WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я: член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук Э. И. Коломиец, академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, ...»

-- [ Страница 1 ] --

УДК 579.22+579.25+606.62

В сборнике представлены результаты исследований в области

микробного синтеза биологически активных соединений, применения

генно-инженерных методов для создания хозяйственно ценных штаммов

микроорганизмов. Рассмотрены вопросы разработки микробных технологий

для сельского хозяйства, медицины, контроля окружающей среды, а также

некоторые аспекты их применения.

Сборник представляет интерес для микробиологов и биотехнологов,

а также работников промышленности и агропромышленного комплекса.

Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я:

член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук Э. И. Коломиец, академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор А. Г. Лобанок (отв. редакторы) член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор А. И. Зинченко, доктор биологических наук, профессор Р. В. Михайлова, доктор биологических наук З. М. Алещенкова, доктор биологических наук А. Н. Капич, доктор биологических наук А. С. Самсонова, кандидат биологических наук Н. А. Головнева, кандидат биологических наук Г. И. Новик, кандидат биологических наук Т. В. Романовская, кандидат биологических наук Л. И. Стефанович

Р е ц е н з е н т ы:

академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор Н. А. Картель, доктор биологических наук, профессор Н. П. Максимова © Институт микробиологии НАН Беларуси, 2012 © Оформление. РУП «Издательский дом «Беларуская навука», 2012

ВВЕДЕНИЕ

Основная цель социально-экономического развития Республики Беларусь – повышение уровня конкурентоспособности белорусской экономики и ее экспортного потенциала за счет переоснащения и создания новых производств в промышленности, АПК, энергетике, медицине и других отраслях народного хозяйства. При этом большие надежды возлагаются на развитие биотехнологии как наиболее высокотехнологичной отрасли. Успехи, достигнутые в изучении структуры и функций геномов живых организмов, обеспечивают возможность изменения свойств существующих и создания новых продуктов и организмов, глубокого познания микробного разнообразия с целью расширения границ применения биологических процессов и биообъектов для нужд человечества. Мировой рынок биотехнологической продукции в настоящее время оценивается в 400 млрд долларов в год и имеет выход практически во все отрасли экономики, включая здравоохранение (субстанции лекарственных препаратов, диагностикумы); аграрный сектор (биопрепараты для стимуляции роста и защиты растений, ферменты, ветеринарные препараты, аминокислоты, кормовые добавки, биопрепараты для переработки и утилизации отходов); пищевую промышленность (пищевые ингредиенты, закваски, ферменты, продукты функционального и лечебного питания); нефтехимическую промышленность (реагенты, биотопливо, биополимеры); добычу и переработку полезных ископаемых, охрану окружающей среды (биогеотехнологии, биодеструкторы поллютантов, биосенсоры для контроля загрязнений и мониторинга окружающей среды);

лесной сектор (услуги, связанные с охраной, защитой и воспроизводством лесов, использованием недревесных ресурсов, утилизация отходов лесопереработки). Фактически биотехнология решает глобальную проблему перехода от использования невозобновляемых ресурсов к возобновляемому сырью, что чрезвычайно актуально на фоне увеличивающихся с каждым годом темпов истощения минеральных природных ресурсов, изменения климата планеты и роста народонаселения.





В целях импортозамещения, увеличения объемов и расширения ассортимента отечественной биотехнологической продукции разработана и одобрена Президиумом Совета Министров Республики Беларусь (протокол от 29 июня 2011 г. № 28) Концепция развития фармацевтической и биотехнологической промышленности Республики Беларусь на 2011–2015 годы и на период до 2020 года, определяющая стратегию формирования конкурентоспособного биотехнологического сектора экономики.

Среди ожидаемых к 2020 г. результатов реализации Концепции – достижение объемов производства биотехнологической продукции не менее 500 млн долларов США в год; обеспечение 60%-ной потребности народного хозяйства в услугах по ДНКтестированию, 85%-ной потребности АПК в пробиотических препаратах, 100%-ной – в биоконсервантах растительного сырья, микробных удобрениях, биопестицидах; увеличение доли отечественных ферментных препаратов на внутреннем рынке до 90%; экономия 5–10% моторного топлива за счет добавки биотоплива из возобновляемого сырья; наращивание экспортных поставок биотехнологической продукции до 100 млн долларов США в год; повышение качества продуктов питания вследствие использования в растениеводстве и животноводстве экологически безопасной биотехнологической продукции; повышение экологической безопасности страны за счет внедрения природоохранных биотехнологий.

С целью реализации указанных задач Институтом микробиологии НАН Беларуси – ведущим научно-исследовательским учреждением страны в области микробиологии и биотехнологии – осуществлен ряд мероприятий, направленных на повышение уровня научного обеспечения биотехнологической отрасли, развитие производственной базы биотехнологий, подготовку и повышение квалификации кадров, совершенствование управления биотехнологической промышленностью в целях импортозамещения и продвижения продукции на внешние рынки.

В частности, осуществляется научное обеспечение развития биотехнологии в рамках Государственной программы научных исследований «Фундаментальные основы биотехнологий», Государственной научно-технической программы «Промышленные биотехнологии», Межгосударственной целевой программы ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии», направленных на расширение ассортимента и повышение качества биотехнологической продукции, сокращение импорта, укрепление внутреннего рынка республики.

В ходе реализации вышеуказанных программ в 2011 г. получены результаты, представляющие несомненную научную и практическую значимость для развития биотехнологической отрасли страны. Выделены, селектированы и сконструированы свыше 100 хозяйственно ценных штаммов микроорганизмов – продуцентов и суперпродуцентов биологически активных соединений. Национальная коллекция непатогенных микроорганизмов пополнена выделенными культурами, проводятся работы по их молекулярно-генетической паспортизации и освоению методов хранения. Разработаны основы 26 импортозамещающих технологий получения биопрепаратов различного назначения, в том числе лечебно-профилактического препарата-синбиотика для животноводства; бактериальных инокулянтов и арбускулярномикоризных грибов для предпосевной обработки семян тритикале; молочной кислоты; микробного комплексного препарата на основе микроорганизмов – деструкторов нефти; трех нуклеотидов и ферментного препарата - ДНК-полимеразы с возможностью «горячего старта», необходимых для постановки полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени; ферментного препарата уридинфосфорилазы, необходимого для синтеза прекурсора субстанции отечественного противоопухолевого препарата Флударабел и др.

С целью интеграции науки и производства, совершенствования систем планирования и мониторинга научно-технических разработок, активизации трансфера технологий и создания эффективной системы продвижения новых видов биотехнологической продукции на внутренний и зарубежные рынки НАН Беларуси проведен комплекс мероприятий по формированию на базе ГНПО «Химический синтез и биотехнологии» мощного научно-производственного кластера по биотехнологиям, включающего организации различных форм собственности. В рамках объединения запланированы работы по модернизации БРУП «Гидролизный завод», предусматривающие усовершенствование технологий производства кормовых дрожжей и биогаза, внедрение ряда новых биотехнологий (производства молочной кислоты, топливных биоэтанола и биобутанола), организацию асептического производства жидких микробных препаратов мощностью до 1000 т/год, создание импортозамещающего промышленного производства ферментных препаратов для кормопроизводства мощностью 300 т/год. На базе Института микробиологии НАН Беларуси будет организовано производство рекомбинантного интерферона для ветеринарии по разработкам ООО «НПЦ БелАгроГен». В целом запланированные в рамках ГНПО «Химический синтез и биотехнологии» мероприятия позволят обеспечить поступательное развитие современной биотехнологической отрасли Республики Беларусь.

Директор Института микробиологии НАН Беларуси, член-корреспондент НАН Беларуси Э. И. Коломиец УДК 579.01+60:001.89 Э. И. КОЛОМИЕЦ, Н. А. ЗДОР, Л. И. СТЕФАНОВИЧ

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННОЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ

ПРОГРАММЫ «ПРОМЫШЛЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ»

НА 2006–2010 ГОДЫ Представлены итоги выполнения Государственной научно-технической программы «Промышленные биотехнологии» на 2006–2010 годы, показана ее значимость в формировании рынка отечественной биотехнологической продукции и влияние на развитие биотехнологической отрасли республики.

В настоящее время биотехнология становится значимым фактором, определяющим развитие таких жизненно важных отраслей, как медицина, пищевая промышленность, фармацевтика, сельское хозяйство, альтернативная энергетика и др. Инновационные биотехнологии предлагают эффективные способы защиты окружающей среды от промышленных загрязнений, обеспечения растениеводства средствами питания, стимуляции роста и защиты растений; животноводства – ветеринарными препаратами и вакцинами, пробиотическими препаратами и сбалансированными кормовыми добавками; пищевой и легкой промышленности – ферментными препаратами. На основе новых молекулярно-генетических технологий создаются трансгенные растения с улучшенными хозяйственно ценными признаками, разрабатываются эффективные средства для диагностики инфекционных заболеваний. Степень зависимости государства от импорта указанной биотехнологической продукции – один из критериев экономического и политического суверенитета.

Опыт развитых стран свидетельствует, что в решении научных проблем в сфере биотехнологии наиболее перспективным является программный подход с привлечением консолидированных бюджетных и внебюджетных финансовых источников.

Беларусь одной из первых стран СНГ создала правовую базу и действующую на ее основе систему программно-целевого управления прикладными исследованиями и научно-техническими разработками через государственные научно-технические программы (ГНТП), ставшие основным инструментом реализации приоритетных направлений научно-технической деятельности, в том числе в сфере биотехнологии.

Логическим развитием фундаментальных и прикладных исследований в республике стала ГНТП «Промышленные биотехнологии» на 2006–2010 годы, разработчиком и головной организацией-исполнителем которой стал Институт микробиологии НАН Беларуси. Программа включала три подпрограммы: «Биопрепараты и технологии для повышения продуктивности животноводства», «Биопрепараты и технологии для повышения продуктивности растениеводства», «Биопрепараты и технологии для промышленности, здравоохранения и охраны окружающей среды», в выполнении которых приняли участие организации НАН Беларуси, Министерства образования и Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь. В выполнении заданий программы были задействованы 19 научных учреждений и ведущих вузов республики, а также организации с частной формой собственности. В задачи программы входило обеспечение полного инновационного цикла по созданию новой биотехнологической продукции – от идеи до внедрения.

В ходе выполнения заданий ГНТП «Промышленные биотехнологии» проведен целый комплекс научно-исследовательских работ по разработке новых технологий и выпуску продукции, в частности:

для растениеводства:

микробные удобрения Гордебак (на основе консорциума высокоэффективных диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов, обеспечивает получение высококачественного пивоваренного ячменя с содержанием белка в зерне, не превышающем 10,5%, что соответствует ГОСТ 5060-86); Ризофос трех марок (на основе клубеньковых и фосфатмобилизующих бактерий, обладает широким спектром действия, в том числе обеспечивает мобилизацию труднорастворимых фосфатов, повышает выход зеленой массы галеги, люцерны, клевера на 37,0; 14,0 и 15,5% ц/га к. ед. и обеспечивает чистый доход от применения 482,0; 177,0 и 194,0 тыс. руб/га соответственно); Сояриз (на основе местных высокоактивных штаммов ризобий, иммобилизованных на торфяном носителе, повышает урожайность сои на 10–15% без внесения азотных удобрений, применение которого в комплексе с современными агротехнологиями может решить белковую проблему в кормопроизводстве республики и обеспечении населения пищевым белком);

бактериальный препарат Клеверин (на основе штамма ризосферных бактерий рода Pseudomonas, повышает урожайность семян клевера практически на 25% и выход зеленой массы на 9%);

микробный препарат Стимул (предназначен для стимуляции роста растений в условиях открытого и защищенного грунта);

биопестициды Melobass против личинок майского хруща (биологическая эффективность – 75%, экономический эффект от использования в плодовых питомниках – 2214,0 тыс. руб/га) и Немацид против галловой нематоды (биологическая эффективность 50,4 и 53,8% на томатах и огурцах соответственно);

биофунгицид Бетапротектин для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили при хранении, обеспечивает снижение вредоносности и степени развития заболевания на 50 и 64% соответственно;

биопрепарат Экогрин для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники, обеспечивает получение экологически чистой продукции, снижение заболеваемости растений на 20–25%, повышение урожайности на 10–15% и улучшает санитарно-гигиенические условия работы на парниково-тепличных комбинатах;

создан новый сорт секалотритикум Амулет, характеризующийся высокой продуктивностью (7,0–8,5 т/га), устойчивостью к полеганию (7–9 баллов) и высоким содержанием белка в зерне (13–14%);

для животноводства и птицеводства:

на РУП «Энзим» и РУП «Белмедпрепараты» (г. Скидель) освоена технология получения кормовой добавки на основе молочнокислых бактерий (ДКМ) для обогащения корма биологически активными веществами, применение которой приводит к снижению заболеваемости желудочно-кишечного тракта КРС (на 100%), увеличению привесов (на 12,5–25%);

технология получения биоконсерванта Лаксил-М, позволяющая снизить потери основных питательных веществ в процессе силосования растительного сырья и увеличить выход кормовых единиц на 7–8%, снизить расход корма при скармливании на 8–9% и увеличить среднесуточные привесы животных на 13–15%;

лечебно-профилактические препараты Билавет на основе бифидо- и молочнокислых бактерий (сокращает сроки лечения сельскохозяйственных животных на 45–50% и способствует увеличению их привесов на 6–10%); Бацинил на основе спорообразующих бактерий для коррекции микробоценоза желудочнокишечного тракта и стимуляции иммунной системы сельскохозяйственных животных (профилактическая эффективность препарата составляет 93,3%, лечебная – 96%, длительность лечения желудочнокишечных и респираторных заболеваний сокращается в 1,9– 2,4 раза, среднесуточный прирост живой массы достигает 15–20%);

антивирусный препарат нового поколения Гентаферон на основе 2-интерферона, предназначенного для борьбы с мультиинфекционными заболеваниями сельскохозяйственных животных, организация производства которого устранит зависимость от импорта других иммуномодуляторов (способствует снижению заболеваемости животных на 40%, повышению сохранности молодняка, сокращению длительности болезней животных на 3–4 дня);

пробиотический препарат Ветоспорин для наружного применения при гнойно-некротических заболеваниях сельскохозяйственных животных, использование которого позволит снизить их заболеваемость на 25–40%, повысить продуктивность на 30–40,5%;

опытно-промышленные технологии получения дезинфицирующих препаратов Энатин и Микроцид-Д, обеспечивающих снижение численности санитарно-показательной микрофлоры (бактерий группы кишечной палочки и стафилококко-стрептококковой) в свиноводческих комлексах и дезинфекцию птицеводческих и животноводческих помещений, санитарно-технического оборудования;

вакцины против лептоспироза сельскохозяйственных животных и пастереллеза пушных зверей, для профилактики инфекционного ларинготрахеита птиц и против сальмонеллеза поросят;

для пищевой промышленности:

технология получения ржаных солодов с повышенной ферментативной активностью, позволяющая увеличить производительность солодовни на 25% за счет сокращения сроков производства солода на 7–8 сут и уменьшить энергопотребление на 15–20%;

для здравоохранения:

технология получения препарата Глюкозооксидаза для применения в производстве амперометрических и потенциометрических биосенсоров для экспресс-анализа содержания глюкозы в биотехнологических, биологических жидкостях, а также в пищевых продуктах.

По результатам исследований получено 23 патента, подано 11 заявок на получение патента, получено 9 свидетельств на товарные знаки, подано 15 заявок на регистрацию товарных знаков.

В результате выполнения программы создан банк промышленно ценных микроорганизмов, проведен комплекс научноисследовательских работ по созданию 43 передовых производственных конкурентоспособных технологий, освоено 25 технологий.

Отработка новых технологий получения биопрепаратов различного назначения и организация их опытно-промышленного производства осуществлялась в Биотехнологическом центре, созданном при Институте микробиологии НАН Беларуси, а также на ряде предприятий микробиологического профиля республики (РУП «Энзим» и РУП «Белмедпрепараты», г. Скидель, РУП «Новополоцкий завод БВК», БРУП «Гидролизный завод»).

Объем произведенной по ГНТП «Промышленные биотехнологии» продукции в 2006–2010 гг. составил более 17 млрд руб.

Вся выпускаемая продукция является импортозамещающей (объем импортозамещения – 7144,8 тыс. долларов США). Экономическая эффективность программы от внедрения разработанных технологий составила 13 173,0 млн руб., от применения разработанной продукции – 296 043,2 млн руб. Коэффициент использования бюджетных средств составил 31,1.

Реализация разработанных технологий и препаратов обеспечит повышение продуктивности растениеводства и животноводства, улучшение качества выпускаемой продукции; экономию азотных и фосфорных минеральных удобрений, восстановление плодородия почв; улучшение санитарно-гигиенической обстановки в регионе; значительное улучшение качества выполняемых клиникобиохимических анализов при диагностике ряда заболеваний.

Таким образом, консолидация научно-технического потенциала организаций республики на выполнение программы обеспечивает создание ряда производств и формирование рынка отечественной биотехнологической импортозамещающей продукции. Опираясь на достигнутые результаты выполнения программы, Институт микробиологии в рамках утвержденных Указом Президента Республики Беларусь от 22.07.2010 г. № 378 научно-технических приоритетов на 2011–2015 годы инициировал разработку новой программы – ГНТП «Промышленные биотехнологии» на 2011–2015 годы.

Совет Министров Республики Беларусь в марте 2012 г., рассматривая развитие биотехнологической отрасли в стране, принял решение, что производство биотехнологической продукции к 2020 г.

должно вырасти до 500 млн долл. при экспорте 100 млн долл. Планируется практически полностью закрыть внутренние потребности страны по основным видам биотехнологической продукции.

