продукции молочной кислоты и других антимикробных веществ. Хотя ряд исследователей выявляли другие лактат-продуцирующие бактерии при отсутствии лактобацилл у здоровых женщин репродуктивного возраста, но в основном среди чернокожих женщин или латиноамериканок [122, 160, 232, 291, 310, 311]. При этом условно-патогенные микроорганизмы (УПМ), подавляемые лактобациллами, присутствуют в низких количествах или отсутствуют вовсе, и отмечается сниженный риск инфицирования возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (ИППП).

Однако популяция лактобацилл может истощаться, и на этом фоне наблюдается увеличение количеств УПМ, и развивается нарушение вагинальной микрофлоры – дисбиоз. Дисбиоз влагалища лежит в основе такого клинико-лабораторного синдрома как бактериальный вагиноз (БВ), который ассоциирован с увеличением риска инфицирования возбудителями ИППП или развития воспалительных заболеваний органов малого таза [59, 75, 90, 131, 136, 187, 199, 203, 230, 271, 276, 298, 301] и различными осложнениями беременности [80, 133, 143, 144, 153, 154, 172, 177, 203, 229, 258]. БВ выявляется у 10-20% европеоидных женщин и у 30-50% представителей негроидной расы [151, 261, 266, 285].

Высокая частота встречаемости и тяжесть последствий БВ требуют выяснения причин развития данного патологического состояния для дальнейшей разработки эффективных мер профилактики и лечения. Несмотря на серьезные усилия мирового научного сообщества, этиология БВ до сих пор неизвестна [121, 186, 253, 285]. Данное обстоятельство диктует необходимость выявления предикторов трансформации нормальной вагинальной микрофлоры в патологическую.

Возможно, что одним из таких предикторов является состав вагинальной лактофлоры. Со времен Додерлейна (1892 год) [102] представления о лактофлоре изменились. Если до 1980 года считалось, что влагалище населяет один вид лактобацилл – L. acidophilus [303], то на сегодняшний день идентифицировано более 20 видов вагинальных лактобацилл. Однако доминирующим обычно является один вид – L. crispatus или L. iners и реже L. jensenii или L. gasseri [23, 50, 64, 218, 232, 257, 262, 279, 281, 288, 291, 297, 302, 306, 310, 311, 312]. Вполне возможно, что доминирующий вид лактобацилл может являться показателем, позволяющим судить о стабильности микробиоценоза. Для этого необходимо установить частоту доминирования отдельных видов лактобацилл среди женщин с нормоценозами (микробиоценозами, в которых преобладают лактобациллы) и дисбиозами (микробиоценозы, в которых преобладают условно-патогенные микроорганизмы), что позволит ассоциировать виды с «нормой» или «патологией». Значительная часть исследований, посвященных видовому составу лактобацилл и микрофлоры влагалища, выполненных с помощью молекулярно-генетических методов, проведена за пределами России [231, 232].

Экстраполяция полученных в ходе этих исследований данных на популяцию российских женщин затруднительна, так как продемонстрированы различия в составе микрофлоры влагалища женщин различной расовой и этнической принадлежности [56, 218, 232, 310, 311].

Актуальность поиска новых подходов к коррекции дисбиоза влагалища обусловлена высокой частотой рецидивов при использовании стандартных схем терапии [17, 70, 72, 140, 180, 206, 243, 260]. Метронидазол и клиндамицин

– препараты первого выбора при лечении БВ – имеют немало побочных эффектов, подавляют не только УПМ, но и лактофлору, и противопоказаны в первом триместре беременности. Исследователи связывают высокую частоту рецидивирования дисбиоза с наличием патологических биопленок на поверхности вагинального эпителия [274, 275], характерной чертой которых является резистентность к антибактериальным препаратам [94, 125].

В качестве альтернативного препарата для коррекции вагинального дисбиоза возможно использование хлоргексидина, который активен в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе облигатных анаэробов [176]. В то же время было показано, что некоторые представители рода обладают Lactobacillus сниженной чувствительностью к хлоргексидину [45, 181, 245, 309]. В настоящее время для лечения и профилактики инфекционно-воспалительной патологии женских половых органов активно используют методику обработки влагалища кавитированными низкочастотным ультразвуком (НУЗ) лекарственными растворами, в том числе раствором хлоргексидина [9, 10, 11, 18, 26, 27, 28, 32]. В литературе имеются данные о том, что грамотрицательные микроорганизмы более чувствительны к НУЗ, чем грамположительные [1, В экспериментах была продемонстрирована способность НУЗ 224].

сенсибилизировать бактериальные биопленки к действию антимикробных препаратов [224,228]. Данные факты позволяют предположить, что обработка влагалища кавитированным НУЗ раствором хлоргексидина может оказаться действенным инструментом в коррекции дисбиотических состояний в силу селективного подавления ассоциированных с дисбиозом влагалища грамотрицательных бактерий.

Методика обработки кавитированным НУЗ 0,05% раствором хлоргексидина (КНУЗ РХ) рекомендована для использования в акушерскогинекологической практике [9, 26, 32]. Получены убедительные доказательства клинической эффективности предложенного метода при лечении кандидозной, микоплазменной и уреаплазменной инфекции репродуктивного тракта [10, 11, 17, 19, 36], неспецифического вагинита [25], послеродовых гнойносептических заболеваний [26], использовании с целью профилактики инфекционно-воспалительных осложнений перед внутриматочными вмешательствами [29] и хирургическим лечением пролапса гениталий [22].

Однако изменения качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища в результате воздействия КНУЗ РХ недостаточно изучены. На сегодняшний день оценка эффекта от обработки влагалища кавитированными НУЗ лекарственными растворами на вагинальную микрофлору проводилась только с помощью микроскопии или культуральных исследований [25, 29].

Появление тест-системы для генотипирования вагинальных лактобацилл методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) открывает новые возможности для объективной оценки изменений вагинальной лактофлоры в результате воздействия КНУЗ РХ.

На протяжении многих лет с целью коррекции дисбиоза влагалища применяют пробиотические препараты. При этом среди исследователей до сих пор отсутствует единое мнение по их эффективности: некоторые докладывают о положительных результатах применения пробиотиков в лечении БВ [54, 55, 174, 191, 215, 221] и нормализации микрофлоры влагалища [234]. Тогда как другие подвергают сомнению их эффективность и демонстрируют, что пробиотические штаммы лактобацилл быстро элиминируются из влагалища и не всегда производят желаемый эффект [71, 77, 93, 96, 109, 138].

Неудовлетворительные результаты применения пробиотиков ряд исследователей связывает с тем, что используемые препараты содержали виды лактобацилл, которые в норме не преобладают во влагалище женщин [77, 126, В России в настоящее время зарегистрирован единственный 234].

пробиотический препарат, содержащий L. crispatus – вид с повышенными протективными свойствами, в норме доминирующий во влагалище [61, 123]. В связи с этим представляется актуальным изучение изменений вагинального микробиоценоза, возникающих после применения данного препарата с целью коррекции дисбиоза.

Цель исследования Оценка возможности коррекции нарушений вагинальной микробиоценоза с помощью кавитированного низкочастотным ультразвуком раствора хлоргексидина и пробиотического препарата для перорального применения у женщин репродуктивного возраста в зависимости от видового состава лактофлоры.

Задачи исследования

1. Изучить видовой состав лактобацилл вагинального отделяемого у женщин репродуктивного возраста с различными вариантами микробиоценоза влагалища и установить варианты лактофлоры, являющиеся благоприятным фоном для поддержания стабильности нормоценоза.

2. Изучить изменения качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, возникшие в результате воздействия кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% водным раствором хлоргексидина биглюканата.

3. Оценить эффект последовательного применения обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% водным раствором хлоргексидина и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые Lactobacillus crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирущего во влагалище вида лактобацилл.

Методология и методы исследования Диссертационное исследование проведено на базе Медикофармацевтического центра «Гармония» (г. Екатеринбург). В период с сентября 2011 по август 2014 года было обследовано 636 женщин репродуктивного возраста, от каждой из которых было взято от 1 до 3 проб вагинального отделяемого. Исследуемые группы формировали в зависимости от задач исследования. Некоторые пациентки параллельно участвовали в нескольких исследованиях.

Всем пациенткам проведено исследование микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ, в пробах от 608 пациенток также генотипировали вагинальные лактобациллы методом ПЦР-РВ. С целью оценки интенсивности воспалительной реакции во влагалище 104 пациенткам выполняли микроскопическое исследование мазка из вагинального отделяемого.

Все исследования проведены в соответствии с требованиями Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» от июня 1964 года (заключение Локального этического комитета при ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России (протокол № 4 от 15.05.2015 г.)).

В работе были использованы микробиологические (микроскопические и молекулярно-генетические) и статистические методы исследования.

Результаты исследований подвергнуты статистической обработке с использованием программ IBM SPSS Statistics 20 и WinPepi.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Достоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом выборки, четко сформулированными критериями включения в исследование, использованием соответствующих цели, задач, методов исследования, современного оборудования, применением актуальных методов статистического анализа данных.

Основные результаты работы представлены на: 67-й, 68-й, 69-й и 70-й всероссийских научно-практических конференциях молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (г. Екатеринбург, 2012, 2013, 2014, 2015 гг.); 8-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (г. Москва, 2014); втором Евразийском конгрессе «Медицина, фармация и общественное здоровье» с международным участием (Екатеринбург, 2015); I международной (71 всероссийской) научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (г. Екатеринбург, 2016 г.).

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Разработка дизайна исследования, формулировка цели и задач исследования были выполнены автором совместно с научным руководителем. Автором лично проведен анализ современной зарубежной и отечественной литературы по изучаемой проблеме. Автором самостоятельно проведены все молекулярно-генетические исследования, разработаны используемые в диссертационной работе показатели: индекс доминирования лактобацилл и кратность прироста условно-патогенных микроорганизмов. Статистическая обработка полученных результатов, подготовка статей и докладов, оформление диссертационной работы осуществлялись автором лично.

Положения, выносимые на защиту

1. Влагалище женщин репродуктивного возраста колонизируют до пяти видов лактобацилл одновременно, однако доминирует, как правило, один.

Доминирование Lactobacillus crispatus ассоциировано с содержанием высокой доли лактофлоры в микробиоценозе и является благоприятным фоном для поддержания нормоценоза влагалища. Доминирование Lactobacillus iners чаще наблюдается при сниженной доле лактофлоры в микробиоценозе, что соответствует критериям выраженного дисбиоза. Доминирование Lactobacillus gasseri, как правило, ассоциировано с промежуточной долей лактофлоры в микробиоценозе, что соответствует критериям умеренного дисбиоза.

2. Обработка влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина селективно воздействует на условнопатогенные микроорганизмы. Видовой состав лактофлоры при этом не изменяется, а доля лактобацилл в микробиоценозе либо сохраняется на прежнем уровне при условии изначально высокого содержания лактобацилл, либо увеличивается, если перед обработкой лактофлора присутствовала в микробиоценозе в низких количествах.

3. После обработки влагалища пациенток с дисбиозом кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина отмечали восстановление нормоценоза у каждой второй пациентки; худшие результаты коррекции наблюдали при доминировании Lactobacillus gasseri. После приема перорального пробиотика, содержащего живые Lactobacillus crispatus, не отмечали достоверного увеличения доли пациенток с нормоценозом и не выявляли Lactobacillus crispatus в случае его отсутствия в микробиоценозе перед коррекцией.

Научная новизна Впервые с помощью молекулярно-генетических методов исследования изучены особенности видового состава вагинальных лактобацилл у женщин репродуктивного возраста с различными вариантами микробиоценоза.

Установлено, что среди популяции женщин репродуктивного возраста города Екатеринбурга чаще выявляются и доминируют виды L. crispatus и L. iners, реже – L. gasseri и L. jensenii. Впервые установлена взаимосвязь между доминирующим видом лактобацилл и долей лактофлоры в микробиоценозе.

Установлено, что наиболее благоприятным является микробиоценоз с долей лактофлоры более 80%, представленной преимущественно L. crispatus.

Продемонстрировано, что в микробиоценозах с долей УПМ более 80% лактофлора представлена почти исключительно L. iners.

Впервые с использованием количественной ПЦР в реальном времени оценены изменения качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища под воздействием КНУЗ РХ. Установлено, что обработка влагалища КНУЗ РХ селективно воздействует на условно-патогенные микроорганизмы, тогда как лактобациллы более устойчивы к данному воздействию, что с микробиологической точки зрения обосновывает целесообразность применения КНУЗ РХ для коррекции дисбиотических нарушений во влагалище.

Впервые с помощью метода ПЦР-РВ оценен микробиологический эффект применения двухэтапной схемы коррекции дисбиотических нарушений во влагалище, включающей обработку влагалища КНУЗ РХ и последующий прием пробиотического препарата на основе живых L. crispatus.

Продемонстрировано, что пероральный прием пробиотического препарата не приводит к колонизации эпителия влагалища пробиотическим видом.

Теоретическая и практическая значимость работы Данные диссертационного исследования дополняют и расширяют современные представления о лактофлоре влагалища. Демонстрируют взаимосвязь между доминированием отдельных видов лактобацилл, долей лактофлоры в микробиоценозе и количеством УПМ. Это позволяет дополнительно прогнозировать устойчивость микробиоценоза на основании выявления того или иного доминирующего вида лактобацилл у пациентки.

Полученные результаты демонстрируют микробиологическую эффективность обработки влагалища КНУЗ РХ или комбинированного применения КНУЗ РХ и пробиотического препарата, содержащего живые L. crispatus,в коррекции дисбиоза влагалища.

Полученные данные могут применяться при преподавании микробиологии, акушерства и гинекологии или использоваться при создании коммерческих тест-систем для генотипирования вагинальных лактобацилл.

Результаты исследования обосновывают целесообразность применения двухэтапной схемы коррекции дисбиоза влагалища, заключающейся в последовательном применении КНУЗ РХ и перорального приема пробиотического препарата, содержащего живые L. crispatus.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследований используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.

Метод оценки лактофлоры влагалища с помощью ПЦР-РВ и алгоритм коррекции дисбиоза влагалища внедрены в лечебное учреждение г. Екатеринбурга – ООО «Медицинский центр Гармония».

По результатам полученных в настоящем исследовании данных было разработано учебно-методическое пособие для врачей акушеров-гинекологов.

Полученные в ходе исследования данные были использованы компанией «ДНК-технология» для создания коммерческой тест-системы «типирование лактобактерий».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Женский репродуктивный тракт состоит из нескольких частей: вульвы, влагалища, матки и маточных труб, яичников. Верхние отделы женского репродуктивного тракта (матка, маточные трубы) в норме свободны от микроорганизмов [15, 16, 202], хотя некоторые исследователи выявляли микроорганизмы на невоспаленном (по данным гистероскопии) эндометрии пациенток [95, 198], тогда как нижние отделы, особенно влагалище, колонизированы микроорганизмами.

При проникновении в верхние отделы репродуктивного тракта микроорганизмы вызывают воспалительные процессы: эндометрит, сальпингит, оофорит, что в конечном итоге может приводить к бесплодию.

Часто воспалительный процесс начинается во влагалище или в шейке матки, после чего происходит его распространение восходящим путем [35, 37].

Влагалище обладает целым комплексом защитных механизмов, позволяющих подавлять адгезию и размножение патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, а, следовательно, и их дальнейшее распространение по репродуктивному тракту. Одним из ключевых факторов, поддерживающих резистентность эпителия влагалища, являются микроорганизмы, населяющие данный биотоп. Нарушения в вагинальном микробиоценозе, самым известным из которых является БВ, сопровождаются повышением риска развития ИППП или воспалительных заболеваний органов малого таза [59, 75, 90, 131, 136, 187, 199, 203, 230, 252, 271, 276, 298, 301], а также осложнений беременности [80, 133, 143, 144, 153, 154, 172, 177, 203, 229, 258]. Причем часто причиной воспалительных процессов являются УПМ, в норме присутствующие во влагалище. В то же время БВ является довольно частым патологическим состоянием и по разным оценкам выявляется у 10-20% женщин в репродуктивном возрасте [151, 261, 266, 285], в то время как точные причины, приводящие к развитию дисбиотических нарушений вагинальной микробиоты, до сих пор неизвестны [121, 186, 252, 285], а эффективные методы коррекции не разработаны [70, 72, 243, 260].

1.1. Роль макроорганизма в формировании вагинального микробиоценоза Одним из ключевых факторов поддержания стабильности вагинального биотопа считаются микроорганизмы, колонизирующие вагинальный эпителий, и тем самым обеспечивающие сниженную восприимчивость к урогенитальным инфекциям [155, 254, 266]. Микроорганизмы, населяющие влагалище, находятся в сложных и тесных взаимоотношениях, как между собой, так и с макроорганизмом. Качественный и количественный состав вагинальных микроорганизмов различается среди индивидуумов [129, 160, 240], а также изменяется под действием различных эндо- и экзогенных факторов [82, 111, 112, 226, 251], в том числе при беременности [294].

