WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я: член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук Э. И. Коломиец, академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, ...»

-- [ Страница 2 ] --

Данные литературы, касающиеся характеристики -амилаз молочнокислых и бифидобактерий, а также их субстратной специфичности, каталитических и физико-химических свойств, представлены очень скудно.

Бактерии Lactobacillus aylovorus продуцируют -амилазу молекулярной массой 150 кДа [64], L. plantarum MCC1407 – 75,45 кДа [44]. Молекулярная масса ферментов других представителей молочнокислых бактерий варьируется в пределах от 150 до 250 кДа [65, 66].

Молекулярная масса внеклеточной -амилазы Lactobacillus fermentum составляет 106 кДа и по величине соответствует массам ферментов, продуцируемых L. aylovorus, L. ferentu и L. anihotivoran [43]. Изоэлектрические точки указанных ферментов также идентичны (pI 3,6). В то же время -амилаза L. ferentu отличается от сравниваемых ферментных белков аминокислотным составом и содержанием в ее молекуле двух равных частей – N-концевой (каталитической) и С-концевой (повторов).

Внеклеточная -амилаза Lactococcus lactis IBB500 характеризуется величиной молекулярной массы 121 кДа и оптимумом действия при рН 4,5 и температуре 35 °С [53]. Фермент L. lactis M 1363 проявляет максимум гидролитической активности при рН 5,0 и температуре 55 °С, предпочитая в качестве субстратов

-циклодекстрин, крахмал, пуллулан, и обладает трансгликозидазной активностью, приводящей к синтезу мальтоолигосахаридов из раствора осахаренного кукурузного крахмала [50].

Трансгликозилазной активностью, приводящей к синтезу разветвленных мальтоолигосахаридов из кукурузного крахмала с выходом 53,1%, обладает также -амилаза Lactobacillus gassery ACC33323 (AMA) [50]. Ферментный белок проявляет максимум активности при рН 5,0 и температуре 55 °С, катализирует гидролиз бета-циклодекстрина, крахмала и пуллулана.

Оптимальным условиям действия -амилазы L. ferentu соответствуют температура 40 °С и рН 5,0, что отличает ее от сопоставляемых ферментов L. plantaru и L. anihotivorans [43].

Продуктами гидролиза крахмала с участием всех трех ферментных белков являются мальтотриоза и мальтотетраоза. В результате действия ферментов L. anihotivorans и L. plantaru дополнительно образуется мальтоза. При гидролизе мальтогексозы -амилазой L. plantaru высвобождается мальтоза и мальтотриоза.

Установлено ингибирование -амилазы L. fermentum акарбозой по смешанному неконкурентному типу, а ферментов L. plantaru и L. anihotivorans – по неконкурентному. Авторы, основываясь на полученных экспериментальных данных, делают вывод о том, что в структуре ферментов в дополнение к каталитически активному сайту имеется субстрат(продукт)связывающий сайт.

Величины молекулярной массы и изоэлектрической точки очищенного внеклеточного фермента Bidobacteriu adolescentis Int-57 составляют соответственно 66 кДa и рI 5,2 [46]. -Амилаза проявляет максимум активности при 50 °С и рН 5,5, стабильна в диапазоне температуры 20–40 °С при рН 5,0–6,0. Величина константы Михаэлиса фермента по отношению к растворимому крахмалу составляет 2,4 г/л, энергия активации – 43,3 кДж/моль. Фермент ингибируют мальтоза (10%), глюкоза (10%), Cu2+ (5 ммоль), Zn2+ (5 ммоль), N-бромосукцинимид (5 ммоль), ЭДТА (5 ммоль), I2 (1 ммоль), активирует – -меркаптоэтанол (10 нмоль).

Внеклеточная очищенная -амилаза, продуцируемая L. anihotivorans в среде с крахмалом, – белок с молекулярной массой 135 кДа и pI 3,8 [32]. Оптимум ее действия отмечается при температуре 55 °С и рН 5,5. Фермент стабилен в диапазоне рН 5,0–6,0 и полностью инактивируется при 55 °С в течение 1 ч. Растворимый крахмал оказывает на -амилазу стабилизирующее действие. Величина константы Михаэлиса фермента составляет 3,44 мг/мл, энергия активации – 32,55 кДж/моль. Предпочтительный субстрат для действия -амилазы L. anihotivorans – амилоза. В меньшей мере подвержены ферментативному гидролизу крахмал и амилопектин. Ионы Al3+, e3+ и Hg2+ (10 ммоль) полностью ингибируют активность фермента.





-Амилаза штамма EM 220 Lactobacillus acidophilus предпочтительно гидролизует амилопектин с образованием мальтозы, мальтотриозы и небольшого количества глюкозы при рН 5,5 и температуре 55 °С [57]. Аналогичными свойствами характеризуется также фермент, продуцируемый L. vitelinus EM 202. В то же время максимум активности -амилазы штамма EM 207 L. acidophilus выявляется при рН 6,4 и 40 °С. Продуктами гидролиза амилопектина с участием фермента являются мальтоза, мальтотриоза и карбогидраты большей степени олигомерности, чем мальтотриоза.

