WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

«Факультет: Медико-биологический Специальность: медицинская биохимия Курс: 6 Выпускная квалификационная работа Студентки Мавлютовой Лейсан ...»

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

“Казанский государственный медицинский университет”

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра биохимии и клинико-лабораторной диагностики

Факультет: Медико-биологический

Специальность: медицинская биохимия

Курс: 6

Выпускная квалификационная работа

Студентки Мавлютовой Лейсан Фарилевны

Тема: Диагностические возможности определения активности и молекулярного спектра протеаз фекалий и сывороток при воспалительных заболеваниях кишечника Научный руководитель: к.б.н., Зинкевич Олег Данилович Рецензент: врач КЛД лаб.МБИ. Уразаев Наиль Гумерович Работа допущена к защите Заведующий кафедрой Мустафин И. Г.

Дата представления Казань, 2017 Содержание Список сокращений………………………………………………………………4 Введение…………………………………………………………………………..5 Глава 1. Обзор литературы ………………………………………………........8

1.1 Роль протеолитических ферментов в физиологии и патологии оргнов ЖКТ……………………………………………………………………………......8

1.2 Классификация протеолитических ферментов…..…………………….......11

1.3 Ингибиторы протеолитических ферментов и их роль в физиологии и патологии человека…………………………………………………………...........14

1.4 Методы определения активности протеаз и их применение в диагностике………………………………………………………………………………….16 Глава 2. Собственные исследования…………………………………...........20

2.1 Материалы…………………………………………………………................20



2.2 Оборудование……………………………………………………………......20

2.3 Реактивы………………………………………………………………….......21

2.4 Аналитические методы …………………………………………………...21

2.5 Определение тотальной протеолитической активности в фекалиях методом радиальной диффузии в субстратном геле…………………

2.6 Зимографический метод определения спектра протеаз протеолитических ферментов в сыворотках и фекалиях нативным SDS-Na электрофорезом в субстратном ПААГ ……………………………………………….................24 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ……………………………..30

3.1 Тотальная протеолитическая активность фекалий пациентов с ВЗК……………………………………………………………………………....30

3.2 Спектр протеолитических ферментов в фекалиях у пациентов с ВЗК…………………………………………………………………………….....33

3.3 Зимографический спектр протеолитических ферментов в фекалиях пациентов с ВЗК……………………………………………………………................36

3.4 Зимографический спектр протеолитических ферментов в сыворотках пациентов с ВЗК……………………………………………………………............42 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…………….46 ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………….50 Библиографический список………………………………………………......51

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК - болезнь Крона ВЗК - воспалительные заболевания кишечника ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ММП- матриксные металлопротеиназы ПААГ - полиакриламидный гель ПМЯЛ - полиморфно-ядерный лейкоцит ПСА- персульфат аммония ТАП - трипсин активирующий пептид ФНО - фактор некроза опухоли ЭДТА-Na2 – динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ЯК - язвенный колит NK – натуральные киллерные клетки PAR- протеиназоактивируемый рецептор SDS- Додецил сульфонат натрия TEMED- Тетраметилэтилендиамин 1-АТ - 1-антитрипсин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) – широко распространенные патологии желудочно-кишечного тракта с неизвестной этиологией, неясным патогенезом и отсутствием специфического лечения [Воробьев Г.И., 2008; Ивашкин В.Т., 2013; Konstantinos H., 2012].





В Российской Федерации отсутствует статистические данные о заболеваемости ВЗК. Имеются лишь отдельные публикации по некоторым регионам. Однако, учитывая данные по США, где зарегистрировано 1,4 млн. человек с ВЗК или 0,43% [41][N Engl J Med. 2009 Nov 19; 361(21): 2066–2078], то в России должно составлять приблизительно 560-620 тыс., что позволяет отнести ВЗК к социально значимым заболеваниям.

Патогенез ВЗК является сложной и малоизученной. В основе лежит, нарушение гомеостаза слизистой кишечника, под влиянием генетических факторов, иммунной системой, нарушение проницаемости кишечника и факторами окружающей среды. [Knights D, Silverberg M.S., Weersma R.K., Gevers D., Dijkstra G., Huang H., Tyler A.D., van Sommeren S., Imhann F., Stempak J.M., 2014;6:107. Manichanh C., Borruel N., Casellas F., Guarner F. 2012;9:599– 608]. Основными причинами возникновения ВЗК являются: нарушение барьерной функции кишечника у генетически предрасположенных лиц с возникновением дисбаланса в иммунном ответе организма. Нарушением баланса между активностью протеаз и содержанием их ингибиторов в просвете кишечника вследствие воспалительных заболеваний органов желудочнокишечного тракта. По мнению ведущих мировых специалистов Nathalie Vergnolle [GUT Published Online First 12 April 2016], Paolo Biancheri [Cell and Tissue Research, Springer-Verlag 2012, Published 20 March 2012] «протеолитические ферменты являются одним из основных звеньев в патогенезе неспецифических заболеваний кишечника (ВЗК), к которым относятся язвенный колит, болезнь Крона и синдром раздраженного кишечника. Их участие в патогенезе связывают с разрушением муцина, белков межклеточного матрикса и активацией протеазо-активируемых рецепторов, что в свою очередь приводит к нарушению целостности кишечного барьера».

Вс выше изложенное позволяет считать, что изучение роли протеолитических ферментов содержимого нижних отделов кишечника в клинике и патогенезе воспалительных заболеваний кишечника является актуальным и позволит предложить дополнительные метода диагностики и критерии эффективности проводимой терапии.

Цель работы – Изучить взаимосвязь активности, молекулярного профиля и специфичности протеолитических ферментов в фекалиях пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.

Задачи исследования:

1. Изучить тотальную протеолитическую активность и по типам активных центров в фекалиях у пациентов с ВЗК.

2. Оценить протеолитическую активность фекалий в стадии ремиссии и обострении при болезни Крона и язвенном колите.

3. Изучить молекулярный спектр протеаз и тип активного центра выявленных фракций при ВЗК.

4. Оценить взаимосвязь между спектром и активностью протеаз в фекалиях и сыворотках пациентов с ВЗК.

Научная новизна. Впервые изучена тотальная активность протеолитических ферментов в фекалиях пациентов с ВЗК с оценкой по различным типам активных центров.

Показана высокая протеолитическая активность фекалий у пациентов с ВЗК с преобладанием сериновых (трипсино-подобных) ферментов. Показаны достоверные различия между тотальной протеолитической активностью группы сравнения и пациентов с ВЗК, вне зависимости от нозологии. Впервые в сыворотках пациентов с ВЗК показано наличие протеолитически активных фракций с молекулярными характеристиками химотрипсина и трипсина.

Практическая ценность работы. На основании полученных результатов предложены дополнительные, объективные лабораторные критерии оценки эффективности проводимой терапии пациентов с ВЗК.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ До 60 годов прошлого столетия протеазы в основном относили к деградирующим белки ферментам, участвующим в процессах пищеварения.

Более широкий спектр действия протеаз возникли с появлением концепции «ограниченного протеолиза», термин введн в оборот Linderstrom-Ланг, который отделил ферменты и процесс, связанные с неспецифическим протеолизм (деградацией) белка от точеченого специфического расщепления пептидной связи, приводящей к активации профермента в фермент [Neurath H.

Proteolytic enzymes, past and future. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:10962– 10963.] В связи с очень жизненно важной функцией ограниченного протеолиза в регуляции процессов внутриклеточной сигнализации в том числе и для эпителиальных клеток кишечника.

1.1 Роль протеолитических ферментов в физиологии и патологии органов ЖКТ В желудочно-кишечном тракте содержится эндогенные и экзогенные протеазы. Эпителий кишечника не только контролирует пищеварительные, абсорбционные и секреторные функции, а также передачу информации к иммунной, сосудистой и нервной систем. Эти функции включают в себя сложный комплекс различных типов клеток: цитокины и белки внеклеточного матрикса, активность и доступность которых регулируется протеазами [Toni M. Antalis, 2007]. Источниками этих ферментов являются резидентные клетки кишечника, а также кишечная микробиота. Как комменсальные, так и патогенные микроорганизмы кишечника продуцируют большое количество протеолитических ферментов, относящихся к сериновым, аспартильным, цистеиновым и металлопротеиназам. В норме протеазы, включая ферменты микробиоты, принимают участие в пищеварении, а также играют гомеостатическую роль в поддержании нормального функционирования и целостности кишечного барьера [Toni M. Antalis, 2007]. С другой стороны – их повышенная продукция или секреция ферментов с иной специфичностью может противоположным образом влиять на кишечную проницаемость. Воспаление является одной из первых ответных реакций организма на любую травму, вне зависимости от природы этого повреждения – механическое, физическое, биологическое [Podolsky D.K. N Engl J Med. 2002].