В реализации поставленных задач ведущая роль принадлежит ГНТП «Промышленные биотехнологии» на 2011–2015 годы, направленной на расширение биоресурсной базы для развития промышленной биотехнологии в республике и предусматривающей разработку и освоение новых производств импортозамещающих микробных препаратов и биотехнологий для обеспечения продовольственной, энергетической и фармакологической независимости и охраны окружающей среды. В качестве приоритетных заданий на ближайшую перспективу определено создание новых биопестицидов, вакцин и сывороток, тест-систем и других микробных препаратов.

E. I. KOLOMIETS, N. A. ZDOR, L. I. STEPHANOVICH

EFFICIENCY OF REALIZING STATE SCIENTIFIC-TECHNOLOGICAL

PROGRAM «INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES»

Results of implementing tate scientific-technological program «Industrial biotechnologies», 2006–2010 have been presented, its contribution into the national market of biotechnological products and effect on progress of biotechnology in Belarus have been demonstrated.

МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЕ

КОНСТРУИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

УДК 579.66:577.15+577.113.3

А. Н. РЫМКО, С. В. КВАЧ, Т. А. КУХАРСКАЯ, А. И. БЕРЕСНЕВ, А. И. ЗИНЧЕНКО

СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММАСУПЕРПРОДУЦЕНТА МУТАНТНОЙ КИСЛОЙ

ФОСФАТАЗЫ ENTEROBACTER AEROGENES

Лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы С помощью методов генной инженерии создан штамм Escherichia coli pPhocEa, продуцирующий мутантную неспецифическую кислую фосфатазу (мНКФ) Enterobacter aerogenes с тремя аминокислотными заменами – A90F, G92D, I171T. Установлено, что фермент нарабатывается в основном в виде тел включения. Впервые показано, что тела включения мНКФ обладают удельной активностью 2,2 ед/мг белка в реакции монофосфорилирования инозина, что в 6,4 раза ниже удельной активности растворимого фермента. Изучена субстратная специфичность мНКФ и показано, что данный фермент способен фосфорилировать инозин, гуанозин, дезоксигуанозин и гуанозин-арабинозид с высокими (до 90%) выходами целевых продуктов. Оптимизированы условия получения 2-фтор-аденин-арабинозид-5-монофосфата (2 фтор-араАМФ). В оптимизированных условиях реакции выход целевого 2-фтор-араАМФ составил 76 моль % в расчете на внесенный в реакционную смесь исходный 2-фтор-араА.

Введение. В настоящее время значительное внимание уделяется использованию модифицированных нуклеозидов (МН) в биохимических, молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Традиционными методами для получения МН считаются химические. Однако в последнее время появилось большое количество публикаций, описывающих синтез МН с использованием ферментов микроорганизмов.

Ранее в лаборатории биотехнологии соединений нуклеиновой природы Института микробиологии НАН Беларуси была разработана технология ферментативного синтеза модифицированного нуклеозида 9--D-арабинофуранозил-2-фтораденина (2-фтор-араА) – предшественника лекарственной субстанции препарата «Флударабел», который представляет собой фосфорилированный нуклеозид – 2-фтор-араАМФ. В настоящее время стадия монофосфорилирования осуществляется в Институте биоорганической химии НАН Беларуси химически с использованием высокотоксичного PCl3. Хорошей альтернативой химическому фосфорилированию МН может стать подход с использованием ферментов. Из литературы известно, что некоторые бактериальные НКФ класса А, продуцируемые Morganella or- morganii, Enterobacter aerogenes и Escherichia blattae, способны вести реакцию монофосфорилирования с использованием в качестве донора фосфатной группы сравнительно дешевого неорганического пирофосфата [1]. Стоит отметить, что выходы нуклеозидмонофосфатов при использовании нативных НКФ крайне низкие из-за смещения равновесия реакции в сторону дефосфорилирования целевого продукта [1]. Из литературы известно, что равновесие реакции может сдвигаться в сторону образования нуклеозидмонофосфата путем изменения активного центра НКФ; например, для фермента Escherichia blattae к этому приводят аминокислотные замены 90, 92 и I171 [2–4]. Вышеуказанные исследования были посвящены получению инозин-5-монофосфата, монофосфорилирование других природных и модифицированных нуклеозидов не изучалось.

Цель исследования – конструирование генно-инженерного штамма Escherichia coli, продуцирующего гетерологичную мутантную НКФ Enterobacter aerogenes, и изучение возможности ее применения для ферментативного фосфорилирования фармацевтически важного нуклеозида 2-фтор-араА.

Материалы и методы исследования. Источником гена НКФ служила ДНК Enterobacter aerogenes. Ген был выделен и мутирован методом ПЦР с использованием Pfu-ДНК-полимеразы («Promega»,

США) и шести олигонуклеотидных праймеров:

phoc1 (5-ACCCAAAAAAACCCCCC-3);

phocR1 (5-CACgtcCCgaaCCAACACCAC-3);

phoc2 (5-CCACttcCgacCCAACCCCCA-3);

phocR2 (5-CCCAACCggtAAACCAA-3);

phoc3 (5-CCAACCCaccCAACCCC-3);

phocR3 (5-ACACCACCCCAAC-3) (Праймтех, Беларусь).

В 5-окончания фланкирующих ген праймеров были встроены сайты узнавания (выделены подчеркиванием) эндонуклеаз рестрикции NdeI (в праймер phoc1) и XhoI (в праймер phocR3).

Процедуру сайтспецифического мутагенеза осуществляли при помощи олигонуклеотидов phocR1, phoc2, phocR2, phoc3, в которых определенные кодоны были заменены на мутантные (выделены строчными буквами). Реакции амплификации осуществляли с помощью амплификатора PC-200 eneAmp PCR ystem («Bio-Rad», США). Амплификацию вели по следующей программе: начальная инкубация – 98 °С в течение 30 с, затем 22 цикла: плавление – 98 °С в течение 10 с, отжиг праймеров – 60 °С, 15 с, полимеризация – 72 °С, 1 мин; финальная элонгация – 72 °С, 3 мин. Продукты амплификации анализировали при помощи агарозного гель-электрофореза.

Синтезированный с помощью ПЦР продукт обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и XhoI («ermentas», Литва) и лигироваermentas»,», ли в вектор pE24b+ («Novagen», США), предварительно обработанный этими же рестриктазами.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5 («Novagen», США), полученные стандартным кальциевым методом [5], c последующим высевом на плотную селективную питательную среду B с добавлением канамицина (100 мкг/мл). Из пяти выросших одиночных колоний выделяли плазмиды, содержащие ген phoc в правильной ориентации. В результате была создана конструкция, обозначенная pE24Phoc.

Полученной плазмидой (pE24Phoc) трансформировали штамм Escherichia coli B21(E3) («Novagen», США). В результате был получен рекомбинантный штамм (названный Escherichia coli pwPhocEa), продуцирующий мНКФ Enterobacter aerogenes, несущую дополнительный гексагистидиновый олигопептид на С-конце молекулы белка. Клетки-трансформанты выращивали в среде B с добавлением канамицина (100 мкг/мл; pH 7,0) до оптической плотности 0,6 ( = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка 1 мМ изопропил--тиогалактопиранозидом (ИПТГ) и продолжали культивирование в течение 3 ч.

По окончании выращивания клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере, содержащем 50 ммоль NaH2P4, 300 ммоль NaCl и 20 ммоль имидазола (рН 8,0).

Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляли на приборе UDM-10 («echpan», Польша) в следующих условиях: мощность – 0,5 кВт, температура – 4 °С, в течение 5 мин. После центрифугирования образца при 20 000 g в течение 30 мин супернатант наносили на хроматографическую колонку со смолой Ni-NA («Qiagen», США). Белок элюировали буфером, содержащим 50 ммоль NaH2P4, 300 ммоль NaCl и 250 ммоль имидазола (рН 8,0), 0,1% riton -100. Полученные в результате аффинной хроматографии фракции анализировали с помощью ДСН-полиакриламидного гель-элетрофореза, и фракции, содержащие мНКФ, объединяли.

Полученный раствор фермента диализовали против 100-кратного объема 50 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 0,1% riton -100.

МНКФ в виде тел включения получали следующим образом:

осадок, полученный после центрифугирования при 20 000 g в течение 30 мин, ресуспендировали в 50 мл раствора, содержащего 1 М мочевину, 2% riton -100, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и умеренном перемешивании на магнитной мешалке. Далее тела включения снова осаждали центрифугированием при тех же условиях и процедуру промывки повторяли. После центрифугирования осадок промывали 50 мМ Naацетатным буфером (рН 5,0) и ресуспендировали в этом же буфере.

Активность мНКФ определяли по скорости фосфорилирования инозина. Реакционную смесь, содержащую 40 мМ инозин, 160 мМ пирофосфат натрия (рН 3,7) и фермент, инкубировали при 35 °С в течение 60 мин. Из образцов отбирали пробы и анализировали с помощью ионообменной ВЭЖХ на колонке K EAE-3W (7,5 150 мм). Элюцию соединений проводили градиентом буфера Б в буфере А (0100% за 10 мин, 10 мин буфер Б 100%); буфер А: 3 мМ КН2РО4, 3 мМ КСl, 0,03%-ный ацетон, рН 3,3; буфер Б: 300 мМ КН2РО4, 300 мМ КСl, рН 4,9. Активность фермента определяли на начальных стадиях реакции. За единицу активности фермента принимали такое количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль инозинмонофосфата (ИМФ) за 1 мин в советующих условиях реакции.

Результаты и их обсуждение. Клонирование, мутагенез phoc и экспрессия рекомбинантного белка. Ген phoc, кодирующий НКФ Enterobacter aerogenes, был сайтспецефически мутирован таким образом, чтобы в полипептидной цепи НКФ были произведены следующие замены: 90F, G92D и I171T. Полученный ген с мутациями был встроен в плазмиду рЕТ24b+ под контролем сильного Т7-промотора. К гену с 3-конца кодирующей цепи была введена дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая гистидиновый гексапептид, выполняющий роль аффинного домена. Полученной плазмидой трансформировали клетки Escherichia coli B21(E3). В результате впервые был создан штамм-продуцент мутантной рекомбинантной НКФ, молекула которой содержит дополнительный гистидиновый гексапептид. Новый штамм был назван Escherichia coli pPhocEa.

При экспрессии белка в полученном штамме с применением 1 мМ ИПТГ доля белка с молекулярной массой 27 кДа (что соответствует теоретически рассчитанной молекулярной массе мНКФ) составляет 35% от общего клеточного белка (по данным ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза).

Очистка мНКФ. На следующем этапе работы проводили очистку рекомбинантного фермента методом аффинной хроматографии на смоле Ni-NA. При этом следует подчеркнуть, что введение в рамку считывания гена phoc дополнительного олигонуклеотида, кодирующего гексапептид, позволило получить белковый препарат с чистотой более 95% (рис. 1). В результате с 1 л культуральной жидкости было получено 6 мг очищенного растворимого фермента с удельной активностью 14 ед/мг белка.

Полученное значение активности мНКФ Enterobacter aerogenes в реакции фосфосфорилирования в 10 раз превышает активности мНКФ, полученной из Escherichia blattae (1,39 ед/мг) [2]. ПоРис. 1. Электрофореграмма мНКФ Escherichia coli pPhocEa на разных стадиях очистки: 1 – препарат мНКФ, тела включения; 2 – клеточный лизат после 3 ч индукции; 3 – препарат мНКФ очищенный с помощью смолы Ni-NA;

4 – маркерные белки с известными молекулярными массами видимому, это связано с различными условиями определения активности белка. В литературе используют буфер с рН 5,0, в котором активность фермента значительно меньше, чем при рН 3,7 (использован в данной работе). Очищенный ферментный препарат использовали для изучения физико-химических свойств фермента и оптимизации условий протекания реакции.

Активность тел включения составила 2,2 ед/мг белка, а суммарный выход белка составил 484 ед с 1 л культуральной жидкости. Таким образом, выход растворимого белка составил меньше 15% от суммарного экспрессируемого белка по активности и 3% по массе. Как видно из данных табл. 1, удельная активность белка в телах включения меньше в 6,4 раза активности растворимого белка. Это можно объяснить как меньшей степенью очистки, так и измененной конформацией экспрессируемого белка, находящегося в виде тел включения [6]. В дальнейшем очищенные тела включения использовались как для изучения физико-химических свойств фермента, так и для изучения биотехнологических аспектов при синтезе 2-фтор-араАМФ.

Т а б л и ц а 1. Сравнение тел включения и растворимого белка мНКФ штамма Escherichia coli pPhocEa

–  –  –

Следует отметить, что получение белка в виде активных тел включения – процедура более простая и дешевая, чем использование одностадийной аффинной хроматографии. Более того, белок в виде тел включений легче отделить от реакционной смеси, что облегчает выделение конечного продукта и позволяет использовать фермент неоднократно.

Изучение влияния температуры и рН среды. При изучении влияния температуры и рН среды на активность мНКФ (как для растворимого белка, так и для белка в виде тел включения) показано, что оптимальным рН является 3,7, оптимальной температурой проведения реакции 35 °C, что полностью совпадает с данными литературы [1].

Изучение влияния концентрации неорганического пирофосфата на активность мНКФ и выход 2-фтор-араАМФ. Как видно из рис. 2, максимальная активность фермента при синтезе 2-фтор-араАМФ наблюдается при концентрации неорганического пирофосфата 160 ммоль и составляет 89% от активности этого фермента в реакции фосфорилирования инозина. Однако максимальный выход продукта (76% от взятого в реакцию 2-фтор-араА) достигается при концентрации пирофосфата 250 ммоль.

Изучение субстратной специфичности. При изучении субстратной специфичности полученного фермента в отношении акцептора фосфатной группы установлено, что лучшим субстратом для полученного мутантного белка является инозин.

Также вызывает интерес способность фермента вести реакцию фосфорилирования таких субстратов, как гуанозин, дезоксигуанозин, гуанозин-арабинозид (выходы целевых продуктов до 90%) и 2-фтор-араА с выходом до 76% (табл. 2).

Рис. 2.

Зависимость удельной активности мНКФ и выхода реакции синтеза 2-фтор-араАМФ от концентрации неорганического пирофосфата:

– относительная удельная активность мНКФ; – выход реакции

–  –  –

При изучении субстратной специфичности полученного фермента в отношении донора фосфатной группы установлено, что мНКФ может использовать такие дешевые источники фосфатной группы как неорганический пирофосфат полифосфат. Однако активность фермента в реакции с неорганическим пирофосфатом в 3 раза выше, чем с полифосфатом.

Заключение. В результате исследований получен генноинженерный штамм Escherichia coli pPhocEa, продуцирующий мНКФ с тремя аминокислотными заменами – A90F, G92D, I171T.

Установлено, что фермент продуцируется в основном в виде тел включения. Удельная активность растворимого белка составила 14 ед/мг. Впервые показано, что тела включения мНКФ обладают удельной активностью 2,2 ед/мг белка в реакции монофосфорилирования инозина. Изучена субстратная специфичность мНКФ и показано, что данный фермент способен фосфорилировать инозин, гуанозин, дезоксигуанозин и гуанозин-арабинозид с высокими (до 90%) выходами целевых продуктов. Оптимизированы условия получения 2-фтор-араАМФ. В результате выход целевого 2-фтор-араАМФ составил 76 моль% в расчете на внесенный в реакционную смесь 2-фтор-араА.

Литература

1. A new enzymatic method of selective phosphorilation of nucleosides / Y. Asano [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 1999. – Vol. 6. – P. 271–277.

2. Improving the pyrophosphate-inosine phosphotransferase activity of Escherichia blattae acid phosphatase by sequential site-directed mutagenesis / Y. Mihara [et al.] // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2004. – Vol. 68. – P. 1046–1050.

3. Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella organii / Y. Mihara [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66. – P. 2811–2816.

4. Enhancement of nucleoside phosphorylation activity in an acid phosphatase / K. Ishikawa [et al.] // Protein Engineering. – 2002. – Vol. 15. – P. 539–543.

5. Sabrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. ambrook, E. rittsch,. Maniatis. – 2nd ed. – New York: Cold pring Harbor aboratory Press, 1989. – P. 2222.

6. Bacterial inclusion bodies: making gold from waste / E. arcia-ruitos [et al.] // rends Biotechnol. – 2012. – Vol. 30, N 2. – P. 65–70.

–  –  –

CREATING OF RECOMBINANT STRAIN-SUPERPRODUCER OF

ENTEROBACTER AEROGENES MUTANT ACID PHOSPHATASE

Laboratory of nucleic copounds biotechnology Using methods of genetic engineering, Escherichia coli pPhocEa strain has been constructed. he strain produces mutant nonspecific acid phosphatase (mNAP) of Enterobacter aerogenes with three amino acid substitutions A90, 92 and I171. It has been shown that the protein is produced substantially in the form of inclusion bodies. In optimal synthesis conditions the activity of the inclusion bodies is 2.2 U/mg, that is 6.4-fold lower than the activity of soluble form of the mNAP.

he substrate specificity of the produced enzyme has been studied. he mNAP can phosphorylate inosine, guanosine, deoxyguanosine and guanosine arabinoside with more than 90% yield. Conditions for 2-fluoro-araAMP synthesis have been optimized. he phosphorylation of 2-fluoro-araA achieved 76%.

УДК 579.66+579.842.11

А. И. БЕРЕСНЕВ, С. В. KВАЧ, А. И. ЗИНЧЕНКО

СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА

ESCHERICHIA COLI, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО

ПУРИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗУ

KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы С помощью методики ПЦР проведено изолирование гена, кодирующего синтез пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФазы) Klebsiella pneumoniae. Осуществлено клонирование полученного гена в вектор pE24b+, а также отбор конструкции, содержащей ген ПНФазы под индуцибельным Т7-промотором в правильной ориентации. На основе штамма Escherichia coli B21(E3) созE3) E3) 3) дан генно-инженерный штамм-суперпродуцент ПНФазы (E. coli КНК-12/1).