Lactobacillus plantarum А6 продуцирует комплекс амилолитических ферментов, которые теряют активность в результате ограниченного протеолиза в условиях субоптимальных значений рН [41]. Полипептидный фрагмент, образующийся при обработке фермента проназой Е, становится более кислым, однако каталитическую активность не теряет. В этом случае, согласно результатам выполненных с использованием сканирующего микроскопа исследований, сродство ферментного белка к растворимому крахмалу не изменяется, однако становится существенно меньшим по отношению к гранулированному крахмалу.

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что изучение особенностей биосинтеза -амилаз бактерий родов Lactobacillus, Lactococcus и Bidobacteriu, выявление или уточнение структуры, субстратной специфичности и свойств ферментных белков по-прежнему остаются актуальными. Однако в последние годы внимание исследователей акцентируется главным образом на выделении, молекулярногенетической характеристике и клонировании генов, ответственных за синтез -амилаз с целью создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов бифидо- и молочнокислых бактерий для их индустриального использования.

Литература

1. Microbial -amylases: a biotechnological perspective / R. upta [et al.] // Process Biochem. – 2003. – Vol. 8, N 11. – P. 1599–1616.

2. Reddy, N. S. An overview of the microbial -amylase family / N.. Reddy, A. Nimmagadda, R.. Rao // African J. Biotechnol. – 2003. – Vol. 2, N 12. – P. 645–648.

3. Niga, P. Enzyme and microbial systems involved in starch processing / P. Nigam,. ingh // Enzyme Microbial echnol. – 1995. – Vol. 17. – P. 770–778.

4. Vihinen, M. Microbial amylolytic enzymes. Review / M. Vihinen, P. Mntsl // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. – 1989. – Vol. 24, N 4. – P. 329–418.

5. Janeek, S. equence similarities and evolutionary relationships of microbial, plant and animal alpha-amylases /. Janeek // Eur. J. Biochem. – 1994. – Vol. 224, N 2. – P. 519–524.

6. Ray, R. R. Beta-amylases from various fungal strains. A review / R. R. Ray // Acta Microbiol. Immunol. Hung. – 2004. – Vol. 51, N 1–2. – P. 85–95.

7. Advances in microbial amylases. Review / A. Pandey [et al.] // Biotechnol.

Appl. Biochem. – 2000. – Vol. 31 (Pt. 2). – P. 135–152.

8. Horvthov, V. Amylolytic enzymes: molecular aspects of their properties / V. Horvthov,. Janecek, E. turdk // en. Physiol. Biophys. – 2001. – Vol. 20, N 1. – P. 7–32.

9. Properties and applications of starch-converting enzymes of the -amylase family / M. J. E. C. van de Maarel [et al.] // J. Biotechnol. – 2002. – Vol. 94. – P. 137–155.

10. irect evolution of a bacterial -amylase: toward enhanced pH-performance and higher specific activity / C. Bessler [et al.] // Protein ci. – 2003. – Vol. 12. – P. 2141–2149.

11. -Amylases from microbial sources – An verview on recent developed /. ivaramakrishnan [et al.] // ood echnol. Biotechnol. – 2006. – Vol. 44, N 2. – P. 173–184.

12. Stiles, M. E. Review article: lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy / M. E. tiles, W. H. Holzapfel // Int. J. ood Microbiol. – 1997. – Vol. 36. – P. 1–29.

13. Amylolytic bacterial lactic acid fermentation – a review /. Reddy [et al.] // Biotechnol. Adv. – 2008. – Vol. 26. – P. 22–34.

14. Yadav, A. K. Bioconversion of renewable resources into lactic acid: an industrial view / A. K. Yadav, A. B. Chaudhari, R. M. Kothari // Crit. Rev. Biotechnol. – 2011. – Vol. 31, N 1. – P. 1–19.

15. Lee, H. S. Amylolytic cultures of Lactobacillus acidophilus: potential probiotics to improve dietary starch utilization / H.. ee,. e,. Carter // J. ood ci. – 2001. – Vol. 66, N 2. – P. 338–344.

16. Nakaura, L. K. Lactobacillus aylolyticus. A new starch hydrolyzing species from swine waste corn fermentation /. K. Nakamura, C.. Crowell // ev.

Ind. Microbiol. – 1979. – Vol. 20. – P. 531–540.

17. Lactobacillus aylolyticus sp. nov., isolated from beer malt and beer wort / I. Bohak [et al.] // yst. Appl. Microbiol. – 1998. – Vol. 21. – P. 360–364.

18. Nakaura L. K. Lactobacillus aylophilus, a new starch-hydrolyzing species from swine waste-corn fermentation /. K. Nakamura, C.. Crowell // ev.

Ind. Microbiol. – 1979. – Vol. 20. – P. 535–540.

19. Kinetics of lactic acid fermentations on glucose and corn by Lactobacillus aylophilus / P. Mercier [et al.] // J. Chem. echnol. Biotechnol. – 1992. – Vol. 55. – P. 111–121.

20. Amylolytic bacteria producing lactic acid / C. Vishnu [et al.] // J. ci. Ind.

Res. – 1998. – Vol. 57. – P. 600–603.

21. Vishnu, C. irect fermentation of various pure and crude starchy substrates to (+) lactic acid using Lactobacillus aylophilus V6 / C. Vishnu,. eenayya,. Reddy // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – Vol. 18. – P. 429–433.