Источники протеаз в желудочно-кишечном тракте:

Клетки иммунной системы высвобождают противоспалительные цитокины, оксиды азота, эйкозаноиды и протеазы в слизистой кишечника [Uehara A., et al, 2003]. В норме кишечник защищен слоем муцина, вырабатываемый бокаловидными клетками. Этот химический барьер также содержит дефенсины и антимикробные пептиды, которые вырабатываются в клетках. Однако, если барьер нарушен в присутствии пищеварительных ферментов, то они генерируют цитотоксические медиаторы, которые совместно транспортируются через портальную венозную систему, лимфатическую систему кишечника в системную циркуляцию, приводя к полиорганной недостаточности и смерти [Truninger K, et al., 2001]. Протеолитические ферменты проникают через кишечный барьер внутрь организма при ишемии-реперфузии в течение нескольких минут [Fasano A. Tight Junctions, 2001]. Затем они обнаруживаются в плазме и периферических органах. Мишенями протеолитических ферментов являются белки межклеточного матрикса и плотных межклеточных соединений, что усиливает эффект «дырявой кишки», позволяя проникать через кишечную стенку продуктам микробного происхождения [G.W.

Schmid-Scho Nbein and Marisol Chang, 2014]. Нарушения баланса между протеазами и антипротеазами является одной из основных причин приводящих к нарушению кишечного барьера [Nathalie Vergnolle, 2015].

Кишечные эпителиальные клетки постоянно подвергаются воздействию протеаз. Протеазы могут быть эндогенные (например, панкреатические протеазы) или могут быть бактериальные, присутствующие в просвете кишки. Их протеолитическая активность может привести к повреждению слоя муцина и белков плотных межклеточных соединений. Протеазы, активируя рецепторный аппарат клеток иммунной системы приводят к изменению их метаболизма и не контролируемому синтезу медиаторов, вызывая «медиаторный хаос» [ Jacob C, et al.,2005].

Протеиназо активируемые рецепторы (PARs), являются связанными с Gбелками могут активироваться трипсином тромбином и другими протеолитическими ферментами на различных типах клеток в желудочно-кишечном тракте. Активность тромбина и других протеиназ значительно увеличивается в толстом кишечнике при воспалительных заболевания [Nathalie Vergnolle, 2004].

Воспаление слизистой оболочки кишечника у больных с ВЗК - характеризуется увеличением провоспалительных медиаторов, включающих интерлейкины и фактор некроза опухоли (ФНО) В процессе воспаления в слизистую кишечника рекрутируются различные клеточные элементы иммунной системы – нейтрофилы, моноциты. макрофаги Т- и В лимфоциты [Capaldo C.T., Nusrat A., 2009; Lee S.H., 2015].

Эпителиальный слой клеток, выстилающих желудочно-кишечный тракт, обеспечивает морфо-функциональную целостность барьерной функции кишечника. Во многом целостность этого барьера обеспечивается через равновесие между протеолитическими ферментами и их естественными ингибиторами. Повышенная проницаемость кишечника является очень важным фактором не только в патологии ЖКТ, но и других соматических заболеваниях таких как атеросклероз, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунные заболевания и пр. Более глубокое понимание механизмов участия протеолитических ферментов в патофизиологических процессах позволит глубже понимать природу заболеваний и разрабатывать новые подходы и лекарственные средства для их терапии и диагностики [Toni M. Antalis, 2007].

1.2 Классификация протеолитических ферментов Протеолитические ферменты (протеазы) - класса гидролаз, расщепляющие пептидные связи между аминокислотами в белках и пептидах.

Гидролазы-класс ферментов, катализирующие гидролиз ковалентной связи с присоединением воды.

Классификация по типу активных центров:

1. Сериновые протеазы

2. Цистеиновые

3. Металлопротеазы

4. Аспартильные Формирование структуры активного центра, и идентификация входящих в него функциональных групп требуют доскональных аналитический изучений. Однако в ряде случаев удалось установить характер функциональных групп, входящих в активный центр фермента. Изучение свойств данных функциональных групп дает возможность осознать их значимость в образовании каталитически активной структуры ферментов и системы их воздействия.

Сериновые протеазы. Имеют однотипное строение каталитического центра, в который входит остаток серина. Максимальная активность наблюдается в нейтральной и щелочной среде. Сериновые протеазы осуществляют гидролиз пептидной связи, образованной аминокислотой, содержащей в положении гидрофобную боковую группу R при этом специфичность ахимотрипсина, например, определяется объемным гидрофобным радикалом в молекуле субстрата (типа боковой группы фенилаланина, триптофана), а для эластазы — метильной группой аланина. Механизм наблюдаемой специфичности обусловлен весьма незначительными различиями в строении активных центров этих двух ферментов. Это вызвано тем, что в соответствующих положениях эластазной пептидной цепи расположены более объемные остатки треонина и валина. Гидроксильная группа свободного серина, подобно другим первичным спиртовым группам, химически мало активна. Однако она оказывает существенное влияет на свойства участка белка, соседнего с остатком серина. Рядом расположенные пептидные связи становятся менее прочными и легко разрываются при кислотном гидролизе [Neil D. Rawlings, Alan J. Barrett, Robert Finn, 2016].

Цистеиновые протеазы (они же тиоловые, или сульфгидрильные протеазы). В состав данных протеаз входит цистеин и их ферментативная активность зависит от сульфгидрильной, тиоловой групп. Ферментативная активность ряда ферментов (а-амилазы, папаина, катепсин К, некоторых дегидрогеназ и многих других) снижается при блокировании содержащихся в них сульфгидрильных групп остатков цистеина [Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J., 2004].

Аспартильные протеазы. К ним относят желудочные протеазы, пепсин, катепсины Д, Е. Многочисленная группа ферментов, способные катализировать реакцию гидролиза пептидной связи в слабокислой и кислой среде.

Два остатка аспарагиновой кислоты участвуют в кислотно-основном катализе в активном центре фермента. В начале, один аспартат акцептирует протон от H2O активного центра, который атакует углерод карбонила пептидной связи. Одновременно, другой аспартат дает протон кислороду карбонильной группы образующегося пептида [Кашпаров и др., 2000].

Металлопротеиназы. По химической природе они являются сложными белками, простетические группы которых представлены металлами, для их действия необходимы ионы цинка, который входит в состав активного центра. Их мишенями являются как белки межклеточного матрикса – это эластин, фибронектин, коллагены, ламинин, а также внутриклеточные белки.

Эти ферменты очень важны для миграции клеток, инвазии, пролиферации, морфогенеза тканей. Они регулируют многие процессы развития, включая ангиогенез, заживление ран и проч [Visse R., Nagase H., 2003].

Многие белки в организме человека синтезируются в неактивной форме (белковые гормоны, рецепторы, ростовые факторы, ферменты, цитокины и т.п.) и приобретают биологические активности после отщепления какого либо фрагмента. Во многих случаях, металлопротеиназы гидролизуя белки, генерируют большое число сигнальных молекул, которые по биологической активности отличаются от своего предшественника [Gillian Murphy and Hideaki Nagase, 2008]. По типу активного центра большинство ферментов являются металл-зависимыми. ММП оказывают существенное влияние на патогенез ВЗК. Такие ММП, как ММП-2, ММП-3, ММП- 7, ММП-МТ-1 постоянно экспрессируются и выполняют защитную роль при ВЗК за счет воздействия на клеточный гомеостаз. В это же время, ММП-1, ММП -8, ММП -9, ММП-10, ММП- 12, ММП-13, в слизистой оболочке толстой кишки в норме не определяются. Повышение их активности влияет на адгезию клеток, миграцию иммунных клеток и процессы репарации. Дисбаланс между провоспалительными, противовоспалительными ММП и ТИМП может привести к нарушению защитной функции кишечника. Это вызывает впоследствии развитие воспаления, образование язв [Ravi A., 2007]. Данное обстоятельство определяет необходимость совместной оценки уровня экспрессии ММП и их ингибиторов, поскольку нарушение баланса «протеаза/ингибитор» имеет важное значение для протеолиза [Nagase H. et al., 1999].