Определена термостабильность рекомбинантной ПНФазы K. pneumoniae.

Проведена частичная очистка ПНфазы при помощью прогревания и сульфатаммонийного фракционирования клеточного лизата. С помощью ПНфазы проведен синтез 2,6-дихлорпурин-2-дезоксирибозида, являющегося промежуточным продуктом получения высокоэффективного противоопухолевого модифицированного нуклеозида 2-хлор-2-дезоксиаденозина.

Введение. В настоящее время значительное внимание уделяется использованию модифицированных нуклеозидов (МН) в биохимических, молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. На основе МН синтезировано большое количество соединений, обладающих высокой противоопухолевой и противовирусной активностью, и постоянно происходит совершенствование существующих и разработка новых методов получения высокоактивных представителей этого класса соединений [1, 2–4].

Основными методами для получения МН традиционно считаются химические. Однако на протяжении короткого промежутка времени опубликовано значительное количество статей, описывающих использование для получения МН биокатализаторов микроорганизмов [5, 6]. Подобный подход позволяет использовать ряд существенных преимуществ ферментативных реакций по сравнению с химическим синтезом (мягкие условия проведения процессов, стерео- и региоспецифичность, повышенный выход целевых продуктов). Однако необходимо указать на практическую невозможность, за редким исключением, получения МН с использованием только ферментов микроорганизмов, поскольку модификация углеводного участка или азотистого основания чаще всего может быть осуществлена только химически [7].

Главный этап ферментативного получения МН – реакция трансгликозилирования, основанная на присоединении активированного углеводного остатка к гетероциклическому азотистому основанию [8, 9].

Чаще всего в качестве ферментов, использующихся для биокаталитического синтеза МН, выступают нуклеозидфосфорилазы (НФ). Существует три вида НФ: уридинфосфорилаза (УРФаза), тимидинфосфорилаза (ТФаза), использующие в качестве субстратов пиримидиновые нуклеозиды, и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФаза), использующая в качестве своих субстратов природные пуриновые нуклеозиды и их модифицированные аналоги [10].

На современном этапе развития биотехнологии существует возможность значительного повышения эффективности биокаталитического синтеза целевых продуктов с использованием методологических подходов генной инженерии. В частности, для селекции микроорганизма по целевому признаку используют методику клонирования гена, непосредственно отвечающего за искомый признак, в вектор, который обеспечивает суперэкспрессию данного гена в штамме-реципиенте. Ранее в лаборатории биотехнологии соединений нуклеиновой природы был создан штамм E. coli БМ-Д6, экспрессирующий рекомбинантную гомологичную ПНФазу E. coli [11], и разработаны технологии ее применения для синтеза ряда фармацевтически важных нуклеозидов. Однако полученная ПНФаза не всегда позволяет вести реакцию трансгликозилирования с высоким конечными выходами продуктов. Например, выход реакции синтеза 2-хлор-2-дезоксиаденозина с применением ПНФазы E. coli не превышает 75 моль%. В настоящей работе с использованием методических подходов генетической инженерии предпринята попытка создания и характеристики новой гетерологичной ПНФазы K. pneumoniae, которая, по нашим предположениям, могла бы обладать улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с гомологичной ПНФазой E. coli. К тому же из литературы известно, что ПНФаза, выделенная из Klebsiella sp., обладает не только пурин-, но и пиримидиннуклеозидфосфорилазной активностью. Такое свойство позволило бы существенно расширить возможность применения этого фермента в биокаталитических синтезах МН.

Цель исследования – создание рекомбинантного штамма E. coli, экспрессирующего гетерологичную рекомбинантную ПНФазу K. pneuoniae; очистка фермента и изучение его каталитических свойств; осуществление ферментативного синтеза 2,6-дихлорпурин-2-дезоксирибозида (ДХПдР), являющегося промежу точным продуктом получения высокоэффективного противоопухолевого МН 2-хлор-2-дезоксиаденозина (ХДА).

Материалы и методы исследования. Объектами исследования были штамм E. coli DH5, необходимый для наработки и анализа сконструированного рекомбинантного вектора, и штамм E. coli B21(E3), который применялся для экспрессии генноинженерной ПНФазы.

Подбор праймеров для ПЦР проводили с использованием известных данных о первичной структуре гена ПНФазы. На 5-концах праймеров были встроены сайты рестрикции NdeI и SalI, дополненные шестью произвольными нуклеотидами.

Реакционная смесь каждой пробы для ПЦР включала следующие компоненты: буфер (67 ммоль Трис-HCl, рН 8,3, 17 ммоль (NH4)24, 3 ммоль MgCl2, 0,1% Твин-20, 0,12 мг/мл БСА, 8% глицерина), четыре природных дезоксинуклеозидтрифосфата (концентрация каждого 0,2 ммоль), по 10 пмоль каждого из праймеров (ACAAACAACAACCCCACAAACC и CA CCCACACACCCCACAACC), 150–200 нг ДНК K. pneumoniae и 1 ед. активности Pfu-полимеразы. Программа амплификации имела следующие параметры: 2 мин при 95 °С, (30 с при 94 °С, 30 с при 55 °С, 1 мин при 72 °С) – 25 циклов;

5 мин при 72 °С. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Соответствующий гену ПНФазы продукт выделяли и лигировали в вектор pE24b+, ранее рестрицированный по NdeI и SalI и дефосфорилированный щелочной фосфатазой.

Наработку бактериального штамма проводили при температуре 37 °С на среде uria–Bertani (B), содержащей 10 г/л трипBertani B), Bertani ), тона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлорида натрия, канамицина в концентрации 50 мкг/мл.

Клетки E. coli B21(E3) с плазмидами, содержащими гены ПНФаз, выращивали до оптической плотности 0,6 ( = 600), после чего осуществляли индукцию синтеза белка путем внесения в среду культивирования -D-лактозы до концентрации 0,4% и продолжали ферментацию бактерий в течение 4 ч.

После окончания культивирования клетки центрифугировали при 7000 g в течение 10 мин и ресуспендировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере.

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), проводили идентификацию белкового состава клеток с использованием 3%-ного концентрирующего и 10%-ного разделяющего гелей.

Анализируемый белковый препарат солюбилизировали добавлением буфера (в соотношении 1:1) следующего состава: 0,125 моль Трис-HCl (рН 6,8), 4% ДСН, 20% глицерина, 0,2 моль дитиотрейтола. Исследуемые образцы подвергали тепловой денатурации при 100 °С в течение 3 мин. По окончании электрофореза белки окрашивали при помощи Кумасси G-250.

Бактериальные клетки штамма E. coli B21(E3), содержаE3), E3), 3), щие ПНФазу K. pneuoniae, подвергали ультразвуковой дезинтеграции, после чего центрифугировали при 21 000 g в течение 20 мин. Полученный супернатант прогревали при 60 °С в течение 6 ч. Через 30 мин, 3 ч и 6 ч отбирались аликвоты исследуемого образца для последующего анализа удельной активности.

Очистку рекомбинантной ПНФазы K. pneuoniae проводили с помощью методики сульфат-аммонийного фракционирования.

Бактериальные клетки штамма E. coli B21(E3), содержащие ПНФазу K. pneumoniae, подвергали ультразвуковой дезинтеграции после чего центрифугировали при 21 000 g в течение 20 мин. К образовавшейся надосадочной жидкости добавляли сухой сульфат аммония до концентрации 20%, затем пробу инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре на магнитной мешалке и центрифугировали при 21 000 g в течение 20 мин. Супернатант прогревали при 60 °С в течение 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугировали при 21 000 g в течение 20 мин. В образовавшемся супернатанте доводили концентрацию сульфата аммония до 80%, суспензию инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего снова центрифугировали при 21 000 g в течение 20 мин. Надосадочную фракцию, содержащую частично очищенную ПНФазу K. pneumoniae, диализовали против 10 000-кратного объема 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,0.

Диализованную ПНФазу K. pneumoniae в 20 мМ калийфосфатном буфере рН 7,0 прогревали при 60 °С в течение 6 ч.

Через определенные временные промежутки отбирали аликвоты исследуемого образца для последующего анализа термостабильности биокатализатора.

Ферментативные активности ПНФаз определяли по скорости образования аденозина из аденина с использованием инозина в качестве донора углеводного остатка. Смесь, содержащую 100 мМ инозин, 50 мМ аденин, 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0 и определенное количество ферментного препарата, инкубировали при 60 °С в течение 20 мин. Из анализируемых проб через определенные промежутки времени с помощью микрокапилляра отбирали аликвоты (5 мкл) и наносили их на пластины для тонкослойной хроматографии ilufol-UV254. Хроматографическое разделение проводили в смеси растворителей изопропанол-хлороформ-29% аммиак (10:10:1; об/об). Расположение пятен субстрата и продукта на хроматографической пластине проводили в ультрафиолетовом свете. Идентифицированные пятна элюировали в 5 мл дистиллированной воды. Измерение ультрафиолетового поглощения растворов веществ в 10 мМ калий-фосфатном буфере измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны = 260 нм.

Единицей активности фермента считали такое его количество, которое способно образовать 1 мкмоль продукта за 1 мин при соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мг сухой биомассы клеток.

Реакционная смесь для синтеза ДХПдР состояла из 0,3 моль 2,6-дихлорпурина, 0,4 моль 2-дезокситимидина, 180 ммоль калий-фосфатного буфера, рН 7,0, 300 ед/мл уридинфосфорилазы и 400 ед/мл ПНФазы K. pneumoniae. Биокаталитический синтез вели при температуре 40 °С в течение 5 ч. Через определенные промежутки времени из смеси отбирали аликвоты объемом 100 мкл и вносили в 900 мкл дистиллированной воды, после чего из полученного разведенного раствора с помощью микрокапилляра отбирали аликвоты (5 мкл) и наносили на пластину для тонкослойной хроматографии ilufol-UV254. Хроматографическое разделение исследуемых образцов проводили в системе растворителей изопропанол-хлороформ-29% аммиак (10:10:1) и бутанол-29% аммиак (7:2,1; об/об). Идентифицированные пятна элюировали в 5 мл дистиллированной воды. Ультрафиолетовое поглощение растворов веществ в воде измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны = 265 нм (для ХДА) и = 275 нм (для 2,6-дихлорпурина и ДХПдР).

Для статистической обработки данных использовали методы, принятые в биологии. Большинство приведенных в работе экспериментальных данных представляют собой усредненные величины 3–5 опытов.

При более глубокой статистической обработке результатов рассчитывали доверительный интервал среднего арифметического для 95%-ного уровня вероятности. Разность двух средних величин считалась достоверной при отсутствии перекрывания их доверительных интервалов.

Для расчетов использовалась компьютерная программа tatgraphics.

Результаты и их обсуждение. Для выделения из геномной ДНК гена deoD, кодирующего ПНФазу K. pneumoniae, использовали методику ПЦР с применением высокоточной Pfu-полимеразы.

Полученный ген deoD встраивался в плазмиду pE24b+ под контролем сильного T7-промотора. В геном некоторых штаммов E. coli, одним из которых является E. coli B21(E3), с помощью бактериофага был внесен ген Т7-РНК-полимеразы. В своей структуре данный ген имеет индуцибельный Т7-промотор. Таким образом, синтез Т7-РНК-полимеразы можно индуцировать при помощи широко распространенного индуктора – -D-лактозы.

В штамм E. coli B21(E3) была введена генетическая конE3) E3) 3) струкция, несущая ген ПНФазы K. pneumoniae в правильной ориентации. Для экспрессии целевого белка проводили индукцию синтеза ПНФазы с использованием 0,4% --лактозы в течелактозы

-лактозы ние 4 ч. По завершении индукции измеряли активность экспрессированной ПНФазы, которая равнялась 290 ед/мг белка.

Измерение термостабильности ПНФазы K. pneumoniae проводили при 60 °С в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0. Аликвоты из исследуемого образца для последующего анализа удельной активности отбирались через 30 мин, 3 ч и 6 ч. Результаты эксперимента представлены на рис. 1. Из рис. 1 видно, что ПНФаза Рис. 1. Остаточная активность рекомбинантной ПНФазы K. pneumoniae K. pneumonia в течение 6 ч прогревания при 60 °С сохраняет 74% исходной удельной активности.

Основываясь на данных анализа термостабильности ПНФазы K. pneumoniae, предпринята попытка включения этапа термостатирования белкового образца, содержащего ПНФазу, в методику частичной очистки целевого белка с помощью сульфат-аммонийного фракционирования.

Для проведения качественного анализа белкового состава полученных сульфат-аммонийных фракций, использовали методику электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Результаты эксперимента представлены на рис. 2. Из результатов, отображенных на рис. 2, видно, что основное количество белка в конечной 80%-ной сульфат-аммонийной фракции представлено целевым белком. При этом показано, что на стадии прогревания исследуемого образца значительное количество побочных белков подвергается тепловой денатурации.

Рис. 2. Очистка ПНФазы K. pneumoniae: М – маркерные белки; 1 – лизат клеток E. coli, продуцирующих ПНФазу K. pneumoniae; 2 – супернатант 20%-ной сульфат-аммонийной фракции; 3 – осадок 20%-ной сульфат-аммонийной фракции; 4 – белковый осадок, образовавшийся после прогревания исследуемого образца при 60 °С; 5 – супернатант, образовавшийся после прогревания исследуемого образца при 60 °С; 6 – осадок 80%-ной сульфат-аммонийной фракции (целевой белок) Из таблицы видно, что в результате частичной очистки получен целевой биокатализатор со степенью очистки 1,5 и с сохранением 68% общей ферментативной активности.

Очистка ПНФазы K. pneumoniae

–  –  –

Полученный частично очищенный препарат ПНФазы характеризовали на наличие пиримидиннуклеозидфосфорилазной активности. В качестве исследуемых субстратов использовали уридин и 2-дезокситимидин. В результате проведенных экспериментов показано, что полученная ПНФаза K. pneumoniae не обладает субстратной специфичностью к указанным нуклеозидам.

Характеристику способности ПНФазы K. pneumoniae катализировать реакцию трансгликозилирования МН проводили, опираясь на данные, полученные в результате биокаталитического синтеза исследуемым ферментом ДХПдР. Данные эксперимента представлены на рис. 3.

Из рис. 3 видно, что при описанных условиях максимальное накопление целевого продукта в реакционной смеси, содержащей ПНФазу K. pneumoniae, достигается к 5 ч протекания реакции (75% из расчета на 2,6-дихлорпурин).

Заключение. Таким образом, проведена амплификация гена, кодирующего ПНФазу, из геномной ДНК K. pneumoniae с использованием высокоточной Pfu-полимеразы. Выделенный ген клонирован в плазмиде pE24b+. В результате получен новый штамм E. coli, являющийся суперпродуцентом ПНФазы K. pneumoniae.

Рис. 3. Динамика накопления ДХПдР в реакционной смеси Показано, что в результате прогревания рекомбинантной ПНФазы при 60 °С в течение 6 ч фермент сохраняет 74% исходной удельной активности. При помощи методики сульфат-аммонийного фракционирования с использованием предварительного прогревания белкового образца проведена частичная очистка ПНФазы K. pneumoniae, в результате которой получен фермент со степенью очистки 1,5. Доказано отсутствие пиримидиннуклеозидфосфорилазной активности рекомбинантной ПНФазы. Способность частично очищенной ПНФазы K. pneumoniae катализировать реакцию трансгликозилирования МН продемонстрирована на примере ферментативного синтеза ДХПдР. Максимальный выход целевого продукта в реакционной смеси, составляющий 75%, достигнут через 5 ч протекания реакции.

Литература

1. Krenitsky, T. A. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase /. A. Krenitsky,. W. Koszalka, J. V. uttle // Biochemistry. 1981. Vol. 20, N 12. P. 36153621.

2. Lehikoinen, P. K. Investigation of -deuterium kinetic isotope effects on the purine nucleoside phosphorylase reaction by the equilibrium-perturbation technique / P. K. ehikoinen, M.. innolt,. A. Krenitsky // Biochem. J. 1989.

Vol. 257, N 2. P. 355359.

3. Li, L. Y. Endonuclease is an apoptotic Nase when released from mitochondria /. Y. i,. uo,. Wang // Nature. 2001. Vol. 412, N 6842.

P. 9599.

4. A new synthesis of purine arabinosides by a combination of chemical and enzymatic reaction / H. Morisava [et al.] // Agric. Biol. Chem. 1985. Vol. 49, N 9. P. 27112717.

5. Biocatalytic transformation of nucleoside derivatives / N. i [et al.] // Biotech. Adv. – 2010. – Vol. 28. – P. 348–366.

6. tructural basis for substrate specificity of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase / E. M. Bennett [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, N 47. – P. 47110–47118.

7. Mikhailopulo, I. A. New trends in nucleoside biotechnology / I. A. Mikhailopulo, A. I. Miroshnikov // Acta Natur. – 2010. Vol. 2, N 2. – С. 3658.

8. ynthesis of 2-chloro-2-deoxyadenosine by microbiological transglycosylation using a recombinant Escherichia coli strain /. A. aran [et al.] // Appl. Biochem.

Microb. – 2008. – Vol. 44. – P. 162–166.

9. Enzymatic synthesis of 2-deoxyadenosine and 6-methylpurine-2deoxyriboside by Escherichia coli H5 overexpressing nucleoside phosphorylases from Escherichia coli B21 /. iang [et al.] // J. Biosci. Bioeng. – 2010. – Vol. 110. – P. 165–168.

10. Mikhailopulo, I. A. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application / I. A. Mikhailopulo, A. I. Miroshnikov // Mendeleev Commun. – 2011. – Vol. 21. – P. 57–68.

11. Суперпродукция пуриннуклеозидфосфорилазы Escherichia coli в pE/Bl21 системе / С. В. Квач [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. – Минск, 2007. – Т. 1. – С. 117124.