22. Nakaura, L. K. Lactobacillus aylovorus, a new starch-hydrolyzing species from waste corn fermentation /. K. Nakamura // Int. J. yst. Bacteriol. – 1981. – Vol. 31. – P. 56–63.

23. Zhang, D. X. irect fermentation of starch to lactic acid by Lactobacillus aylovorus /.. Zhang, M. Cheryan // Biotechnol. ett. – 1991. – Vol. 10. – P. 733–738.

24. Jore, J. P. M. tudies on the -amylase of Lactobacillus aylovorus as a model for heterologous protein secretion by lactobacilli / J. P. M. Jore, J. e Parasis // EM Microbiol. Rev. – 1993. – Vol. 12. – P. 26–29.

25. Giraud, E. Molecular characterization of the -amylase genes of Lactobacillus plantarum A6 and Lactobacillus aylovorus reveals an unsual 3 end structure with direct tandem repeats and suggests a common evolutionary origin / E. iraud,. Cuny // ene. – 1997. – Vol. 198. – P. 149–157.

26. Comparative characterization of complete and truncated forms of Lactobacillus aylovorus alpha-amylase and role of the C-terminal direct repeats in raw-starch binding / R. Rodriguez anoja [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, N 8. – P. 3350–3356.

27. Sen, S. Amylase from Lactobacillus cellobiosus -39 isolated from vegetable wastes: purification and characterization /. en,.. Chakrabarty // J. Appl. Bacteriol. – 1986. – Vol. 60. – P. 419–423.

28. Production of lactic acid by direct fermentation of starchy wastes by an amylase-producing Lactobacillus / M. Chatterjee [et al.] // Biotechnol. ett. – 1997. – Vol. 19. – P. 873–874.

29. Isolation and characterization of new amylolytic strains of Lactobacillus fermentum from fermented maize doughs (mawe and ogi) from Benin / V. J. P. Agati [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 1998. – Vol. 85. – P. 512–520.

30. tudy of starch fermentation at low pH by Lactobacillus fermentum gi E1 reveals uncoupling between growth and alpha-amylase production at pH 4.0 / M. Calderon antoyo [et al.] // Int. J. ood Microbiol. – 2003. – Vol. 80, N 1. – P. 77–87.

31. Lactobacillus anihotivorans sp. nov., a new starch-hydrolyzing lactic acid bacterium isolated from cassava sour starch fermentation / J. Morlon-uyot [et al.] // Int. J. yst. Bacteriol. – 1998. – Vol. 48. – P. 1101–1109.

32. Purification and characterization of an extracellular alpha-amylase produced by Lactobacillus manihotivorans M18010(), an amylolytic lactic acid bacterium /. Aguilar [et al.] // Enzyme Microb. echnol. – 2000. – Vol. 27, N 6. – P. 406–413.

33. Guyot, J. P. Effect of pH control on lactic acid fermentation of starch by Lactobacillus manihotivorans M18010 / J. P. uyot, M. Calderon, J. Morlonuyot // J. Appl. Microbiol. – 2000. – Vol. 88, N 1. – P. 176–182.

34. Guyot, J. P. Effect of different cultivation conditions on Lactobacillus manihotivorans N32, an amylolytic lactobacillus isolated from sour starch cassava fermentation / J. P. uyot, J. Morlon-uyot // Int. J. ood Microbiol. – 2001. – Vol. 67, N 3. – P. 217–225.

35. Characterization and differentiation of Lactobacillus manihotivorans strains isolated from cassava sour starch / J. P. uyot [et al.] // Int. J. ood Microbiol. – 2003. – Vol. 87, N 1–2. – P. 187–192.

36. Ohkouchi, Y. irect production of + -lactic acid from starch and food wastes using Lactobacillus manihotivorans M18011 / Y. hkouchi, Y. Inoue // Bioresour. echnol. – 2006. – Vol. 97, N 13. – P. 1554–1562.

37. Isolation and physiological study of an amylolytic strain of Lactobacillus plantarum / E. iraud [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1991. – Vol. 36. – P. 379–383.

38. Giraud, E. egradation of raw starch by a wild amylolytic strain of Lactobacillus plantarum / E. iraud, A. Champailler, M. Raimbault // Appl.

Microbiol. Biotechnol. – 1994. – Vol. 60, N 12. – P. 4319–4323.

39. evelopment of an amylolytic alpha-amylase gene / A. itzsimons [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60, N 10. – P. 3529–3535.

40. Characterization of starch hydrolyzing lactic acid bacteria isolated from a fermented fish and rice food «Burong Isda» and its amylolytic enzyme / M. lympia [et al.] // J. erment. Bioeng. – 1995. – Vol. 80. – P. 124–130.

41. Lactobacillus plantaru amylase acting on crude starch granules. Native isoforms and activity changes after limited proteolysis / J. A. lorncio [et al.] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2000. – Vol. 84–86. – P. 721–730.

42. Sanni, A. New efficient amylase-producing strains of Lactobacillus plantaru and L. ferentu isolated from different Nigerian traditional fermented foods / A. anni, J. Morlon-uyot, J. P. uyot // Int. J. ood Microbiol. – 2002. – Vol. 72. – P. 53–62.

43. Isolation, characterization and inhibition by acarbose of the alpha-amylase from Lactobacillus fermentum: comparison with L. anihotivorans and L. plantarum amylases / P. alamond [et al.] // Comp. Biochem. Physiol. Part B. Biochem.