Причем кардинальные изменения в составе вагинального микробиоценоза могут происходить в течение короткого промежутка времени [75, 232, 268]. В то же время в долгосрочной перспективе состав вагинального микробиоценоза является относительно стабильным. Например, в одном из исследований было продемонстрировано, что состав вагинальной микробиоты у здоровых женщин не претерпевает существенных изменений во время менструального цикла [162]. Хотя в другом исследовании был получен диаметрально противоположный результат [268]. Весьма узкий спектр микроорганизмов выделяется в качестве доминирующих, особенно в группе лактат-продуцирующих бактерий [232]. Более того, по сравнению с другими биотопами человека, состав вагинальной микрофлоры является наиболее постоянным среди индивидуумов, особенно если проводить оценку на родовом уровне [157]. По всей видимости, со стороны макроорганизма имеются факторы, обеспечивающие селекцию отдельных групп микроорганизмов [148, 232].

Одним из ключевых факторов, влияющих на состав и количество микроорганизмов, населяющих влагалище, является уровень эстрогенов [115]. При повышении уровня эстрогенов увеличивается количество гликогена в вагинальном эпителии [69, 115], который является питательным субстратом для лактобацилл [60]. Значительное повышение уровня эстрогенов и прогестерона наблюдается при беременности, что также приводит к утолщению вагинального эпителия и увеличению содержания гликогена [69]. Лактобациллы ферментируют гликоген до лактата, закисляя среду (до значений pH4,5), что традиционно является одним из показателей здоровья влагалища [60]. Некоторые исследователи демонстрируют, что лактобациллы не способны утилизировать гликоген [189, 238, 270]. В таком случае питательным субстратом является продукт его деградации (за счет низкого pH или клеточных ферментов) – глюкоза [67]. Поэтому до сих пор не ясно, что именно ферментируют лактобациллы in vivo – гликоген или глюкозу, однако в конечном итоге все равно происходит сбраживание до молочной кислоты. По мере уменьшения уровня эстрогенов после менопаузы наблюдается постепенное снижение количества вагинальных лактобацилл или их полное исчезновение [146, 152, 213, 303]. Восстановление же уровня эстрогенов при заместительной гормональной терапии приводит к реколонизации вагинального эпителия лактобациллами [146]. Кроме лактобацилл влагалище здоровых женщин могут населять другие микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту: Atopobium vaginae, Megasphaera spp. и Leptotrichia spp. [237, 310, 311]. Молочная кислота, продуцируемая данными микроорганизмами, наряду с другими факторами микробного и немикробного происхождения, подавляет рост остальных бактерий [68, 210]. Помимо продукции молочной кислоты представители нормальной микрофлоры блокируют адгезию патогенных и условнопатогенных микроорганизмов на клетках вагинального эпителия [66, 86, 212, 296, 308] и продуцируют другие вещества с прямой антимикробной активностью [57, 142, 204].

Ряд исследователей отмечают, что качественный и количественный состав микроорганизмов, населяющих влагалище, значительно отличается среди представителей различных рас и этнических групп [56, 218, 232, 310, 311]. Данный факт свидетельствует о том, что существуют генетические факторы, обеспечивающие селективные преимущества отдельным видам вагинальных микроорганизмов. В проспективном исследовании Srinivasan et al. было продемонстрировано, что во время менструаций наблюдается транзиторное снижение количества лактобацилл и увеличение количества Gardnerella vaginalis, рост которой по предположению авторов может стимулироваться ионами железа, присутствующими в менструальной крови [268].

Таким образом, противоинфекционная защита вагинального эпителия опосредована как самим эпителием и факторами врожденного и адаптивного иммунитета, так и населяющими его микроорганизмами (главным образом лактобациллами). В то же время качественный и количественный состав вагинальной микробиоты во многом регулируется макроорганизмом.

1.2. Роль лактобацилл в противоинфекционной защите влагалища и поддержании стабильности вагинального микробиоценоза Впервые о вагинальных лактобациллах упоминает профессор Додерлейн, опубликовавший в 1892 году монографию, в которой описал бактерии, продуцирующие молочную кислоту, способную ингибировать рост патогенных микроорганизмов in vitro и in vivo [102]. В 1928 году Thomas et al. идентифицировали палочки Додерлейна как Lactobacillus acidophilus, но при этом предположил, что в дальнейшем данная группа микроорганизмов будет реклассифицирована [282]. В 1980 году было продемонстрировано, что является гетерогенной группой бактерий с общими L. acidophilus биохимическими свойствами [175]. Эта группа была разделена на основании гомологии ДНК (чего нельзя было сделать биохимически) [163], в результате были выделены несколько видов лактобацилл внутри комплекса

L. acidophilus [105, 114, 247]:

Lactobacillus acidophilus Lactobacillus amylolyticus Lactobacillus amylovorus Lactobacillus crispatus Lactobacillus gallinarium Lactobacillus gasseri Lactobacillus iners Lactobacillus jensenii Lactobacillus johnsonii.

Поскольку внутри комплекса L. acidophilus выделяют и одноименный вид, возникают терминологические трудности, так как не всегда понятно о какой именно таксономической единице говорят исследователи.

В 1999 году был открыт новый вид лактобацилл – L. iners [114].

Данный микроорганизм не растет на традиционных селективных средах (агар Рогоза или MRS-агар), используемых для выделения лактобацилл, но способен расти на кровяном агаре [30, 114]. Поэтому исследователи, использовавшие для первичного выделения культур лактобацилл традиционные селективные среды, не смогли идентифицировать этот вид [50, 128, 218, 262, 302]. В дальнейшем с помощью молекулярно-генетических методов L. iners часто выявляли как у здоровых женщин, так и у пациенток с патологией влагалища [56, 61, 77, 98, 118, 122, 124, 150, 201, 257, 277, 279, 281, 288, 291, 292, 300, 313].

Генотипирование лактобацилл осуществляют по нуклеотидным последовательностям участка гена 16S рибосомальной РНК [236, 248, 299].

На сегодняшний день идентифицировано более 20 видов вагинальных лактобацилл, однако доминирующим обычно является один – L. crispatus или L. iners и реже L. jensenii или L. gasseri [50, 64, 218, 232, 257, 262, 279, 281, 288, 291, 297, 302, 306, 310, 311, 312]. Редкое сосуществование разных видов лактобацилл может быть обусловлено либо предварительным заселением влагалища определенным видом, либо влиянием различных факторов макроорганизма, которые селекционируют отдельные виды [173].

Лактобациллы посредством ряда механизмов обеспечивают колонизационную резистентность влагалища, тем самым снижают риск развития ИППП и БВ [4, 59, 75, 90, 131, 136, 153, 187, 199, 203, 230, 252, 254, 266, 271, 276, 298, 301]. Колонизируя вагинальный эпителий, они могут блокировать адгезию различных урогенитальных патогенов: стрептококков группы B, Staphylococcus aureus [308], G. vaginalis [66], Neisseria gonorrhoeae [296], Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella pneumoniae [212]. В опытах in vitro было продемонстрировано, что живые клетки или его L. crispatus экзополисахарид снижают адгезию Candida albicans, а сам экзополисахарид повышает экспрессию бета-дефензина 2 клетками вагинального эпителия [104], что также может обеспечивать защиту вагинального эпителия от колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

Однако отдельные виды и штаммы лактобацилл обладают разной способностью прикрепляться к клеткам эпителия [87, 265], отсюда следует, что конкуренция за площадь адгезии является лишь одним из нескольких механизмов их антагонистической активности [119].

Способность лактобацилл продуцировать молочную кислоту является другим важным защитным фактором, подавляющим рост возбудителя гонореи [132] и кислоточувствительных микроорганизмов, ассоциированных с БВ [68, 210]. Низкий вагинальный pH (около 4,5) традиционно является одним из показателей здоровья влагалища [60]. Изменение pH с 7 до 4,5 снижает жизнеспособность ассоциированных с БВ бактерий в 2-104 раз в зависимости от вида [210]. Однако авторы в данном исследовании продемонстрировали, что физиологические концентрации именно молочной кислоты при данном приводят к критическому снижению pH 106-108 жизнеспособности БВ-ассоциированных бактерий в раз.

Использование же уксусной кислоты, при аналогичных значениях pH, не позволяет добиться столь значимого результата. По всей видимости, механизм антимикробного действия лактата основан не только на закислении среды, так как при использовании других органических кислот наблюдается менее выраженный микробоцидный эффект [119, 210]. Breshears et al. также продемонстрировали, что именно лактат ингибирует рост G. vaginalis, тогда как просто низкий pH среды или уксусная кислота оказывают меньший эффект на популяцию G. vaginalis [73]. Различные группы исследователей сообщают о том, что средние значения вагинального pH у афроамериканок и латиноамериканок выше, чем у европеоидных женщин [120, 232, 269]. В то же время некоторые исследователи предполагают, что данные различия достоверны только в том случае, когда микрофлора чернокожих женщин представлена не лактобациллами [120, 240]. Ravel et al. продемонстрировали, что наиболее низкие значения pH наблюдаются при доминировании L. crispatus и L. iners [232]. В этом же исследовании было установлено, что у латиноамериканок и афроамериканок часто доминирующими являются микроорганизмы не из рода Lactobacillus.

Кроме молочной кислоты лактобациллы вырабатывают и другие вещества с потенциальной антимикробной активностью: перекись водорода [46, 50, 104, 110, 142, 239, 286, 302] и бактериоцины [57]. Подобно другим микроорганизмам-комменсалам лактобациллы могут модулировать местный иммунный ответ и поддерживать барьерную функцию эпителия [204].

Отдельные виды и штаммы лактобацилл различаются по способности продуцировать перекись водорода [50, 53, 189, 262]. Снижение количества или полное отсутствие перекись-продуцирующих лактобацилл ассоциировано с развитием БВ и инфекций влагалища [110, 142], повышенным содержанием Escherichia coli [135], эндометритом [136], преждевременными родами [302]. Наличие перекись-продуцирующих лактобацилл, наоборот, коррелирует с пониженным риском развития БВ [53, 89, 142]. Wilks et al. продемонстрировали, что присутствие во влагалище лактобацилл, продуцирующих большие количества перекиси водорода, ассоциировано с меньшим риском развития БВ к 20 неделе беременности и хориоамнионита [302]. В другом исследовании было продемонстрировано, что одновременная колонизация влагалища и прямой кишки перекисьпродуцирующими лактобациллами снижает риск развития БВ в 4 раза [53].

Отмечено, что лактобациллы, продуцирующие перекись водорода, реже выявляются у чернокожих женщин [50]. Тем не менее, O'Hanlon et al.

продемонстрировали, что антимикробная активность перекиси водорода блокируется семенной и цервовагинальной жидкостями [209]. А ряд других исследователей отмечают во влагалище низкую концентрацию кислорода, который является метаболическим предшественником перекиси водорода [149, 209, 210]. Следовательно, данный защитный механизм вряд ли является значимым in vivo [119, 209, 210]. Лактобациллы часто инфицированы умеренными бактериофагами [166, 188, 219]. Существует гипотеза, что активация профагов может приводить к трансформации вагинальной микрофлоры [219]. Некоторые исследователи предполагают, что продукция перекиси водорода приводит к селекции штаммов, инфицированных дефектными бактериофагами [188]. Nagi et al. предположили, что разная вероятность выявления перекись-продуцирующих штаммов лактобацилл у здоровых женщин и пациенток с БВ вообще не зависит от способности штаммов продуцировать H2O2 [200]. Возможно и то, что штаммы лактобацилл, продуцирующие H2O2, менее адаптированы к сосуществованию с другими видами микроорганизмов, и поэтому редко выделяются при БВ Кроме профагов в геноме вагинальных лактобацилл часто [209].

обнаруживаются плазмиды [189], которые потенциально могут кодировать продукты, полезные для адаптации лактобацилл к вагинальной среде.

Бактериоцины лактобацилл также могут сдерживать рост отдельных групп микроорганизмов. Например, лактоцин 160 повреждает цитоплазматическую мембрану – микроорганизма, G. vaginalis [284] ассоциированного с БВ [217]. На сегодняшний день выявлено, по меньшей мере, два бактериоцина, продуцируемых вагинальными лактобациллами В одном из исследований было [178, 208, 278, 284, 290].

продемонстрировано, что рост N. gonorrhoeae не подавляется лактатом при pH 5,5, тогда как добавление стерильного фильтрата суточной культуры L. crispatus при аналогичном pH полностью подавляло рост гонококка.

Исходя из этого, авторы предположили, что L. crispatus продуцировал некий отличный от молочной кислоты противомикробный фактор [73].

Отдельные виды лактобацилл с разной частотой выявляются у здоровых женщин и пациенток с БВ. Вид L. crispatus часто выявляют у здоровых женщин [61, 123, 310] и наоборот, крайне редко у пациенток с БВ [53, 122, 167, 262, 288, 302], в то время как вид L. iners часто и в высоких количествах определяют у обеих категорий женщин [34, 56, 61, 77, 98, 118, 122, 124, 150, 201, 257, 277, 279, 281, 288, 291, 292, 300, 313]. Вообще L. iners чаще других лактобацилл может сосуществовать с другими родами микроорганизмов [184]. А женщины, у которых присутствует вид L. iners, имеют большую вероятность колонизации представителями родов Leptotrichia и Megasphaera, БВ-ассоциированными бактериями, Eggerthellaподобными бактериями [277]. Обнаружение L. gasseri в исследовании Antonio et al. было ассоциировано с четырехкратным увеличением риска развития БВ [50]. В другом исследовании было продемонстрировано, что при доминировании L. crispatus в течение первого триместра беременности, риск трансформации вагинальной микрофлоры в патологическую снижен в 5 раз в сравнении с общепопуляционным риском, в то время как при доминировании видов L. iners или L. gasseri данный риск превышает популяционный в 10 раз [294]. Возможно, это связано с меньшей способностью видов L. iners и L. gasseri продуцировать перекись водорода [50, 53]. Однако O'Hanlon et al., продемонстрировали, что продуцируемая лактобациллами H2O2 блокируется семенной и цервовагинальной жидкостями, что ставит под сомнение данную гипотезу [209]. Более того, при культивировании в анаэробных условиях in vitro рост самих лактобацилл ингибируется H2O2 гораздо сильнее, чем БВассоциированных бактерий [210]. Группой австрийских исследователей было отмечено, что у 85% беременных, родивших в срок до 37 недель гестации, в первом триместре во влагалище из лактобацилл присутствовал только L. iners, тогда как среди пациенток, родивших в срок после 37 недель гестации, в первом триместре в 56% случаев во влагалище выявляли несколько видов лактобацилл одновременно, а только L. iners – лишь у 16%.

Авторы сделали вывод, что присутствие во влагалище только L. iners в первом триместре является фактором риска преждевременных родов [221].

Некоторые исследователи объясняют частое выявление L. iners при патологии влагалища сниженными протективными свойствами данного вида [294]. Однако есть и альтернативное объяснение – L. iners обладает большим, в сравнении с другими лактобациллами, адаптивным потенциалом [183, 184], что позволяет данному виду выживать в присутствии высоких количеств других микроорганизмов. В то же время эти два объяснения не являются взаимоисключающими. Вполне возможно, что в реальности отдельные виды лактобацилл обладают разными протективными и адаптивными потенциалами. Примечательно, что вид L. iners, выделяемый от женщин различной этнической принадлежности, является гомогенным (по гену 16S рибосомальной РНК), и, по всей видимости, отсутствуют выраженные штаммовые различия внутри данного вида [311]. Поэтому сложно предположить, что такая широкая адаптация вида может объясняться селекцией отдельных штаммов. Примечательно также, что L. iners (а именно штамм L. iners AB-1) обладает самым коротким геномом среди всех исследованных на сегодняшний день лактобацилл [289] – его длина составляет всего около 1,3 миллиона пар оснований [184], что в среднем в 1,5-2 раза короче, чем у остальных лактобацилл [289]. Однако при этом геном содержит сразу 6 копий оперона рибосомальной РНК [184]. Ранее было продемонстрировано, что более высокое количество копий данного оперона может придавать бактериям преимущества в адаптации к меняющимся условиям окружающей среды [168]. Также в геноме L. iners AB-1 обнаружено сразу 65 генов (около 5,5% от всех кодирующих последовательностей), предположительно полученных в результате горизонтального переноса от других микроорганизмов, что в среднем в 10-50 раз выше, чем у отдельных штаммов L. crispatus, L. gasseri, L. johnsonii и L. acidophilus [184]. В этом же исследовании было продемонстрировано, что L. iners AB-1 способен использовать муцин в качестве альтернативного источника углерода. Кроме того, не было обнаружено генов большинства адгезинов, характерных для других лактобацилл, зато были обнаружены гены альтернативных адгезинов из группы сортазо-зависимых белков. Показано, что геном L. iners AB-1 содержит опероны стрессовых протеинов, что может обеспечивать персистенцию микроорганизма в условиях измененной среды, и гены цитолизина и гемолизина. [184]. В другом исследовании было продемонстрировано, что L. iners при БВ усиливает экспрессию целого ряда генов. В частности, генов ваголизина (способного разрушать клетки вагинального эпителия и ранее обнаруженного у G. vaginalis [127]), цитолизина и генов антифаговой защиты (CRISPR система и система рестрикции-модификации). Существует предположение, что бактериофаги могут истощать популяцию лактобацилл во время эпизодов БВ [166], а некоторые исследователи считают бактериофаги маркерами изменений в микробиоценозах [235]. В таком случае усиление экспрессии генов антифаговой защиты может способствовать выживанию вида. Кроме этого, L. iners увеличивает экспрессию генов ферментов, необходимых для утилизации глицерола. Аналогичными генами обладает и L. crispatus. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что лактобациллы могут использовать глицерол в качестве альтернативного источника углерода [183]. При культивировании in vitro L. iners AB-1 не экспрессирует гены антифаговой защиты, зато увеличивают экспрессию гена цитолизина [183], что в очередной раз свидетельствует о высокой экологической пластичности данного вида. Возможно, что L. iners, за счет высокой способности к персистенции при дисбиотических состояниях [118, 158, 257, 294, 313], может являться ключевым фактором, обеспечивающим восстановление лактофлоры после устранения причин дисбиоза [184].