12. Ling, F. Purification and characterization of a novel nucleoside phosphorylase from a Klebsiella sp. and its use in the enzymatic production of adenine arabinoside /. ing, Y. Inoue, A. Kimura // Appl. Env. Microb. – 1990. – Vol. 56, N 12. – P. 3830– 3834.

–  –  –

Laboratory of nucleic copounds biotechnology Using PCR techniques isolation of gene encoding of purine nucleoside phosphorylasy (PNPase) Klebsiella pneuoniae has been performed. Cloning of the obtained gene into the vector pE24b+, and selection of structure that contains PNPase gene under the inducible 7-promoter in the correct orientation has been carried out. Based on the strain of E. coli B21 (E3), PNPase producing strain has been created. he thermal stability of recombinant PNPase K. pneuoniae has been determined. PNPase partial purification using the method of ammonium sulfate fractionation has been done 2,6-diclorpurine-2-deoxyriboside synthesis with PNPase K. pneuoniae has been implemented.

УДК 579.6:577.15:577.113.3:579.842.11

Д. В. БУРКО, С. В. КВАЧ, А. И. ЗИНЧЕНКО

СОЗДАНИЕ ШТАММА ESCHERICHIA COLI –

ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОЙ

ЛИЗИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS

И ПРИМЕНЕНИЕ ЕЕ ДЛЯ СИНТЕЗА

ДИАДЕНОЗИНТЕТРАФОСФАТА

Лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы Сконструирован новый рекомбинантный штамм Escherichia coli pth2 – продуцент гетерологичной лизил-тРНК-синтетазы Therus thermophilus. Количество белка, продуцируемое клетками этого штамма, выраженное в мг лизил-тРНКсинтетазы /л культуральной жидкости (25 мг/л), в 2,5 раза превосходит соответствующий показатель лучшего из известных штаммов-продуцентов (E. coli JM101R(p28)). В структуре данного белка имеется дополнительный гистидиноR(p28)).

R(p28)).

(p28)).

p28)).

28)).

вый олигопептид, позволяющий проводить одноэтапную очистку фермента на аффинной смоле Ni-NA-агарозе с 46%-ным выходом. Впервые показано, что лизил-тРНК-синтетаза T. thermophilus способна катализировать синтез диаденозинтетрафосфата при 60 °С c выходом целевого продукта 49,8%.

Введение. Диаденозинполифосфаты – широко распространенные у про- и эукариот соединения, молекулы которых состоят из двух остатков аденозина, соединенных фосфатным мостиком из 2–6 остатков фосфорной кислоты. Эти вещества выполняют широкий спектр регуляторных функций как на клеточном [1–4], так и на организменном уровне [5–8]. Было замечено, что в условиях стресса они выступают в роли сигнальных молекул и способствуют формированию ответа клетки на стресс. За это свойство динуклеотиды называют «алармонами» (alarmones). Одним из наиболее важных и изученных алармонов, вызывающих не только фундаментальный, но и прикладной интерес, является диаденозин-5,5-P1, P4тетрафосфат (Ар4А) [9]. Установлено, что данное соединение способно влиять на тонус сосудов [10], агрегацию тромбоцитов [11], выделение инсулина -клетками поджелудочной железы [12], передачу нервного импульса [13] и т. д. Таким образом, благодаря своим биологическим свойствам Ар4А является перспективной субстанцией ряда фармакологических препаратов, которые при решении проблемы доступности этого динуклеотида могут быть использованы для терапии ишемии миокарда, сахарного диабета, глаукомы, болезни Паркинсона, артериальной гипертензии, токсикоза второй половины беременности и других заболеваний.

Получить Ар4А можно как химически [14, 15], так и биокаталитически с использованием различных ферментов, таких как, например, аминоацил-тРНК-синтетазы, ацетил-СоА-синтетазы, Т4-ДНК-лигазы, Т4-РНК-лигазы и др. [16–18]. Химический синтез динуклеотида неэффективен, поскольку выходы конечного продукта не превышают 25%. Использование бактериальных ферментов для синтеза Ар4А позволяет значительно повысить выход целевого продукта.

Ранее нами были созданы штаммы E. coli lysU2 и E. coli ysU-12 – продуценты гомологичной немодифицированной и модифицированной лизил-тРНК-синтетазы соответственно [19, 20], а также штамм E. coli ppa8 – продуцент гомологичной неорганической пирофосфатазы, дополнительного фермента, необходимого при синтезе Ар4А с помощью лизил-тРНК-синтетаз [21]. Очищенные рекомбинантные лизил-тРНК-синтетазы и неорганическая пирофосфатаза использованы для синтеза Ар4А. Выход реакции синтеза динуклеотида составил не менее 95% [19–21].

Интересным и развивающимся направлением в биотехнологии является использование ферментов термофильных микроорганизмов, которые обладают рядом преимуществ перед ферментами мезофильных микроорганизмов, а именно, способностью вести катализ при более высоких температурах с более высокой скоростью.

Кроме того, ферменты термофильных организмов стабильны при длительном хранении при температуре окружающей среды и устойчивы к действию органических растворителей. Также благодаря свойству термостабильности такие ферменты можно частично очистить из белковой смеси прогреванием [22].

Цель исследования – создание рекомбинантного штамма E. coli – продуцента гетерологичной лизил-тРНК-синтетазы термофильной бактерии T. thermophilus и изучение возможности применения выделенного термостабильного фермента для реакции синтеза Ар4А.

Объекты и методы исследования. Клетки Т. thermophilus культивировали в течение 24 ч при 65 °С в среде Т74 следующего состава: 0,4% дрожжевой экстракт, 0,2% NaCl, 0,8% полипептон.

Выделение геномной ДНК проводили с помощью фенол-хлороформного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона [23]. Ген lysS T. thermophilus синтезировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя o-aq-полимеразу (Promega, США) и синтетические олигонуклеотидные праймеPromega,, ры: 5-AAAGATCT AACACCAACCCCCACCCC-3 и 5-AGAATTC AACCCCCCCACCCC-3. Продукты амплификации разделяли электрофоретическим методом в 1%-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену lysS T. thermophilus, выделяли и лигировали в вектор pRsetB (Invitrogen, США), реInvitrogen,, стрицированный по BaHI- и EcoRI-сайтам и обработанный щелочной фосфатазой.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli DH5, полученные стандартным кальциевым методом [23], c последующим высевом на плотную селективную питательную среду uria–Bertani (B), содержащую 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl и ампициллин в концентрации 150 мкг/мл. Из пяти выросших одиночных колоний выделяли плазмиды, содержащие ген lysS T. thermophilus в правильной ориентации. В результате была получена плазмида, названная pRsetBysRHis. Путем последующей трансформации плазмидой pRsetBysRHis клеток E. coli B21(E3) (Novagen, США) был получен рекомбинантный штамм E. сoli pth2.

Клетки E. сoli pth2 выращивали в селективной B-среде до достижения культурой оптической плотности 0,6 ( = 600 нм);

затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопропил---тиогалактопиранозида (ИПТГ) (1 мМ) и продолжали культивирование в течение 5 ч. По окончании выращивания клетки осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 10 мин.

Осадок клеток ресуспендировали в буфере А, содержащем 50 ммоль NaH 2P4, 300 ммоль NaCl и 10 ммоль имидазола (рН 8,0). Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляли на приборе «onifier 250/450» (Branson, США) при мощности 40–50 Вт (180 импульсов по 0,5 с). После центрифугирования образца при 20 000 g в течение 30 мин супернатант наносили на хроматографическую колонку (l–5 см, d = 1 см) со смолой Ni-NA-агарозой (Qiagen, США). Белок элюировали буфером Б, содержащим 50 ммоль NaH 2P4, 300 ммоль NaCl и 250 ммоль имидазола (рН 8,0). Полу ченные в результате аффинной хроматографии белковые фрак ции анализировали с помощью

-полиакриламидного гель-электрофореза [24], и фракции, содержащие лизил-тРНК-синтетазу T. therophilus (ysRHis), объединяли и подвергали диализу против 1000-кратного объема 20 мМ Трис-HCl-буфера (рН 7,5), содержащего 10% глицерина и 0,2 ммоль ЭДТА.

Ферментативную активность ysRHis T. thermophilus анализировали по скорости реакции превращения AP в Ар4А.

Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержала 20 ммоль Трис-HCl (рН 7,5), 4 ммоль хлорида магния, 150 ммоль хлорида натрия, 160 мкмоль сульфата цинка, 4,3 ммоль АТР, 2,4 ммоль

-лизина и 0,5 ед. пирофосфатазы [21]. Смесь инкубировали при 60 оС при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии в системе растворителей: диоксан – вода – 25%-ный водный аммиак (6:4:1, об/об). Вещества на пластинах обнаруживали в УФ-свете и идентифицировали сравнением с образцами-свидетелями.

Пятна, соответствующие AP и Ap4A, экстрагировали в 3 мл 10 мМ Трис-HCl, их концентрации определяли спектрофотометриHCl,, чески с использованием известных коэффициентов молярной экстинкции ( = 260 нм, = 15 400 моль–1 см–1 и = 30 800 моль–1 см–1 для AP и Ap4A соответственно). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обеспечивало образование Ap4A в количестве 1 нмоль за 1 мин в соответствующих условиях реакции.

Результаты и их обсуждение.

Создание рекомбинантного штамма E. coli – продуцента гетерологичной лизил-тРНК-синтетазы T. thermophilus. На первом этапе работы нами был получен новый рекомбинантный штамм E. coli pth2 – продуцент гетерологичной термостабильной ysRHis. Для этого был использован вектор pRsetB, в котором встроенный ген находится под контролем сильного Т7-промотора и на N-конце несет дополнительную нуклеотидную последоваконце тельность, кодирующую гистидиновый гексапептид, необходимый для металло-аффинной очистки экспрессируемого белка.

Для анализа уровня экспрессии ysRHis в штамме E. coli pth2 была проведена индукция синтеза фермента. Выращивание рекомбинантного штамма осуществляли в среде B. Синтез белка индуцировали 1 мМ ИПТГ при достижении растущей культурой клеток оптической плотности 0,6 ( = 600 нм). Индукция длилась в течение 5 ч. По окончании культивирования проводили анализ белкового состава индуцированных клеток с помощью ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза, результаты которого изображены на рис. 1.

Из рис. 1 видно, что молекулярная масса одной субъединицы ysRHis составляет приблизительно 63 кДа, что согласуется с литературными данными [25]. Также из рис. 1 видно, что количество ysRHis составляет приблизительно 25% от суммарного количества водорастворимых клеточных белков.

Для сравнения полученного рекомбинантного штамма E. coli pth2 с лучшим из известных штаммов-проду- Рис. 1. Электрофореграмма центов был выбран следующий пара- белкового состава лизата клеметр – количество термостабильной ток E. coli pth2 при индуклизил-тРНК-синтетазы T. thermophilus, ции синтеза фермента 1 мМ ИПТГ (М – положение и молекоторое обнаруживается в 1 л культу- кулярные массы стандартных ральной жидкости (КЖ) (табл. 1). Этот белков) параметр выбран по причине того, что ферменты, изолированные из известных штаммов-продуцентов, ранее в реакции синтеза Ар4А не изучались.

Т а б л и ц а 1. Способность рекомбинантных штаммов E.

сoli продуцировать лизил-тРНК-синтетазу T. thermophilus

–  –  –

Как следует из табл. 1, полученный в настоящей работе рекомбинантный штамм E. coli pth2 продуцирует термофильную лизил-тРНК-синтетазу в 2,5 раз эффективнее, чем лучший из описанных в литературе штамм E. coli JM101TR(p28) [25].

Выделение и очистка LysRSHis T. thermophilus. Следующий этап работы был посвящен очистке рекомбинантного фермента ysRHis, содержащего гексагистиновый олигопептид, с использованием аффинной хроматографии на смоле Ni-NA-агарозе. Такая модификация белка позволяет облегчить процедуру его выделения и широко применяется при очистке различных белков [26].

Модификация гена lysS T. thermophilus позволила нам получить высокоочищенный препарат белка с выходом около 46%.

В частности, был получен препарат, представляющий собой раствор, содержащий 16,5 мг ysRHis. Выделение фермента было проведено со степенью очистки 5,5 из лизата, содержащего 196,8 мг суммарного клеточного белка (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Выделение и очистка LysRSHis

–  –  –

Ультразвуковая дезинтеграция клеток 196,8 ± 9,5 0,37 1,9 ± 0, 1 1,0 100 Хроматография на смоле Ni-NA-агарозе 16,5 ± 0,9 0,17 10,5 ± 0,2 5,5 46 Следует особо отметить, что такое высокое значение коэффициента очистки обусловлено, по-видимому, заниженной активностью ysRHis в неочищенном лизате из-за присутствия в нем интерферирующих и ингибирующих агентов [27, 28].

Синтез Ар4А. Интерес к ysRHis как биокатализатору реакции синтеза Ар4А был обусловлен двумя обстоятельствами. Вопервых, этот фермент ранее в реакции синтеза динуклеотида еще не изучался, а во-вторых, как уже было упомянуто выше, было сделано предположение о том, что фермент термофильного организма будет характеризоваться способностью вести реакцию синтеза Ар4А при повышенной температуре с высокой скоростью.

Однако, как видно из рис. 2, выход целевого продукта при его синтезе с помощью ysRHis при 60 °С достигает только 49,8% за сутки проведения реакции. Таким образом, по эффективности синтеза Ар 4А ysRHis существенно проигрывает гомологичной индуцибельной лизил-тРНК-синтетазе E. coli [19, 20], применение которой повышает выход целевого продукта до 94–95% за 1,5 ч проведения реакции. По-видимому, это связано со следующим обстоятельством. В геноме E. coli имеется ген lysS, кодирующий конститутивную изоформу лизилРис. 2. Зависимость выхода Ар4А (в расчете на исходный АТР) от времени реакции тРНК-синтезы (ys), основной функцией которой является аминоацилирование тРНК ys, и ген lysU, кодирующий индуцибельную изоформу лизил-тРНК-синтезы (ysU), основная функция которой – синтез различных динуклеозидполифосфатов, в том числе Ар4А. В геноме же T. thermophilus не обнаружено генов, кодирующих какую-либо иную изоформу лизил-тРНК-синтетазы, кроме конститутивно экспрессируемой. Основная функция термостабильной лизил-тРНК-синтетазы T. therophilus – аминоацилирование тРНК ys. В настоящем исследовании мы установили, что этот фермент обладает также слабой Ар4А-синтезирующей активностью, что, по-видимому, является дополнительным его свойством.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что лизил-тРНК-синтетаза термофильной бактерии T. thermophilus способна осуществлять синтез Ар4А, однако использование данного фермента носит исключительно фундаментальный интерес.

Заключение. Таким образом, в результате настоящего исследования сконструирован новый рекомбинантный штамм E. coli pth2 – продуцент гетерологичной лизил-тРНК-синтетазы T. thermophilus. Продуцирующая способность клеток этого штамма, выраженная в мг лизил-тРНК-синтетазы/л КЖ (25 мг/л), в 2,5 раза превосходит соответствующий показатель лучшего из известных штаммов-продуцентов (E. coli JM101R(p28)). В структуре данноR(p28)).

R(p28)).

(p28)).

p28)).

28)).

го белка имеется дополнительный гистидиновый олигопептид, позволяющий проводить одноэтапную очистку фермента на аффинной смоле Ni-NA-агарозе с 46%-ным выходом. Впервые покаNA-агарозе NA-агарозе

-агарозе зано, что лизил-тРНК-синтетаза T. thermophilus способна катализировать синтез Ар4А при 60 °С c выходом целевого продукта 49,8%.

Литература

1. Grut, F. iadenosine 5,5-P1, P4-tetraphosphate triggers initiation of in vitro NA replication in baby hamster kidney cells /. rummt // Proc. Natl. Acad.

ci. UA. – 1978. – Vol. 75, N 1. – Р. 371–375.

2. iadenosine 5,5-P1, P4-tetraphosphate (Ap4A) controls the timing of cell division in Escherichia coli / A. Nishimura [et al.] // enes Cells. – 1997. – Vol. 2. – P. 401–413.

3. Vartanian, A. A. he involvement of diadenosine 5,5-P1, P4 -tetraphosphate in cell cycle arrest and regulation of apoptosis / A. A. Vartanian, H. uzuki, A. I. Poletaev // Biochem. Pharmacol. – 2003. – Vol. 65. – P. 227–235.

4. iadenosine oligophosphates (Apn A), a novel class of signaling molecules? /.. Kisselev [et al.] // EB ett. – 1998. – Vol. 427, N 2. – P. 157–163.

5. Baxi, M. D. iadenosine polyphosphates: their biological and pharmacological significance / M.. Baxi, J. K. Vishwanatha // J. Pharmacol. oxic. – 1995. – Vol. 33, N 3. – P. 121–128.

6. Identification and characterization of P(1), P(7)-i(adenosine-5)-heptaphosphate from human platelets / J. Jankowski [et al.] // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274, N 34. – P. 23926–23931.

7. ubcellular distribution studies of diadenosine polyphosphates – Ap4A and Ap5A – in Bovine Adrenal Medulla: Presence in Chromaffin ranules / A. R. Castillo [et al.] // J. Neurochem. – 1988. – Vol. 51, N 6. – P. 1696–1703.

8. Presence of dinucleotide and AP receptors in human cerebrocortical synaptic terminals / J. Pintor [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 1999. – Vol. 366, N 2/3. – P. 159–165.

9. Characterization of stress protein ys U. Enzymic synthesis of diadenosine 5,5-P1, P4 -tetraphosphate (Ap4A) analogues by ys U / M. heoclitou [et al.] // J. Chem. oc. – 1996. – Vol. 1. – Р. 2009–2019.