Mol. Biol. – 2002. – Vol. 133, N 3. – P. 351–360.

44. tatistical optimization of alpha-amylase production by probiotic Lactobacillus plantarum MCC1407 in submerged fermentation /. H. Panda [et al.] // Pol.

J. Microbiol. – 2008. – Vol. 57, N 2. – P. 149–155.

45. Efficient production of optically pure -lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified -lactate dehydrogenase gene-deficient and alpha-amylase-secreted Lactobacillus plantaru strain / K. kano [et al.] // Appl. Environ.

Microbiol. – 2009. – Vol. 75, N 2. – P. 462–467.

46. Lee, S. K. Note: purification of amylase secreted from Bidobacteriu adolescentis /. K. ee, Y. B. Kim,. E. Ji // J. Appl. Microbiol. – 1997. – Vol. 83, N 3. – P. 267–272.

47. Новик, Г. И. Продукция гидролаз и естественная антибиотикорезистентность бифидо- и молочнокислых бактерий / Г. И. Новик, Н. И Астапович, Н. Е. Рябая // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43, № 2. – С. 164–172.

48. Ryan, S. M. creening and identification of starch-, amylopectin-, and pullulan-degrading activities in Bifidobacterial strains /. M. Ryan,.. itzgerald,. van inderen // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72, N 8. – P. 5289–5296.

49. Protein secretion in Lactococcus lactis: an efficient way to increase the overall heterologous protein production / Y. e oir [et al.] // Microb. Cell actories. – 2005. – Vol. 4, N 2. – P. 1–13.

50. Extracellular secretion of a maltogenic amylase from Lactobacillus gassei ACC33323 in Lactococcus lactis M1363 and its application on the production of branched maltoolygosaccharides / M.-H. Cho [et al.] // J. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 17, N 9. – P. 1521–1526.

51. Improvement in lactic acid production from starch using alpha-amylasesecreting Lactococcus lactis cells adapted to maltose or starch / K. kano [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 75, N 5. – P. 1007–1013.

52. Petrov, K. + -lactic acid production from starch by a novel amylolytic Lactobacillus lactis subsp. lactis B84 / K. Petrov, Z. Urshev, P. Petrova // ood Microbiol. – 2008. – Vol. 25, N 4. – P. 85–91

53. Wako, A. A new protein of -amylase activity from Lactococcus lactis / A. Wako, M. Polak-Berecka, Z. argosli // J. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – Vol. 20, N 9. – P. 1307–1313.

54. echnological properties of Lactobacillus fermentum involved in the processing of dolo and pito, West African sorghum beers, for the selection of starter cultures / Y. awadogo-ingani [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2008. – Vol. 104, N 3. – P. 873–882.

55. election of Lactobacillus sp. PC101 that produces active dietary enzymes such as amylase, lipase, phytase and prorease in pigs / E.-Y. Kim [et al.] // J. en.

Appl. Microbiol. – 2007. – Vol. 53. – P. 111–117.

56. Thosen, M. H. Batch fermentations on synthetic mixed sugar and starch medium with amylolytic lactic acid bacteria / M. H. homsen, J. P. uyot, P. Kiel // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 74, N 3. – P. 540–546.

57. Amylase production by three Lactobacillus strains isolated from chicken crop / M. Champ [et al.] // J. Appl. Bacteriol. – 1983. – Vol. 55, N 3. – P. 487–493.

58. Heterologous expression and secretion of Lactobacillus aylovorus

-amylase in Leuconostoc citreum / H.-J. Eom [et al.] // Biotechnol. ett. – 2009. – Vol. 31. – P. 1783–1788.

59. Rodriguez Sanoja, R. Electrotransformation of Lactobacillus manihotivorans M 18010 and M 18011 / R. Rodriguez anoja, J. Morlon-uyot, J. P. uyot // J. Appl. Microbiol. – 1999. – Vol. 87, N 1. – P. 99–107.

60. oreign gene expression and secretion system in the genus Bidobacteriu to produce functional lactid acid bacteria product producing useful protein: пат.

20040087056 (A) Корея, IPC1–7: C12N15/56 /. E. Ji, M.. Park; заявитель Bifido Co td. – № 20030021296; заявл. 04.04.03; опубл. 13.10.04.

61. Bidobacteria-bacillus-coli shuttle expression vector, preparation method and application thereof: пат. 101220370(А) Китай, IPC1–7: А61Л39/108; А61К39/39;

А61Р31/04; С12N1/21; С12N15/31; С12N15/70; С12N15/74; C12R1/01; C12R1/19 / M. Yongping; заявитель Chongqing University of Medica. – № 20081300178;

заявл. 22.01.08; опубл. 16.07.08.

62. tarch-binding domain affects catalysis in two Lactobacillus alpha-amylases / R. Rodrguez-anoja [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71, N 1. – P. 297–302.

63. Tarahojoo, S. New strategy for enhancement of microbial viability in simulated gastric conditions based on display of starch-binding domain on cell surface /. arahomjoo, Y. Katakura,. hioya // J. Biosci. Bioeng. – 2008. – Vol. 105, N 5. – P. 503–507.

64. Burges-Casler, A. High-molecular-weight amylase activities from bacteria degrading starch-plastic films / A. Burges-Casler,. Imam, M. ould // Appl.

Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 57. – P. 612–614.

65. Burgess-Cassler, A. P. Partial purification and comparative characterization of alpha-amylase secreted by Lactobacillus aylovorus / A. P. Burgess-Cassler, A. Imam // Curr. Microbiol. – 1991. – Vol. 23. – P. 207–213.

66. Ia, S. H. A study of cornstarch granule digestion by an unusually high molecular weight alpha-amylase secreted by Lactobacillus aylovorus /. H. Imam // Cur. Microbiol. – 1991. – Vol. 22. – P. 365–370.

–  –  –

Л. И. САПУНОВА, А. Г. ЛОБАНОК, А. Н. ПАВЛЮК, Л. В. ЕРХОВА, А. А. КОСТЕНЕВИЧ

СИНТЕЗ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ И ПРОТЕИНАЗЫ

БАКТЕРИЯМИ РОДА ARTHROBACTER, РАСТУЩИМИ

В СРЕДАХ РАЗЛИЧНОГО СОСТАВА

Лаборатория ферментов Проведена оценка бета-галактозидазной и протеиназной активности коллекционных культур бактерий рода Arthrobacter, растущих в средах различного состава. С учетом высокого уровня синтеза бета-галактозидазы и/или протеазы штаммы БИМ В-2239, БИМ В-2240, БИМ В-2241 и БИМ В-2242 Arthrobacter sp. отобраны как перспективные для получения из молока и отходов его переработки кормов с пониженным содержанием казеина и/или лактозы.

Введение. Род Arthrobacter принадлежит к классу Actinobacteria и включает гетерогенную группу аэробных грамположительных преимущественно сапрофитных бактерий, за исключением отдельных оппортунистических патогенов, представленных видами Arthrobacter scleroae, A. albus, A. creatinolyticus, A. cuinsii, A. luteolus, A. sanguinis, A. woluwensis [1]. Бактерии рода Arthrobacter обитают повсеместно в природе, утилизируют широкий спектр органических и неорганических соединений, выполняя тем самым важную функцию в круговороте веществ в природе, в формировании гумусного слоя почвы и детоксикации ксенобиотиков [2].

Многие виды этой группы бактерий являются коммерческими продуцентами биологически активных веществ, включая ферменты [3]. Однако данные о протеиназах, синтезируемых представителями рода Arthrobacter, и возможностях их практического использования немногочисленны. Так, для получения препаратов протеолитического действия предлагаются штаммы Arthrobacter ramosus [4] и Arthrobacter sp. [5]. Сообщается также об использовании протеиназ других видов рода Arthrobacter для получения N-ацил--метионинов [6] и депротеинизации сырья при производстве пищевого продукта с низким содержанием холестерина [7].

Ранее нами среди коллекционных культур бактерий рода Arthrobacter были выделены, а затем селектированы и запатентованы штаммы – высокоактивные продуценты глюкозоизомеразы [8] и бета-галактозидазы [9, 10]. Показана целесообразность использования штамма Arthrobacter sp. БИМ В-2242, продуцирующего внеклеточную бета-галактозидазу трансгликозилирующего действия, для получения биологически активной кормовой добавки на основе молока и продуктов его переработки [11].

Однако качество кормовой добавки определяется эффективностью ферментативного гидролиза не только лактозы, но также казеина и других белков, содержащихся в указанных субстратах и вызывающих у животных диспепсию и аллергические реакции.

Цель исследования – оценка бета-галактозидазной и протеолитической активности культур бактерий рода Arthrobacter, растущих в средах различного углеводного и азотного состава.

Объекты и методы исследования. В работе использовали культуры бактерий рода Arthrobacter, хранящиеся в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов.

Для пересева и хранения бактериальных культур использовали агаризованную пептонно-дрожжевую среду, содержащую (в г/л):

глюкозу – 5,0; пептон – 10,0; дрожжевой экстракт– 5,0; NaCl – 5,0; агар-агар – 15,0.

Глубинное выращивание бактерий рода Arthrobacter проводили при 27–29 °С в течение 72 ч в колбах Эрленмейера c 50 мл питательных сред следующего состава (в %): пептон – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,5; Mg4·7H2 – 0,1; K 2HP4 – 0,3. Источником углерода и специфического субстрата в среде для синтеза бетагалактозидазы бактериями служила лактоза и содержащие ее сухое молоко или сухая молочная сыворотка в количестве 1,5% в пересчете на содержание дисахарида, казеин и белки в составе молока и молочной сыворотки, а индукторами синтеза протеиназы – пептон и дрожжевой экстракт. Исходное значение рН среды – 6,8 ± 0,1.

Питательные среды инокулировали 3 об.% суспензии клеток бактерий (ОП540 = 0,2), полученных на пептонно-дрожжевом агаре при 27–29 °С в течение 72 ч.

По окончании культивирования клетки бактерий отделяли центрифугированием (8000 g, 15 мин) при комнатной температуре.

Активность -галактозидазы определяли спектрофотометрическим методом с использованием о-нитрофенил---галактозида в качестве субстрата [12]. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее гидролиз субстрата с образованием 1 мкмоля 4-нитрофенола при рН 7,0 и 40 °С за 1 мин.