С помощью молекулярно-генетических методов исследования удалось выяснить, что у значительной части здоровых женщин лактобациллы не являются доминирующими микроорганизмами [122, 160, 232, 291, 310, 311].

Кроме лактобацилл влагалище здоровых женщин могут населять другие микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту: A. vaginae, Megasphaera spp. и Leptotrichia spp. [237, 310, 311]. Было установлено, что вид доминирующих микроорганизмов значительно зависит от расовой/этнической принадлежности исследуемых женщин [56, 232] и географической области их проживания [218].

Например, у афро- и латиноамериканок реже выявляются лактобациллы [232, 311]. Кроме этого, у чернокожих женщин реже выявляются H2O2-продуцирующие лактобациллы [50]. Ravel et al. исследовали 396 здоровых североамериканских женщин различной этнической принадлежности и с помощью кластерного анализа выделили пять групп вагинального микробиоценоза [232]. В четырех группах (1-3, 5) доминировали отдельные виды лактобацилл: в первой – L. crispatus, во второй – L. gasseri, в третьей – L. iners, в пятой – L. jensenii. А оставшаяся группа (4) состояла из большого количества микроорганизмов, лактобациллы при этом не занимали доминирующего положения. В итоге у европеоидов и азиаток в 89,7% и 80,2% случаев, соответственно, выявляли лактобациллярные варианты микробиоценоза (группы 1, 2, 3, 5), тогда как у афро- и латиноамериканок часто выявляли нелактобациллярные варианты (группа 4) – 40,4% и 38,1%, соответственно. Данные результаты, вместе с предыдущими исследованиями [122, 160, 291, 310, 311] говорят о том, что снижение количества или отсутствие лактобацилл не обязательно является патологией.

1.3. Молекулярно-генетические методы в изучении вагинального микробиоценоза: новые взгляды на микробиоту влагалища На сегодняшний день наши представления о вагинальном микробиоценозе значительно расширились благодаря применению молекулярно-генетических методов исследования. Была переоценена роль многих групп микроорганизмов, входящих в состав вагинального микробиоценоза [78, 79]. Были открыты новые, ранее не выделяемые микроорганизмы [122, 139, 207, 214, 218, 291, 306, 314], в том числе ассоциированные с БВ [122, 207]. Пересмотрены вопросы систематики различных микроорганизмов, населяющих вагинальный эпителий. Например, в 1992 году микроорганизмы, ранее идентифицированные как Lactobacillus minutus, Lactobacillus rimae [211], Streptococcus parvulus внутри группы лактат-продуцирующих бактерий были реклассифицированы в род Atopobium [92]. А в 1999 году в Швеции был изолирован похожий на эти три вида, но не идентичный им микроорганизм, названный A. vaginae [237]. С тех пор данный микроорганизм довольно часто выявляли у женщин с помощью молекулярно-генетических методов исследования, причем намного чаще у женщин с БВ [39, 64, 72, 78, 97, 116, 117, 122, 123, 190, 195, 207, 281, 283, 291, 297, 300, 306, 310, 311]. Использование культуральных методов может явиться причиной гиподиагностики данного микроорганизма, так как он является анаэробным и требовательным к питательным средам микроорганизмом, кроме того растет в виде точечных колоний, которые можно не заметить [237].

С помощью молекулярно-генетических методов исследования выявлены три генотипа G. vaginalis, различающихся по способности продуцировать фермент нейраминидазу (сиалидазу) [244], повышенный уровень которого ассоциирован с БВ [156, 259] и преждевременными родами [81, 84]. В других исследованиях было продемонстрировано, что отдельные штаммы G. vaginalis различаются по способности экспрессировать гены, обеспечивающие метаболические процессы и синтез факторов патогенности [307], а также гены, ответственные за синтез адгезинов и образование биопленок [141]. На сегодняшний день предпринимаются попытки секвенировать геномы других микроорганизмов, колонизирующих вагинальный эпителий [185, 225, 255, 314], что в дальнейшем может позволить выделить отдельные гены – маркеры патологических состояний [119].

Реклассифицированы были и представители нормальной микрофлоры влагалища – лактобациллы. В 1980 году было продемонстрировано, что вид L. acidophilus, традиционно считавшийся доминирующим среди здоровых женщин микроорганизмом, является гетерогенной группой бактерий с общими биохимическими свойствами [175]. Данная группа была разделена на основании гомологии ДНК (чего нельзя было сделать биохимически) [163], в результате были выделены несколько видов лактобацилл внутри комплекса L. acidophilus [105, 114, 247].

Также было продемонстрировано, что лактобациллы не являются доминирующими микроорганизмами у значительной части клинически здоровых женщин [122, 160, 232, 291, 310, 311] и могут замещаться другими продуцентами молочной кислоты: A. vaginae, Megasphaera spp. и Leptotrichia spp. [310, 311]. Отсюда следует, что отсутствие лактобацилл или присутствие определенных микроорганизмов, таких как G. vaginalis, Peptostreptococcus spp., Prevotella spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp. не обязательно означает патологическое состояние [160, 162]. Более того, некоторые микроорганизмы могут транзиторно доминировать во влагалище здоровых женщин (например, G. vaginalis при повышении pH во время менструации) [268]. G. vaginalis вообще выявляется в вагинальном содержимом 50-70% женщин при нормальных показателях по шкале Нугента [267]. Данный факт заставляет исследователей искать факторы и маркеры патогенности у этого микроорганизма [156, 244, 259, 307], выявление которых позволит дифференцировать патологические состояния от варианта нормы.

Использование культуральных методов исследования привело к искаженному восприятию вагинальной микробиоты: недооценке ее разнообразия (так как многие микроорганизмы являются требовательными к условиям культивирования или вообще некультивируемыми), и переоценке разнообразия лактобацилл [41, 101]. Около 25 лет назад Redondo-Lopez et al., используя культуральные методы исследования, вообще пришли к выводу, что нет двух женщин, колонизированных одним и тем же видом лактобацилл [233]. Однако, несмотря на ограничения культурального метода, он является незаменимым при изучении биопленкообразования вагинальными микробами [42, 182].

В 2008 году был запущен амбициозный проект «Микробиом человека»

[220]. Целями проекта являются изучение микробного состава различных биотопов человека (в том числе и влагалища), влияния микробовкомменсалов на функционирование организма человека и их роль в развитии патологии. Результаты, полученные в рамках данного проекта, подтверждают и систематизируют многие ранее накопленные данные о составе и функционировании вагинального микробиоценоза [134, 157, 183, 184, 231, 232]. В то же время на многие вопросы до сих пор не получены ответы.

Например, по-прежнему остается неизвестной этиология БВ [121, 186, 253, 285], а имеющиеся методики его коррекции ассоциированы с высокой частотой рецидивирования [70, 72, 140, 180, 206, 243, 260].

1.4. Нарушения и методы коррекции вагинального микробиоценоза Наиболее частым нарушением вагинального микробиоценоза является БВ, выявляемый у 10-20% европеоидных женщин и у 30-50% представителей негроидной расы [151, 261, 266, 285]. У женщин с БВ повышается риск развития ИППП или воспалительных заболеваний органов малого таза [59, 75, 90, 131, 136, 187, 199, 203, 230, 271, 276, 298, 301] и осложнений беременности [80, 133, 143, 144, 153, 154, 172, 177, 203, 229, 258]. Например, вероятность преждевременных родов при БВ повышается в 1,5-3 раза в сравнении с общепопуляционным показателем [99, 130]. А у женщин после экстракорпорольного оплодотворения на фоне нарушений вагинальной микробиоты и снижения количества перекись-продуцирующих лактобацилл повышается вероятность ранних выкидышей [106, 242, 263, 304], возможно за счет повышения количеств провоспалительных цитокинов в матке [83, 84, 106, 145, 241, 263]. В недавнем проспективном исследовании было продемонстрировано, что ВИЧ-позитивные женщины, в случае развития БВ, с большей вероятностью инфицируют данным вирусом своих половых партнеров [91].

При БВ снижается количество нормофлоры и увеличивается доля УПМ [38, 122, 151, 266, 305]. УПМ, ассоциированными с БВ, являются: G. vaginalis [141], A. vaginae [72], БВ-ассоциированные бактерии (BVAB1, BVAB2, BVAB3) из порядка Clostridiales [122], Megasphaera spp. [179] и Snaethia spp.

[123]. Однако список не ограничивается перечисленными микроорганизмами [119].

Ассоциированные с БВ микроорганизмы часто существуют в форме биопленок [274]. Более 90% идентифицированных при БВ биопленок состоят из A. vaginae и G. vaginalis [137, 274]. Также было продемонстрировано, что биопленки G. vaginalis присутствуют на поверхности вагинального эпителия только у женщин с БВ и отсутствуют у здоровых женщин [274]. Более того, была сформулирована гипотеза, что биопленки G. vaginalis участвуют в трансмиссии БВ от одного организма к другому, так как биопленки данного микроорганизма обнаруживаются в моче сексуальных партнеров женщин с БВ [273]. И вообще на сегодняшний день собрано много фактов, косвенно указывающих на половую передачу БВ [62, 76, 142, 159, 197, 249, 250].

Однако также были идентифицированы атипичные формы БВ, при которых не выявляли традиционные виды микроорганизмов, ассоциированные с данным состоянием. Пятидневный курс интравагинального метронидазола продемонстрировал у этих пациенток эффективность только в 74% случаев через месяц после окончания терапии [100].

Этиология БВ до сих пор остается неизвестной [121, 186, 253, 285]. На фоне снижения количества или полного исчезновения лактобацилл наблюдается рост количества УПМ: G. vaginalis, Mobiluncus mulieris, A. vaginae, Prevotella bivia, Fusobacterium nucleatum и т.д. [98, 253, 274].

Данные микроорганизмы, в отсутствии лактобацилл, в избытке получают питательные вещества и площадь для адгезии на эпителиальных клетках. В исследованиях in vitro было показано, что вагинальные эпителиоциты, полученные от женщин с БВ, угнетают ростовые свойства лактобацилл и стимулируют биопленкообразование УПМ, данный факт может объяснять устойчивость данного патологического состояния [3]. БВ обычно является полимикробным состоянием [122, 123, 264, 293]. Разные микроорганизмы, ассоциированные с БВ, стимулируют рост друг друга. Например, в ряде исследований было продемонстрировано, что G. vaginalis обладает большим адгезивным потенциалом в сравнении с другими микроорганизмами, ассоциированными с БВ [141, 182, 216, 217]. Отсюда следует, что G. vaginalis может являться наиболее ранним микроорганизмом, колонизирующим вагинальный эпителий при БВ и облегчающим адгезию других БВассоциированных бактерий [182, 272, 274]. Кроме того, еще в конце 1970-х было выяснено, что G. vaginalis продуцирует аминокислоты, стимулирующие рост P. bivia [88]. P. bivia (ранее Bacteroides bivia) в свою очередь утилизирует эти аминокислоты с образованием аммония, который уже ускоряет рост G. vaginalis [227]. Продуцировать большие количества аммония за счет пептидил-трансферазной активности могут и некоторые представители рода Atopobium при дефиците углеводов в среде [113, 165, 171]. В исследовании Machado et al. было продемонстрировано, что P. bivia, M. mulieris, F. nucleatum и A. vaginae ускоряют рост G. vaginalis in vitro в 3-4 раза [182]. В этой же работе было выявлено, что M. mulieris обладает выраженной способностью вытеснять лактобациллы с предварительно колонизированной ими поверхности. Учитывая низкий адгезивный потенциал авторы выдвинули гипотезу, что данный M. mulieris, микроорганизм продуцирует бактериоцины, активные в отношении лактобацилл.

Недавно было продемонстрировано, что при БВ в вагинальном микробном сообществе повышается экспрессия генов, кодирующих ферменты цикла трикарбоновых кислот, что приводит к накоплению в вагинальном отделяемом сукцината, образующегося при неполном окислении углеводов. Кроме этого, повышается экспрессия генов, кодирующих бутирил-СоА-дегидрогеназу и бутирилкиназу, что приводит к продукции бутирата, в основном за счет Prevotella amnii и Megasphaera spp.

Ранее было продемонстрировано, что бутират обладает [183].

противовоспалительной активностью [196, 287]. Возможно, что отсутствие воспалительной реакции при БВ в какой-то степени обеспечивается повышением концентрации бутирата.

Для лечения БВ рекомендовано использовать три химиопрепарата:

метронидазол и клиндамицин (основные схемы) или тинидазол (альтернативная схема) [31, 305]. Однако положительный эффект после лечения довольно часто является временным. Заболевание продолжается или рецидивирует у 10-29% пациенток в течение одного месяца [140, 180, 206], у 30% – в течение 3 месяцев, и у 40-50% – в течение полугода [18, 70, 72, 243, И только половина БВ-позитивных женщин, пролеченных 260].

клиндамицином и метронидазолом, колонизируются перекисьпродуцирующими лактобациллами через 70-90 дней после терапии [44, 206].

Кроме того, антибактериальная терапия БВ при беременности не позволяет снизить частоту развития преждевременных родов [48, 99, 169, 256].

Возможно, что низкая эффективность терапии БВ связана с тем, что микроорганизмы, ассоциированные с данным состоянием, часто находятся в биопленках [274, 275]. В исследованиях с другими микроорганизмами было продемонстрировано, что резистентность к антимикробным препаратам является характерной чертой биопленок [94, 125]. Например, биопленки крайне устойчивы к высоким концентрациям имепенема и E. coli ципрофлоксацина, тогда как планктонные клетки данного микроорганизма полностью погибают при более низких концентрациях данных препаратов [58]. Чувствительность биопленок P. aeruginosa к торбамицину в сто раз ниже чувствительности планктонных клеток. А минорная часть микроорганизмов внутри биопленки P. aeruginosa (менее 0,1%) остается жизнеспособной даже после десятикратного увеличения терапевтической дозы офлоксацина, тогда как остальная популяция погибает при терапевтической концентрации препарата [74]. В дальнейшем данная популяция резистентных клеток может снова размножиться до исходных количеств, тем самым приводя к рецидивам заболевания. Возможно, что такой механизм лежит и в основе рецидивирования БВ. В недавнем исследовании продемонстрировали, что количества Srinivasan et al.

отдельных групп анаэробных микроорганизмов во влагалище быстро и резко снижаются на фоне применения метронидазола, однако после отмены препарата происходит восстановление популяции данных микроорганизмов [268]. В другом исследовании также отмечалось резкое снижение количества анаэробных микроорганизмов и увеличение относительной доли лактобацилл (в основном за счет L. iners) на фоне назначения антибактериальной терапии, однако после отмены препарата микробиоценоз, как правило, возвращался к исходному состоянию в течение 2-4 недель [231]. Ferris et al. также отмечали восстановление лактофлоры после терапии метронидазолом, в основном за счет вида L. iners [118]. McMillan et al. продемонстрировали in vitro, что метронидазол нарушает целостность биопленки, состоящей из A. vaginae и однако при этом не наступает полной эрадикации G. vaginalis, микроорганизмов [194]. В этом же исследовании было продемонстрировано, что добавление пробиотических штаммов лактобацилл (L. reuteri RC-14 и L. rhamnosus GR-1) вызывает гибель большой доли A. vaginae и G. vaginalis.

Антагонистическая активность лактобацилл по отношению к биопленкам G. vaginalis была продемонстрирована и в другом исследовании [246].

Однако нет гарантии, что аналогичный эффект будет наблюдаться in vivo.

Низкая эффективность терапии БВ с помощью клиндамицина, метронидазола и тинидазола [70, 72, 140, 180, 206, 243, 260] заставляет искать новые подходы для борьбы с данным патологическим состоянием.

Например, разрушение биопленок микроорганизмов, ассоциированных с БВ.