10. iadenosine polyphosphates are selective vasoconstrictors in human coronary artery bypass grafts / A. R. Conant [et al.] // Vascular Pharmacology. – 2008. – Vol. 48, N 4/6. – P. 157–164.

11. Analogues of diadenosine 5,5-P1, P4 -tetraphosphate (Ap4A) as potential anti-platelet-aggregation agents / P. C. Zamecnik [et al.] // Proc. Natl. Acad. ci.

UA. – 1992. – Vol. 89, N 6. – P. 2370–2373.

12. iadenosine polyphosphates. A novel class of glucose-induced intracellular messengers in the pancreatic beta-cell / C. Ripoll [et al.] // iabetes. – 1996. – Vol. 45. – P. 1431–1434.

13. iadenosine polyphosphate receptors from rat and guinea-pig brain to human nervous system / J. Pintor [et al.] // Pharmacol. her. – 2000. – Vol. 87. – P. 103–115.

14. Reiss, J. ismutation reactions of nucleoside polyphosphates. he synthesis of alpha, omega-dinucleoside 5-polyphosphates / J. Reiss, J. Moffat // J. rg. Chem. – 1965. – Vol. 30, N 10. – Р. 3381–3387.

15. ynthetic inhibitors of adenylate kinases in the assays for APases and phosphokinases / P. eldhau [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1975. – Vol. 57, N 1. – P. 197–204.

16. Fraga, H. Enzymatic synthesis of mono and dinucleoside polyphosphates / H. raga, R. ontes // Biochim. Biophys. Acta. – 2011. – Vol. 1810, N 12. – P. 1195–1204.

17. 4 RNA ligase catalyzes the synthesis of dinucleoside polyphosphates / E. A. Atencia [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1999. – Vol. 261, N 3. – P. 802–811.

18. Guranowski, A. pecific and nonspecific enzymes involved in the catabolism of mononucleoside and dinucleoside polyphosphates / A. uranowski // Pharmacol. her. – 2000. – Vol. 87, N 2/3. – P. 117–139.

19. Квач, С. В. Повышение уровня экспрессии гена lysU Escherichia coli путем создания генно-инженерного штамма-суперпродуцента лизил-тРНК-синтетазы / С. В. Квач, Д. В. Бурко // Молодежь в науке-2006. Прилож. к журн. «Весцi Нац.

акад. навук Беларусi». – Ч. 1. – Минск: Беларус. навука, 2006. – С. 82–84.

20. Бурко, Д. В. Биокаталитический синтез диаденозин-тетрафосфата с использованием генно-инженерных лизил-тРНК-синтетазы и пирофосфатазы / Д. В. Бурко, С. В. Квач // Молодежь в науке-2007. Прилож. к журн. «Весцi Нац.

акад. навук Беларусi». – Ч. 1. – Минск: Беларус. навука, 2008. – С. 46–51.

21. Бурко, Д. В. Получение и очистка генно-инженерной неорганической пирофосфатазы Escherichia coli / Д. В. Бурко, С. В. Квач, А. И. Зинченко // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. науч. конф., Минск, 2–6 июня 2008 г. – Минск, 2008. – Т. 1 – С. 296–298.

22. Haki, G. D. evelopments in industrially important termostable enzymes: a review /.. Haki,. K. Rakshit // Bioresour. echnol. – 2003. – Vol. 89, N 1. – P. 17–34.

23. Sabrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. ambrook, E. rittsch,. Maniatis. – 2nd ed. – New York: Cold pring Harbor aboratory Press, 1989. – 2222 p.

24. Laeli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage 4 / U. K. aemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, N 259. – P. 680–685

25. Properties of the lysyl-tRNA synthetase gene and product from the extreme thermophile hermus thermophilus / J. Chen [et al.] // J. Bacteriol. – 1994. – Vol. 176, N 9. – Р. 2699–2705.

26. enetic аpproach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent / E. Hochuli [et al.] // Nat. Biotechnol. – 1988. – Vol. 6, N 11. – Р. 1321–1325.

27. Hydrolysis of diadenosine polyphosphates by nucleotide pyrophosphatases / phosphodiesterases / P. Vollmayer [et al.] // Eur. J. Biochem. – 2003. – Vol. 270, N 14. – P. 2971–2978.

28. Hydrolysis of diadenosine polyphosphates by nucleotide pyrophosphatases/ phosphodiesterases / A. Vartanian [et al.] // EB ett. – 1999. – Vol. 456, N 1. – P. 175–180.

D. V. BURKO, S. V. KVACH, A. I. ZINCHENKO

CREATION OF ESCHERICHIA COLI STRAIN PRODUCING

RECOMBINANT THERMUS THERMOPHILUS LYZYL-TRNASYNTHETASE AND ITS APPLICATION FOR DIADENOSINE

TETRAPHOSPHATE SYNTHESIS

Laboratory of nucleic copounds biotechnology A new recombinant strain of E. coli pth2, producer of heterological T. therophilus lysyl-tRNA synthetase has been constructed. he amount of the protein produced by cells of the strain (mg of lysyl-tRNA-synthetase per of culture liquid) is 2.5-fold higher than the same parameter of best of the known strainsproducer (E. coli JM101R(p28)). he protein has N-terminal fusion polyhistidine peptide, that allows simple purification by metal affinity chromatography with 46% yield. It is shown for the first time that lysyl-tRNA synthetase T. therophilus is able to catalyze the Ap4A synthesis at 60 °C with 49.8% the desired product yield.

УДК 579.66:577.113.3:577.15

А. С. КОРОВАШКИНА, С. В. КВАЧ, А. И. ЗИНЧЕНКО

СОЗДАНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

РЕКОМБИНАНТНОЙ ДИГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ

THERMOTOGA MARITIMA

Лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы С помощью методов генной инженерии созданы два штамма-продуцента полноразмерной рекомбинантной дигуанилатциклазы Therotoga maritima с нативным и мутантным аллостерическим центром – Escherichia coli pmadgc-w7 и E. coli pmadgc соответственно. Установлено, что целевые ферменты нарабатываются преимущественно в форме активных тел включения. Показано, что полноразмерная ДГЦ T. maritima с мутацией R158A в аллостерическом центре обладает активностью, в 7 раз превышающей активность фермента дикого типа. Впервые показана возможность синтеза препаративных количеств цикло-диГМФ с использованием дигуанилатциклазы, находящейся в форме тел включения.

Введение. Дигуанилатциклазы (ДГЦ) – семейство бактериальных ферментов, катализирующих синтез циклического 3,5-дигуанилата (цикло-диГМФ) из двух молекул гуанозин-5трифосфата (ГТФ). ДГЦ обнаружены у всех бактерий, включая представителей таких порядков, как Therotogales и Aquicales, но не встречаются среди белков, синтезируемых представителями, относящимися к надцарствам Archaea и Eukarya [1].

Продукт реакции, катализируемой ДГЦ, – цикло-диГМФ – является бактериальным внутриклеточным вторичным посредником, участвующим в регуляции таких процессов, как образование биопленок, подвижность, адгезия, синтез экзополисахаридов, вирулентность и др. [2].

Открытие иммуностимулирующих свойств цикло-диГМФ привело к увеличению числа исследований, направленных на изучение возможности применения данного соединения в качестве терапевтического средства и адъюванта для вакцин [3].

В связи с этим необходима разработка простого и экономически выгодного способа получения препаративных количеств данного циклического динуклеотида.

В настоящее время цикло-диГМФ получают главным образом методом сложного многостадийного химического синтеза, который предусматривает использование дорогостоящих реагентов и характеризуется малым выходом целевого продукта.

Альтернативный способ получения цикло-диГМФ – ферментативный синтез с применением ДГЦ. Однако такой способ производства также не позволяет достигать высокого выхода данного циклического динуклеотида вследствие ингибирования фермента конечным продуктом реакции. Для повышения выхода целевого продукта в литературе предложено использовать ферменты с мутантным аллостерическим центром.

Описаны способы получения препаративных количеств циклодиГМФ с использованием мутантной ДГЦ Gluconacetobacter xylinu [4], фермента Escherichia coli дикого типа [2] и фрагмента ДГЦ Therotoga maritima с мутацией в аллостерическом центре [5]. Их недостатками являются невысокий выход растворимой формы белка (10–15 мг/л культуральной жидкости) и необходимость проведения трудоемкой процедуры рефолдинга. Кроме того, мезофильные ферменты G. xylinu и E. coli быстро теряют свою активность при температурах выше 30 °С, что требует их дробного внесения в реакционную смесь при проведении длительных процессов.

Полноразмерная ДГЦ T. maritima (№ M1788, enBank) состоит из двух доменов – каталитического E-домена и гидродомена фобного домена с неизвестной функцией [5]. Из литературы известно, что для проявления ферментативной активности необходимо образование димера ДГЦ [6]. Ранее использованный фрагмент ДГЦ T. maritima, состоящий только из каталитического домена, в реакционной смеси находится в форме мономера, и синтез цикло-диГМФ происходит путем образования нестабильных димерных комплексов.

Мы предположили, что использование полноразмерной ДГЦ T. maritima, состоящей из каталитического и гидрофобного домена, позволит повысить скорость протекания реакции за счет образования стабильных димерных комплексов ДГЦ.

Цель исследования – создание и характеристика штаммовпродуцентов полноразмерной ДГЦ T. maritima, в том числе с мутантным аллостерическим центром, и изучение возможности применения таких ферментов для синтеза цикло-диГМФ.

Объекты и методы исследования. Источником структурного гена TM1788, кодирующего аминокислотную последовательность ДГЦ, служила хромосомная ДНК штамма бактерий T. maritima. Ген TM1788 выделяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием «Phusion High-idelity» ДНКполимеразы («ermentas», Литва) и синтетических олигонуклеоermentas», », тидных праймеров: gcfull 5-ACATATGAAACC GGGGGGAAGT-3 и gcfullR 5-ACACTCGAGAAACAAAAACAC-3. В 5-окончания праймеров встроены сайты узнавания (выделены курсивом) рестрицирующих эндонуклеаз NdeI (gcfull) и XhoI (gcfullR).

Направленный мутагенез аллостерического центра ДГЦ проводили методом мегапраймеров с использованием пары синтетических олигонуклеотидов: R-f 5- ACAGCAAAACAC-3 и R-r 5-ACCCTGCAACCCCCAAACC-3 (мутация выделена полужирным шрифтом) [7]. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Фрагмент, соответствующий гену TM1788, выделяли из геля с использованием набора реактивов «MinElute el Extraction Kit» («Qiagen», Германия) и после инкубирования со смесью эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI («Promega», США) лигировали в вектор pE24b+ («Novagen», США), предNovagen», », варительно обработанный этими же рестриктазами.

В результате были получены плазмиды: pEdgc-w7, несущая ген полноразмерной ДГЦ T. maritima дикого типа, и pEdgcR158A, несущая ген TM1788 с мутацией R158A. Путем последующей трансформации полученными плазмидами клеток E. coli B21(E3) («Novagen», США) были получены рекомбинантные штаммы E. coli pmadgc-w7 и E. coli pmadgc – продуценты ДГЦ T. aritia дикого (ДГЦW) и мутантного (ДГЦR158A) типа соответственно.

Клетки-трансформанты культивировали в течение 12–14 ч на термостатированной биологической качалке с частотой колебания платформы 170–190 об/мин при 37 °С в колбах Эрленмейера объемом 2 л с 0,5 л питательной среды, содержащей 1,0%-ный триптон; 0,5%-ный дрожжевой экстракт; 0,5%-ный глицерин;

0,05%-ную глюкозу; 0,2%-ную --лактозу; 0,025 М Na2HP4;

0,025 М KH2P4; 0,05 М NH4Cl; 0,005 М Na24; 50 мкг/мл канамицина (pH 7,0). По окончании выращивания клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере А, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 100 мМ NaCl. Ультразвуковую дезинтеграцию клеток проводили в приборе «onifier-450»

(«Branson», США) при следующих режимах: мощность – 0,05 кВт;

температура – 4 °С; продолжительность – 600 импульсов по 0,5 с.

Полученный лизат клеток центрифугировали 30 мин при 21 000 g.

Осадок, содержащий тела включения, отмывали 1 М раствором мочевины с добавлением тритона Х-100 до конечной концентрации 2%. После центрифугирования осадок промывали буфером А и ресуспендировали в этом же буфере.

Измерение концентрации тел включения проводили с использованием модифицированного биуретового метода. Для этого суспензию, содержащую тела включения, кипятили в течение 5 мин с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН) до конечной концентрации 1%, затем проводили измерение концентрации белка по стандартному протоколу [8].

Анализ белкового состава проводили с помощью ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза. Чистоту и молекулярную массу белка определяли с использованием пакета программ «otalab 120» («Nonlinear ynamics», США).

Определение активности ДГЦ проводили в 100 мкл реакционной смеси, содержащей (ммоль): хлорид магния – 5,0; хлорид натрия – 250,0; Трис-HCl (рН 8,0) – 50,0; ГТФ – 1,0 и 1 мкл суспенHCl зии отмытых тел включения. Реакционную смесь инкубировали при 55 °С. Ход реакции контролировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием анионообменной колонки «K EAE-3W» («KB-Bromma», Швеция). Соединения элюировали линейным градиентом от 3 ммоль KCl + 3 ммоль KH2P4 (pH 3,3) до 360 ммоль KCl + 360 ммоль KH2P4 (pH 4,9) за 25 мин при скорости 1 мл/мин. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало образование цикло-диГМФ в количестве 1 мкмоль за 1 мин.

Результаты и их обсуждение. В литературе описаны способы ферментативного получения цикло-диГМФ с использованием бактериальных ДГЦ G. xylinu [4], E. coli [2] и фрагмента ДГЦ T. maritima [5]. Наиболее перспективным является использование фермента гипертермофильного микроорганизма T. maritima, так как данный фермент обладает, по литературным данным, большей термостабильностью [5]. Однако вследствие отсутствия гидрофобного домена фрагмент ДГЦ T. maritima в растворе не образует стабильные димерные комплексы, которые необходимы для синтеза целевого продукта. Мы предположили, что полноразмерная ДГЦ T. aritia, состоящая из каталитического и гидрофобного домена, будет обладать большей ферментативной активностью за счет образования в реакционной смеси стабильных димерных комплексов.

Для изучения влияния аллостерической регуляции циклодиГМФ на активность фермента в настоящей работе получены два варианта полноразмерной ДГЦ – с нативным и измененным (R158A) аллостерическим центром.

На первом этапе работы с помощью методов генетической инженерии сконструированы два штамма-продуцента полноразмерной ДГЦ T. aritia дикого и мутантного типа – E. coli pmadgc-w7 и E. coli pmadgc соответственно. Клетки выращивали на питательной среде ZYM505 [9], индукцию синтеза белка проводили методом аутоиндукции. Анализ белкового состава клеточного лизата, а также растворимой и нерастворимой фракции белков проводили при помощи ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза (см. рисунок).

Электрофореграмма белкового состава клеток E. coli pmadgc и E. coli pmadgc-w7: M – положение и молекулярные массы (кДа) стандартных белкДа)) ков; 4, 5 – белковый состав клеток E. coli pmadgc (4) и E. coli pmadgc-w7 (5) после аутоиндукции; 3, 6 – белковый состав растворимой фракции клеток E. coli pmadgc (3) и E. coli pmadgc-w7 (6); 2, 7 – белковый состав нерастворимой фракции клеток E. coli pmadgc (2) и E. coli pmadgc-w7 (7); 1, 8 – отмытые тела включения мутантной (1) и нативной (8) ДГЦ Из рисунка видно, что основная часть целевых белков находится в нерастворимой фракции клеточного лизата, т. е. нарабатывается в форме тел включения. В растворимой фракции белка, соответствующего по молекулярной массе ДГЦ (29 кДа), не обнаружено. Это может быть связано с наличием гидрофобного домена на N-конце полноразмерной ДГЦ, что приводит к ее неконце обратимой агрегации [5].

Уровень синтеза ДГЦR158A (6%), рассчитанный с использованием пакета программ «otalab 120», приблизительно в 4 раза ниже, чем уровень синтеза ДГЦW (23%). Это может быть связано с тем, что мутантная ДГЦ обладает большей активностью и, следовательно, более токсична для клеток.

Ранее считалось, что тела включения представляют собой неактивные агрегаты белка. Для получения растворимой формы белка, обладающей активностью, требовалось проведение трудоемкой и неэффективной процедуры рефолдинга [10]. Однако недавние исследования показали, что некоторые белки обладают ферментативной активностью, находясь в телах включения [11, 12].

Основываясь на литературных данных, на следующем этапе мы проанализировали ферментативные активности как растворимой, так и нерастворимой фракции клеточного лизата. ДГЦактивность в растворимой фракции отсутствовала, в то время как в нерастворимой фракции она составила 4,23 ед/г белка для ДГЦ R158A и 1,84 ед/г для ДГЦ W. Из-за наличия в пробах интерферирующей фосфатазной активности значительная часть ГТФ расщеплялась с образованием гуанозин-5-дифосфата (ГДФ) и гуанозин-5-монофосфата (ГМФ), что снижало конечный выход продукта. Это вызвало необходимость дополнительной очистки ферментов, которую осуществляли путем отмывки тел включения 1 М раствором мочевины с добавлением тритона Х-100 до 2%. Чистоту полученных ферментных препаратов контролировали с помощью полиакриламидного ДСН-гельэлектрофореза (см. рисунок). Результаты проведенных экспериментов суммированы в таблице.

Активность ДГЦ в очищенных препаратах возросла в среднем в 25 раз по сравнению с исходной активностью. Это, по-видимому, связано с присутствием в лизате клеток белковых примесей, обладающих интерферирующей фосфатазной активностью. В очищенном препарате фосфатазной активности не обнаружено.