Активность протеиназы определяли методом Ансона в модификации [13]. Метод основан на учете продуктов ферментативного гидролиза казеина (рН 8,0), представленных пептидами и аминокислотами и имеющих максимум поглощения при 280 нм.

За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, катализирующее высвобождение неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов гидролиза субстрата в количестве, соответствующем приросту оптической плотности (ОП280) реакционной среды на 0,01 при 37 °С в течение 1 мин.

Протеолитическую активность вычисляли по формуле: ПА = ОП280 100 n / Vферм t, где ОП280 – оптическая плотность опытного образца в сравнении с контрольным; n – разведение ферментного раствора, раз; t – длительность реакции гидролиза, мин; 100 – коэффициент, учитывающий прирост оптической плотности реакционной среды на 0,01; Vферм – количество ферментного раствора, взятого на анализ, мл.

Активность протеиназы и бета-галактозидазы выражали в условных единицах в расчете на 1 мл культуральной жидкости (ед/мл) или на 1 мг белка (ед/мг белка, удельная активность).

Содержание белка в ферментных растворах определяли по Брэдфорд [14] и выражали в мг/мл, величину рН – потенциометрически.

Приведенные экспериментальные данные являются средним арифметическим результатов 2–3 опытов, выполненных в трехкратной повторности.

Результаты и их обсуждение. Ранее было установлено, что штаммы 2239, 2240, 22441 и 2242 Arthrobacter sp. в среде с лактозой активно синтезируют внеклеточные бета-галактозидазы с оптимумом действия при рН 7,0 [9, 15, 16]. Результаты сравнительной оценки синтеза бета-галактозидаз бактериями в средах, содержащих молоко и молочную сыворотку в качестве единственного источника лактозы, приведены в табл. 1–3.

Анализ экспериментальных данных свидетельствует о том, что именно указанные выше штаммы 2239, 2240, 22441 и 2242 Arthrobacter sp. выделяются среди 9 исследованных коллекционных культур бактерий рода Arthrobacter наиболее активным синтезом бета-галактозидазы также и в процессе роста в средах с молоком и молочной сывороткой. При этом максимум накопления внеклеточного фермента в среде с лактозой наблюдается у Arthrobacter sp. 2240 (17,30 ед/мл), в среде с молочной сывороткой – у Arthrobacter sp. 2241 (11,90 ед/мл) и Arthrobacter sp. 2242 (10,25 ед/мл), в среде с молоком – у Arthrobacter sp. 2241 (19,35 ед/мл).

Невысокой внеклеточной бета-галактозидазной активностью характеризуется A. oxydans БИМ B-248, независимо от состава используемых для его культивирования сред, следовой – A. cit-.

reus БИМ B-3 (0,04–0,12 ед/мл) и A. ureafaciens БИМ B-6 (0,01– 0,03 ед/мл), а также A. crystallopoietes БИМ B-13 (0,01 ед/мл), утилизирующий лактозу молока и молочной сыворотки, и A. glo-.

biformis БИМ B-10 (0,01 ед/мл), растущий в средах с лактозой и молоком.

Исследовали также способность культур бактерий рода Arthrobacter продуцировать протеиназы, гидролизующие казеинат натрия преимущественно в нейтральной или слабощелочной зоне рН, что соответствует кислотно-щелочным условиям получения кормовой добавки с использованием молока или отходов его переработки. Полученные результаты представлены в табл. 1–3.

Т а б л и ц а 1. Синтез бета-галактозидазы и протеазы бактериями рода Arthrobacter в среде с лактозой Бета-галактозидаза Протеаза рН Белок, Культура бактерий конечный мг/мл ед/мл ед/мг белка ед/мл ед/мг белка Arthrobacter sp.

БИМ B-2239 6,6 0,28 3,92 14,000 2,04 7,286 Arthrobacter sp. БИМ B-2240 6,6 0,24 17,30 72,083 0,20 0,833 Arthrobacter sp. БИМ B-2241 6,3 0,34 9,05 26,618 0,31 0,912 Arthrobacter sp. БИМ B-2242 6,9 0,37 7,57 20,459 0 0 A. citreus БИМ B-3 5,5 0,28 0,04 0,143 0 0 A. ureafaciens БИМ B-6 8,3 0,32 0,03 0,094 0,86 2,688 A. crystallopoietes БИМ B-13 8,3 0,31 0 0 0,17 0,548 A. oxydans БИМ B-248 8,6 0,34 0,18 0,529 0,08 0,235 A. globiforis БИМ B-10 8,1 0,17 0,01 0,059 0,03 0,176 Т а б л и ц а 2. Синтез бета-галактозидазы и протеазы бактериями рода Arthrobacter в среде с молочной сывороткой