При ВЗК ММП-9 является протеазой, которая в большом количестве продуцируется клетками воспаления, преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами (ПМЯЛ) [Baugh M.D, 1999], специфическим ингибитором ММП-9 является ТИМП-15 [Lichtinghagen R. et al., 2003]. По данным Castaneda F.E. et al. (2005), эпителиальная ММП-9 увеличивает степень повреждения ткани при колитах.

Основную часть протеолитических ферментов составляют металлосодержащие и сериновые протеазы. Количественное соотношение классов протеаз в организме человека изображено [39]Nathalie Vergnolle Gut doi:10.1136/gutjnl-2015-309147.

1.3 Ингибиторы протеолитических ферментов и их роль в физиологии и патологии человека В регуляции протеолиза участвуют ингибиторы протеолитических ферментов. В организме они представленными специфическими белками.

Ингибиторы (с латинского inhibere – останавливать, сдерживать) способны прекращать действие ферментов. Основная функция ингибиторов заключается в блокировании активности протеаз. По механизму воздействия ингибиторы делят на обратимые и необратимые [Мосолов В.В., Валуева Т.А. 2005;

Scott A, Weldon S, Taggart CC., 2011].

doi:10.1042/BST0391437[40] Активность сериновых протеиназ регулируется белками-ингибиторами серпинов (Serine Proteaze Inhibitor). К ним относят 1-АТ, Cl-ингибитор, антитромбин, ингибиторы активаторов плазминогена и другие [Silverman G.A., Whisstock J.C., Askew D.J., Pak S.C., Luke C.J., Cataltepe S., Irving J.A., Bird P.I. 2004].

1-антитрипсин — линейный гликопротеин с молекулярной массой 52 кДа, со свободным цистеиновым остатком и тремя боковыми углеводными цепями. Синтезируется преимущественно в печени, а также макрофагами, моноцитами и эпителиальными клетками слизистой оболочки кишечника.

1-антитрипсин является основным ингибитором сериновых протеаз в плазме человека. Также доказано, что фекальный 1- антитрипсин — важнейший маркер интестинальной потери белка и повышенной проницаемости кишечника, так как он имеет устойчивость к деградации в кишечнике с помощью своей антипротеолитической активности.

Биологическая функция серпинов:

Важная функция 1-АТ состоит в ингибировании активности эластазоподобных и химотрипсиноподобных протеиназ, которые поступают из гранулоцитов в воспалительные экссудаты и вызывают вторичное повреждение тканей. Для начальных стадий острого воспаления обычно характерно снижение уровней ингибитора, вслед за этим происходит повышение концентрации, которое связано с увеличением синтеза белка [Stoller J.K., 2005].

C1-ингибитор является сильным антивоспалительным белком и основным ингибитором системы комплемента [Wagenaar-Bos I.G. et al., 2006;

Wouters D. et al., 2008]. Кроме препятствия действию компонентов комплемента, C1-ингибитор, снижает активность калликреина и фактора свертывания XII [Bracho F.A., 2005]. Участвует в процессах гемостаза [Cicardi M. et al., 2005; Nettis E. et al., 2005; Bernstein I.L., 2008].

Серпины, участвуют в физиологических процессах, таких как воспаление, свертывание, ангиогенез, апоптоз, активация комплемента [Richardson J.

et al., 2006], защищают клетки от внутреннего и внешнего протеолитического повреждения [Silverman G.A. et al., 2004].

Ингибитор трипсина был обнаружен в 1938 году в бобах сои Glycine max Боуманом, и позднее в 1945 году выделен из них Кунитцом путем кристаллизации. На сегодняшний день известно, что в бобах сои содержится несколько полиморфных типов данного белка [Wang K.J. et al., 2008]. Ингибитор трипсина Кунитца из соевых бобов относится к белкам глобулярного типа. Молекулярная масса соевого ингибитора составляет 20 093 D. Соевый ингибитор тормозит активность трипсина, в меньшей степени химотрипсина, плазмина, калликреина плазмы (не влияет на тканевый калликреин), фактор свертывания Ха, энтеропептидазы [I. T. Nizamutdinova, Y. M. Kim, J. I. Chung et al., 2009].

1.4 Методы определения активности протеаз и их применение в диагностике В последнее время для оценки клинической эффективности медицинского вмешательства стали использоваться специальные критерии, называемые точками клинической эффективности – суррогатные и конечные точки, что позволяет сделать вывод о действенности (полезности или вредности) применения или внедрения определенного медицинского вмешательства в клинической практике. «Конечная точка» – мера оценки эффективности медицинского (диагностического, лечебного, иного) вмешательства [Bucher H. C., Guyatt G. H., Cook D. J. et al.1999].

Использование реперных точек в роли критериев эффективности медицинского вмешательства дает наиболее объективные результаты. Однако затратность и длительность исследований с применением реперных точек (особенно при хронических заболеваниях) препятствуют их широкому использованию. В связи с этим часто для оценки эффективности медицинских вмешательств в практических работах врачей, в том числе в клинических и экспериментальных исследованиях, используются биомаркеры [Rogler G., 2015].

Изучение активности протеиназ при заболеваниях желудочнокишечного тракта имеет большое как диагностическое, так и прогностическое значение. Трипсиноподобные протеиназы плазмы крови могут влиять на процессы внутриклеточного метаболизма через активацию интегральных мембранных белков PARs (proteinase activated receptors), приводя к запуску многие пути внутриклеточной сигнальной трансдукции. Связывание трипсина и тромбина с внеклеточной петлей РАR-2 и РАR-1 сопровождается активацией фосфолипазы C, протеинкиназы C, Рyk2, Rаf1, JАКs, Srс, NF-kВ, МАРК, SТАТ2, SТАТ3 [DeFea K.A., Zalevsky J., Thoma M.S. et al. 2000;

Johne B., Fagerhol M. K., Lyberg T. et al. 1997], увеличением концентрации и повышением активности матриксных металлопротеиназ [Nielsen O. H. et al., 2000]. Активация трипсином и тромбином PARs, которые локализованы в желудке и кишке, стимулирует секрецию пепсина [Kaser A., Nieuwenhuis E., Glimcher L. et al. 2006.; Kawabata A., Kinoshita M., Nishikawa H. et al. 2001].

Стимуляция рецепторов возникает при повреждении кишечника и проникновении протеиназ в интерстиций [Ossovskaya V.S., Bunnett N.W. 2004;

Weldon M. J., Lowe C., Joseph A. E., Maxwell J. D., 1996]. Дефицит их ингибиторов является предрасполагающим фактором повышенной активности трипсиноподобных протеиназ [Веремеенко К.Н. 1994]. При ВЗК происходит превращение трипсиногена в трипсин. В процессе его активации из аминотерминальной области высвобождается короткий пептид из 8 аминокислотных остатков молекулярной массы 900 дальтон, который получил название трипсин - активирующий пептид (ТАП). В норме он высвобождается в ЖКТ и в сыворотке и моче не обнаруживается [Gudgeon A.M., Heath D.I., Hurley P., Jehanli A., Patel G., Wilson C., 1990]. При тяжелом течении ВЗК в сыворотке обнаруживается фракция трипсина, которая ингибируется ингибитором трипсина из соевых бобов. Что свидетельствует о нарушении кишечного барьера и транслокации трипсина в системный кровоток.

Как известно, слизистая оболочка кишечника при воспалительных заболеваниях продуцирует значительное количество нейтрофилов, что побудило исследователей и клиницистов использовать белки, полученные из нейтрофилов, как биомаркер для оценки состояния кишечной стенки и эффективности лечения у больных ВЗК [Rogler G., 2015].

Кишечник является резервуаром и главным источником протеолитических ферментов, которые, в случае снижения его барьерной функции, могут генерировать воспалительные медиаторы и вызывать их массивное поступления в кровоток. Происхождение ферментов кишечника и их вклад в патологический процесс изучено не достаточно. Расшифровка индивидуального профиля микробных, резидентных клеток кишечника, воспалительных клеток позволит установить вклад в развитие патологического процесса и разработать в будущем подходы к профилактике и лечению [Toni M. Antalis, 2007].