Чистота отмытых тел включения, рассчитанная с использованием программы «otalab 120», составила 31% от общего белка для ДГЦR158A и 50% для ДГЦW. Таким образом, с 1 л культуральной жидкости получено приблизительно 80 мг ДГЦR158A (с удельной активностью 60,25 ед/г в пересчете на белок) и 410 мг ДГЦW, удельная активность которой составила 8,8 ед/г белка, что в 7 раз ниже удельной активности мутантного фермента.

Полученные ферменты использовали в реакции синтеза цикло-диГМФ. В реакционную смесь, состоящую из 50 ммоль Трис-HCl (pH 8,0), 250 ммоль NaCl, 5 ммоль MgCl2, 1 ммоль ГТФ, вносили 2,5 мкмоль ДГЦR158A или 9,5 мкмоль ДГЦW. Реакционную смесь инкубировали при 55 °С, ход реакции контролировали с помощью ВЭЖХ. Показано, что в описанных выше условиях синтез цикло-диГМФ проходит на 100% за 1 ч при использовании мутантного фермента и на 95% – за 5 ч при использовании ДГЦ дикого типа. По литературным данным, при синтезе циклодиГМФ с применением мутантного фрагмента ДГЦ T. aritia Выделение и очистка ДГЦ T. maritima

–  –  –

Ультразвуковая дезинтеграция клеток 2 1,27 1,57 1 100 1,4 1,9 0,74 1 100 Получение нерастворимой фракции белка центрифугированием клеточного лизата 2,3 0,55 4,23 2,7 115 1,9 1,032 1,84 2,5 135 Отмывка 1 М раствором мочевины и 2%-ным раствором тритона Х-100 4,8 0,26 18,68 12 240 3,6 0,825 4,4 5,9 259 реакция проходит за то же время при использовании 10 мкмоль фермента, что в 4 раза превышает количество использованной нами мутантной ДГЦR158A [5].

Заключение. В результате выполнения работы получены два штамма-продуцента полноразмерной рекомбинантной ДГЦ T. aritima с нативным и мутантным аллостерическим центром – E. coli pmadgc-w7 и E. coli pmadgc соответственно. Продуцирующая способность полученных штаммов в отношении ДГЦ более чем в 5 раз превышает продуктивность известных в литературе штаммов. Впервые установлено, что целевые ферменты нарабатываются в основном в форме активных тел включения, что позволяет облегчить процедуру очистки ДГЦ и последующего отделения фермента от компонентов реакционной смеси. За счет введения мутации в аллостерический сайт фермента удалось повысить активность полноразмерной ДГЦ T. maritima в 7 раз. Благодаря наличию гидрофобного домена мутантный фермент ДГЦR158A является более эффективным по сравнению с фрагментом данного белка и позволяет проводить реакцию синтеза цикло-диГМФ за то же время с меньшими затратами фермента.

Литература

1. Galperin, M. Y. Bacterial signal transduction network in a genomic perspective / M. Y. alperin // Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 6. – P. 552–567.

2. Zahringer, F. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-MP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli /. Zahringer, C. Massa,. chirmer // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2011. – Vol. 163. – P. 71–79.

3. Chen, W. hepotential of 3,5-cyclic diguanylic acid (c-di-MP) as an effective vaccine adjuvant / W. Chen, R. K. ee, H. Yan // Vaccine. – 2010. – Vol. 28, N 18. – P. 3080–3085.

4. arge-scale production of the immunomodulator c-di-MP from MP and AP by an enzymatic cascade / V. pehr [et al.] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2011. – Vol. 165. – P. 761–775.

5. Enzymatic synthesis of c-di-MP using a thermophilic diguanylate cyclase /. Rao [et al.] // Anal. Biochem. – 2009. – Vol. 389. – P. 138–142.

6. Roling, U. C-di-MP: the dawning of a novel bacterial signalling system / U. Romling, M. omelsky, M. Y. alperin // Mol. Microbiol. – 2005. – Vol. 57, N 3. – P. 629–639.

7. PCR. he basics from background to bench / M. J. McPherson,.. Moller. – New York: BI, 2000. – P. 143–148.

8. Справочник биохимика / Р. Досон и [др.]. – М.: Мир, 1991. – С. 465–466.

9. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures /. W. tudier // Protein Expr. Purif. – 2005. – Vol. 41, N 1. – P. 207–234.

10. Rainer, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rainer,. Hauke // AEB J. – 1996. – Vol. 10. – P. 49–56.

11. Bacterial inclusion bodies: making gold from waste / E. arcia-ruitos [et al.] // rends Biotechnol. – 2011. – Vol. 30. – P. 65–70.

12. Nahalka, J. Enzymatic synthesis of sialylation substrates powered by a novel polyphosphate kinase (PPK3) / J. Nahalka, V. Patoprsty // rg. Biomol. Chem. – 2009. – Vol. 7. – P. 1778–1780.

A. S. KOROVASHKINA, S. V. KVACH, A. I. ZINCHENKO

CONSTRUCTION OF STRAINS PRODUCING RECOMBINANT

DIGUANYLATE CYCLASE OF THERMOTOGA MARITIMA

Laboratory of nucleic copounds biotechnology In the result of this work strains E. coli pmadgc-w7 and E. coli pmadgc producing full-length recombinant diguanylate cyclase of T. aritia with native and mutant allosteric site have been constructed. he obtained strains have 5-fold higher C producing level than ones described in literature. It has been shown that target enzymes are produced substantially in the form of inclusion bodies that allows to facilitate the protein purification process and subsequent isolation of the enzyme from the reaction mixture. here has been 7-fold increase in activity of the T. aritia C with introducing the mutation in allosteric site. Moreover, mutant enzyme CR158A is more active than truncated protein and allows synthesis of c-di-MP with lower enzyme amounts used due to presence of hydrophobic domain.

УДК 579.23:579.22

А. А. БАРЕЙКО1, А. В. СИДОРЕНКО1, Г. И. НОВИК1, С. П. СИНЕОКИЙ2

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КУЛЬТУР

ЛАКТОКОККОВ

Лаборатория «Коллекция микроорганизмов»

Института микробиологии НАН Беларуси, Минск, Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, ФГУП ГосНИИгенетика, Москва, Россия Бактерии рода Lactococcus обладают рядом производственно ценных свойств, таких как высокая протеолитическая активность, продукция диацетила, бактериоцинов, экзополисахаридов, витаминов, устойчивость к бактериофагам. Они традиционно используются в качестве заквасочных культур для производства ферментированных молочных и мясных продуктов, овощных консервов. Интерес привлекает применение лактококков в составе монои поликомпонентных пробиотиков. При отборе производственных штаммов бактерий рода Lactococcus необходимо учитывать плазмидную детерминированность многих практически значимых свойств данных микроорганизмов.

Эти знания необходимы для разработки методик по сохранению лактококков с исходными характеристиками и могут быть использованы при создании рекомбинантных штаммов – продуцентов биологически активных соединений.

Кроме того, интересен поиск новых природных штаммов, перспективных для использования в пищевой промышленности.

Введение. Бактерии рода Lactococcus привлекают внимание микробиологов, молекулярных биологов и генетиков как интересный объект фундаментальных и прикладных исследований.

Лактококки широко используются при производстве ферментированных молочных и мясных продуктов, а также в качестве основы пробиотических препаратов [1].

Представители рода Lactococcus обнаруживаются в молоке и молочных продуктах, на растительном материале, в кишечнике коров и коз, редко – в образцах фекалий и почвы [2].

Исследование микрофлоры молочных производств с применением современных молекулярно-генетических методов, таких как секвенирование гена 16 pРНК, показали существование еще не описанных видов лактококков [3].

Бактерии рода Lactococcus имеют статус RA (enerally Recognized As afe), то есть признаны безопасными для использования в пищевой промышленности и других областях народного хозяйства [2].

На сегодняшний день большинство заквасочных культур лактококков представляют собой хорошо адаптированные, генетически близкие линии со сходными фенотипическими свойствами. Поэтому представляется интересным поиск новых природных штаммов, которые помогут решить многие промышленные проблемы, связанные с неудовлетворительными органолептическими свойствами и быстрой порчей выпускаемых продуктов, вызванная поражением бактериофагами лактококков, входящих в состав закваски.

Морфологические и физиолого-биохимические свойства лактококков. Клетки лактококков имеют сферическую или овальную форму, располагаются в парах, длинных или коротких цепочках. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазо- и оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 30 °С, оптимум pH 5,4–7,1. Лактококки не растут при 6,5% NaCl и при pH 9,6.

Хемоорганотрофы; метаболизм бродильного типа. Лактококки ферментируют лактозу, галактозу, сахарозу, мальтозу [2].

Лактококки относятся к группе гомоферментативных молочнокислых бактерий. Сбраживают глюкозу с образованием (+)молочной кислоты без продукции газа. Представители рода Lactococcus имеют сложные пищевые потребности, что связано с их приспособленностью к обитанию в молоке и других средах, богатых нутриентами. В синтетической среде для их роста необходимо наличие аминокислот (изолейцин, валин, гистидин, метионин, аргинин, пролин) и витаминов (ниацин, кальций пантотенат, биотин) [4, 2].

Протеолитическая активность. В молоке содержится мало свободных аминокислот (1 мг/л), необходимых для роста лактококков. Поэтому большинство штаммов бактерий рода Lactococcus, изолируемых из молока и кисломолочных продуктов, характеризуется высокой протеолитической активностью [5].

Cистема протеолиза белков лактококков состоит из прикрепленной к клеточной стенке протеазы (PrtP), трех белковых переPrtP), ), носчиков (pp, tp, tpP) и пептидаз (Pep). Протеаза клеточной стенки расщепляет около 40% пептидных связей молочных белков еще до их поступления в бактериальную клетку. Образовавшиеся олигопептиды переносятся транспортными системами в цитоплазму, где гидролизуются пептидазами до аминокислот.

Созданы мутантные штаммы с инактивированными генами, кодирующими транспортные белки и пептидазы. Показано, что мутанты с инактивированной АТФ-зависимой олигопептидной транспортной системой pp, но имеющие ди- и трипептидную транспортную активность (tp, tpP), не росли в молоке.

Инактивация генов пептидаз при сохранении системы pp приводила только к снижению скорости роста в данной среде. Также обнаружено, что гены пептидной транспортной системы и пептидаз располагаются на хромосоме, а гены протеаз – исключительно на плазмидах [3, 6].

Штаммы лактококков, выделяемые из молока, содержат разнообразные конвертазы, которые деградируют ароматические аминокислоты и аминокислоты с разветвленной цепью. В результате этого процесса образуются летучие низкомолекулярные соединения, которые придают специфический вкус домашним кисломолочным продуктам [7, 8].

Следует отметить, что способность лактококков гидролизовать белки имеет как положительное (например, для создания вкуса сыра), так и отрицательное (потеря текстуры мяса) значение для пищевой промышленности [9].

Продукция диацетила. Лактококки образуют различные вещества, придающие аромат и вкус молочным продуктам.

Одним из них является диацетил [9].

Продукция диацетила – отличительное свойство штаммов L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis и связана с их способностью утилизировать цитрат [10]. Конечные продукты цитратного метаболизма – диацетил, ацетоин, 2,3-бутандиол, уксусная кислота, углекислый газ – придают характерный вкус кисломолочным продуктам [11].

У штамма L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis описана пермеаза (CitP), кодируемая плазмидным геном citP. Она переносит цитрат в бактериальную клетку без модификаций, после чего он расщепляется цитратлиазой до пирувата. При высокой внутриклеточной концентрации пируват токсичен для клетки и обычно разлагается в присутствии ионов Mg2 +, Na+ и тиаминпирофосфата. Предполагают, что образование диацетила и ацетоина как конечных продуктов цитратного метаболизма предотвращает накопление в клетке пирувата [12]. Реакции образования диацетила способствует аэрация и низкие значения pH питательной среды [11].

Продукция экзополисахаридов. Многие штаммы лактококков продуцируют экзополисахариды, которые улучшают реологические качества кисломолочных продуктов. Такие культуры могут использоваться в пищевой промышленности в качестве замены стабилизаторам [12].

Экзополисахариды образуют плотную капсулу вокруг клетки, что делает лактококки более устойчивыми к неблагоприятным внешним воздействиям (низкие значения рН, термообработка) и проникновению бактериофагов [12]. Химический состав экзополисахаридов, продуцируемых представителями рода Lactococcus, варьируется в зависимости от штамма и условий культивирования. В целом для биополимеров этих микроорганизмов характерно присутствие галактозы, глюкозы, иногда рамнозы, реже – гексоз [13].

Продукция экзополисахаридов может быть обусловлена генами, находящимися на крупных плазмидах (от 27 до 47 т. п. н.).

Так, плазмида pNZ4000 размером 42,2 т. п. н. несет 14 генов, связанных с продукцией этих биополимеров. Плазмидной локализацией генов, детерминирующих продукцию экзополисахаридов, объясняется нестабильность данного признака [14].

Продукция бактериоцинов. Бактериоцины представляют собой пептиды, продуцируемые бактериями для подавления роста других бактерий. Эти соединения отличаются от антибиотиков по некоторым важным аспектам: синтезируются на рибосомах, клетка-хозяин невосприимчива к ним, имеют другие механизмы действия, обладают узким спектром антимикробной активности – обычно подавляют только бактерии, близкородственные продуцирующему штамму [15].

Бактериоцины, которые продуцируют молочнокислые бактерии, можно разделить на три больших класса: лантибиотики, небольшие термостабильные пептиды и большие термолабильные протеины. Лактококки продуцируют в основном бактериоцины первых двух классов [16].

Лантибиотики являются небольшими пептидами (5 кДа), включающими дегидратированные аминокислоты и аминокислоты, которые обычно не обнаруживаются в природе (например лантионин или -метиллантионин). Бактериоцины первого класса синтезируются в неактивной форме с N-концевой лидерной поконцевой следовательностью, которая расщепляется в процессе созревания, освобождая активный пептид [17].

Лантибиотики, исходя из их структурных и функциональных характеристик, могут быть разделены на две группы: типа А и типа В. Лактококки синтезируют только лантибиотики типа A, которые на основе размера, заряда и последовательности лидерного пептида, делятся на две группы. Лантибиотики типа А являются катионными пептидами, которые могут содержать до 34 аминокислотных остатков. Они действуют, разрушая целостность цитоплазматической мембраны бактерий [18].

Примером лантибиотиков типа А является низин. Низин был открыт в 1928 г. Роджерсом и сотрудниками и до сегодняшнего дня является самым широко используемым промышленным бактериоцином [19]. Низин синтезируется некоторыми штаммами L. lactis и проявляет антимикробную активность в отношении широкого спектра грамположительных бактерий. Показано, что низин подавляет рост большинства молочнокислых бактерий, представителей видов Staphylococcus aureus, Listeria onocytogenes, бактерий родов Bacillus и Clostridiu spp., способен индуцировать автолиз чувствительных стафилококковых клеток [16].

Основная мишень действия низина – цитоплазматическая мембрана. Показано, что низин ингибирует биосинтез пептидогликана, взаимодействуя с липидом II – предшественником клеточной стенки, и приводит к образованию пор. Поры в мембране делают возможным диффузию из клетки таких соединений, как аминокислоты и АТФ, вызывая исчезновение протондвижущей силы и остановку биосинтеза макромолекул (ДНК, РНК, белков) [20]. Низин может освобождать два катионных фермента (N-ацетилмурамоил--аланинамиазу и N-ацетилглюкозаминидазу), гидролизирующих клеточную стенку, что приводит к лизису клетки [21].

Чувствительные штаммы бактерий вырабатывают устойчивость к низину. Полная невосприимчивость клетки к этому бактериоцину может быть связана с одновременной продукцией липопротеина NisI, заякоренного снаружи клеточной мембраны, и белка-переносчика АТФ NisE, снижающего концентрацию низина ниже ингибирующего уровня [16, 22]. Обнаружено, что многие грамположительные бактерии, не продуцирующие низин, имеют ферменты, инактивирующие его. Например, Bacillus cereus инактивирует низин путем восстановления дегидроаминокислот [23]. Структурные изменения компонентов клеточной стенки, вызванные мутациями кодирующих их генов, могут препятствовать адсорбции низина на клетках бактерий [16].

Бактериоцины класса II представляют собой небольшие (до 10 кДа) термостабильные, не содержащие лантионин, мембраноактивные пептиды. Для этого класса характерен узкий спектр ингибирующей активности. Бактериоцины класса II можно разделить на три подкласса (IIa, IIb, IIc). Лактококки продуцируют бактериоцины классов IIb (лактицин 3147) и IIc (лактококкцин A, лактококцин 972). Для большинства бактериоцинов класса II молекулоймишенью на поверхности чувствительной клетки является пермеаза маннозы, входящая в состав фосфотрансферазной системы. Таким образом, бактериоцины II класса, как и класса I, устраняют протондвижущую силу, формируя поры в клеточной стенке [12].

Способность к продукции бактериоцинов кодируется генами, расположенными на крупных плазмидах. Например, у штамма L. lactis ARIA 8530 образование лактицина 481 (бактериоцин класса I), активного в отношении Clostridiu tyrobutyricu, кодируется опероном из шести генов, который находится на плазмиде размером 70 т. п. н. [24]. Продукция лактококкцина (бактериоцин класса II) также детерминируется плазмидными генами. При этом на одной плазмиде может располагаться локус генов, кодирующих несколько типов лактококкцинов. Примером служит плазмида p9B4–6 L. lactis subsp. cremoris 9B4, содержащая локус из двух генов. Один из них детерминирует образование лактококкцина М, имеющего низкую бактерицидную активность, второй – синтез высокоактивного лактококкцина А [25].

Фагоустойчивость. Бактериофаги присутствуют на всех молочных заводах, и их литическое действие на производственную культуру может привести к снижению качества продукта.

Поэтому при отборе штаммов молочнокислых бактерий важно учитывать признак фагоустойчивости [2].