–  –  –

Arthrobacter sp. БИМ B-2239 6,85 2,19 1,06 0,484 0,30 0,137 Arthrobacter sp. БИМ B-2240 5,7 3,12 7,15 2,292 2,80 0,897 Arthrobacter sp. БИМ B-2241 7,0 3,24 19,35 5,972 0,41 0,127 Arthrobacter sp. БИМ B-2242 6,4 4,16 8,54 2,053 0 0 A. citreus БИМ B-3 6,3 4,35 0,06 0,014 0 0 A. ureafaciens БИМ B-6 8,4 2,95 0,02 0,007 0 0 A. crystallopoietes БИМ B-13 8,1 3,07 0,01 0,003 0,61 0,199 A. oxydans БИМ B-248 7,1 3,39 0,79 0,233 0,51 0,150 A. globiforis БИМ B-10 7,9 4,97 0,01 0,002 0,55 0,111 Анализ экспериментальных данных показывает, что только штамм Arthrobacter sp. БИМ В-2242 активно растет во всех исследуемых средах и не синтезирует при этом специфичную по отношению к казеину протеиназу. В условиях опыта не выявляетcя также протеолитическая активность у A. citreus БИМ B-3, растущего в средах с лактозой и молоком, у Arthrobacter sp. БИМ B-2239, Arthrobacter sp. БИМ 2240 и A. crystallopoietes БИМ B-13 – в среде с молочной сывороткой, а у A. ureafaciens БИМ B-6 – в среде с молоком.

В то же время именно вышеперечисленные штаммы, за исключением A. crystallopoietes БИМ B-13, оказались наиболее активными продуцентами протеиназы. Так, максимальный уровень образования фермента, в условиях опыта достигающий 2,80 ед/мл, выявлен у Arthrobacter sp. БИМ B-2240 в среде с молоком, у Arthrobacter sp. БИМ B-2239 – в среде с лактозой (2,04 ед/мл), у A. ureafaciens БИМ B-6 (1,36 ед/мл) и A. citreus БИМ B-3 (1,07 ед/мл) – в среде с молочной сывороткой.

Сравнительно невысокий уровень синтеза протеиназы, составляющий от 0,17 до 0,61 ед/мл, обнаружен у штамма A. crystallopoietes БИМ B-13, растущего в средах с лактозой и молоком, и у Arthrobacter sp. БИМ B-2241 (0,31–0,58 ед/мл) – в средах с лактозой, молочной сывороткой и молоком.

Следует подчеркнуть, что только фермент, синтезируемый Arthrobacter sp. БИМ B-2239 в среде с лактозой, характеризуется максимально высокой удельной активностью – 7,29 ед/мг белка.

Этот показатель каталитической активности протеиназ других исследуемых бактерий составлял от 0,127 ед/мг белка у Arthrobacter sp. БИМ B-2241 до 0,897 ед/мг белка – у Arthrobacter sp. БИМ B-2240.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что различный уровень протеолитической активности при интенсивном росте всех без исключения исследованных представителей рода Arthrobacter в испытанных средах может быть следствием влияния на процесс условий культивирования, а также регуляторной функции присутствующих в среде углеводов, белков, пептидов и аминокислот. Так, например, из 54 бактериальных культур, изолированных из ила озера onar (Индия), максимальным уровнем продукции протеиназы обладал штамм A. raosus, растущий в среде с 1,0% соевого жмыха в качестве единственного источника углерода и азота [17]. При его замене казеином, дрожжевым экстрактом, триптоном или желатином образование фермента бактериями снижалось соответственно в 2,1; 6,8; 16,7 и 56,8 раза.

Показано, что необходимым условием синтеза протеиназ A. aureus [18] и Arthrobacter sp. [19–21] является наличие в среде культивирования белков и пептидов, концентрация которых оказывает на образование фермента регуляторное действие.

Протеиназы, катализирующие гидролиз казеината натрия, s1и -казеина, продуцирует A. nicotianae 9458 в среде с дрожжевым экстрактом [22], а фермент, гидролизующий казеин, – Arthrobacter sp. в минимальной и комплексной среде, содержащей белок [23]. Сообщается также и о независимом от наличия в среде экзогенных белковых субстратов биосинтезе протеиназы штаммом Arthrobacter sp. [24].

Сахариды и некоторые аминокислоты репрессируют синтез и/или секрецию внеклеточной протеиназы у штамма Arthrobacter sp., выделенного из травяного настоя [19]. Добавление в среду таких легкометаболизируемых источников углерода, как глюкоза, сукцинат, цитрат, сахароза или глицерин, снижает продукцию протеазы у A. aureus в 3–10 раз [18]. Моно-, ди- или полисахариды вызывают репрессию синтеза ферментного белка у A. raosus в 1,3–6,0 раз [17]. В то же время штамм Arthrobacter sp. активно синтезирует протеиназу в присутствии легкометаболизируемых углеводов [5].

Кроме того, известно, что микроорганизмам, утилизирующим экзогенные белки, свойственен синтез как вне- и внутриклеточных протеиназ, так и клеточносвязанных пептидаз. Так, например, Arthrobacter sp. В22 [20] и A. nicotianae [25] продуцируют только внеклеточные протеазы, катализирующие гидролиз белков с образованием пептидов. В то же время штамм Arthrobacter sp. синтезирует внеклеточную протеиназу и ассоциированную с клеточной стенкой аминопептидазу широкой субстратной специфичности, специфичные пролин-иминои пролин-имидопептидазы, а также эндопептидазу, гидролизующую казеин [23]. Сообщается также о синтезе штаммом A. nicotianae 9458 двух внеклеточных молекулярных форм протеиназ, катализирующих гидролиз казеината натрия, s1и -казеина [22], и внеклеточной пролин-иминопептидазы [26].

Принимая во внимание полученные нами результаты и данные литературы, предстоит исследовать состав протеолитического комплекса, синтезируемого отобранными штаммами бактерий рода Arthrobacter, и определить роль источников углеродного и азотного питания в регуляции синтеза отдельных ферментов комплекса, в том числе пептидаз.