Hymes et al. в своем исследовании продемонстрировали, что ДНКаза разрушает биопленки G. vaginalis за счет деградации экстрацеллюлярной ДНК, входящей в состав матрикса биопленки, и тем самым потенцирует эффект метронидазола как in vitro, так и на мышиной модели in vivo [161].

Синергичное действие ДНКазы и антимикробных препаратов было отмечено и в исследованиях с другими, не ассоциированными с БВ, микроорганизмами [164, 280]. Поэтому можно предположить, что данный метод может быть полезен в борьбе с биопленками различных микроорганизмов. Однако самым популярным среди исследователей подходом к восстановлению вагинальной микробиоты является применение пробиотических препаратов, как правило, на основе живых лактобацилл [51, 52, 126, 147, 191, 234].

Впервые пробиотики для коррекции микрофлоры влагалища были применены в 1928 году. Добавление сывороточного бульона с культурой L. acidophilus останавливало размножение N. gonorrhoeae in vitro и in vivo Применение штаммов и [282]. Lactobacillus fermentum Lactobacillus при урогенитальных инфекциях не принесло ощутимых rhamnosus результатов. Возможно, это связано с тем, что данные виды в норме не доминируют во влагалище [77, 126, 234]. Наиболее привлекательным кандидатом для пробиотических препаратов является вид L. crispatus, который часто выявляется во влагалище здоровых женщин [61, 123] и наоборот, крайне редко – у пациенток с БВ [53, 122, 167, 262, 288, 302]. Более того, данный вид может обладать повышенной способностью персистировать во влагалище [286], а штамм L. crispatus CTV-05, применяемый для изготовления пробиотических препаратов, обладает высокой способностью прикрепляться к вагинальному эпителию in vitro [53]. В своем исследовании Antonio et al. продемонстрировали, что пробиотический штамм L. crispatus CTV-05 успешно колонизирует вагинальный эпителий у 69% пациенток [52].

Причем если пациентки уже были колонизированы индигенным L. crispatus, то успеха удавалось добиться только в 51% случаев, а если у пациенток перед инсталляциями выявляли другие виды лактобацилл – то в 90%. Однако у данного исследования имеются два серьезных ограничения. Во-первых, была исследована возможность колонизации эпителия влагалища здоровых женщин, тогда как в реальности пробиотики придется использовать у пациенток с дисбиотическими нарушениями. Во-вторых, не было оценено количество штамма L. crispatus CTV-05 в вагинальном содержимом, а вместо этого был установлен только факт его наличия. Возможно, что L. crispatus CTV-05 колонизирует вагинальный эпителий, но при этом присутствует в низком количестве и не оказывает значительного влияния на микробиоценоз.

В России в настоящее время зарегистрирован единственный пробиотический препарат на основе L. crispatus – Экофемин Флораваг (ЭФ).

В состав препарата входят живые лактобациллы трех видов, в том числе штамм L. crispatus LMG 9479. Препарат предназначен для перорального приема, что обеспечивает восстановление микрофлоры как репродуктивного, так и желудочно-кишечного тракта. Ранее была продемонстрирована высокая эффективность перорального применение пробиотиков, содержащих лактобациллы [65], и для двух штаммов лактобацилл (L. rhamnosus GR-1 и L. fermentum RC-1) доказана возможность колонизации влагалища за счет транслокации из ампулы прямой кишки [234]. Заселение влагалища микробиотой в онтогенезе происходит аналогичным образом, поэтому пероральный способ введения является физиологичным. Ампула прямой кишки является резервуаром как лактобацилл, так и УПМ, способных вызывать инфекционную патологию репродуктивного тракта и мочевыводящих путей у женщины [222]. Кроме того, пероральный прием препарата повышает приверженность лечению у пациенток. Однако данные о клинической и микробиологической эффективности ЭФ для коррекции дисбиоза влагалища ограничены.

Вопрос об эффективности пробиотических препаратов на сегодняшний день остается открытым. Некоторые авторы утверждают, что данные препараты вызывают изменения вагинальной микрофлоры с БВассоциированной на лактофлору [234]. Однако другие исследователи демонстрируют, что пробиотические штаммы быстро элиминируются из влагалища и не всегда производят желаемый эффект [77]. Большая часть исследователей оценивают эффективность применения пробиотиков, опираясь на клинические критерии Амселя [47] или шкалу Нугента [205], которые не позволяют в полной мере изучить изменения в вагинальной микробиоте. Среди этих исследователей также отсутствует однозначное мнение об эффективности применения пробиотических препаратов (как изолировано, так и в сочетании с антимикробными препаратами) при лечении БВ: часть отмечает увеличение случаев выздоровления [54, 55, 174, 191, 215, 221], в то время как другие не выявили этого [71, 109, 138]. Bodean et al. отметили более низкий уровень рецидивирования БВ в течение 12 месяцев после терапии метронидазолом при одновременном приеме пробиотических препаратов с интравагинальным или пероральным путем введения, чем после терапии только метронидазолом [65]. Однако в исследовании скудно описаны критерии подбора пациентов и диагностики БВ, что не позволяет оценить объективность полученных результатов. Во всех исследованиях используются различные пробиотические штаммы, и даже виды лактобацилл и их дозировки, пути введения (перорально или интравагинально) и схемы приема препарата, что затрудняет однозначную интерпретацию полученных результатов [192].

1.5. Влияние хлоргексидина на микроорганизмы и применение кавитированного низкочастотным ультразвуком растворов в акушерстве и гинекологии Хлоргексидина биглюканат является антисептическим и дезинфицирующим средством с бактерицидной активностью. Хлоргексидин состоит из катионных молекул, которые связываются с отрицательно заряженными структурами на поверхности микробных клеток [176]. После этого происходит повреждение микробной клеточной стенки, хлоргексидин транспортируется к цитоплазматической мембране и атакует ее. В результате микробная клетка теряет ионы, высокие концентрации хлоргексидина приводят к коагуляции или преципитации цитоплазмы, что и обеспечивает бактерицидный эффект [176, 193]. Хлоргексидин обладает широким спектром активности: действует на грамотрицательные и грамположительные бактерии, а также на клетки грибов [108, 176, 193]. Тем не менее, рядом исследователей было продемонстрировано, что хлоргексидин оказывает менее выраженный эффект на популяцию лактобацилл полости рта в сравнении с другими кариесогенными бактериями [45, 181, 245, 309]. В исследовании Akca et al. было показано, что биопленки лактобацилл более резистентны к хлоргексидину, чем биопленки Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, S. aureus, тогда как планктонные клетки лактобацилл более восприимчивы к хлоргексидину, чем планктонные клетки перечисленных бактерий [45]. Возможно, что биопленки вагинальных лактобацилл также менее чувствительны к хлоргексидину в сравнении с биопленками УПМ, ассоциированных с дисбиозом влагалища. В литературе имеется описание применения тампонов с хлоргексидином для лечения БВ, однако судить об эффективности данного подхода не представляется возможным ввиду малого объема наблюдаемых пациентов [49].

Эксперименты и клинические исследования показали, что достаточно эффективным средством сенсибилизации биопленок к антимикробным агентам может быть обработка влагалища растворами лекарственных средств, кавитированных НУЗ [8, 14, 17, 28]. Биоакустический эффект ультразвукового воздействия проявляется в уменьшении жизнеспособности бактерий в биопленках в результате одновременного воздействия НУЗ и антимикробных препаратов [63], а также происходит стимуляция кровообращения за счет микромассажного действия ультразвука [9, 32].

Повышенный приток крови может способствовать модуляции местного иммунного ответа.

Было показано, что проведение кавитационной терапии в комплексном лечении хронического рецидивирующего вульвовагинального кандидоза приводило к усилению защитных реакций в очаге воспаления:

отмечалась нормализация общего числа лейкоцитов, снижение активности лизосом, увеличение функционального резерва, активности и интенсивности фагоцитоза [9].

Преимущество использования кавитированных растворов заключается в более эффективной доставке препаратов [2] и более выраженному их воздействию на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы [26, 28].

Считается, что ультраозвучивание лекарственных растворов приводит к формированию кавитационных пузырьков – микрополостей в месте разрежения жидкой среды. На поверхностях кавитационных пузырьков, в результате больших напряжений, образуются электрические заряды, которые в свою очередь могут способствовать образованию ионов в жидкости, в том числе H2O2, обладающей бактерицидным эффектом [9]. Исследователи отмечают более выраженное действие НУЗ на грамотрицательные микроорганизмы [1, 224]. Учитывая данный факт можно предположить, что ультраозвученные растворы могут селективно воздействовать на БВассоциированную микрофлору при относительной безвредности для лактофлоры.

Для лечения и профилактики воспалительных заболеваний генитального тракта в акушерстве и гинекологии рекомендуются несколько кавитированных лекарственных растворов, в том числе: 0,05% водный раствор хлоргексидина, 10% раствор Бетадина в разведении 1:20 или 1:50 со стерильным физиологическим раствором, 3% раствор гидрокарбоната натрия, 0,005 % раствор Имунофана в разведении 1:100 или 1:50 со стерильным физиологическим раствором, 0,02% водный раствор фурацилина и растворы антибиотиков [9, 26, 32]. При этом стоит отметить, что кавитированные НУЗ растворы также применяются для лечения бактериальных инфекций в гнойной хирургии [8, 20] и оториноларингологии [21, 63], а в гинекологии кроме обработки влагалища осуществляют также и обработку данными растворами полости матки с целью лечения хронического эндометрита [12, 13].

Методика обработки влагалища КНУЗ РХ в настоящее время получила широкое распространение в акушерско-гинекологической практике. Показана ее клиническая эффективность в лечении инфекционновоспалительных заболеваний гениталий, возможности профилактики инфекционных осложнений после внутриматочных вмешательств [9, 10, 11, Однако оценка эффекта от обработки влагалища 27, 36, 40].

кавитированными НУЗ лекарственными растворами на вагинальную микрофлору проводилась только с помощью микроскопии вагинального секрета [25, 29]. В руководствах по использованию кавитированных НУЗ лекарственных растворов тип мазка вагинального отделяемого не рассматривается как показание или противопоказание к применению методики [9, 25, 26, 32]. Поэтому методика используется в лечении пациенток с любым типом мазка, в том числе и с «нормоценозом».

Учитывая более выраженный эффект НУЗ на грамотрицательные микроорганизмы [1] и сообщения о сниженной чувствительности некоторых представителей рода Lactobacillus к хлоргексидину [45, 181, 245, 309], возможно, что обработка влагалища КНУЗ РХ может оказаться действенным инструментом в коррекции дисбиоза влагалища.

Кроме этого, изучение эффекта обработки влагалища КНУЗ РХ на состав вагинальной микробиоты в целом и лактофлоры в частности позволит оценить безопасность применения данной методики с целью профилактики инфекционно-воспалительных осложнений перед внутриматочными вмешательствами [29] и хирургическим лечением пролапса гениталий [22], а также профилактики гнойно-септических заболеваний [26] у пациенток с нормоценозом влагалища.

Таким образом, на сегодняшний день, по-прежнему детально не изучена роль отдельных видов лактобацилл в поддержании стабильности вагинального микробиоценоза, что не позволяет однозначно оценить значение выявления того или иного вида лактобацилл во влагалище. До сих пор нет эффективного, простого и доступного практикующим врачам инструмента для типирования вагинальной лактофлоры.

Не решен и вопрос коррекции дисбиотических состояний вагинальной микробиоты:

существующие методики либо не всегда эффективны, либо до сих пор отсутствуют убедительные данные об их эффективности. Не исследован эффект обработки влагалища КНУЗ РХ – широко применяемой в акушерской и гинекологической практике методики – на качественный и количественный состав микрофлоры влагалища.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика обследованных групп женщин и дизайн исследования Для изучения видового состава вагинальных лактобацилл у женщин репродуктивного возраста в исследование были включены 608 женщин в возрасте от 18 до 45 лет, (средний возраст 30,3±6,6 лет), наблюдавшихся в медицинском центре «Гармония» или обратившихся на прием к гинекологу в период с сентября 2011 по август 2014 года. Помимо возраста критериями включения в исследуемую группу являлось отсутствие у пациенток ВИЧинфекции, парентеральных гепатитов, возбудителей ИППП: Treponema pallidum, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis, а также отсутствие системного или местного приема антимикробных препаратов в течение четырех недель перед исследованием.

Всех женщин обследовали однократно: оценивали состояние микробиоценоза влагалища и проводили генотипирование 6 видов лактобацилл с помощью метода ПЦР-РВ (рисунок 2.1).

С целью изучения изменений качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза, возникших в результате воздействия КНУЗ РХ были обследованы 104 пациентки, планировавшие искусственное прерывание беременности (ИПБ) в сроках от 5 до 12 недель методом вакуумаспирации. Средний возраст беременных составил 29,3±6,7 лет.

С целью профилактики воспалительных осложнений ИПБ всем женщинам, планировавших проведение вакуум-аспирации [26, 29], проводили обработку влагалища КНУЗ РХ с помощью аппарата АУЗХ-100 в соответствии с руководством [26]: время воздействия – 1-2 минуты, мощность – 6-8 единиц, объем используемого раствора – 150-200 мл.

Беременным с клинико-лабораторными признаками вагинита или БВ назначали три процедуры, обработку проводили один раз в сутки, последнюю – за 1-2 часа до манипуляции; клинически здоровым женщинам с профилактической целью выполняли одну процедуру за 1-2 часа до манипуляции.

Состояние микробиоценоза влагалища исследовали до и после обработки влагалища КНУЗ РХ микроскопическим методом и методом ПЦРРВ. У 71 из 104 пациенток в дополнение к оценке микробиоценоза до и после обработки генотипировали вагинальные лактобациллы (рисунок 2.1).

Для оценки эффекта последовательного применения обработки влагалища КНУЗ РХ и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые L. crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирующего вида лактобацилл в исследование были включены 84 женщины в возрасте от 18 до 44 лет (средний возраст 30,7±5,5) с дисбиозом влагалища, подтвержденным методом ПЦР-РВ. В зависимости от выраженности дисбиотических нарушений обследованные были разделены на две группы: 32 женщины с умеренным анаэробным дисбиозом (группа I) и 52 женщины с выраженным анаэробным дисбиозом (группа II).

С целью коррекции дисбиоза влагалища всем пациенткам на первом этапе проводили обработку влагалища КНУЗ РХ с помощью аппарата АУЗХв соответствии с руководством [26] (время воздействия – 1-2 минуты, мощность – 6-8 единиц, объем используемого раствора – 150-200 мл, кратность – один раз в день в течение трех дней подряд). На втором этапе все пациентки получали пробиотический препарат на основе L. crispatus «Экофемин Флораваг» (ЭФ) по 1 капсуле 2 раза в сутки в течение 10 дней перорально. ЭФ является биологически активной добавкой, содержащей три вида лактобацилл: L. crispatus, L. brevis и L. acidophilus.

Клиническую оценку состояния нижних отделов гениталий и определение видового состава лактобацилл проводили до начала и после окончания лечения. Состояние микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ исследовали трехкратно: до лечения – на этапе первичного консультирования; непосредственно после третьей обработки влагалища КНУЗ РХ; через месяц после окончания приема ЭФ (рисунок 2.1).

–  –  –

2.2. Методы исследования 2.2.1. Микроскопическое исследование Микроскопию вагинального отделяемого, окрашенного метиленовым синим и по Романовскому-Гимзе, проводили двукратно 104 пациенткам: до обработки влагалища КНУЗ РХ и после.

При оценке микроскопической картины учитывали количество и тип эпителиальных клеток, количество лейкоцитов, характер микрофлоры.

Классификацию микробиоценоза влагалища по результатам микроскопического исследования проводили в соответствии с рекомендациями Кира Е.Ф. (2001) [15].

1. Нормоценоз, характеризующийся доминированием лактобацилл, отсутствием грамотрицательной микрофлоры, спор мицелия и дрожжеподобных грибов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых»

эпителиальных клеток, соответствующих фазе менструального цикла.

2. Промежуточный тип характеризуется умеренным или сниженным количеством лактобацилл, наличием кокков. Обнаруживаются лейкоциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Является пограничным типом, часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается субъективными жалобами и клиническими проявлениями.

3. Дисбиоз влагалища, выражающийся в незначительном количестве или полном отсутствии лактобацилл, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой микрофлорой; наличием «ключевых клеток». Количество лейкоцитов вариабельно, отмечается отсутствие или незавершенность фагоцитоза.

4. Вагинит (воспалительный тип мазка) – полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, отмечается выраженный фагоцитоз. При обнаружении гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифов, спор выставляется соответствующий этиологический диагноз. В случае отсутствия этиологически значимых микроорганизмов при таком варианте микроскопической картины пациенткам ставят диагноз неспецифического вагинита.

2.2.2. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для оценки микробиоценоза влагалища Для оценки микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ использовали набор реагентов Фемофлор-16 (ООО «НПО ДНК-технология», Москва) и амплификаторы ДТ-96 и ДТ-322 этого же производителя. Всего было исследовано 908 образцов вагинального отделяемого.