Явление фагоустойчивости для лактококков детально изучено и описано. Это свойство детерминируется в основном плазмидными генами. Плазмиды с генами фагоустойчивости путем конъюгативного переноса могут передаваться молочнокислым бактериям других родов. Поэтому некоторые исследователи полагают, что генетический обмен вносит существенный вклад в развитие фагоустойчивости заквасочных культур [2].

Описано четыре основных механизма фагоустойчивости, которые направлены на ингибирование различных стадий жизненного цикла фага: ингибирование адсорбции (Ads), блок проникновения, система рестрикции-модификации (R/M) и абортивная инфекция (Abi) [26]. Ингибирование адсорбции связано с образованием устойчивых к бактериофагу мутантов, которые могут получаться либо за счет хромосомных мутаций, либо за счет наличия плазмидных систем. Анализ плазмиды pCI528, размером 46 т. п. н., изолированной из штамма L. lactis subsp. creoris UC503, показал, что она детерминирует Ads+ фенотип [27].

Крупная конъюгативная плазмида pNP40 (64,9 т. п. н.), детерминирующая фагоустойчивость клеток за счет блокирования проникновения бактериофагов, обнаружена у L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis RC3. Эта плазмида содержит гены устойчивости к кадмию (cadA и cadC), гены cspC и cspD, кодирующие белки холодового шока, а также ген nisR, детерминирующий устойчивость к низину. При изучении плазмиды pNP40 обнаружено, что наряду с системой блока проникновения она содержит гены abiE и abiF, обеспечивающие фагоустойчивость клеток за счет абортивной инфекции. Показано, что развитие абортивной инфекции детерминируется кластером плазмидных генов, белковые продукты которых ингибируют развитие фага на уровне его репликации (AbiA, Abi, AbiK, AbiR, AbiP), транскрипции фаговой ДНК (Abi1, Abi, AbiQ, AbiB), а также подавляют синAbi1, 1,,, ), тез капсидного белка (AbiC) [28].

Фагоустойчивость, обусловленная работой системы рестрикции-модификации, обеспечивается путем расщепления чужеродной ДНК, попавшей в клетку, при сохранении собственной ДНК. Показано, что многие ферменты системы рестрикциимодификации кодируются плазмидными генами. В клетках фагоустойчивого штамма L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis PC220 обнаружены плазмиды pAH33 (6 т. п. н.) и pAH82 (20,3 т. п. н.), несущие гены hsdS, кодирующие отдельные субъединицы ферментов R/M-системы. Детально охарактеризованы плазмиды pR2030 (46,2 т. п. н.), pN801 (12 т. п. н.) и pNP40 (64,9 т. п. н.) L. lactis M2301, детерминирующие устойчивость клеток к бактериофагам за счет работы систем рестрикции-модификации [26].

Устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам. Штаммы лактококков чувствительны к амикацину, ампициллину, первому поколению цефалоспоринов, хлорамфениколу, эритромицину, гентамицину, оксациллину, пенициллину, сульфаниламидам, тетрациклину, триметоприму и ванкомицинину. По сравнению с другими молочнокислыми бактериями лактококки менее устойчивы к карбенициллину, цифлоксацину, норфлоксацину. Устойчивость к гентамицину, канамицину, линкомицину, рифампину, стрептомицину варьируется [29].

Резистентность лактококков к антибиотикам может быть естественной или приобретенной. Последняя является результатом мутаций генома или детерминируется плазмидными генами.

Антибиотикоустойчивость, обусловленная плазмидными генами, – отрицательная характеристика производственных штаммов лактококков вследствие возможности коньюгационного переноса генов резистентности к антибиотикам другим микроорганизмам, в частности патогенной микрофлоре.

У штамма L. lactis subsp. lactis K214 обнаружена плазмида pK214 (29,8 т. п. н.), которая несет гены устойчивости к тетрациклину (tet(S)), стрептомицину (str), хлорамфениколу (cat) [30].

Связь между присутствием в клетках плазмидной ДНК и устойчивостью бактерий к неорганическим солям впервые установлена в 1970-х гг. [26]. Описана коинтегративная плазмида pAH90 (26 т. п. н.) L. lactis MG1614, детерминирующая устойчивость к ионам кадмия и цинка [31]. Плазмида pN306, несущая оперон lco, обеспечивает устойчивость L. lactis subsp. lactis 1252 к ионам меди [32].

Использование лактококков в промышленности. В молочной промышленности штаммы L. lactis ssp. lactis и L. lactis ssp.

cremoris используются для производства кефира, простокваши, ряженки, йогурта, молодых, вызревающих мягких (бри), полутвердых (гауда) и твердых (чеддер) сыров [9].

Многообещающее направление – конструирование высокотехнологичных штаммов Lactococcus при помощи методов генной инженерии. Для лактококков разработаны эффективные протоколы трансформации, созданы клонирующие векторы, в том числе на основе их природных плазмид и системы белковой экспрессии [33].

Наиболее эффективная система клонирования в клетках лактококков – векторы pCY и pEC, у которых экспрессия контролируется низининдуцированным промотором. В качестве репортерного белка используется нуклеаза стафилококка (Nuc), представляющая хорошо охарактеризованный секретирующий белок, активность которого можно легко обнаружить. Данная система была разработана для контролируемой продукции в клетках L. lactis цитоплазматических или секретируемых белков.

В качестве опытного штамма был выбран L. lactis NZ9000, несущий гены nisR, nisK – хромосомную кассету, ответственную за сигнальную трансдукцию низина. С использованием векторов pCY и pEC и штамма L. lactis NZ9000 разработаны системы секреции -лактамазы, люциферазы, интерлейкинов, энтероцина и колицинов, лизоцина, аминопептидазы N, липазы, плазмина [33].

При помощи генно-инженерных методов сконструировано несколько высокотехнологичных штаммов лактококков, входящих в состав заквасок для молочной промышленности. В Норвегии созданы мутантные штаммы бактерий рода Lactococcus, не сбраживающие лактозу и обладающие автолитическими свойствами.

Так как массовый автолиз клеток лактококков способствует более быстрому высвобождению внутриклеточных ферментов, принимающих участие в созревании продукта, такие штаммы используют для получения высококачественных сыров. В России получены фагоустойчивые штаммы лактококков, применяемые в сыроделии [34].

Группой российских исследователей сконструирован штамм L. lactis BK-18 – продуцент стрептококкцина (антибактериальной субстанции наружного применения для лечения инфекций, вызванных грамположительными бактериями, получившей коммерческое название «Томицид»). При внесении этого штамма в качестве закваски в молоко получают приятный на вкус кисломолочный продукт, который сохраняет все свойства лекарственного препарата и предлагается как эффективное средство в комплексном лечении и профилактике дисбактериозов [35].

Имеются сведения об использовании для получения сыра чеддер генно-инженерного штамма L. lactis subsp. creoris PC4268, несущего плазмиду синтеза лактицина – термостабильного бактериоцина с широким спектром антимикробного действия [36].

Создан рекомбинатный штамм L. lactis subsp. cremoris NZ9000 – продуцент рибофлавина (витамина B2). Он может применяться для производства рибофлавина (как альтернатива химическому синтезу), а также в качестве заквасочной культуры для получения кисломолочных продуктов, обогащенных этим витамином [37].

Заключение. Бактерии рода Lactococcus широко используются в пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства. Отбор производственных культур лактококков должен основываться на комплексном изучении их практически ценных характеристик, таких как способность к продукции бактериоцинов, витаминов, экзополисахаридов, устойчивость к бактериофагам.

Изучение генетических признаков бактерий рода Lactococcus важно как для понимания детерминированности многих практически важных свойств, так и для создания новых высокотехнологичных штаммов при помощи генно-инженерных методов.

Литература

1. Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание / Б. А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – Т. III: Пробиотики и функциональное питание. – 288 с.

2. he Prokaryotes: A handbook on the biology of bacteria: in 7 v. / M. workin (editor-in-chief) [et al.]. – 3rd ed. – UA: pringer, 2006. – Vol. 4: Bacteria:

irmicutes, Cyanobacteria. – 1140 p.

3. Klijn, N. etection and characterization of lactose-utilizing Lactococcus spp. in natural ecosystems / N. Klijn, A. H. Weerkamp, W. M. de Vos // Appl. Env.

Microbiol. – 1995. – Vol. 61. – P. 788–792.

4. Anderson, A. W. he nutritional requirements of lactic streptococci isolated from starter cultures. I: rowth in a synthetic medium / A. W. Anderson, P. R. Elliker // J. airy c. – 1953. – Vol. 36. – P. 161–167.

5. Mixed cultures of proteinase-positive and proteinase-negative strains of Lactococcus lactis in milk / V. Juillard [et al.] // J. airy ci. – 1996. – Vol. 79. – P. 964–970.

6. Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria / J. E. Christensen [et al.] // Ant. v. eeuwen. – 1999. – Vol. 76. – P. 217–246.

7. lavour forming abilities and amino acid requirements of Lactococcus lactis strains isolated from artisanal and non-dairy origin / E. Ayad [et al.] // Int. airy J. – 1999. – Vol. 9. – P. 725–735.

8. Roudot-Algaron, F. Catabolism of aromatic and branched-chein amino acids in Lactococcus lactis /. Roudot-Algaron, M. Yvon // ait. – 1998. – Vol. 78. – P. 23–30.

9. Ray, B. undamental ood Microbiology / ed. by B. Ray. – 3rd ed. – UA:

CRC Press, 2004. – 608 p.

10. Kepler, G. M. Biochemistry and genetics of citrate utilization in Streptococcus lactis ssp. diacetylactis /. M. Kempler,.. McKay // J. airy ci. – 1981. – Vol. 64. – P. 1527–1539.

11. Cogan, T. M. lavor production by dairy starter cultures /. M. Cogan // J. Appl. Bacteriol. ymp. uppl. – 1995. – Vol. 79. – P. 49–64.

12. actic acid bacteria microbiological and functional aspects /. alminen (editor-in-chief) [et al.]. – 3rd ed. – UA: Marcel ekker, Inc., 2004. – 630 p.

13. Cerning, J. Exocelular polysaccharides produced by lactic acid bacteria / J. Cerning // EM Microbiol. Rev. – 1990. – Vol. 87. – P. 113–130.

14. Van Kranenburg, R. Nucleotide sequence analysis of the lactococcal EP plasmid pNZ4000 / R. Van Kranenburg, M. Kleerebezem, W. M. de Vos // Plasmid. – 2000. – Vol. 43. – P. 130–136.

15. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation / J. Cleveland [et al.] // Int. J. ood Microbiol. – 2001. – Vol. 71. – P. 1–20.

16. Klaenhaer, T. R. enetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria /. R. Klaenhammer // EM Microbiol. Rev. – 1993. – Vol. 12. – P. 39–85.

17. Jack, R. W. Unique peptide modifications involved in the biosynthesis of lantibiotics / R. W. Jack, H.. ahl // rends Biotechnol. – 1995. – Vol. 13. – P. 269–278.

18. McAuliffe, O. antibiotics: structure, biosynthesis and mode of action /. McAuliffe, R. P. Ross, C. Hill // EM Microbiol. Rev. – 2001. – Vol. 25. – P. 285–308.

19. Rogers, L. he inhibiting effect of Streptococcus lactis on Lactobacillus bulgaricus /. Rogers // J. Bacteriol. – 1928. – Vol. 16. – P. 321–325.

20. Use of the cell wall precursor lipid II by a pore-forming peptide antibiotic / E. Breukink [et al.] // cience. – 1999. – Vol. 286. – P. 2361–2364.

21. Hechard, Y. Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from grampositive bacteria / Y. Hechard, H.. ahl // Biochimie. – 2002. – Vol. 84. – P. 545–557.

22. Effects of gene disruptions in the nisin gene cluster of Lactococcus lactis on nisin production and producer immunity / R. Ra [et al.] // Microbiology. – 1999. – Vol. 145, N 5. – P. 1227–1233.

23. Venea, K. actococcal bacteriocins: mode of action and immunity / K. Venema,. Venema, J. Kok // rends Microbiol. – 1995. – Vol. 3. – P. 299–303.

24. Characterization of the lacticin 481 operon: the Lactococcus lactis genes lctF, lctE, and lctG encode a putative ABC transporter involved in bacteriocin immunity / A. Rince [et al.] // Appl. Env. Microbiol. – 1997. – Vol. 63. – P. 4252–4260.

25. rganization and nucleotide sequences of two lactococcal bacteriocin operons / M. J. van Belkum [et al.] // Appl. Env. Microbiol. – 1991. – Vol. 57. – P. 492–498.

26. Plasmids of lactococci: genetic accessories or genetic necessities? /. Mills [et al.] // EM Microbiol. Rev. – 2006. – Vol. 30, N 2. – P. 243–273.

27. Lucey, M. Cell surface characteristics of Lactococcus lactis harbouring pCI528, a 46 kb plasmid encoding inhibition of bacteriophage adsorption / M. ucey, C. aly,.. itzgerald // J. en. Microbiol. – 1992. – Vol. 138. – P. 2137–2143.

28. equence analysis of the actococcal plasmid pNP40: a mobile replicon for coping with environmental hazards / J. riscoll [et al.] // J. Bacteriol. – 2006. – Vol. 188, N 18. – P. 6629–6639.

29. Mathur, S. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria – a review /. Mathur, R. ingh // Int. J. ood Microbiol. – 2005. – Vol. 105. – P. 281–295.

30. Teuber, M. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food / M. euber,. Meile,. chwarz // Ant. van eeuwen. – 1999. – Vol. 76. – P. 115–137.

31. Novel mechanism of bacteriocin secretion and immunity carried out by lactococcal multidrug resistance proteins /. ajic [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278. – P. 34291–34298.

32. enetic and transcriptional analysis of a novel plasmid-encoded copper resistance operon from Lactococcus lactis / C. Q. iu [et al.] // ene. – 2002. – Vol. 297. – P. 241–247.

33. Controlled intra- or extracellular production of staphylococcal nuclease and ovine omega interferon in Lactococcus lactis /.. Bermudez-Humaran [et al.] // EM Microbiol. ett. – 2003. – Vol. 224. – P. 307–313.

34. Лодыгин, А. Д. Анализ направлений развития пищевой биотехнологии / А. Д. Лодыгин, А. Б. Рябцева // Серия «Продовольствие»: cб. науч. тр. / СевКавГТУ. – Ставрополь, 2005. – № 1. – С. 1–9.

35. An application in cheddar cheese manufacture for a strain of Lactococcus lactis producing a novel broad-spectrum bacteriocin, lacticin 3147 / M. P. Ryan [et al.] // Appl. Env. Microbiol. – 1996. – Vol. 62. – P. 612–619.

36. Блинкова, Л. П. Перспективы использования бактериоцинов для профилактики и терапии инфекции / Л. П. Блинкова // Журнал микробиологии. – 1984. – T. 5. – С. 10–14.

37. Riboflavin production in Lactococcus lactis: potential for in situ production of vitamin-enriched foods / C. Burgess [et al.] // Appl. Env. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, N 10. – P. 5769–5777.

H. A. BAREIKA1, A. V. SIDARENKA1, G. I. NOVIK1, S. P. SINEOKY2

PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL

PROPERTIES OF LACTOCOCCAL CULTURES

Laboratory «Microbial collection», Institute of Microbiology, National Acadey of Sciences of Belarus, Minsk, Russian National Collection of Industrial Microorganiss, State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganiss, Moskow, Russia Lactococcus species possess industrial valuable properties like high proteolytic activity, diacetil, bacteriocins, exopolysaccharides and vitamin production, bacteriophage tolerance. raditionally they are used as starter cultures for manufacturing fermented milk and meat products, canned vegetables. Interest attracts application of lactococci in composition of mono- and polycomponent probiotics.

While selection of industrial strains of Lactococcus genus, it is necessary to take into account plasmid determination of some of their practical important properties.

hese knowledge can help during developing technique to maintain lactococci with primary features and can be used to develop recombinant strains – producers of biological active compounds. In addition it is interesting to search new natural strains, which employment will be promising in dairy industry.

УДК 579.083.13+602.3:579.8+604.4+637.144

–  –  –

-Амилазы (КФ 3.2.1.1, 1,4--D-глюкан глюканогидролазы) – ферменты класса гидролаз, которые катализируют эндогидролиз 1,4--гликозидных связей в полисахаридах, содержащих три или более остатка D-глюкозы. Их физиологическая функция в живых организмах заключается в метаболизме углеводов. Выпускаемые в промышленных масштабах -амилазы растительного и микробного происхождения используются для производства пищевой продукции (глюкозных, мальтозных и глюкозо-фруктозных сиропов, кристаллической глюкозы и фруктозы, осветленных плодово-ягодных и овощных соков, пива, кваса и т. д.), кормов, детергентов, бумаги, текстиля, фармакологических препаратов [1, 2].

Основу промышленных технологий производства ферментных препаратов амилолитического действия составляют микроорганизмы, ввиду таких их преимуществ, как высокая технологичность и продуктивность, обусловливающие дешевизну продукта, разнообразие свойств синтезируемого ферментного белка, включая внеклеточную локализацию, широкую субстратную специфичность, высокую термо- и рН-стабильность, разнообразие физико-химических свойств. Несмотря на то что на долю препаратов -амилаз приходится до 25% мирового рынка ферментов, в их коммерческом получении задействовано лишь ограниченное число продуцентов, преимущественно бактерий рода Bacillus (B. subtilis var. aylosaccharicus, B. ayloliquefaciens, B. licheniforis) и грибов рода Aspergillus [1–3]. Результаты исследований, касающихся селекции новых штаммов-продуцентов

-амилаз, условий их образования, способов выделения, очистки, свойств и аспектов применения обобщены в ряде обзоров [4–11].