Методы определения активности протеолитических ферментов. Определения активности протеаз белковыми субстратами. В качестве белковых субстратов используют желатин, гемоглобин, казеин, азоказеин, сывороточный альбумин. Метод основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов. Скорость реакции определяют по количеству образовавшихся аминокислот – тирозина и триптофана, которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина или спектрофотометрический при 280 нм. Этим методом определяют белок, расщепленный до аминокислот или пептидов, которые не осаждаются трихлоруксусной кислотой, как в свободном, так и в связанном состоянии. В основу расчета активности протеолитических ферментов положена зависимость степени гидролиза белка от числа единиц активности фермента, введенных в ферментативную реакцию.

Определение активности протеаз хромогенными субстратами. Хромогенные субстраты - вещество не белковой природы (как правило полепептид или их эфир, приобретающее определенную окраску после расщепления протеолитическим ферментом. Изменение окраски можно обнаружить спектрофотометрический; прирост оптической плотности пропорционален протеолитической активности протеазы. Все эти методы чувствительны и достаточно специфичны. Недостатком является то, хромогенные субстраты расщепляются, даже если фермент находится в комплексе с белковым ингибитором.

Глава 2. Собственные исследования

2.1 Материалы для исследования.

Материалом для исследования служила коллекция сывороток и фекалий от пациентов с ВЗК, собранная ассистентом кафедры госпитальной терапии Мухаметовой Д.Д. в 2013-15 годах при выполнении диссертационной работы «Клиническое значение показателей кишечной проницаемости и гуморального иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника» Исследования проводились на базе ЦНИЛ КГМА и на кафедре биохимии КГМУ.

Методы исследования.

Все биологически пробы исследовали на содержание общей протеолитической активности, активности серин- и металл-зависимых протеиназ методом радиальной диффузии, а также зимографическим методом.

2.2 Оборудование:

Спектрофотометр UV/VIS Excellence.

Doc-Print VX2.

Перемешивающее устройство LS 110.

Камера для электрофореза (Bio-Rad).

Аналитические весы.

pH- метр.

Power Pac Universal (Bio-Rad).

Mini- Protean 3 Dodeca Cell (Bio-Rad).

Заливочный столик.

Стекла для проведения электрофореза 1,5 мм (Bio-Rad).

Термостат.

Ультротермостат Haake S 13 Центрифуга Centurion Scientific

–  –  –

2.4 Аналитические методы.

Спектрофотометрия - фотометрический метод анализа, который используют для количественного определений белков, нуклеиновых кислот, витаминов и изучения активности многих ферментов в сыворотки крови и в моче. Этот метод является чувствительным, отличается быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов. Недостатком метода является то, что при определении активности протеолитических ферментов, невозможно определить активные центры, ввиду их связи с ингибиторами.

Общую концентрацию белка и оптическую плотность определяли на спектрофотометре UV/VIS Excellence. Он предназначен для измерения поглощения и пропускания в ультрафиолетовом (UV) и видимом (VIS) диапазонах (от 190 до 1100 нм). Для проведения спектрофотометрического анализа сначала измеряли холостую пробу объемом 2 мкл (mQ H2O). После того как измерили холостую пробу, капали 2 мкл исследуемой пробы на неподвижный модуль прибора. Сверху на каплю опускали подвижный модуль прибора, в результате чего из образца формировался столбик жидкости между подвижным и неподвижными модулями. Высота столбика регулируется автоматически в диапазоне 0,05-1,00 мм. Измеряли общую концентрацию белка и оптическую плотность при длине волны А280, А260, А220.

Специальные методы исследования Определение тотальной протеолитической активности активность протеаз с различными типами активных центров определяли методом радиальной диффузии и методом зимографии.

Зимографический метод. Для определения спектра протеаз по молекулярным массам и типам активных центров использовали метод нативнго SDS-Na электрофорез в субстратном ПААГ. Электрофореграммы ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности изоферментного спектра. При многих заболеваниях наблюдается изменение соотношения фракций ферментов. Выявление этих изменений с помощью метода электрофореза используются в диагностических целях.

Метод радиальной диффузии в субстратном геле. Основан на диффузии исследуемого белка в гель агарозы в котором содержится субстрат. Широко используется в иммунохимии для определения концентрации антигена, в изучении гемостаза (по Аструпу) для определения активаторов плазминогена и для определения активности различных гидролитических ферментов с внесением в гель агарозы соответствующих субстратов. Метод отличает высокая чувствительность и воспроизводимость. Недостатком является длительность процесса (20-24 часа).

2.5 Определение тотальной протеолитической активности в фекалиях методом радиальной диффузии в субстратном геле В качестве подложки использовали 1% гель агарозы с содержанием 0,2% субстратного белка – желатина.

Подготовка золя агарозы. Навеску 10 грамм агарозы и 2 г желатина, заливали 500 мл дистиллированной водой и оставляли набухать на 1 час при комнатной температуре. Набухшую смесь агарозы и желатина растопили на кипящей водяной бани до полного растворения. К золю агарозы приливали 100 мл нагретого до 1000С 10 кратного субстратного буфера и доводили до 1 литра кипящей дистиллированной водой. Разливали во флаконы по 300 мл.

Готовый раствор хранили до использования при 4оС.

Перед использованием гель агарозы топили на кипящей водяной бани и стабилизировали на ультратермостате в течение 25-30 минут при температуре 500С. На одно стекло размером 200 х 115 мм готовили 60 мл агарозы. Для ингибирование сериновых протеиназ добавляли 17 мг ингибитора трипсина из соевых бобов. Для ингибирование металлопротеиназ добавляли 15 мг ЭДТА, а для сериновых и металлозависимых 17 мг ингибитора трипсина из соевых бобов + 15 мг ЭДТА. После чего наслаивали гель на стеклянную пластину размером 200 х 115 мм. Разлитый гель для формирования плотной структуры выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем 2 часа при температуре +40С. В сформированном тврдом геле вырезали лунки пробойником диаметром 2 мм по шаблону.

В каждую лунку вносили по 20 мкл испытуемого раствора, а также разведения трипсина в качестве контроля. Субстратные гели на стклах помещали во влажную камеру для исключения подсушивания гелей и образцов и инкубировали 18-20 часов при 370С.

По окончании инкубации сткла с гелями помещали в фиксирующую жидкость на 30 минут (45% этанол, 45% H2O, 10% ледяная уксусная кислота), после чего гели отжимали от избытка фиксирующего раствора 10 слоями фильтровальной бумагой со сменой до полусухого состояния. Сткла с подсохшим гелем помещали под струю воздуха вентилятора до полного высушивания (гладкая прозрачная плнка геля).

Сткла с высушенным гелем окрашивали 0,2% раствором амидочрного 10В в течение 15 минут на фиксирующем растворе. От избытка красителя стекла промывали фиксирующим раствором до просветления зон лизиса субстратного белка.

Оценка результатов реакции.

Измеряли диаметр зон просветления, рассчитывали площадь зоны. Калибровочный график строили по площади зон лизиса трипсином, выражая активность в PU/г кала за 1 час. Активность сериновых протеиназ оценивали по разнице между тотальной активностью и активностью в присутствие ингибитора трипсина из соевых бобов. Активность металлзависимых протеиназ оценивали по разнице между тотальной активностью и активностью в присутствии хелаторов кальция и цинка (Na2ЭДТА). Активность тиоловых протеиназ оценивали по разнице между тотальной активностью и полученной в гелях с одновременным внесением соевого ингибитора и Na2ЭДТА.

2.6 Зимографический метод определения спектра протеаз протеолитических ферментов в сыворотках и фекалиях нативным SDS-Na электрофорезом в субстратном ПААГ.

Протеолитические ферменты биологических образцов определяли также с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с добавлением в качестве субстрата 2% желатин.

Подготовка проб сывороток: венозную кровь центрифугировали в течение 15-20 минут на скорости 3000 об/мин. Разливали по аликвотам и хранили при -20°C до использования. Перед использованием образцы размораживали, снова центрифугировали в том же режиме, после чего к 80 мкл сыворотке приливали 20 мкл 4-х кратного буфера для образца (в соотношении 1:4).

Подготовка проб копрофильтратов: навеску кала в 0,5 г смешивали с 5 мл 0,85% NaCl. Тщательно перемешивали на качающемся шейкере в течение минут. Затем центрифугировали 15-20 минут со скоростью 15-30 9000об./мин. Отбирали супернатант и замораживали. Перед использованием размораживали и в пробирки наливали по 1 мл исследуемого копрофильтрата, центрифугировали 14000 об/мин 5 минут. После центрифугирование готовили разведения фильтрата в зависимости от содержания ферментов.