Набор Фемофлор предназначен для выявления ДНК УПМ, ДНК лактобацилл и геномной ДНК человека (в качестве контроля взятия биологического материала). Данный набор предназначен для исследования качественного и количественного состава микробиоценоза урогенитального тракта.

Принцип метода основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающемся в повторяющихся циклах: термической денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой.

Набор реагентов Фемофлор включает: смесь для ПЦР-амплификации, специфичную для всех бактерий (общая бактериальная масса – ОБМ), смесь, специфичную для лактофлоры (Lactobacillus spp.) и смеси, специфичные для УПМ. В одну из пробирок набора со смесью для амплификации добавлен внутренний контрольный образец, предназначенный для оценки эффективности протекания полимеразной цепной реакции. Одна из пробирок предназначена для контроля взятия биологического материала, в ней содержится смесь для амплификации геномной ДНК человека.

В реакционную смесь для проведения ПЦР введены ДНК-зонды, каждый из которых несет флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции.

При образовании специфического продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации.

ДНК-зонды, используемые для детекции продуктов амплификации ДНК общей бактериальной массы, лактобацилл и большинства УПМ, помечены флуоресцентными метками FAM; ДНК-зонды, используемые для детекции продуктов амплификации внутреннего контрольного образца, контроля взятия материала и M. genitalium, помечены HEX.

Пробирки для амплификации различных мишеней объединены в стрипы по 8 пробирок (таблица 2.1). Использование двух флуоресцентных красителей (FAM и HEX) позволяет сократить количество пробирок, так как при этом возможно одновременно регистрировать результаты двух разных реакций амплификации, проходящих в одной пробирке.

После прохождения амплификации стандартное программное обеспечение производителя по показателю индикаторного (порогового) цикла рассчитывает количество ОБМ, количество и доли лактобацилл и каждого из УПМ. В зависимости от доли лактобацилл определяется вариант микробиоценоза. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывается показатель амплификации геномной ДНК человека (контроль взятия биологического материала).

Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных парафином. Смешивание слоев и превращение их в реакционную смесь происходит только при плавлении парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки.

В определенные пробирки (таблица 2.1) добавлен олигонуклеотид, меченный ROX. Он используется программным обеспечением прибора ДТкак маркер определения положения стрипа в плашке. После прохождения амплификации программа сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера, и если находит несовпадение, то предлагает программно пересчитать результат анализа, расположив пробирки в соответствующем порядке. В случае если оператор дает согласие на эту операцию, скорректированные данные можно сохранить в новом файле.

Таблица 2.1 – Набор Фемофлор-16: состав стрипов и каналы детекции продуктов амплификации В зависимости от количества лактобацилл и условно-патогенных микроорганизмов выделяли четыре группы вагинального микробиоценоза – абсолютный нормоценоз, условный нормоценоз, умеренный дисбиоз и выраженный дисбиоз (рисунок 2.

2) [6]. Микробиоценоз влагалища оценивали как абсолютный нормоценоз в случаях, когда лактобациллы составляли более 80% ОБМ, а количество микроорганизмов-ассоциантов (Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Candida spp.) при этом составляло менее 104 геном-эквивалентов в 1 мл – ГЭ/мл (далее все количества микроорганизмов указаны в этих единицах), если же количество ассоциантов превышало указанный порог, то такой вариант микробиоценоза расценивали как условный нормоценоз. В случаях, когда доля лактобацилл составляла 20от ОБМ, микробиоценоз расценивали как умеренный дисбиоз. Если доля лактобацилл не превышала 20% от ОБМ, микробиоценоз расценивали как выраженный дисбиоз.

Рисунок 2.2 – Алгоритм формирования заключения по состоянию микробиоценоза влагалища после исследования вагинального отделяемого набором Фемофлор-16.

2.2.3. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для генотипирования вагинальных лактобацилл Для оценки видового состава лактофлоры проводили определение количества Lactobacillus spp. и генотипирование шести видов лактобацилл (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) в 766 пробах от 608 женщин репродуктивного возраста. Общее количество лактобацилл оценивали с помощью набора реагентов Фемофлор (подробно данный набор описан в предыдущем разделе). Генотипирование проводили методом ПЦР-РВ с использованием набора реагентов для научного применения (ООО НПО «ДНК-Технология», Москва) в амплификаторах ДТи ДТ-322 того же производителя. Регистрацию и учет результатов ПЦР проводили с помощью программного обеспечения для детектирующих амплификаторов ДТ-322 и ДТ-96 (ООО НПО «ДНК-Технология», Москва).

Количество отдельных видов лактобацилл (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) в каждой пробе рассчитывали по показателю порогового цикла. Пороговый цикл для каждого вида (при его наличии в пробе) определялся программно и отображался в протоколе исследования.

Далее для расчета количества каждого вида использовали предоставленную производителем набора реагентов формулу:

Где N – количество вида в 1 мл исследуемого материала;

Ct – пороговый цикл Далее в каждой пробе определяли доминирующий вид лактобацилл. В случае одновременного присутствия нескольких видов Lactobacillus spp., доминирующим считали тот, доля которого была наибольшей.

Долю отдельного вида лактобацилл рассчитывали по следующей формуле:

–  –  –

2.2.4. Статистические методы Все полученные в ходе исследований результаты сводили в базы данных в программе Microsoft Office Excel 2007.

Средний возраст пациенток в исследуемых группах выражали средним арифметическим и стандартным отклонением; оба показателя рассчитывали в программе Microsoft Office Excel 2007.

В качестве средних величин ОБМ и количеств отдельных групп микроорганизмов использовали медианы. Для отображения вариации признака внутри групп указывали 0,05 и 0,95 перцентили. Медианы и перцентили рассчитывали в программе Microsoft Office Excel 2007.

Для оценки достоверности различий между частотными показателями рассчитывали двусторонний критерий Фишера в программе WinPepi. Для оценки достоверности различий между средними показателями рассчитывали критерий Манна-Уитни в программе IBM SPSS Statistics 20. Во всех случаях различия интерпретировали как достоверные при минимальном уровне значимости =0,05.

ГЛАВА 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ У

ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С РАЗЛИЧНЫМИ

ВАРИАНТАМИ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА

В данном фрагменте работы были изучены особенности вагинального микробиоценоза при доминировании отдельных видов лактобацилл и выполнена оценка значения выявления отдельных видов лактобацилл в качестве доминирующих для поддержания нормоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста.

Исследовали отделяемое влагалища у 608 женщин репродуктивного возраста. У каждой пациентки оценивали состояние микробиоценоза влагалища. В зависимости от количества лактобацилл и УПМ выделяли четыре группы вагинального микробиоценоза – абсолютный нормоценоз, условный нормоценоз, умеренный дисбиоз и выраженный дисбиоз [6].

Кроме определения варианта микробиоценоза у каждой пациентки определяли общее количество и видовой состав лактофлоры, а также оценивали количества отдельных групп УПМ: Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., G. vaginalis/P. bivia/Porphyromonas spp. (группа GPP), Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp. (группа SLF), Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. (группа MVD), Lachnobacterium spp./Clostridium spp. (группа LC), Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. (группа MC), Peptostreptococcus spp., A. vaginae.

3.1. Частота выявления и доминирования отдельных видов лактобацилл В каждой пробе одновременно определяли от 1 до 5 видов лактобацилл: чаще один или два (44,1% и 31,9% случаев, соответственно) вида, реже 3 (18,4% случаев) или 4 вида (5,3% случаев), 5 видов одновременно выявляли только в двух пробах (0,3% случаев).

Отдельные виды лактобацилл в обследуемой группе из 608 женщин выявляли с различной частотой. L. iners идентифицировали в 366 (60,2%) случаев, L. crispatus – в 253 (41,6%); L. jensenii, L. gasseri и L. vaginalis обнаружили у 195 (32,1%), 117 (19,2%) и 111 (18,3%) пациенток, соответственно. Вид L. johnsonii выявили только у 3 пациенток (0,5% случаев).

Далее оценивали частоту выявления отдельных видов лактобацилл в качестве доминирующих. Если в пробе присутствовали одновременно несколько видов Lactobacillus spp., доминирующим считали тот, доля которого была наибольшей. Примечательно, что даже при одновременном выявлении 3 и более видов лактобацилл доля доминирующего вида превышала 50% (96% случаев) или даже составляла более 90% (59% случаев). Таким образом, в случаях, когда популяция лактобацилл была представлена несколькими видами, один вид имел весомое количественное преимущество над другими на момент исследования, что не исключает смены доминирующего вида при изменении среды. Ранее ряд исследователей продемонстрировали, что качественный и количественный состав вагинальной микрофлоры может кардинально изменяться в течение короткого промежутка времени [75, 232, 268].

Почти у половины женщин в качестве доминирующего вида выявляли L. iners (295 случаев – 48,5%), у трети – L. crispatus (184 случая – 30,3%), и гораздо реже L. gasseri (75 случаев – 12,3%) и L. jensenii (43 случая – 7,1%).

L. vaginalis и L. johnsonii доминировали только у 9 (1,5%) и 2 (0,3%) женщин, соответственно.

Таким образом, основными представителями нормофлоры влагалища являются L. crispatus, L. iners, L. gasseri и, в меньшей степени, L. jensenii, что согласуется с результатами других исследований [23, 30, 50, 64, 218, 232, 257, 262, 279, 281, 288, 291, 297, 302, 306, 310, 311, 312]. L. johnsonii и L. vaginalis, по всей видимости, не принимают значительного участия в формировании вагинального микробиоценоза. Первый выявляли крайне редко, всего у 3 из 608 пациенток, то есть менее чем в 1% случаев. Второй выявляли относительно часто, но, как правило, в низких количествах – в 81% случаев доля этого вида не превышала 10% от суммарного количества Lactobacillus spp. в исследуемой пробе.

–  –  –

Данный показатель отражает, с какой частотой исследуемый вид, в случае его выявления, доминировал среди лактобацилл при абсолютном нормоценозе, умеренном или выраженном дисбиозе. Было показано, что величина индекса для L. crispatus, L. iners, L. gasseri и L. jensenii варьировала от 16% до 96% в зависимости от вида лактобацилл и состояния микробиоценоза.

–  –  –

Следующая задача исследования заключалась в том, чтобы оценить взаимосвязь между доминирующим видом лактобацилл (L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii) и отдельными группами УПМ. Из одиннадцати исследуемых групп УМП (Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., группа GPP, Eubacterium spp., группа SLF, группа MVD, группа LC, группа MC, Peptostreptococcus spp., A. vaginae) выбрали те, средняя доля которых при дисбиозах была не менее 1% от всех выявляемых микроорганизмов [5]. Для расчета средней доли каждой группы УПМ при дисбиозах делили среднее количество отдельной группы УПМ на среднее количество всех выявляемых микроорганизмов (в качестве средних величин использовали медианы). В итоге для сравнения были взяты только четыре группы УПМ: группа GPP (среднее количество – 107,2, средняя доля – 23,7%), Eubacterium spp. (среднее количество – 106,4, средняя доля – 4%), группа MVD (среднее количество – 106, средняя доля – 1,6%) и A. vaginae (среднее 106,3, количество – средняя доля – Аналогичные группы 3,2%).

микроорганизмов чаще выявлялись во влагалище женщин с БВ в другом исследовании [24]. Средние доли оставшихся семи групп УПМ не превышали 0,3% от среднего количества ОБМ и, по всей видимости, их роль в развитии дисбиоза влагалища не так очевидна.

Связь между отдельными видами лактобацилл и группами УПМ оценивали по двум параметрам: средние количества УПМ при доминировании различных видов лактобацилл у женщин с нормоценозами (абсолютными+условными) и кратность прироста УПМ при дисбиозах (умеренных+выраженных). Средние количества отдельных групп УПМ при нормоценозах составляли от 102,7 до 104,7 (рисунок 3.2). Для оценки кратности прироста каждой группы УПМ делили их средние количества при дисбиозах на средние количества при нормоценозах (в качестве средних величин использовали медианы). Таким образом рассчитывали, во сколько раз количество отдельных групп УПМ при дисбиозах превышает этот показатель при нормоценозах на фоне доминирования разных видов лактобацилл.

Рисунок 3.2 – Средние количества отдельных групп УПМ в зависимости от доминирующего вида лактобацилл у женщин с нормоценозом влагалища.

Данные для всех групп представлены в lg. Соединительными линиями отмечены достоверно различающиеся показатели 3.2.1. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus crispatus Вид L. crispatus выявляли у 253 (41,6%) пациенток, в том числе в качестве доминирующего – в 184 (30,3%) случаях Индекс доминирования для L. crispatus был наибольшим в группе пациенток с абсолютным нормоценозом – 85% (таблица 3.1). Это значит, что у женщин с абсолютным нормоценозом данный вид в случае его выявления доминировал в 85% случаев. При дисбиозах этот показатель был ниже и составлял 68% при умеренном дисбиозе и всего 28% – при выраженном дисбиозе. То есть частота доминирования L. crispatus при абсолютном нормоценозе была достоверно выше, чем при выраженном дисбиозе (p0,001). Более того, частота доминирования данного вида при умеренном дисбиозе достоверно превышала таковую при выраженном дисбиозе (p=0,025).

При нормоценозах на фоне доминирования L. crispatus наблюдали наименьшие количества УПМ (за исключением микроорганизмов группы MVD, количество которых было незначительно ниже при нормоценозах на фоне доминирования L. gasseri – 102,9). Данную группу приняли в качестве референтной (для последующего сравнения количеств УПМ при нормоценозах на фоне доминирования других видов лактобацилл). При этом средние количества отдельных групп УПМ были следующими: группа GPP – 103,6, Eubacterium spp. – 103,7, группа MVD – 103, A. vaginae – 102,7 (рисунок 3.2).

При дисбиозах на фоне доминирования L. crispatus количество микроорганизмов группы GPP увеличивалось в среднем в 501 раз, Eubacterium spp. – в 158 раз, группы MVD – в 16 раз. В то время как среднее количество A. vaginae незначительно сокращалось. То есть в основном увеличивалось количество микроорганизмов группы GPP.

Таким образом, вид присутствовал в составе L. crispatus микробиоценоза влагалища у 41,6% женщин, в том числе в качестве доминирующего вида лактобацилл – у 30,3%. Учитывая низкое количество УПМ при нормоценозе и кратность их прироста при дисбиозах на фоне доминирования L. crispatus, можно сделать заключение о том, что доминирование данного вида является благоприятным прогностическим фактором для поддержания нормоценоза влагалища.

3.2.2. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus iners L. iners оказался самым часто выявляемым видом лактобацилл у женщин, в том числе в качестве доминирующего. L. iners выявляли у 366 (60,2%) пациенток, в том числе в качестве доминирующего – у 295 (48,5%).

Индекс доминирования для L. iners был наибольшим в группе пациенток с выраженным дисбиозом – 96% (таблица 3.1). То есть L. iners при выраженном дисбиозе являлся доминирующим видом лактобацилл в 96% случаев его выявления. Реже данный вид доминировал при умеренном дисбиозе (86% случаев) и еще реже при абсолютном нормоценозе (70% случаев). Таким образом, частота доминирования L. iners была достоверно выше при дисбиотических состояниях и составила 96% (против 70% при абсолютном нормоценозе, p0,001) при выраженном и 86% при умеренном дисбиозе (против 70% при абсолютном нормоценозе, p=0,028).

При нормоценозах на фоне доминирования L. iners отмечали более высокие средние количества УПМ: Eubacterium spp. (104,7 против 103,7, p=0,007), микроорганизмов группы MVD (103,4 против 103, p=0,001) и микроорганизмов группы GPP (104 против 103,6, p=0,001). A. vaginae выявляли в среднем количестве 102,9, что достоверно не отличилось от аналогичного показателя в референтной группе (рисунок 3.2).

При дисбиозах на фоне доминирования L. iners отмечали наибольшую кратность прироста трех из четырех групп УПМ (группы GPP и MVD, A. vaginae): среднее количество микроорганизмов группы GPP увеличивалось в 2512 раз, Eubacterium spp. – в 20 раз, группы MVD – в 5012 раз, A. vaginae – в 19553 раза. Примечательно, что только при доминировании L. iners наблюдается такой колоссальный прирост сразу трех групп УПМ: группы GPP, группы MVD и A. vaginae.

Таким образом, в обследованной нами группе женщин L. iners оказался наиболее распространенным видом вагинальных лактобацилл, причем присутствовал как у женщин, состояние микробиоценоза которых соответствовало нормоценозу, так и у пациенток с дисбиотическими нарушениями. При этом частота его доминирования зависела от доли лактофлоры в микробиоценозе и значительно повышалась именно при дисбиозах, особенно при выраженных.