В то же время ограничены и противоречивы сведения о синтезе -амилаз утилизирующими крахмал бактериями родов Bidobacteriu, Lactobacillus и Lactococcus, использующимися для производства ферментированных продуктов питания и кормов из такого сельскохозяйственного сырья, как молоко, мясо, овощи, фрукты, зерновые [12]. Исключение составляют утилизирующие крахмал лактококки и лактобациллы – продуценты молочной кислоты in vivo. Данные об их амилазной активности в процессе использования крахмала, содержащегося в отходах переработки сорго, кассавы, пшеницы, риса, ячменя и других растений, приводятся в ряде обзоров [13, 14].

Известны следующие проявляющие амилолитическую активность представители рода Lactobacillus: L. acidophilus [15], L. aylolyticus [16, 17], L. aylophilus [18–21], L. aylovorus [22–26], L. cellobiosus [27, 28], L. ferentu [29–31], L. anihotivorans [32–37], L. plantaru [38–46].

Продукция -амилазы характерна также для многих видов бифидобактерий – Bidobacteriu adolescentis [47, 48], B. breve, B. dentiu, B. infantis, B. pseudolongu, B. therophilu [49].

Практически единичные работы посвящены -амилазам бактерий рода Lactococcus, в частности L. lactis [50–54].

Возрастающие объемы производства продуктов питания из крахмалсодержащего сырья с использованием молочнокислых и бифидобактерий обусловливают актуальность поиска и создания высокопродуктивных и технологичных штаммов, в том числе методом рекомбинантных ДНК, с улучшенными каталитическими характеристиками продуцируемых ими ферментных белков.

С целью выбора стартерных культур были оценены технологические свойства 264 изолятов Lactobacillus fermentum, использующихся для производства пива. Невысокий уровень амилолитической активности обнаружен у 11,5% из них [55].

Из 210 культур аэробных и 132 культур анаэробных бактерий по признаку синтеза одновременно амилазы, липазы, фитазы и протеазы отобран штамм PC101, идентифицированный как Lactobacillus sp. [56].

Изучена также амилолитическая активность 155 изолятов культур молочнокислых бактерий из йогурта, предназначенного для детского питания. Только у двух штаммов Lactobacillus plantarum был обнаружен невысокий (0,05 ед/мл) уровень синтеза ассоциированной с клетками -амилазы.

Установлено, что 6 из 7 изолятов бактерий Lactobacillus anihotivorans, являющихся доминирующим видом в процессе производства крахмала из кассавы, синтезируют -амилазу [35].

В то же время свойство продуцировать фермент, катализирующий гидролиз крахмала, обнаружено только у одного (А6) из шести изолятов L. plantaru [56].

Две из трех утилизирующих крахмал бактериальных культур, выделенных из организма цыплят, были идентифицированы как штаммы EM 207 и EM 220 Lactobacillus acidophilus и одна – как L. vitelinus EM 202 [57]. Установлено, что более предпочтительными, чем глюкоза или мальтоза, субстратами для синтеза ими внутриклеточной -амилазы являются амилопектин или крахмал, для образования фермента L. vitelinus EM 202 – мальтоза.

Способность синтезировать -амилазы изучена у 44 штаммов бифидобактерий, растущих в средах с крахмалом, амилопектином и пуллуланом [48]. Среди них выявлено 19 штаммов, расщепляющих только картофельный крахмал, и 11 – деполимеризующих крахмал, амилопектин и пуллулан. Штаммы, одновременно утилизирующие все три субстрата, были классифицированы как Bidobacteriu breve (5), B. dentium (1), B. infantis (1), B. pseudolongum (3), B. thermophilum (1). Установлено, что синтез бактериями внеклеточных ферментов, деградирующих крахмал, является индуцированным.

Новый штамм Lactococcus lactis subsp. lactis B84, утилизирующий крахмал в качестве единственного источника углерода, был изолирован болгарскими учеными из спонтанно ферментированной ржаной закваски [52]. Установлено, что гидролиз субстрата катализируют локализованная в цитоплазме и внеклеточная -амилаза, гликогенфосфорилаза и амилопуллуланаза.

Показано, что ключевая роль в гидролизе полисахарида принадлежит клеточносвязанному ферменту, имеющему максимум активности при температуре 45 °С и рН 5,4.

При глубинном выращивании Lactobacillus plantarum MCC1407 в среде, содержащей растворимый крахмал (1%), оптимальными условиями для синтеза -амилазы оказались температура 35 °С, активная кислотность среды, соответствующая рН 7,0, длительность культивирования 36 ч [44].

Синтез -амилазы Lactobacillus plantarum А6 также происходит при наличии в среде крахмала и содержащих этот полисахарид растительных отходов [56]. Этот штамм молочнокислых бактерий, растущий в среде с гранулами крахмала из кассавы, продуцирует внеклеточный фермент (60 ед/мл) в стационарной фазе роста в условиях стабилизации кислотности среды (рН 6,0).

В нерегулируемых условиях активной кислотности амилолитическая активность бактерий составляла всего 2 ед/мл, в результате чего крахмал не потреблялся [38].

рН-Статирование (рН 6,0) сопровождается максимальным уровнем продукции -амилазы L. manihotivorans M18010, в результате чего длительность процесса ферментации крахмала сокращается вдвое [33]. Синтез фермента бактериями в среде с глюкозой отсутствует.

Условия кислотности среды, соответствующие рН 5,0, оптимальны для роста Lactobacillus fermentum gi E1 [30]. Варьирование величины рН в пределах 4,0–6,0 не влияет на накопление биомассы бактериями. В то же время синтез -амилазы резко снижается, когда культура растет в среде с крахмалом при рН 4,0.

В среде с мальтозой продукция фермента штаммом gi E1 остается постоянной в диапазоне рН 4,0–5,0. Основываясь на распределении ферментативной активности между вне- и внутриклеточной фракциями, предполагаем, что вначале крахмал подвергается ферментативному гидролизу до декстринов, а затем из них с участием внеклеточного фермента образуется мальтоза, которая транспортируется в клетку, где и подвергается гидролизу до глюкозы с участием внутриклеточной -гликозидазы [30].

Максимум продукции -амилазы штаммом M18011 бактерий Lactobacillus manihotivorans наблюдается при исходной активной кислотности крахмалсодержащей среды, соответствующей рН 5,0–5,5 [36].

Установлено, что штамм Lactobacillus fermentum gi E1 утилизирует крахмал, глюкозу, фруктозу, сахарозу или их смеси и продуцирует при этом -амилазу [30]. Одинаковый уровень синтеза -амилазы культурой отмечается как в среде с крахмалом, так и в среде с его смесями с сахарозой или фруктозой или одновременно с фруктозой и глюкозой. В то же время в среде с крахмалом и глюкозой или смесью крахмала, глюкозы, фруктозы и сахарозы продукция -амилазы бактериями и скорость ее синтеза снижаются.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии Lactobacillus manihotivorans N32 при их выращивании в крахмалсодержащей среде в атмосфере азота характеризуются пониженным уровнем синтеза -амилазы по сравнению с их аэробной ферментацией [34]. Добавление к азоту двуокиси углерода ( 0%) 2 восстанавливает продукцию фермента, максимум которой отмечается в средах с крахмалом, мальтозой или целлобиозой. При ферментации смеси глюкозы и мальтозы наблюдается выраженная диауксия роста бактерий: потребление мальтозы и образование -амилазы начинается лишь после ассимиляции глюкозы.

В настоящее время выявлены гены, кодирующие внеклеточную и цитоплазматическую формы -амилаз Lactococcus lactis subsp. lactis B84 [52]. Секвенированы гены, ответственные за синтез этого фермента у Lactobacillus plantarum A6, L. aylovorus и L. anihotivorans [25].

В основном гены, ответственные за синтез -амилаз у представителей рода Lactobacillus, локализованы на хромосоме [25, 39, 58].

Однако сообщается, что штамм L. anihotivorans N32 утрачивает способность к синтезу -амилазы и, следовательно, к утилизации крахмала при элиминации содержащейся в его клетках плазмиды [35]. На плазмиде размером 30 кб локализован и ген

-амилазы Lactococcus lactis IBB500 [53].

Установлено, что клетки Lactobacillus plantarum легко подвергаются электропорации, что обусловило применение этих бактерий в качестве модельных организмов для клонирования генов -амилазы [26, 39]. Имеются также данные об использовании L. aylovorus [24], L. manihotivorans [59] и Lactococcus lactis [49] в качестве реципиентных организмов для экспрессии чужеродных генов.

Ген -амилазы из Lactobacillus gassery ACC33323 (AMA) клонирован в L. lactis M1363 [5], из Bidobacteriu sp. – в Bidobacteriu sp. и Escherichia coli [60]. Экспрессируемые рекомбинантными штаммами ферментные белки каталитически активны и по свойствам соответствуют ферментам, продуцируемым штаммами-донорами соответствующих генов. На основе плазмиды KJ36 сконструирован шаттл-вектор для клонирования гена -амилазы Bidobacteriu longum в Escherichia coli и Bidobacteriu sp. [61].

Получены стабильные в течение не менее 50 генераций в неселективных условиях рекомбинантные штаммы Lactobacillus plantarum p80 и L. plantaru NCIB8826, содержащие фрагмент гена -амилазы L. aylovorus в интегрированном в хромосому и самореплицирующуюся плазмиду виде [39]. Уровень синтеза внеклеточного фермента штаммом L. aylovorus – донором гена

-амилазы – составлял 47 ед/л, а полученных рекомбинантов варьировался в пределах от 23 до 69 ед/мл.

Две конструкции, полный ген -амилазы Lactobacillus aylovorus и его укороченный на 66 кДа с терминального карбоксильного конца участок, были клонированы в L. plantaru M9211 [26]. Продукты экспрессии сконструированных фрагментов ДНК с геном -амилазы проявляли одинаковую ферментативную активность по отношению к амилазе, амилопектину,

-циклодекстрину и растворимому крахмалу. В то же время значения Km и Vax фермента, кодируемого укороченным геном AyA, были несколько выше, а его термостабильность – меньше.

Указанный фермент не связывался также с -циклодекстрином и природным крахмалом, слабо гидролизовал гликоген и не проявлял активности в отношении крахмала. Авторы исследования делают вывод о том, что -амилаза L. aylovorus содержит участок, ответственный за ее связывание со специфическим субстратом – крахмалом.

Японскими исследователями сконструирован рекомбинантный штамм Lactococcus lactis I 1403, несущий ген -амилазы из Streptococcus bovis 148 и экпрессирующий каталитически активный ферментный белок [51]. Для более эффективной экспрессии клонированного гена проведена адаптационная селекция рекомбинанта к мальтозе или крахмалу. Позднее ген -амилазы из Streptococcus bovis 148 был клонирован также в штамме Lactobacillus plantaru, дефицитном по -лактатдегидрогеназе, что позволило впервые осуществить прямое получение D-молочной кислоты из крахмалсодержащих отходов [45].

Новый крахмалсвязывающий домен описан у -амилаз, выделенных из клеток трех различных представителей лактобацилл – Lactobacillus plantarum, L. aylovorus и L. anihotivorans [62].

Обычно этот домен образован 100 аминокислотами, тогда как у исследуемых бактерий он представлен 500 аминокислотами, которые организованы в тандем повторов. Степень идентичности генов, кодирующих исследуемые ферменты, составляет 98%.

Однако структура их крахмалсвязывающих доменов существенно различается, что приводит к различиям их амилолитической активности. Так, фермент L. aylovorus каталитически в 10 раз более эффективен по отношению ко всем испытанным полимерным субстратам, чем фермент L. plantarum.

В результате выполненного японскими учеными исследования С-терминальная область пептидогликангидролазы Lactococcus lactis I1403 внедрена в линкерную область, в результате чего синтез крахмалсвязывающего домена -амилазы Streptococcus bovis 148 происходил в Escherichia coli внутриклеточно [63].

Гибридный белок оказался способным связываться с клеточной поверхностью Lactobacillus casei NRR В-441 и с кукурузным крахмалом, благодаря чему почти на треть повышалась устойчивость бактерий в желудочно-кишечном тракте животных.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«Ученые записки университета имени П.Ф. Лесгафта, № 9 (91) – 2012 год учебное пособие / Д.Н. Давиденко, А.И. Зорин, В.Е. Борилкевич ; отв. ред. Д.Н. Давиденко ; С.-Петерб. гос. ун-т. – СПб. : Изд-во СПб ГУ, 2001. – 208 с.3....»

«Special material. Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 191 УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ О понятии и классификаци...»

«Андреева Юлия Викторовна МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАЛЕАРКТИЧЕСКИХ ВИДОВ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА "ANOPHELES MACULIPENNIS" (DIPTERA, CULICIDAE) 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2007 Работа выполнена в Научно – исследовательском институте биологии и биофизи...»

«ЛАДЫГИН Константин Владимирович ТЕХНОЛОГИЯ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ОЧИСТКИ ОБРАТНООСМОТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ОБЕЗВРЕЖИВАНИИ ФИЛЬТРАТА ПОЛИГОНОВ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ Специальность 03.02.08 – Экология (в хими...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины" ГИДРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕК БАССЕЙНА ДНЕПРА (В ПРЕДЕЛАХ ГОМЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ) Гомель 2008 УДК 574.5 (476.2, 282.2...»

«BWC/MSP/2010/MX/INF.2 Совещание государств участников 5 August 2010 Конвенции о запрещении разработки, Russian производства и накопления запасов Original: English бактериологического (биологического) и токсинного о...»

«ДИСПАНСЕРИЗАЦИЯ ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ (КРАТКАЯ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ГРАЖДАН О ДИСПАНСЕРИЗАЦИИ И ПОРЯДКЕ ЕЕ ПРОХОЖДЕНИЯ) Диспансеризация проводится бесплатно по полису ОМС в поликлинике по месту жительства (прикрепления) в со...»

«Малхасян Артем Витальевич АГРАРНО-ПРАВОВЫЕ ПРОБЛЕМЫ В СФЕРЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ 12.00.06 – Земельное право; природоресурсное право; экологическое право; аграрное право Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель доктор юридических...»

«УДК 544.6 ВЛАГОПЕРЕНОС В БИКОМПОНЕНТНЫХ КОНСЕРВАЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ НА БАЗЕ НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ Н. Е. Беспалько Кафедра "Безопасность жизнедеятельности и военная подготовка", ФГБОУ ВПО "ТГТУ"; bgd@mail.nnn.tstu.ru Ключевые слова...»

«АНАЛИЗ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ В БЕЛАРУСИ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ПЕРСПЕКТИВ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ* Елена Ракова** Резюме Зависимость от одного поставщика топливно-энергетических ресурсов и превалирова...»

«Для экологического номера Journal of Eurasian Research в 2004 г. Экологическое образование в сообществах Евгений Патаракин, Сергей Шустов Ключевые слова: экологическое образование, сетевые сообщества Введение В последнее время...»

«Хайбрахманов Тимур Салаватович КАРТОГРАФИЧЕСКАЯ БАЗА ДАННЫХ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКОЛОГО-ГЕОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ Специальность 25.00.33 – картография Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель в.н.с., к.г.н. Лабутина И.А. Москва –...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО ГОРОДСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ ПОСТАНОВЛЕНИЕ г. Аксай № 1167 26.12.2013г. Об утверждении стоимости услуг, предоставляемых МУП АГП "Аксайское кладбище" согласно гарантированному перечню услуг по погребению В соответствии с Федеральным законом от 12.01.1996 N 8-ФЗ О погребении и похоронном деле, Областным законом Росто...»

«УДК 612.017.1:616-097 КОЛИКОВА ЮЛИЯ ОЛЕГОВНА АУТОАНТИТЕЛА К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2003 Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Ишмухаметова Д.Г. Официальные оппоненты:...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт наук о Земле Кафедра физической географии и экологии Марьинских Дмитрий Ми...»

«ООО "РЗА СИСТЕМЗ" г. Москва Щиты оперативного постоянного тока серии ШОТ1М с ограниченными функциональными характеристиками РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ ЕАБР.656574.003-01 РЭ 2012 г. Наименование Редакция Дата 03.10.11 г. Версия №0 Оригинальное издание 16.05.12 г. Версия №1 Издание №1 Содержани...»

«Всероссийская научно-практическая конференция "Экология и безопасность в техносфере: современные проблемы и пути решения" ванные системы по управлению пожарно-спасательными формированиями, прогнози...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2012. № 4 (20). С. 145–161 УДК 575.86:599.322.2 М.В. Цвирка, В.П. Кораблёв Биолого-почвенный институт ДВО РАН (г. Владивосток) ГЕНЕТИЧЕСКАя ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИя ДЛИННОхВОСТОГО СУСЛИКА (Spermophilus undulatus) ПО ДАННЫМ RAPD-PCR-АНАЛИЗА...»

«4 истории в картинках Я сделал свою первую мультимедийную презентацию в 17 лет. Она предназначалась для большого проекта на школьном уроке биологии и была посвящена загрязнению окружающей среды. Мое...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 119-126. УДК 591.5:598.113.6 ЖИВОРОДЯЩАЯ ЯЩЕРИЦА, LACERTA VIVIPARA, КАК ИНТЕГРАЦИОННАЯ МОДЕЛЬ Б...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 77–97 УДК [597.6+598.1](571.1) Л.А. Эпова1, В.Н. Куранова2, С.Г. Бабина1 Государственный природный заповедник "Кузнецкий Алатау" (г. Междуреченск) Томский государственный университет (г. Томск) ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, БИОТОПИЧЕ...»

«Конференция учащихся муниципальных образовательных учреждений города Калуги "СТАРТ В НАУКУ" Секция: Экология Если не мы, то кто же? (Спасение лесной орхидеи) Автор: Мозгин Тихон, ученик 2 "А" класса МБОУ "Средняя общеобразовательная школа № 13" г. Калуги Научный руководитель: учитель начальных классов Демичева Елена А...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.