Подготовка реактивов для проведения зимографического анализа.

Акриламид - 30% – 87,6 грамма акриламида, 2,4 грамма бис-метиленакриламид растворяли в 300 мл mQ H2O. Готовый раствор хранили в холодильнике при температуре 4°C 30 дней.

Буфер для приготовления разделяющего геля – 1,5 М трис-HCl, pH 8,8.

Для приготовления раствора 54,4 г ТРИС растворяли в 150 мл mQ H2O.

Устанавливали pH 8,8 раствора 6 М HCl, затем доводили общий объем до 300 мл mQ H2O. Готовый буфер хранили в холодильнике при температуре 4°C.

Буфер для приготовления концентрирующего геля – 0,5 М трис- HCl, pH 6,8. Для приготовления раствора 6 г ТРИС растворяли в 60 мл воды, устанавливали pH 6,8 с помощью концентрированной HCl. Затем доводили объем раствора до 100 мл mQ H2O. Готовый буфер хранили в холодильнике при температуре +4°C.

10% SDS - для приготовления раствора 10 г SDS растворяли в 100 мл дистиллированной воды.

10% персульфат аммония (ПСА) - 100 мг персульфат аммония растворяли в 1 мл дистиллированной воды.

Электродный буфер pH 8,3 (10х кратный буфер): для приготовления электродного буфера навески: 144 г глицина, 30 г Триса, 10 г SDS растворяли в 300 мл дистиллированной воды. В конце добавили 10 грамм SDS-Na, растворяли, доводили объем до 1 л дистиллированной водой. Готовый буфер хранили при температуре 4°C.

Концентрированный субстратный буфер (10-кратный буфер): для приготовления раствора навески: 144 г глицина, 2 г азида натрия, 30 г ТРИСа растворяли в 400 мл дистиллированной водой. pH буфера коррегировали раствором 1 М трис до 8,0. Объем раствора доводили до 1 л дистиллированной водой. Готовый буфер хранили при температуре 4°C.

Субстратный буфер без ионов кальция: 25 мл концентрированногосубстратного буфера 10- кратного доводили до 250 мл дистиллированной водой, добавили 0,95 грамма ЭДТА до растворения. Готовится ex-tempore.

Субстратный буфер (10-кратный)c ионами кальция и цинка: для навески 144 глицина, 2 грамма азида натрия, 30 грамма триса, 5,55 грамма хлорида кальция, 2,72 грамма хлорида цинка растворяли в 400 мл дистиллированной водой, коррекцию pH до 8,0 проводили 1 М раствором Трис. Довели объем до 1 л дистиллированной водой и хранили до использования при 4оС.

Ренатурирующий растор. Навеска 50 г тритона Х-100 растворяли в 250 мл дистиллированной воды при 70-800С и доводили охлажднной дистиллированной водой до 2 л.

Состав растворителя для образца:

Буфер для образцов 3,55 мл деионизированной воды 1,25 мл 0.5 М Tris-HCl, pH 6,8 2,5мл Глицерин

2.0 мл 10 % (w/v) SDS 0,2 мл 0.5 % (w/v) Бромфенолового синего 9,5мл Общий Объем Хранили при комнатной температуре.

Приготовление геля:

Состав 10% разделяющего геля. Расчт на один гель.

Дистиллированная вода – 4,1 мл Акриламид/Bis – 3,3 мл Буфер 1.5 М Tris-HCl, pH 8.8 – 2,5 мл 10% SDS – 0,1 мл 2 % желатин – 1 мл

Перед заливкой гелей добавляли:

10% персульфат аммония – 10 мкл ТЕМЕД – 5 мкл

Состав 5% концентрирующего геля:

Дистиллированная вода – 5,7 мл Акриламид/бис акриламид – 1,7 мл Буфер 0.5 М Tris-HCl, pH 6.8 – 2,5 мл 10% SDS – 0,1 мл

Перед заливкой гелей добавляли:

10% персульфат аммония – 10 мкл ТЕМЕД – 5 мкл Перед добавлением персульфата аммония и ТЕМЕД, смесь аккуратно перемешивали, не допуская попадания пузырьков воздуха. Заливали в камеру. Сверху на поверхность гелевого раствора наслаивали по 300 мкл раствора бутанола, насыщенного дистиллированной водой. Оставляли на 30 минут для полимеризации.

Раствор концентрирующего геля заливали на полимеризованный разделяющий гель до края тонкого стекла. Использовали 15-луночную гребенку.

Полная полимеризация происходила в течение 20-25 минут. После полной полимеризации во внутреннюю камеру наливали электродный буфер и осторожно вынимали гребенку, избегая образования воздуха.

Состав разделяющего геля с ингибитором трипсина из соевых бобов:

Акриламид/Bis – 3,3 мл Буфер 1.5 М Tris-HCl, pH 8,8 – 2,5 мл 10% SDS – 0,1 мл Ингибитор трипсина из соевых бобов – 1мл

Перед заливкой гелей добавляли:

10% персульфат аммония – 10 мкл ТЕМЕД – 5 мкл Проведение электрофореза Для проведения зимографического определения протеолитических ферментов готовили 4 геля. В 1 и 2 гель добавляли желатин, в 3 и 4 желатин и соевый ингибитор. Вносили в лунки разделяющего геля по 10мкл исследуемых образцов. В первую лунку вносили – 10 мкл контрольного раствора трипсина (5 мг/мл в буфере для образцав) разведении 1/1000. Концентрирование образцов проводили при токе 6 мА на 1 гель.

Разделяющий электрофорез проводили при силе тока 14 мА на один гель.

После завершения электрофореза гели переносили в пластиковые мкости и ренатурировали 2,5% Тритона Х-100, 3-ды по 15 минут. Затем, гель для полной зимограммы промывали 2-ды по 10 минут в полном субстратном буфере с ионами Ca++и Zn++. Гели с соевым ингибитором трипсина промывали 2-ды субстратным буфером, содержащим ионы Са++ и Zn++ без ЭДТА.

Проведение реакции протеолиза проводили, заливая в пластиковые мкости соответствующие буферные растворы. Гель без ингибитора с ингибитором трипсина инкубировали в полном субстратном буфере с двухвалентными ионами. Гель для ингибирования металлзависимых протеиназ и ингибированием и металлзависимых с сериновыми протеиназами инкубировали инкубировали в субстратном буфере без двухвалентных ионов с добавлением ЭДТА.

Спустя 18 часов гели фиксировали в течение 50 минут, затем промывали 5 раз по 10 минут дистиллированной водой и окрашивали Кумасси G250 в течение 45-55 минут. От избытка краски гели отмывали 10% -ной уксусной кислотой. Протеазо - активные полосы проявлялись как не окрашенные полосы на синем фоне субстратного геля.

Гель-документирование проводили на Doc-Print VX2.

Активность ферментов выражали в PU/мл раствора образца по отношению к трипсину с известной активностью.

–  –  –

Представленные результаты свидетельствуют об отсутствии достоверных различий в протеолитической активности фекалий в ремиссии и в стадии обострения, что вероятно может свидетельствовать о сохраняющемся этом звене патогенеза, что далее может привести к обострению заболевания. В пользу этой точки зрения свидетельствует и хронический рецидивирующий характер течения ВЗК.

–  –  –

Из приведнных результатов следует, что, не смотря на маленькую выборку пациентов находившихся на лечении в стационаре, протеолитическая активность фекалий уменьшалась с высокой степенью достоверности.

3.2 Спектр протеолитических ферментов в фекалиях у пациентов с ВЗК Активность сериновых и металл-зависимых протеиназ при ВЗК приведена в таблице 3.5; 3.6; 3.7 и Рис 3.1, 3.2, З.3, Таблица 3.5. Тотальная протеолитическая активность у пациентов с ВЗК по типам активных центров

–  –  –

Примечание; вариант 1 – тотальная активность, вариант 2 – сериновые протеиназы, вариант 3 – металл зависимые протеиназы.

Приведнные результаты свидетельствуют о том, что основной вклад в протеолитическую активность фекалий при ВЗК принадлежит сериновым протеиназам.

–  –  –

Примечания: вариант1 – общие протеазы, вариант 2 – сериновые протеиназы, металл зависимые протеиназы.

Из результатов следует, что протеолитическая активность фекалий у пациентов с ВЗК в основном обусловлена сериновыми протеиназами.