3.2.3. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus gasseri L. gasseri выявляли у 117 (19,2%) женщин, в том числе у 75 (12,3%) – в качестве доминирующего вида. Индекс доминирования для L. gasseri был наибольшим в группе пациенток с умеренным дисбиозом – 74% (таблица 3.1). То есть, данный вид при условии его выявления доминировал у женщин с умеренным дисбиозом в 74% случаев, в то время как при выраженном дисбиозе L. gasseri доминировал только у 57% женщин, у которых выявляли данный вид, а при абсолютном нормоценозе – у 53% обследованных.

При нормоценозах на фоне доминирования L. gasseri не выявили значимых различий по количеству УПМ в сравнении с референтной группой (рисунок 3.2). Среднее количество микроорганизмов группы GPP составило 103,9, Eubacterium spp. – 104, группы MVD – 102,9, A. vaginae – 102,8.

На фоне доминирования L. gasseri при дисбиозах отмечали увеличение количества микроорганизмов группы GPP в 501 раз, Eubacterium spp. – в 100 раз, группы MVD – в 6 раз. Среднее количество A. vaginae оставалось прежним. То есть, при доминировании видов L. crispatus и L. gasseri наблюдали примерно одинаковую картину: неизменное количество (или даже небольшое снижение) A. vaginae и умеренное увеличение количества остальных УПМ, в основном за счет группы GPP.

Таким образом, L. gasseri являлся третьим по частоте доминирования видом вагинальных лактобацилл после L. iners и L. crispatus. Исключение составляют промежуточные состояния микробиоценоза, а именно умеренный дисбиоз, при которых значительно повышалась частота доминирования L. gasseri. Количества УПМ на фоне доминирования L. gasseri при нормоценозах минимальны и не отличаются от аналогичных показателей при доминировании L. crispatus, а при дисбиозах наблюдается умеренное увеличение количеств УПМ (в основном за счет группы GPP).

Значение выявления L. gasseri в качестве доминирующего вида в каждом конкретном случае нуждается в индивидуальной интерпретации.

Потенциально неблагоприятным может быть сочетание L. gasseri с L. iners, так как на фоне доминирования последнего наблюдается самый большой прирост УПМ при дисбиозах. Сочетание L. gasseri/L. crispatus возможно расценивать как более благоприятное, так как количества УПМ и кратность их прироста при доминировании данных видов минимальны.

3.2.4. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus jensenii L. jensenii выявляли у 195 (32,1%) женщин, однако доминировал данный вид только в 43 (7,1%) случаях. В отличие от трех наиболее распространенных видов (L. crispatus, L. iners, L. gasseri) L. jensenii чаще выявляли в качестве сопутствующего (или вспомогательного) вида лактобацилл. Тем не менее, данный вид являлся доминирующим у 7,1% пациенток, что обязывает рассматривать его как одного из ключевых элементов лактофлоры.

Индекс доминирования для L. jensenii был наибольшим в группе пациенток, состояние микробиоценоза влагалища которых отвечало критериям умеренного дисбиоза – 52% (таблица 3.1), тогда как при выраженном дисбиозе индекс доминирования L. jensenii составил 24%, а при абсолютном нормоценозе – лишь 16%. В целом распределение индекса доминирования L. jensenii повторяет таковое у L. gasseri. Однако в каждой отдельно взятой категории L. gasseri доминирует в 1,5-3 раза чаще, чем L. jensenii. Но при этом в случае одновременного выявления данных двух видов (22 пробы) L. jensenii доминировал в 9 случаях, а L. gasseri – всего в 1 случае.

При нормоценозах на фоне доминирования L. jensenii отмечали более высокое количество микроорганизмов группы в сравнении с GPP референтной группой (104,7 против 103,6, p=0,001). Средние количества других групп УПМ достоверно не отличались от данных значений в референтной группе: Eubacterium spp. выявляли в среднем количестве 104,3, микроорганизмы группы MVD – 103,3, A. vaginae – 102,7 (рисунок 3.2).

Количества всех четырех групп УПМ на фоне доминирования увеличивалось при дисбиозах: среднее количество L. jensenii микроорганизмов группы GPP увеличивалось в 79 раз, Eubacterium spp. – в 200 раз, группы MVD – в 20 раз, A. vaginae – в 1259 раз. То есть при доминировании L.

jensenii отмечали умеренный прирост 3 групп УПМ:

Eubacterium spp., группы GPP и группы MVD и выраженный прирост A. vaginae (но тем не менее не столь выраженный как при доминировании L. iners).

Таким образом, доминирование L. jensenii следует расценивать как неблагоприятный фон для поддержания нормоценоза влагалища. Однако данный вид редко является доминирующим и чаще выявляется как вспомогательный вид, тогда как доминирующими являются виды L. crispatus и L. iners. В случае выявления сочетания L. iners/L. jensenii прогноз для поддержания нормоценоза влагалища будет менее благоприятным, чем при выявлении сочетания L. crispatus/L. jensenii.

Результаты исследования, представленные в этой главе, опубликованы:

1. Ворошилина Е.С. Видовой состав вагинальных лактобактерий у женщин репродуктивного возраста с дисбиозом влагалища / Е.С. Ворошилина, Д.Л. Зорников, Л.В. Тумбинская, Е.В. Гончарова // Уральский медицинский журнал. – 2011. – №13(91). – С. 75-78.

2. Зорников Д.Л. Взаимосвязь отдельных видов лактобацилл с суммарной долей лактофлоры в вагинальном микробиоценозе и группами условно-патогенных микроорганизмов, ассоциированных с дисбиозом влагалища / Д.Л. Зорников, Л.В. Тумбинская, Е.С. Ворошилина // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2015. – № 4 (55). – С. 99ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ КАЧЕСТВЕННОГО И

КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОГО

МИКРОБИОЦЕНОЗА ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ВЛАГАЛИЩА

КАВИТИРОВАННОЫМ НИЗКОЧАСТОТНЫМ УЛЬТРАЗВУКОМ

0,05% РАСТВОРОМ ХЛОРГЕКСИДИНА В данном фрагменте работы были изучены изменения качественного и количественного состава вагинальной микрофлоры (в том числе и лактобацилл), возникшие в результате обработки влагалища КНУЗ РХ.

4.1. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на количество и долю лактобацилл в вагинальном микробиоценозе Основным маркером интенсивности воспалительного процесса во влагалище является количество лейкоцитов. В связи с отсутствием четких норм содержания лейкоцитов в вагинальном отделяемом более информативным следует считать определение индекса воспаления (ИВ) – соотношения лейкоцитов к клеткам вагинального эпителия, который у большинства здоровых женщин составляет менее 1 [33]. У 42 (40,4%) из 104 обследованных беременных при первичном обращении ИВ был более 1, что свидетельствовало о наличии воспалительной реакции слизистой влагалища.

После проведения обработки влагалища КНУЗ РХ количество женщин с повышенным ИВ (более 1) снизилось в 4 раза и составило 12 (11,5%) человек. Соответственно, возросла доля женщин с нормальным его значением (таблица 4.1).

–  –  –

Возможности микроскопического исследования для изучения вагинальной микрофлоры ограничены, так как большинство значимых в патологии микроорганизмов невозможно идентифицировать по морфологическим признакам. В связи с этим для оценки динамики количественного и качественного состава вагинальной микрофлоры до и после обработки влагалища КНУЗ РХ было решено использовать данные ПЦР-РВ.

Интерпретацию результатов ПЦР-РВ проводили в соответствии с ранее разработанными критериями [6], всех пациенток по состоянию микробиоценоза разделили на 4 группы: абсолютный нормоценоз, условный нормоценоз, умеренный дисбиоз и выраженный дисбиоз.

Структура микробиоценоза влагалища по данным ПЦР-РВ у обследованных женщин до и после обработки КНУЗ РХ представлена в таблице 4.2.

–  –  –

Критериям нормоценоза соответствовало состояние микробиоценоза у 76 (73,1%) беременных при первичном обследовании; в том числе у 39 (37,5%) женщин выявили абсолютный нормоценоз и у 37 (35,6%) – условный нормоценоз. После обработки влагалища критериям нормоценоза соответствовало состояние микробиоценоза у 83 (79,8%) из 104 обследованных женщин, причем у 70 (67,3%) выявлен абсолютный и всего у 13 (12,5%) – условный нормоценоз. Уменьшение доли пациенток с условным нормоценозом обусловлено снижением содержания Ureaplasma spp. в исследуемых образцах под воздействием КНУЗ РХ ниже клинически значимого порога в 104 ГЭ/мл.

Критериям дисбиоза соответствовало состояние микробиоценоза у 28 (26,9%) беременных при первичном обследовании; в том числе критериям умеренного дисбиоза – у 11 (10,6%), выраженного дисбиоза – у 17 (16,3%) женщин. Дисбиоз во всех случаях был обусловлен доминированием облигатных анаэробов. После обработки влагалища критериям дисбиоза по данным ПЦР-РВ соответствовало состояние микрофлоры у 21 (20,2%) пациентки, при этом частота выявления выраженного дисбиоза снизилась трехкратно – это состояние определяли только у 6 (5,8%) женщин.

Умеренный дисбиоз идентифицировали у 15 (14,4%) обследованных.

Положительная динамика состояния вагинального микробиоценоза после обработки КНУЗ РХ отмечена у большинства беременных с дисбиозом. Так, у 7 из 11 пациенток умеренный дисбиоз после обработки влагалища сменился на абсолютный нормоценоз; восстановление микробиоценоза влагалища до абсолютного нормоценоза наблюдали у 3 из 17 беременных с выраженным дисбиозом, у 9 пациенток из этой группы после орошений выявили умеренный дисбиоз.

Данные об уровне колонизации (ОБМ), количестве лактобацилл и доле нормофлоры в составе вагинальной микрофлоры до и после обработки влагалища КНУЗ РХ представлены в таблице 4.3.

–  –  –

В группе женщин с абсолютным нормоценозом ОБМ составила 107,7 ГЭ/мл до и 106,2 ГЭ/мл после обработки. Абсолютное количество лактобацилл снизилось с 107,7 ГЭ/мл до 106,2 ГЭ/мл после обработки, при этом доля нормофлоры практически не изменилась и составила 99,8% и 98,8% до и после орошений, соответственно. Аналогичные изменения зафиксированы в группе пациенток с условным нормоценозом: ОБМ и количество лактобацилл снизилось после обработки влагалища с 108 ГЭ/мл до 106,1 ГЭ/мл. Доля нормофлоры в составе микробиоценоза влагалища изменилась незначительно – с 99,5% до 97,4%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у пациенток как с абсолютным, так и условным нормоценозом количество лактофлоры после обработки снижалось соответственно уменьшению ОБМ (таблица 4.4), при этом доля лактобацилл в составе микробиоценоза практически не изменялась и составляла более 90% у всех обследованных беременных.

Таблица 4.4 – Количество лактобацилл и условно-патогенной микрофлоры после обработки влагалища КНУЗ РХ у беременных с нормоценозом и дисбиозом (n=104) Состояние вагинальной Изменение Изменение количества микрофлоры (ПЦР-РВ) ОБМ*, lg ГЭ/мл лактобацилл*, lg ГЭ/мл

–  –  –

Среди женщин с дисбиозом наблюдалась иная картина (таблица 4.2). В группе беременных с умеренным дисбиозом снижение ОБМ было более выраженным (с 107,8 ГЭ/мл до 106,6 ГЭ/мл) в сравнении с лактофлорой, количество которой после обработки уменьшилось с 106,6 ГЭ/мл до 105,9 ГЭ/мл. В результате доля нормофлоры в составе микробиоценоза влагалища выросла с 49,2% до 91,6%. Схожие изменения отмечены у пациенток с выраженным дисбиозом: ОБМ снизилась с 108,3 ГЭ/мл до 106,1 ГЭ/мл, тогда как снижение количества нормофлоры было менее значимым (с 106,5 ГЭ/мл до 105,3 ГЭ/мл), при этом доля лактобацилл в микробиоценозе существенно возросла – с 1,4% до 47%.

Таким образом, у пациенток с дисбиозом снижение ОБМ влагалища после обработки КНУЗ РХ происходит преимущественно за счет условнопатогенной микрофлоры. Полученные данные позволяют предположить, что вагинальная нормофлора, представленная лактобациллами, менее чувствительна к воздействию КНУЗ РХ по сравнению с условнопатогенными облигатными анаэробами, доля которых значительно возрастает при дисбиозе влагалища.

Открытым остается вопрос о необходимости восстановления нормофлоры во влагалище путем дотации лактофлоры интравагинально или per os данной категории пациенток. Тот факт, что у беременных с нормоценозом (абсолютным или выраженным) обработка КНУЗ РХ привела только к умеренному снижению колонизации влагалища и не вызвала значимого «вымывания» лактофлоры, демонстрирует безопасность данного метода воздействия на влагалищную микрофлору. Данный факт подтверждается тем, что в случаях нормоценоза доля нормофлоры практически не изменялась в результате обработки и оставалась достаточно высокой (более 90% от ОБМ). Поэтому дотация лактобацилл данной категории женщин, вероятно, не является необходимой.

В группе беременных с умеренным дисбиозом доля лактобацилл значительно повышалась, однако не всегда достигала нормальных значений.

Вопрос о необходимости второго этапа терапии для данных пациенток с использованием пробиотиков, содержащих лактобациллы, должен решаться индивидуально с учетом данных лабораторных исследований.

Использование КНУЗ РХ у пациенток с выраженным дисбиозом влагалища приводило к существенному возрастанию доли нормофлоры в микробиоценозе за счет селективной элиминации условно-патогенной микрофлоры, однако исходно низкое содержание лактобацилл не позволяло достичь их оптимального уровня после первого этапа лечения.

Необходимость дотации лактофлоры на втором этапе терапии выраженного дисбиоза не вызывает сомнений.

4.2. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на видовой состав лактофлоры Изучение влияния КНУЗ РХ на структуру лактофлоры позволило установить, что оно ограничено и обусловлено изначальным видовым составом вагинальных лактобацилл. Так, количество и перечень одновременно выявляемых видов после обработки не изменялись ни у одной из пациенток. То есть все виды лактобацилл, выявляемые в микробиоценозе до начала терапии, сохранялись и после нее, изменялись только их количественные соотношения. Данный факт имеет принципиальное значение, так как устойчивость микробного сообщества к воздействию различных факторов связана с видовым разнообразием нормофлоры [170].

Примечательно, что у большинства наблюдаемых женщин доминирующий вид лактобацилл остался неизменным (у 55 (77,5%) из 71), и только у 16 (22,5%) женщин была отмечена смена доминирующего вида. Стоит отметить, что во всех случаях смена господствующего вида происходила на присутствовавший ранее в микробиоценозе вид, но в меньшей доле, а ранее доминировавший вид при этом сохранялся, но уже в качестве сопутствующего. На фоне доминирования L. crispatus, L. iners и L. jensenii смену доминирующего вида фиксировали нечасто: в 23,1% (у 6 пациенток из 26), 17,1% (у 6 пациенток из 35) и 25% (у 1 пациентки из 4), соответственно.

В то время как на фоне доминирования L. gasseri изменение доминирующего вида наблюдали у каждой второй пациентки (у 3 пациенток из 6).

Результаты исследования, представленные в этой главе, опубликованы:

1. Ворошилина Е.С. Коррекция дисбиоза влагалища кавитированным раствором хлоргексидина в первом триместре беременности: эффективность и безопасность / Е.С. Ворошилина, Д.Л. Зорников, Е.Э. Плотко // Журнал акушерства и женских болезней. – 2014. – Т. 63, № 5. – С. 29-37.

2. Ворошилина Е.С. Влияние кавитированного низкочастотным ультразвуком раствора хлоргексидина на количественный и видовой состав лактофлоры влагалища / Ворошилина Е.С., Плотко Е.Э., Хаютин Л.В., Зорников Д.Л. // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2016. – № 4. – С. 52-60.

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО

ПРИМЕНЕНИЯ ОБРАБОТКИ ВЛАГАЛИЩА КАВИТИРОВАННЫМ

НИЗКОЧАСТОТНЫМ УЛЬТРАЗВУКОМ 0,05% ВОДНЫМ

РАСТВОРОМ ХЛОРГЕКСИДИНА И ПРОБИОТИЧЕСКОГО

ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ,

СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ LACTOBACILLUS CRISPATUS, НА

ВАГИНАЛЬНУЮ МИКРОФЛОРУ У ЖЕНЩИН С ДИСБИОЗОМ

ВЛАГАЛИЩА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОМИНИРУЩЕГО ВИДА

ЛАКТОБАЦИЛЛ

Учитывая селективное влияние обработки КНУЗ РХ на населяющие влагалище УПМ, перспективным представляется вариант комбинированного последовательного применения орошения влагалища КНУЗ РХ и приема пробиотического препарата, содержащего штаммы L. crispatus. Отдельный интерес представляет исследование влияния пробиотического препарата для перорального применения на видовой состав лактофлоры и состояние вагинальной микрофлоры в целом. Кроме того, для более точной оценки возможностей коррекции дисбиоза с помощью данной схемы требуется исследовать зависимость результатов коррекции от стартового состояния вагинального микробиоценоза и лактофлоры.