3.3 Зимографический спектр протеолитических ферментов в фекалиях пациентов с ВЗК Для изучения вопроса о природе высокой активности сериновых протеиназ мы применили зимографический метод с различными ингибиторами.

Метод заключается в проведении SDS электрофореза в 10% полиакриламидном геле, сополимеризованным с субстратным белком (желатинов в концентрации 0.2 %.) Рис. 3.3.1. Зимограмма копрофильтратов пациентов с язвенным колитом без ингибиторов 23кД Примечание: первая дорожка трипсин в концентрации 35 PU/мл; 3-15 дорожки – копрофильтраты пациентов.

Рис. 3.3.2. Зимограмма копрофильтратов пациентов с язвенным колитом в присутствии блокатора ЭДТА.

–  –  –

Примечание: первая дорожка трипсин в концентрации 35 PU/мл; 3-15 дорожки – копрофильтраты пациентов.

Рис. 3.3.3. Зимограмма копрофильтратов пациентов с язвенным колитом в присутствии ингибитора трипсина из соевых бобов Рис. 3.3.4. Зимограмма копрофильтратов пациентов с болезнью Крона без ингибиторов 23кД Примечание: дорожка 1 - трипсин в концентрации 35 PU/мл; 3-15 дорожки – копрофильтраты пациентов в разведениях 1-40х, 2 – 200х.

Рис. 3.3.5. Зимограмма копрофильтратов пациентов с болезнью Крона в присутствии блокатора ЭДТА.

–  –  –

Рис. 3.3.6. Зимограмма копрофильтратов пациентов с болезнью Крона в присутствии ингибитора трипсина из соевых бобов Рис. 3.3.6. Зимограмма копрофильтратов добровольцев без ингибиторов <

–  –  –

Рис. 3.3.8. Зимограмма копрофильтратов добровольцев с ингибитором трипсина из соевых бобов.

Приведнные результаты исследования спектра протеиназ в фекалиях пациентов с ВЗК подтверждают наше предположение о том, что высокая протеолитическая активность фекалий пациентов обусловлена трипсином, который не инактивируется в процессе пассажа через тонкий кишечник до толстого кишечника.

У части пациентов присутствуют в фекалиях протеиназы с высокой молекулярной массой, которые не являются не сериновыми и не металл зависимыми. Мы предполагаем, что это тканевые цистеиновые ферменты, которые выходят в просвет кишечника в результате воспаления и инфильтрации слизистой оболочки нейтрофильными лейкоцитами и макрофагами, что является общепризнанным и не требует доказательств. Кроме того, наличие протеиназ с высокой молекулярной массой, возможно, связано с изменением состава кишечной микрофлоры.

3.4 Спектр протеолитических ферментов в сыворотках пациентов с ВЗК Для решения вопроса о возможности транслокации протеаз в системный кровоток мы исследовали наличие протеаз в сыворотках пациентов с ВЗК зимографическим методом. Для исследования были отобраны сыворотки пациентов с тяжелой степенью тяжести с язвенным колитом и болезнью Крона. Результаты исследования приведены в рис.3.3.1., 3.3.2., 3.3.3., 3.3.4., 3.3.5, 3.3.6.

Рис. 3.3.1 Спектр протеолитических ферментов в сыворотках добровольцев, не имеющих заболеваний ЖКТ.

Рис. 3.3.2. Спектр протеолитических ферментов в сыворотках добровольцев, не имеющих заболеваний ЖКТ с ингибированием металл зависимых протеиназ (ЭДТА).

Рис. 3.3.3. Спектр протеолитических ферментов в сыворотках добровольцев, не имеющих заболеваний ЖКТ с ингибитором трипсина из соевых бобов.

Рис. 3.3.4 Спектр протеолитических ферментов в сыворотках пациентов с ВЗК.

Примечение: дорожка 1 – трипсин; дорожка 2-8 пациенты с БК 3 степенью тяжести; дорожки 9-15 язвенный колит с 3 степенью тяжести.

Рис. 3.3.5 Спектр протеолитических ферментов в сыворотках пациентов с ВЗК с ингибированием ЭДТА.

Примечение: дорожка 1 – трипсин; дорожка 2-8 пациенты с БК 3 степенью тяжести; дорожки 9-15 язвенный колит с 3 степенью тяжести.

Рис. 3.3.6. Спектр протеолитических ферментов в сыворотках пациентов с ВЗК с ингибитором трипсина из соевых бобов.

Примечение: дорожка 1 – трипсин; дорожка 2-8 пациенты с БК 3 степенью тяжести; дорожки 9-15 язвенный колит с 3 степенью тяжести.

Результаты исследования протеиназ в сыворотках пациентов с ВЗК показывают, что спектр металл зависимых ферментов вариабелен и не отличается от спектра ферментов здоровых лиц. Из 14 сывороток пациентов с тяжелой течением язвенного колитом обнаружены сериновые протеиназы с молекулярными характеристиками трипсина. При болезни Крона ни у одного из 11 пациентов спектр сывороточных протеиназ не отличался от спектра здоровых лиц.

Глава 4. Обсуждение полученных результатов

Язвенный колит и болезнь Крона – широко распространенные неспецифические воспалительные заболевания кишечника с неизвестной этиологией, до конца неясным патогенезом и отсутствием специфического лечения [Воробьев Г.И., 2008; Ивашкин В.Т., 2013; Konstantinos H., 2012].

По мнению ведущих мировых специалистов в области лечения и изучения этиопатогенеза ВЗК - Podolsky D.K., Nathali Vergonelle., Fasano A. и др., главным звеном патогенеза является дисбаланс между протеазами и антипротеазами в просвете кишечника. Причиной этого дисбаланса может быть отсутствие в микробиоме бактерий, обладающих способностью продуцировать ингибиторы протеолитических ферментов. В первую очередь это относится к сериновым протеиназам. Как мы показали в своих экспериментах, фекалиях здоровых лиц очень низкое содержание протеаз обнаруживается у лиц старше 50 лет. В возрасте от 7 до 30 лет фекалии не содержат обнаруживаемые количества протеиназ. По-видимому, это связано с отсутствием нарушений в микробиоме кишечника.

Наши исследования полностью подтверждают гипотезу о роли протеолитических ферментов в патогенезе ВЗК и нарушении кишечной проницаемости.

Результаты наших исследований протеолитической активности фекалии у пациентов с ВЗК показывают более высокую активность по сравнению с лицами не имеющих заболеваний в ЖКТ. При болезни Крона она составила (медиана) 596,3 PU/г кала/1 час, при язвенном колите – 412, против группы сравнения – 51,7 PU/г кала/1 час.

При изучения активности протеиназ с различными типами активных центром мы обнаружили, что 90-98% протеолитической активности фекалий пациентов с ВЗК обусловлены сериновыми протеиназами.

Мы не выявили достоверных различий между протеолитической активностью фекалий в периодах обострения и ремиссии (БК ремиссия – 405,05, обострение – 506,3, p=0,85; ЯК ремиссия – 438,45, обострение – 412,3, p=0,85) что может свидетельствовать о сохраняющемся звене патогенеза ВЗК, что может привести к обострению заболевания.

Анализ результатов зависимости протеолитической активности фекалий пациентом с ВЗК не выявил достоверных различий в период обострения и в ремиссии. БК ремиссия – 405,05: БК обострение – 506,3; ЯК ремиссия – 438,45; ЯК обострение – 412,3; все p0,8.

Изучение протеолитической активности фекалий у пациентов при ВЗК в зависимости от степени тяжести заболевания не выявило достоверных различий, хотя наблюдается тенденция к увеличению медианы в зависимости от тяжести заболевания. БК лгкая – 159,4; БК средняя – 432,6; БК–тяжелая – 826,8. ЯК легкая – 296,85; ЯК средняя – 412,3; ЯК тяжелая – 710,4. Результаты свидетельствую о зависимости протеолитической активности фекалий при ВЗК от тяжести заболевания. По всей видимости, необходимы парные исследования активности протеиназ фекалий у каждого пациента в период ремиссии и обострения.

Анализ результатов зависимости активности протеолитической активности фекалий от пола пациента не выявил достоверных различий. БК мужчины – 506,3 PU/г кала/1 час; БК женщины – 398,25; ЯК мужчины – 412,3;

ЯК женщины – 354,75; p0,5.