В данном фрагменте работы был оценен эффект последовательного применения обработки влагалища КНУЗ РХ и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые Lactobacillus crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от степени выраженности дисбиотических нарушений и доминирующего вида лактобацилл.

При первичном осмотре жалобы предъявляли 61 (72,6%) из 84 обследованных женщин (таблица 5.1), в том числе 20 (23,8%) отмечали выделения с неприятным запахом, 16 (19,0%) – зуд и жжение в области наружных половых органов, 22 (26,2%) – обильные выделения без запаха, 3 (3,6%) жаловались на дискомфорт после половых контактов. При осмотре клинические признаки вагинита или вагиноза присутствовали у 47 (56,0%) обследованных, в том числе патологический характер белей выявлен у 40 (47,6%), гиперемия слизистой влагалища – у 17 (20,2%) женщин. Жалобы и клинические симптомы, указывающие на инфекционно-воспалительную патологию влагалища, отсутствовали на момент обращения у 14 (16,7%) женщин. Исследование микробиоценоза влагалища было проведено в рамках прегравидарной подготовки либо во II и III триместрах беременности.

–  –  –

После проведенного курса терапии жалобы на патологические бели или дискомфорт в области гениталий предъявляли только 28 (33,3%) женщин, клинические признаки инфекционной патологии влагалища определялись у 23 (27,4%) обследованных. Таким образом, предложенная двухэтапная схема коррекции дисбиоза влагалища без применения системной и местной антибактериальной терапии позволила добиться клинического улучшения у каждой второй пациентки.

Положительная динамика состояния микробиоценоза по данным ПЦРРВ была отмечена после завершения курса орошений влагалища (таблица 5.2).

–  –  –

Доля женщин с выраженным анаэробным дисбиозом после орошений влагалища КНУЗ РХ снизилась с 61,9% до 28,6%, с умеренным дисбиозом – с 38,1% до 25,0% среди всех обследованных женщин. При этом у 46,4% женщин произошло восстановление микробиоценоза до нормоценоза, в том числе у 36,9% – до абсолютного нормоценоза.

Ранее нами было показано, что у пациенток с умеренным и особенно выраженным дисбиозом восстановление доли лактофлоры до нормальных значений после орошений влагалища КНУЗ РХ происходит только в 35,7% случаев, что обосновывает целесообразность назначения пробиотика на втором этапе терапии. Однако после приема ЭФ дальнейшего увеличения доли пациенток с нормоценозом отмечено не было. При этом снизилось количество женщин с выраженным дисбиозом по сравнению, как с первой (p0,001), так и со второй точкой наблюдения (различия не достоверны, p=0,281).

Исследование индивидуального состояния микробиоценоза влагалища до и после курса лечения в зависимости от тяжести дисбиотических нарушений позволила более точно оценить возможность коррекции дисбиоза с помощью предложенной двухэтапной схемы (таблица 5.3). В группе I (у пациенток с умеренным дисбиозом) восстановление доли лактофлоры до показателей, соответствующих нормоценозу, произошло в 22 (68,7%) случаях, а в 3 (9,1%) случаях был отмечен прирост доли лактофлоры в пределах 27-30%. У 7 (21,8%) женщин доля лактофлоры оставалась практически неизменной на протяжении курса лечения. Таким образом, индивидуальная положительная динамика была зафиксирована у 25 (78,1%) из 32 женщин группы I.

В группе II (пациентки с выраженным дисбиозом) восстановление нормоценоза зарегистрировано только у 21 (40,4%) из 52 женщин, что достоверно реже, чем в группе I (p=0,021). Еще у 15 (28,8%) женщин выраженный дисбиоз сменился умеренным. Прирост доли лактофлоры у этих пациенток был в пределах 16-71%, однако с учетом крайне низкого содержания лактобацилл на старте наблюдения достичь нормоценоза у этих женщин не удалось. Таким образом, положительная динамика была зафиксирована у 36 (69,2%) из 52 женщин с выраженным дисбиозом, а ее отсутствие – у 16 (30,8%) пациенток, в том числе у 3 пациенток, у которых лактобациллы не выявляли на всех этапах наблюдения.

–  –  –

При генотипировании лактобацилл у каждой пациентки одновременно выявляли от 1 до 4 видов, при этом доминирующим считали тот, доля которого была наибольшей. Наиболее благоприятный для сохранения стабильного нормоценоза вид – L. crispatus – до начала терапии преобладал только у 6 (7,1%) женщин, причем у 3 из них состояние микробиоценоза влагалища соответствовало критериям умеренного, а у 3 – выраженного дисбиоза. Чаще других в качестве доминирующего вида выявляли L. iners – у 46 (54,7%) обследованных, вторым по частоте видом был L. gasseri – у 22 (26,2%) женщин. Еще реже в качестве доминирующего вида выявляли L. jensenii и L. vaginalis – у 4 (4,8%) и 3 (3,6%), соответственно.

Примечательно, что у 3 (3,6%) женщин лактобациллы не были выявлены ни при первичном обследовании, ни после курса ЭФ.

Была предпринята попытка установить зависимость эффекта предложенной схемы коррекции от доминирующего вида лактобацилл (таблица 5.4).

–  –  –

Восстановление нормоценоза после серии орошений влагалища КНУЗ РХ отмечали у 33,3-100% пациенток в различных исследуемых группах. У 4 женщин, в лактофлоре которых доминировал L. jensenii, нормоценоза удалось достичь у всех пациенток и данное состояние микробиоценоза сохранилось через месяц после окончания лечения. Однако достоверных различий между результатами коррекции дисбиоза и доминирующим видом лактобацилл выявлено не было, возможно по причине недостаточного количества пациенток в исследуемых группах.

После приема ЭФ достоверного увеличения доли пациенток с нормоценозом не было отмечено ни в одной группе женщин. Частота достижения нормоценоза также достоверно не отличалась среди пациенток с различными вариантами лактофлоры.

Следующим шагом сравнили частоту увеличения доли лактофлоры (минимум 10% прирост) в микробиоценозе после обработки влагалища КНУЗ РХ и приема ЭФ у пациенток с различными вариантами лактофлоры (таблица 5.5).

Таблица 5.5 – Частота увеличения суммарной доли лактофлоры в микробиоценозе после обработки влагалища КНУЗ РХ и приема пробиотического препарата ЭФ у пациенток с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирующего вида лактобацилл (n=81)

–  –  –

После обработки влагалища КНУЗ РХ фиксировали увеличение доли лактофлоры у 33,3-100% пациенток с разными вариантами лактофлоры. Было отмечено, что увеличение доли лактобацилл достоверно чаще происходило среди пациенток, у которых доминировал L. iners, чем среди женщин, доминирующим видом у которых был L. gasseri (80,4% против 50,0%, У женщин, лактофлора которых была преимущественно p=0,024).

представлена L. jensenii, увеличение доли лактобацилл отмечали в 100% случаев. Однако не было выявлено достоверных различий по сравнению с другими исследуемыми группами, возможно по причине малого количества наблюдений. Отдельно стоит сказать о том, что при доминировании L. crispatus увеличение доли Lactobacillus spp. после обработки КНУЗ РХ зарегистрировали у 3 (50%) из 6 женщин. В силу малочисленности данной группы судить о достоверности изменений невозможно.

Через месяц после окончания приема ЭФ количество пациенток с увеличившейся долей лактофлоры во всех исследуемых группах достоверно не изменилось по сравнению с аналогичным показателем после обработки влагалища КНУЗ РХ. Однако стоит отметить, что количество пациенток с увеличившейся долей лактофлоры в группе с доминированием L. gasseri изменилось с 11 (50,0%) до 15 (68,2%), а в группе с доминированием L. iners

– c 37 (80,4%) до 35 (76,1%). В результате исчезли достоверные различия, наблюдавшиеся между двумя этими исследуемыми группами, после серии орошений влагалища КНУЗ РХ.

Анализ индивидуальной динамики состояния микрофлоры в течение лечения показал, что установившиеся после обработки влагалища КНУЗ РХ варианты микробиоценоза могли изменяться через месяц после приема ЭФ (таблица 5.6).

Таблица 5.6 – Динамика состояния микробиоценоза у пациенток после обработки влагалища КНУЗ РХ и приема пробиотического препарата ЭФ (n=84) Состояние микробиоценоза влагалища через месяц после окончания приема ЭФ Абсолютный Условный Умеренный Выраженный нормоценоз нормоценоз дисбиоз дисбиоз Абсолютный Состояние микробиоценоза влагалища после обработки

–  –  –

Абсолютный нормоценоз после приема ЭФ сохранился у 20 (64,5%) пациенток; тогда как у 5 (16,1%) отмечали условный нормоценоз, у 5 (16,1%)

– умеренный дисбиоз, у 1 (3,2%) – выраженный дисбиоз. В то же время были зафиксированы случаи улучшения вариантов микробиоценоза к концу лечения: например, у 5 (23,8%) и 3 (12,5%) пациенток, у которых после обработки КНУЗ РХ фиксировали умеренный и выраженный дисбиоз, соответственно, через месяц после окончания терапии микробиоценоз восстановился до абсолютного нормоценоза.

Дискутабельным является вопрос о возможности замены собственных лактобацилл пробиотическим штаммом, обладающим высоким протективным потенциалом – L. crispatus. В ходе настоящего исследования не было зарегистрировано ни одного случая обнаружения L. crispatus во влагалище после курса терапии ЭФ при исходном отсутствии данного вида в составе лактофлоры. После проведенной терапии у 70 (86,4%) обследованных женщин доминирующий вид лактофлоры остался без изменения. У 11 (13,6%) пациенток произошла замена доминирующего вида лактобацилл на вид, представленный ранее в микробиоте, но в меньшем количестве. L. crispatus в качестве доминирующего вида выявляли в два раза чаще после лечения (рисунок 5.1), однако у всех этих пациенток данный вид присутствовал в меньшем количестве в составе вагинальной микрофлоры до лечения. Полученные данные позволяют утверждать, что видовой состав нормофлоры у каждой конкретной женщины стабилен и мало изменяется под воздействием, как физико-химических факторов, так и пробиотических штаммов микроорганизмов. Можно предположить, что назначение пробиотика на втором этапе коррекции дисбиоза влагалища скорее способствует восстановлению популяции собственной лактофлоры, чем изменению ее видового состава.

Рисунок 5.1 – Доминирующие виды вагинальных лактобацилл у пациенток до и после коррекции дисбиоза влагалища (n=84).

Достоверных различий нет Таким образом, последовательное применение обработки влагалища КНУЗ РХ и пробиотического препарата ЭФ позволило достичь нормоценоза у каждой второй пациентки. Лучшие результаты коррекции отмечали у пациенток с умеренным дисбиозом: нормоценоза в данной группе пациенток удалось достичь в 68,7% случаев. Тогда как у пациенток с выраженным дисбиозом нормоценоз после курса коррекции отмечали достоверно реже – в 40,4% случаев (p=0,021). Результаты коррекции не отличались среди пациенток с разными вариантами лактофлоры: не было выявлено достоверных различий между частотой достижения нормоценоза и отмечали сопоставимые показатели прироста доли лактобацилл у пациенток с доминированием L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii, L. vaginalis.

Обработка влагалища КНУЗ РХ достоверно реже приводила к повышению доли лактофлоры в микробиоценозе среди пациенток, у которых в качестве доминирующего вида выявляли L. gasseri, чем среди пациенток, у которых доминировал L. iners. Однако через месяц после приема ЭФ данных различий не отмечали. Не было зарегистрировано ни одного случая обнаружения L. crispatus во влагалище после курса терапии ЭФ при исходном отсутствии данного вида в составе лактофлоры.

Результаты исследования, представленные в этой главе, опубликованы:

1. Плотко Е.Э. Дисбиоз влагалища: видовой состав лактофлоры и возможности немедикаментозной коррекции / Е.Э. Плотко, Д.Л. Зорников, Л.В. Хаютин, Е.С. Ворошилина // Акушерство и гинекология. – 2015. – № 10.

– С. 112-117.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Состояние вагинального микробиоценоза оказывает серьезное влияние на репродуктивное здоровье женщины. Многочисленные исследования демонстрируют, что у пациенток с дисбиозом увеличены риск инфицирования ИППП или развития воспалительных заболеваний органов малого таза [75, 90, 131, 136, 187, 199, 203, 230, 271, 276, 298, 301] и различных осложнений беременности [80, 133, 143, 144, 153, 154, 172, 177, 203, 229, 258].

Несмотря на серьезные усилия мирового научного сообщества, точные причины развития дисбиоза влагалища до сих пор неизвестны [121, 186, 253, 285], а существующие схемы коррекции часто сопровождаются рецидивами [70, 72, 140, 180, 206, 243, 260]. Данные обстоятельства диктуют необходимость выявления предикторов трансформации нормальной вагинальной микрофлоры в патологическую и новых подходов к коррекции дисбиотических состояний во влагалище.

Возможно, что одним из таких предикторов является состав вагинальной лактофлоры. Со времен Додерлейна (1892 год) [102] представления о лактофлоре изменились. Если до 1980 года считалось, что влагалище населяет один вид лактобацилл – L. acidophilus [282], то на сегодняшний день идентифицировано более 20 видов вагинальных лактобацилл. Однако доминирующим обычно является один вид – L. crispatus или L. iners и реже L. jensenii или L. gasseri [23, 50, 64, 218, 232, 257, 262, 279, 281, 288, 291, 297, 302, 306, 310, 311, 312]. При этом стоит отметить, что значительная часть исследований, посвященных видовому составу лактобацилл и микрофлоре влагалища, выполненных с помощью молекулярно-генетических методов, проведена за пределами России [231, 232]. Экстраполяция полученных в ходе этих исследований данных на популяцию российских женщин затруднительна, так как продемонстрированы различия в составе микрофлоры влагалища женщин различной расовой и этнической принадлежности [56, 218, 232, 310, 311].

Вполне возможно, что доминирующий вид лактобацилл может являться показателем, позволяющим судить о стабильности микробиоценоза.

Для проверки этого предположения было решено установить частоту доминирования отдельных видов лактобацилл среди женщин с различными вариантами микробиоценоза влагалища. С помощью метода ПЦР-РВ нами были изучено состояние вагинального микробиоценоза и состав лактофлоры у 608 женщин репродуктивного возраста. Было продемонстрировано, что влагалище каждой женщины могут колонизировать до пяти видов лактобацилл одновременно. Однако, доминирующее положение, как правило, занимает один вид, тогда как остальные присутствуют в значительно меньших количествах и являются сопутствующими. Данный факт обуславливает возможность смены доминирующего вида лактобацилл в случае изменения условий в биотопе.

Наиболее часто выявляемыми видами лактобацилл являлись L. iners и L. crispatus, реже выявляли L. jensenii и L. gasseri. L. johnsonii и L. vaginalis не вносили существенного влияния в формирование вагинального микробиоценоза. Первый вид выявляли крайне редко, всего у 3 из 608 пациенток, то есть менее чем в 1% случаев. Второй вид выявляли относительно часто, но, как правило, в низких количествах – в 81% случаев доля этого вида не превышала 10% от суммарного количества Lactobacillus spp. в исследуемой пробе.

Частота доминирования отдельных видов лактобацилл зависела от суммарной доли Lactobacillus spp. в микробиоценозе. L. crispatus с большей частотой доминировал у женщин с долей лактофлоры более 80%, что соответствует критериям нормоценоза. Наибольшая частота доминирования L. gasseri и L. jensenii была отмечена у женщин с долей лактофлоры 20-80%, данные варианты микробиоценоза расценивают как умеренный дисбиоз.

Наиболее часто встречающийся вид – L. iners – как доминирующий выявляли при любых вариантах микробиоценоза, однако по мере снижения общей доли нормофлоры в микробиоценозе увеличивалась частота обнаружения его как единственного вида лактобацилл. При доле лактофлоры менее 20% (выраженном дисбиозе) L. iners, как правило, оставался единственным детектируемым видом лактобацилл. По всей видимости, это связано с метаболической пластичностью данного вида и способностью быстро адаптироваться к новой среде обитания, посредством оперативного изменения уровня экспрессии разных групп генов [183, 184].

Объективные микробиологические данные, полученные в настоящем исследовании, позволяют заключить, что наиболее благоприятным вариантом вагинального микробиоценоза является нормоценоз (микробиоценоз с долей лактофлоры не менее 80%) с доминированием L. crispatus. При доминировании данного вида лактобацилл отмечается наименьшее количество УПМ и не так высок прирост их количества при развитии дисбиоза.

Роль L. iners в формировании различных видов микробиоценоза влагалища окончательно не ясна. С одной стороны, частота доминирования данного вида более высока при пониженной доле лактофлоры, что соответствует критериям дисбиоза, а количество УПМ при нормоценозах и их прирост при дисбиозах на фоне доминирования данного вида максимальны. Эти наблюдения позволяют предположить, что L. iners обладает сниженным протективным потенциалом в сравнении с другими видами лактобацилл, особенно L. crispatus. С другой стороны, способность данного вида доминировать при нормоценозе и сохраняться при дисбиотических состояниях с повышенным уровнем рН наводит на мысль, что адаптивный потенциал L. iners может обеспечивать реколонизацию влагалища другими видами лактобацилл после устранения инициирующего фактора дисбиоза [184]. В таком случае L. iners можно рассматривать как буфер между нормоценозом и дисбиозом, а его выявление в сочетании с L. crispatus, как дополнительный маркер устойчивости микробиоценоза к воздействиям факторов окружающей среды.

В качестве альтернативного препарата для коррекции вагинального дисбиоза возможно использование хлоргексидина, который активен в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе облигатных анаэробов [176]. В то же время было показано, что некоторые представители рода Lactobacillus обладают сниженной чувствительностью к хлоргексидину [45, 181, 245, 309]. В настоящее время для лечения и профилактики инфекционно-воспалительной патологии женских половых органов активно используют методику обработки влагалища кавитированными НУЗ лекарственными растворами, в том числе раствором хлоргексидина [9, 10, 11, 18, 26, 27, 28, 32]. В литературе имеются данные о том, что грамотрицательные микроорганизмы более чувствительны к НУЗ, чем грамположительные [1, 224]. В экспериментах была продемонстрирована способность НУЗ сенсибилизировать бактериальные биопленки к действию антимикробных препаратов [224,228]. Данные факты позволяют предположить, что обработка влагалища кавитированным НУЗ раствором хлоргексидина может оказаться действенным инструментом в коррекции дисбиотических состояний в силу селективного подавления ассоциированных с дисбиозом влагалища грамотрицательных бактерий.

Методика обработки влагалища кавитированным НУЗ 0,05% раствором хлоргексидина (КНУЗ РХ) рекомендована для использования в акушерскогинекологической практике [9, Получены убедительные 26, 32].

доказательства клинической эффективности предложенного метода при лечении кандидозной, микоплазменной и уреаплазменной инфекции репродуктивного тракта [10, 11, 17, 19, 36], неспецифического вагинита [25], послеродовых гнойно-септических заболеваний [26], использовании с целью профилактики инфекционно-воспалительных осложнений перед внутриматочными вмешательствами [29] и хирургическим лечением пролапса гениталий [22]. Однако изменения качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища в результате воздействия КНУЗ РХ недостаточно изучены. На сегодняшний день оценка эффекта от обработки влагалища кавитированными НУЗ лекарственными растворами на вагинальную микрофлору проводилась только с помощью микроскопии или культуральных исследований [25, 29].

С целью оценки влияния обработки влагалища КНУЗ РХ на качественный и количественный состав микрофлоры влагалища были двукратно обследованы 104 беременных, планировавшие ИПБ методом вакуум-аспирации. Обработка КНУЗ РХ проводилась данным пациенткам с целью профилактики развития инфекционно-воспалительной патологии после процедуры ИПБ. Всем беременным проводили анализ микробиоценоза, а 71 пациентке дополнительно генотипировали вагинальные лактобациллы до и после процедуры. В результате было продемонстрировано, что КНУЗ РХ селективно воздействует на условно-патогенную микрофлору и практически не оказывает воздействия на качественный и количественный состав лактобацилл, что приводило к увеличению доли лактофлоры у пациенток с дисбиозом влагалища. Данные наблюдения оправдывают применение КНУЗ РХ с целью коррекции нарушений вагинальной лактофлоры.

Однако не во всех случаях доля лактофлоры увеличивалась до целевого показателя в 80% от суммы выявляемых микроорганизмов. В связи с этим было решено оценить эффект, оказываемый на вагинальную микрофлору, от комбинированного последовательного применения обработки влагалища КНУЗ РХ и приема пробиотического препарата у женщин с дисбиозом. В качестве пробиотического препарата был выбран ЭФ – пробиотик для перорального применения, содержащий живые лактобациллы трех видов, в том числе L. crispatus. ЭФ, в настоящее время, является единственным зарегистрированным в Российской Федерации препаратом, в состав которого входит L. crispatus – вид с повышенным протективным потенциалом, в норме доминирующий во влагалище [61, 123]. Было обследовано 84 женщины репродуктивного возраста, состояние микробиоценоза влагалища которых по данным ПЦР-РВ соответствовало критериям дисбиоза. Исследование микробиоценоза у всех пациенток проводили трижды: до и после обработки КНУЗ РХ и через месяц после окончания приема ЭФ. Перед обработкой влагалища КНУЗ РХ и через месяц после окончания приема ЭФ дополнительно к исследованию микробиоценоза оценивали качественный и количественный состав лактобацилл. В результате было показано, что применение указанной схемы позволяет достичь нормоценоза у каждой второй пациентки. Однако после приема ЭФ не отмечали достоверного увеличения количества женщин с нормоценозом, в сравнении с их количеством после орошений КНУЗ РХ. Также было отмечено, что прием перорального пробиотика не приводит к колонизации эпителия L. crispatus в случаях, если данный вид отсутствовал в микробиоценозе до коррекции.

Было продемонстрировано, что эффективность коррекции дисбиоза с помощью предложенной схемы зависит от степени выраженности нарушений вагинальной микрофлоры: у пациенток с умеренным дисбиозом нормоценоз через месяц после приема ЭФ регистрировали достоверно чаще, чем в группе пациенток с выраженным дисбиозом. Но при этом не было отмечено зависимости между частотой достижения нормоценоза и доминирующим видом лактобацилл.

Перспективы дальнейшего изучения вагинальной микрофлоры, в том числе и лактофлоры у женщин репродуктивного возраста заключаются в следующем:

Выяснение механизмов колонизации эпителия влагалища новорожденных и женщин репродуктивного возраста вагинальной микрофлорой;

Изучение устойчивости видового состава лактофлоры при воздействии различных неблагоприятных факторов среды;

Выяснение роли L. iners – наиболее распространенного вида вагинальных лактобацилл, в формировании и поддержании стабильности нормального микробиоценоза влагалища;

Выявление факторов, провоцирующих развитие дисбиоза, и изучение особенностей прогрессирования дисбиотических состояний на фоне доминирования различных видов вагинальных лактобацилл;

Изучение вклада отдельных групп УПМ в развитие дисбиоза влагалища с использованием молекулярно-генетических методик;

Поиск новых средств для эффективной и безопасной коррекции дисбиотических состояний во влагалище.

ВЫВОДЫ

У женщин репродуктивного возраста во влагалище чаще 1.

доминировали среди нормофлоры виды и Lactobacillus crispatus Lactobacillus iners, реже – Lactobacillus gasseri и Lactobacillus jensenii.

Доминирование Lactobacillus crispatus было ассоциировано с высокой долей лактофлоры и низким количеством условно-патогенных микроорганизмов в микробиоценозе, что позволяет рассматривать преобладание данного вида как благоприятный фон для поддержания нормоценоза. У пациенток с выраженными дисбиотическими нарушениями, как правило, единственным детектируемым видом лактобацилл являлся Lactobacillus iners.

Обработка влагалища кавитированным низкочастотным 2.

ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина селективно подавляет условно-патогенную микрофлору и не оказывает существенного влияния на качественный и количественный состав лактофлоры. Доля нормофлоры в микробиоценозе не изменяется на фоне изначально высокого количества лактобацилл; у пациенток с низким начальным уровнем лактобацилл – увеличивается, но не всегда достигает целевого значения. Увеличение доли лактофлоры достоверно реже отмечали при доминировании Lactobacillus gasseri.

Последовательное применение обработки влагалища 3.

кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина и пероральный прием пробиотического препарата, содержащего живые Lactobacillus crispatus, у женщин с дисбиозом влагалища позволили добиться увеличения доли лактобацилл в 70% случаев с восстановлением нормоценоза у каждой второй пациентки. После курса пробиотика не было зафиксировано дальнейшего роста доли лактофлоры и появления Lactobacillus crispatus во влагалище в случае его отсутствия перед коррекцией. Возможности коррекции дисбиоза с помощью данной схемы зависят от выраженности дисбиотических нарушений и не зависят от доминирующего вида лактобацилл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Перед коррекцией дисбиоза влагалища с помощью кавитированного низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина рекомендуется проведение генотипирования и определение доминирующего вида вагинальных лактобацилл, так как дисбиозы с представленной преимущественно лактофлорой плохо поддаются Lactobacillus gasseri коррекции с помощью данной методики.

Пациенткам с умеренным дисбиозом по данным полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, лактофлора которых представлена не для восстановления нормоценоза рекомендуется Lactobacillus gasseri, применение серии из 3 ежедневных орошений влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина.

Пациенткам с умеренным дисбиозом, лактофлора которых преимущественно представлена и пациенткам с Lactobacillus gasseri, выраженным дисбиозом для восстановления нормоценоза рекомендуется серия из ежедневных орошений влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина и 10-дневный курс пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые Lactobacillus crispatus.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БВ – бактериальный вагиноз ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ГЭ/мл – геном-эквивалентов на миллилитр ИВ – индекс воспаления ИПБ – искусственное прерывание беременности ИППП – инфекции, передаваемые половым путем КНУЗ РХ – кавитированный низкочастотным ультразвуком 0,05% водный раствор хлоргексидина НУЗ – низкочастотный ультразвук ОБМ – общая бактериальная масса ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени УПМ – условно-патогенные микроорганизмы ЭФ – биологически активная добавка «Экофемин Флораваг»

CRISPR – clustered regularly interspaced short palindromic repeats Spp. (species) – виды

–  –  –

Гизингер, О.А. Применение ультразвуковой кавитационной 9.

терапии в лечении воспалительных заболеваний нижнего отдела генитального тракта: учебное пособие / О.А. Гизингер, О.Р. Зиганшин, И.В. Семёнова [и др.]. – Екатеринбург: Изд. А.Г. Меденков, 2015. – 44 с.

Гизингер, О.А. Ультразвуковая кавитация в терапии женщин с 10.

кандидозно-микоплазменной инфекцией генитального тракта / О.А. Гизингер, О.И. Летяева // Врач. – 2014. № 1. – С. 83-87.

Гизингер, О.А. Ультразвуковая кавитация в терапии хронических 11.

рецидивирующих кандидозов. / О.А. Гизингер, И.В. Семенова, О.Р. Зиганшин // Врач. – 2014. № 7. – С. 76-79.

Глухов, Е.Ю. Использование низкочастотного ультразвука в 12.

лечении пациенток с хроническим эндометритом, страдающих различными формами бесплодия / Е.Ю. Глухов, А.М. Богданова, Е.Н. Козырева // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2015. – Т. 15, № 1. – C. 32-37.



Pages:   || 2 |

Похожие работы:

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Бала...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 574 496 C1 (51) МПК G08G 1/01 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014127098/11, 03.07.2014 (21)(22) Заявка: (72) Авт...»

«ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ГОРОДСКИХ ПОЧВ МЕТОДОМ БИОТЕСТИРОВАНИЯ Яковишина Татьяна Федоровна доцент кафедры экологии и охраны окружающей среды, канд. с.-х. наук, доцент, Государственное высшее учебное заведение "Приднепровская...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа № 6" Принято Утверждено на педагогическом совете приказом МБОУ "СОШ№6" протокол от 29.05.2017г. № 5 29.05.2017г № 153о РАБОЧАЯ ПРОГРАММА учебного курса "Готовимся к ЕГЭ по био...»

«Экосистемы. 2016. Вып. 6. С. 100–106 СЕЛЕКЦИЯ И ДЕКОРАТИВНОЕ РАСТЕНИЕВОДСТВО УДК: 582.973:631.526.32 ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕКОРАТИВНЫХ СОРТОВ И ФОРМ ЖИМОЛОСТИ (LONICERA L.) В РОССИИ Сорокопудов В. Н.1, Куклина А....»

«АКАДЕМИЯ НАУК СССР УРАЛЬСКИА НАУЧНЫА ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЕДЕНИЯ ЖИВОТНЫХ СВЕР ДЛОВСК 1980 УДК 591.5 Экологические асnекты nоведения животных: [Сб. статей]. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1980. Статьи сборника выполнены на основе изу­ че...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ "Кемеровский государственный университет" Институт биологии, экологии и природных ресурсов Рабочая программа дисциплины БОЛЬШОЙ ПРАКТИКУМ Направлен...»

«ПОЧИНКОВСКИЙ МУНИЦИПАЛЬНЫЙ РАЙОН МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РИЗОВАТОВСКАЯ СРЕДНЯЯ ШКОЛА ПРИНЯТО УТВЕРЖДЕНО на заседании педагогического совета приказом директ...»

«3.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS AGROECOLOGY АГРОЭКОЛОГИЯ Красноперова Е. А., Юлдашбаев Ю. А., Гала Krasnoperova E. A., Yuldashbaev Yu. A., Galatov A. N. тов А. Н. Методологические аспекты экологиза Methodological aspects of agrarian production eco ции аграрного производства РАСТЕНИЕВОДСТВО PLANT RAISING Кибальник О...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московск...»

«НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF ARMENIA ДОКЛАДЫ REPORTS №2 Том Volume БИОФИЗИКА УДК 577.391;547.963.3 Ц. М. Авакян, Н. И. Мкртчян, Н. В. Симонян, Г. Э. Хачатрян Биологическое действие электронов с энергией 7...»

«Ольга В. Таглина Илья Мечников http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=4432817 Илья Мечников.: Фолио; Харьков; 2010 Аннотация Жизнь Ильи Ильича Мечникова была необычайно насыщенной, богатой событиями и научными открытиями. Он является не только известнейшим биологом, зоологом, эпидемиологом, врачом, одни...»

«УЗА-10М.В3 МИКРОПРОЦЕССОРНОЕ УСТРОЙСТВО ЗАЩИТЫ И АВТОМАТИКИ ПО ЧАСТОТЕ И НАПРЯЖЕНИЮ ПРИСОЕДИНЕНИЙ 6-110 КВ ТЕХНИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ И ИНСТРУКЦИЯ ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ ЕМВ.002.12.12.100. В3 ТО 2012г. Перед включением оперативного тока заземлить! При проверке сопротивления изоляции мегомметром заземление отключить! Наимено...»

«УДК 544.6 ВЛАГОПЕРЕНОС В БИКОМПОНЕНТНЫХ КОНСЕРВАЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ НА БАЗЕ НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ Н. Е. Беспалько Кафедра "Безопасность жизнедеятельности и военная подготовка", ФГБОУ ВПО "ТГТУ"; bgd@mail.nnn.tstu.ru Ключевые слова и фразы: амиды; амины; атмосферная коррозия; массоперенос воды; индустриальное масло; н-гептан;...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и прикладного значения химии в...»

«BWC/MSP/2010/MX/INF.2 Совещание государств участников 5 August 2010 Конвенции о запрещении разработки, Russian производства и накопления запасов Original: English бактериологического (биологического) и токсинного оружия и...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Международный государственный экологический университет имени А. Д. Сахарова" А. С. Шиляев С. П. Кундас А. С. Стукин ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ УЛЬТРАЗВУКА В МЕДИЦИНЕ И ЭКОЛОГИИ Учебно-методическое пособие Рекомендовано к изданию УМО высших учебных заведений Респу...»

«Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 151 УДК 502.34 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ Влияние эксплуатации опасных производственных объектов на современное состояние экологии в России Хан Карина Алекса...»

«ПРАВИЛА ПРОЖИВАНИЯ В КВАРТИРЕ БЛОКИРОВАННОГО ЖИЛОГО ДОМА В ЖИЛОМ КОМПЛЕКСЕ "ПАВЛОВО-2"1. СФЕРА ДЕЙСТВИЯ ПРАВИЛ ПРОЖИВАНИЯ. 1.1. Пользование Квартирой в блокированном жилом доме, приквартирным участком и Единой инфраструктурой поселка осуществляется с учетом соблюдения прав и законных инте...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Балашовский институт (филиал) Рабочая программа дисциплины Мировая художественная культура Направлени...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Казинцев Владимир Александрович (RU), (24) Дата начала отсчета срока...»

«79014_729310 ВЕРХОВНЫЙ СУД РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ № 302-ЭС15-12604 ОПРЕДЕЛЕНИЕ г. Москва 21.10.2015 Судья Верховного Суда Российской Федерации Чучунова Н.С., рассмотрев жалобы (заявления) общества с ограниченной ответственностью "Тайга" и Агентства лесного...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2011. – Т. 20, № 2. – С. 31-43. УДК 598.1(091)(470.53) ОБ ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ГЕРПЕТОФАУНЫ ПЕРМСКОГО КРАЯ 2011 А.Г. Бакиев, Н.А. Четанов* Институт экологии Волж...»

«Песков В.Н., Тарасенко М.О., Франчук М.В. 82 Изменчивость линейных размеров. птенцов обыкновенного жулана УДК 598.292:591.3 ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ, ПРОПОРЦИЙ ТЕЛА И ПЕРИОДИЗАЦИЯ РАЗВИТИЯ ПТЕНЦОВ ОБЫКНОВЕН...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.