Влияние терапии на активность протеолитических ферментов фекалий у пациентов с ВЗК (10 пациентов с БК, 21 пациент с ЯК) показало абсолютную зависимость от терапии. БК до лечения -398,15 PU/г кала/1 час; БК после лечения – 67,7, p=0,00766; ЯК до лечения – 1160; ЯК после лечения – 412,2;

p = 0,00024.

Для выяснения роли трипсина из поджелудочной железы в высокой протеолитической активности фекалий у пациентов мы использовали ингибиторы сериновых и металл зависимых протеиназ. Исследование показало, что по медиане 79% составляют сериновые протеиназы. Активность металл зависимых протеиназ составляет только 5,17% от общей активности по имедиане. Анализ по критерию Стъюдента показал, что активность сериновых ферментов составила 89,7% (177 PU/г кала/1 час ). По всей видимости, остальная активность относится к цистеиновым и не индефицируемым протеиназам.

Анализ тотальной активности протеиназ по типам активных центров у пациентов с ЯК показал, что по медиане 98,4% относится к сериновым протеиназам. По критерию Стъюдента активность сериновых протеиназ составила 80.79%. Доля металл зависимых протеиназ составила соответственно 2,19% и 6,41%.

При болезни Крона уровень сериновых протеиназ составил по медиане 97.8%. по критерию Стъюдента – 88,04%.

Эти данные подтверждают гипотезу о схожести патогенеза при болезни Крона и язвенном колите. Именно о значимой роли в патогенезе ВЗК нарушения баланса между сериновыми ферментами поджелудочной железы и их ингибиторами в просвете кишечника.

Зимографический анализ спектра протеиназ подтверждает, что высокая активность протеолитической активности копрофильтратов пациентов с ВЗК обусловлена сериновыми ферментами с молекулярными характеристиками трипсина (Рис. 3.3.1.). Спектр протеаз в зимографическом анализе не выявил достоверных различий между язвенным колитом и болезнью Крона и группой сраванения. Однако, стоит отметить. что в спектре протеиназ при болезни Крона выявляются протеазы с м.м. выше 98 kD, которые не являются не серинговыми, не металл зависимыми протеиназами. Природу этих ферментов предстоит ещ выяснить.

Приведнные результаты исследования спектра протеиназ в фекалиях пациентов с ВЗК подтверждают наше предположение о том, что высокая протеолитическая активность фекалий пациентов обусловлена трипсином, который не инактивируется в процессе пассажа через тонкий кишечник до толстого кишечника.

У части пациентов присутствуют в фекалиях протеиназы с высокой молекулярной массой, которые не являются не сериновыми и не металл зависимыми. Мы предполагаем, что это тканевые цистеиновые ферменты, которые выходят в просвет кишечника в результате воспаления и инфильтрации слизистой оболочки нейтрофильными лейкоцитами и макрофагами, что является общепризнанным и не требует доказательств. Кроме того, наличие протеиназ с высокой молекулярной массой, возможно, связано с изменением состава кишечной микрофлоры.

Для выяснения возможности транслокации трипсина из просвета кишечника в системный кровоток, мы провели зимографический анализ сывороток пациентов с ВЗК и сравнили его с здоровыми лицами.

Наши исследования показали. в основном, спектр протеиназ у пациентов с ВЗК не отличается от здоровых лиц, не считая вариаций с активностью отдельных фракций. Однако, следует отметить. что из 7 проб от пациентов с язвенным колитом с третьей степенью тяжести в сыворотках 4 пациентов обнаружены фракции протеаз с молекулярными характеристиками трипсина (Рис. 3.3.4-3.3.6).

Полученные нами данные позволяют сделать заключение, что протеолитические ферменты в просвете кишечника играют важную роль в патогенезе неспецифических воспалительных заболевапний кишечника. Параметры активности ферментов в фекалиях могут служить маркером дисбаланса между протеазами и анти протеазами в просвете кишечника.

У пациентов с ВЗК обнаружен высокий уровень протеолитической активности фекалий по сравнению с контрольной группой без заболеваний органов ЖКТ.

Между протеолитической активностью фекалий у пациентов с БК и ЯК не обнаружено достоверных различий.

Показана возможность использования данного теста для мониторинга эффективности проводимой терапии.

Высокая протеолитическая активность фекалий у пациентов с ВЗК в основном обусловлена трипсино- подобными протеиназами.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с ВЗК обнаружен высокий уровень протеолитической активности фекалий по сравнению с контрольной группой без заболеваний органов ЖКТ.

2. Между протеолитической активностью фекалий у пациентов с БК и ЯК не обнаружено достоверных различий.

3. Показана возможность использования данного теста для мониторинга эффективности проводимой терапии.

4. Высокая протеолитическая активность фекалий у пациентов с ВЗК в основном обусловлена трипсино - подобными протеиназами.

5. При тяжелых формах ВЗК в сыворотках пациентов обнаруживается протеаза с молекулярными характеристиками трипсина.

6. Сыворотки пациентов с ВЗК отличаются вариабельностью спектра протеиназ, которые в основном являются металл-зависимыми.

Список литературы

1. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений Прикладная биохимия и микробиология. 2005. № 41, С. 3261-282

2. Bracho F.A. / Hereditary angioedema. // Curr Opin Hematol. 2005. Vol. 12, № 6. Р.493-508

3. Bucher H. C., Guyatt G. H., Cook D. J. et al. Users’guides to the medical literature: XIX. Applying clinical trial results. A. How to use an article measuring the eff ect of an intervention on surrogate end points / Evidence-Based Medicine Working Group // JAMA. – 1999. – Vol. 282. – P. 771-778

4. Capaldo C.T., Nusrat A. / Cytokine regulation of tight junctions. // Biochim Biophys Acta. 2009; 1788:864–871., Lee S.H. / Intestinal permeability regulation by tight junction: implication on inflammatory bowel diseases // Intest Res. 2015, P.11–18

5. Cicardi M., Zingale L., Zanichelli A., Pappalardo E., Cicardi B. / C1 inhibitor: Cell and Tissue Research // Springer-Verlag 2012, P. 42-49

6. Cicardi M., Zingale L.C., Zanichelli A., Deliliers D.L., Caccia S. / The use of plasma-derived C1 inhibitor in the treatment of hereditary angioedema // Expert Opin. Pharmacother. 2007. Vol. 8, № 18. P. 3173-3181

7. DeFea K.A., Zalevsky J., Thoma M.S. et al. / Betaarrestin-dependent endocytosis of proteinase-activated receptor 2 is required for intracellular targeting of activated ERK1/2 // J. Cell Biol. – 2000. – Vol. 148. – P. 1267–1281

8. Fasano A. Tight Junctions / Boca Raton: CRC Press // Pathological and therapeutical implications of macromolecule passage through the tight junction, 2001, P. 697–722

9. Gillian Murph, Hideaki Nagase / Progress in matrix metalloproteinase research // Mol Aspects Med. 2008 October; 29(5):P. 290–308

10. Gudgeon A.M., Heath D.I., Hurley P., Jehanli A., Patel G., Wilson C. et al. / Trypsinogen activation peptides assay in the early prediction of severity of acute pancreatitis. // Lancet 1990; 335: P.4–8

11. GUT Published Online First 12 April 2016

12. Jacob C., et al. / Mast cell tryptase controls paracellular permeability of the intestine. Role of protease-activated receptor 2 and beta-arrestins. // J Biol Chem. 2005, P. 336–348

13. Johne B., Fagerhol M. K., Lyberg T. et al. / Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin // Mol. Pathol. – 1997. – Vol. 50, No. 3. – P. 113-123

14. Kaser A., Nieuwenhuis E., Glimcher L. et al. / Innate immunity in inflammatory bowel disease // Falk symposium. — 2006. — P. 23-4

15. Kawabata A., Kinoshita M., Nishikawa H. et al. / The protease-activated receptor-2 agonist induces gastric mucus secretion and mucosal cytoprotection // J. Clin. Invest. – 2001. – Vol. 107. – P. 1443–145

16. Knights D., Silverberg M.S., Weersma R.K., Gevers D., Dijkstra G., Huang H., Tyler A.D., van Sommeren S., Imhann F., Stempak J.M., 2014;6:P. 107.

Manichanh C., Borruel N., Casellas F., Guarner F. / Molecular and clinical aspects // Springer Semin Immunopathol. 2005. Vol. 27, № 3. Р. 286-298

17. Nathalie Vergnolle / Gut doi:10.1136 // Protease inhibition as new therapeutic strategy for Gl diseases, 2015

18. Nathalie Vergnolle / J Clin Invest. Nov 15, //A role for proteinase-activated receptor–1 in inflammatory bowel diseases, 2004; 114(10): P. 1444–1456

19. Neil D. Rawlings, Alan J. Barrett, Robert Finn / Twenty years of the MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors // Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4, P. 343–350

20. Nettis E., Colanardi M.C., Loria M.P., Vacca A. / Acquired C1-inhibitor // Neurath H. / Proteolytic enzymes, past and future // Proc Natl Acad Sci USA.

1999;96: P. 10962–10963

21. Nielsen O. H. et al. / Established and emerging biological activity markers of infl ammatory bowel disease // Am. J. Gastroenterol. – 2000. – Vol. 95. – P. 359-367

22. Nizamutdinova I.T., Kim Y. M., Chung J. I. et al / Anthocyanins from black soybean seed coats preferentially inhibit TNF--mediated induction of VCAM-1 over ICAM-1 through the regulation of GATAs and IRF-1 // Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 57, 2009, P. 7324–7330

23. Ossovskaya V.S., Bunnett N.W. / Protease-activated receptors: Contribution to physiology and disease // Physiol. Rev. – 2004. – Vol. 84. – Р. 579–621

24. Podolsky D.K. / Inflammatory bowel disease. // N Engl J Med. 2002;347 P.

417–429

25. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. / Evolutionary families of peptidase inhibitors. // Biochem. J. 2004, P. 705–716

26. Richardson J., Viswanathan K., Lucas A. Serpins, / The vasculature, and viral therapeutics // Front. Biosci. 2006. Vol. 1, № 11. P. 1042-1056

27. Rogler G. / Clinical utility of biomarkers in IBD / G. Roger, L. Biederman // Curr Castroenterol Rep.- 2015 – Vol. 17, №7 449-445

28. Schmid-Scho Nbein G.W., Marisol Chang. / The Autodigestion Hypothesis for Shock and Multi-organ Failure // Annals of Biomedical Engineering, Vol. 42, No. 2, February 2014 (2013) P. 405–414

29. Silverman G.A., Whisstock J.C., Askew D.J., Pak S.C., Luke C.J., Cataltepe S., Irving J.A., Bird P.I. / Human clade B serpins (ov-serpins) belong to a cohort of evolutionarily dispersed intracellular proteinase inhibitor clades that protect cells from promiscuous proteolysis // Cell Mol. Life Sci. 2004. Vol. 61, № 3. P. 301-325

30. Silverman G.A., Whisstock J.C., Askew D.J., Pak S.C., Luke C.J., Cataltepe S., Irving J.A., Bird P.I / Human clade B serpins (ov-serpins) belong to a cohort of evolutionarily dispersed intracellular proteinase inhibitor clades that protect cells from promiscuous proteolysis // Cell Mol. Life Sci. 2004. Vol. 61, № 3. P. 301-325

31. Stoller J.K., Aboussouan L.S. / Alpha1-antitrypsin deficiency // Lancet.

2005, P. 365

32. Toni M. Antalis / Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol// Mechanisms of

Disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. 2007 Jul; 4(7):

P. 393–402

33. Truninger K., et al. / Genetic aspects of chronic pancreatitis: insights into aetiopathogenesis and clinical implications. // Swiss Med Wkly. 2001;131 P.

565–574

34. Uehara A., et al. / Neutrophil serine proteinases activate human nonepithelial cells to produce inflammatory cytokines through protease-activated receptor 2.

// J Immunol. 2003, P. 5690–5696

35. Visse R., Nagase H,. / Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. // Circ Res. 2003, P.

827–839

36. Wagenaar-Bos I.G., Hack C.E. / Structure and function of C1-inhibitor // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2006. Vol. 26, № 4. P. 615-632

37. Wang K.J., Takahata Y., Kono Y., Kaizuma N. / Allelic differentiation of Kunitz trypsin inhibitor in wild soybean (Glycine soja) // Theor. Appl. Genet.

2008. Vol. 117. P. 565-573

38. Weldon M. J., Lowe C., Joseph A. E., Maxwell J. D. / Review article:

quantitative leucocyte scanning in the assessment of infl ammatory bowel disease activity and its response to therapy // Aliment. Pharmacol. Th er. – 1996. – Vol. 10, No. 2. – P. 123-132 39. [Электронный ресурс] http://gut.bmj.com/content/early/2016/04/12/gutjnlдата обращения 13.05.2017) 40. [Электронный ресурс] http:// SLPI and elafin: multifunctional antiproteases of the WFDC family. Biochem Soc Trans 2011;39:1437–40.

doi:10.1136/gutjnl-2015-309147 (дата обращения 13.05.2017) 41. [Электронный ресурс] www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0804647 / Clara Abraham, M.D., Judy H. Inflammatory Bowel Disease // Cho M.D.N Engl J Med 2009 doi:10.1042/BST0391437 (дата обращения 13.05.2017)



Похожие работы:

«ЭЛЕКТРОТЕХНИЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ МЕАНДР МР 19.0316.01 ПС V03.04.16 Устройства защиты многофункциональные УЗМ-51МД ТУ 3425-003319288072014 Наличие функции детектирования аварийной электрической дуги Защита от скачков и длительных перенапряжений Встроенная варисторная защита от импульс...»

«Зорников Данила Леонидович ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОЙ ЛАКТОФЛОРЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 03.02.03 – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель:...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и...»

«3.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS AGROECOLOGY АГРОЭКОЛОГИЯ Красноперова Е. А., Юлдашбаев Ю. А., Гала Krasnoperova E. A., Yuldashbaev Yu. A., Galatov A. N. тов А. Н. Методологические аспекты экологиза Methodological as...»

«Приложение к основной образовательной программе основного общего образования муниципального бюджетного общеобразовательного учреждения "Средняя общеобразовательная школа №5", принятой на заседании педагогического совета протокол от 31....»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2011. – Т. 20, № 2. – С. 31-43. УДК 598.1(091)(470.53) ОБ ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ГЕРПЕТОФАУНЫ ПЕРМСКОГО КРАЯ 2011 А.Г. Бакиев, Н.А. Четанов* Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти (Россия) Поступила 14 ок...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 26 (65). 2013. № 3. С. 232-245. УДК 612.135:528.811+537-96 АДАПТАЦИОННО-ЗАЩИТНЫЕ РЕАКЦИИ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА КОЖИ В УСЛОВИЯХ ЛОКАЛЬНОГО ХОЛОДОВОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЭМИ КВЧ...»

«Внеклассное мероприятие для учеников 1-4 классов " Помоги птицам перезимовать" Цель: Расширить знания детей о птицах, вызвать сочувствие к голодающим и замерзающим зимой птицам, учить проявлять заботу к ним.Задачи: Образовательные: Формирование экологическ...»

«муниципальный район Кошкинский Раздел "Охрана окружающей среды и природопользования" на 2014 год и плановый период 2016 – 2018 годов За последние пять лет состояние окружающей среды на территории муниципального р...»

«Тотальный вторжение, 2001, Anton Belozerov, МФ [с.н.], 2001 Опубликовано: 12th September 2011 Тотальный вторжение СКАЧАТЬ http://bit.ly/1cgXAGl Днепровская тарань биология, улов...»

«ISSN 2224-5308 АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ ЛТТЫ ЫЛЫМ АКАДЕМИЯСЫНЫ ХАБАРЛАРЫ ИЗВЕСТИЯ NEWS НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN БИОЛОГИЯ ЖНЕ МЕДИЦИНА С...»

«УДК 612.017.1:616-097 КОЛИКОВА ЮЛИЯ ОЛЕГОВНА АУТОАНТИТЕЛА К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2003 Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского госу...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 25 (64). 2012. № 4. С. 255-263. УДК 548.736+546.64+54.057 СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И К...»

«BWC/MSP/2010/MX/INF.2 Совещание государств участников 5 August 2010 Конвенции о запрещении разработки, Russian производства и накопления запасов Original: English бактериологического (биологического) и токсинного оруж...»

«Биология. 7 класс Пояснительная записка Рабочая программа составлена на основе Закона об образовании Российской Федерации от 29.12.1012 приказ №273/ФЗ, Федерального государственного образовательного стандарта основного общего образования, Федерального базисного учебного плана для общеобразовательных учреждений, Пример...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.