Заключение. Анализ полученных данных показывает, что высокий уровень синтеза одновременно бета-галактозидазы и протеазы характерен для штамма Arthrobacter sp. БИМ В-2240, растущего в среде с молоком. Содержащие лактозу молочная сыворотка и молоко являются, помимо лактозы, приемлемыми субстратами для активного синтеза бета-галактозидазы штаммами БИМ В-2240, БИМ В-2241 и БИМ В-2242 Arthrobacter sp., а белки, пептиды и аминокислоты, входящие в состав сред на основе молока и лактозы, – соответственно для синтеза протеиназы культурами Arthrobacter sp. БИМ В-2240 и Arthrobacter sp. БИМ В-2239.

Отобранные штаммы бактерий могут быть использованы для получения на основе молока и продуктов его переработки кормов с пониженным содержанием казеина и лактозы.

Литература

1. tructural characterization of the major glycolipids from Arthrobacter globiformis and Arthrobacter scleroae / M. Pasciak [et al.] // Carbohydr. Res. – 2010. – Vol. 345, N 10. – P. 1497–1503.

2. Квасников, Е. И. Артробактер в природе и производстве / Е. И. Квасников, Е. Н. Писарчук. – Киев: Наук. думка, 1980. – 220 с.

3. Coi, G. Arthrobacter spp. /. Comi, C. Cantoni // Psychrotrophic Bacteria. – 2002. – Vol. 1. – P. 111–116.

4. Process for production of protease using deoiled soyabean cake and alkaliphilic bacteria Arthrobacter raosus and Bacillus alcaphilus: пат. 188072 (A1) Индия, IPC1–7: C12N9/52 / K. P. Pralhad, N.. hrikant,.. hipad, K. A. atish;

заявитель Agharkar Res. Inst. – № 1998B02497; заявл. 13.01.98; опубл. 17.08.02.

5. Method of preparing a yeast-cell lytic enzyme system: пат 8701388 (A1) США, IPC1–7: C12N9/24; C12N9/52 / J. A. Asenjo, B. A. Andrews; заявитель Univ. Columbia. – № 19850772363; заявл. 04.09.85; опубл. 12.03.87.

6. Process for producing N-acyl--methionines: пат. 1529633 (A) Великобритания, IPC1–7: C07C149/20; C07C149/247 / заявитель Procter and amble. – № 19760008293;

заявл. 02.03.76; опубл. 25.10.78.

7. Method for decomposing cholesterol in egg yolk: пат. 5076311 (A) Япония, IPC1–7: A231/015; A231/32; C123/00 /. Kubota, K. Yoshimura,. akao; заявитель erumo Corp. – № 19910273542; заявл. 26.09.91; опубл. 30.03.93.

8. Штамм бактерий Arthrobacter nicotianae В-391 Д – продуцент глюкозоизомеразы: пат. 11170 Респ. Беларусь, МПК7 С 12 N 15/61 / Л. И. Сапунова, А. Г. Лобанок, И. О. Казакевич; заявитель ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси». – № а 20061327; заявл. 22.12.06; опубл. 30.10.08 // Афіц. бюл. / Нац. цэнтр інтэлектуал. уласнасці. – 2008. – № 4. – С. 114–115.

9. -alactosidase activity in actinobacteria of Arthrobacter genus / A. A. Kostenevich [et al.] // Modern problems of microbiology and biotechnology: Матер. Miжнар. конф. мол.

учених i студентiв / голов. ред. В. О. Iваниця. – Одеса: Астропринт, 2007. – C. 74.

10. Способ получения внеклеточной -галактозидазы: пат. 15050 Респ.

Беларусь, МПК7 С 12N 9/38, С 12N 1/20, C 12R 1/06 / Л. И. Сапунова, И. О. Тамкович, А. Г. Лобанок, А. А. Костеневич; заявитель ГНУ «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси». – а 20091062; заявл.

14.07.2009; опубл. 28.02.2011 // Афiц. бюл. / Нац. цэнтр iнтэлектуал. уласнасцi. – 2011. – № 5. – С. 130–131.

11. Эффективность использования кормовой добавки на основе молочного сырья в кормлении цыплят-бройлеров и телят / Н. А. Шарейко [и др.] // Уч. записки УО ВГАВМ. – Витебск, 2011. – Т. 47, № 2, ч. 1. – С. 329–333.

12. Kuby, S. A. Purification and kinetics of -galactosidase from E. coli, strain K-12 /. A. Kuby, H. A. ardy // J. Amer. Chem. oc. – 1953. – Vol. 75. – P. 890–896.

13. Петрова, И. С. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробиологического происхождения / И. С. Петрова, М. М. Винцюнайте // Прикладная биохимия и микробиология. – 1980. – Т. 2, № 2. – С. 322–327.

14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72. – P. 248–254.

15. Поиск продуцентов -галактозидазы среди бактерий / Л. И. Сапунова [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы VI Междунар. науч. конф., Минск, 1–5 июня 2008 г. – Минск: Изд. И. П. Логвинов, 2008. – Т. 1. – С. 171–173.

16. Костеневич, А. А. Влияние рН и температуры на активность и стабильность бета-галактозидазы бактерий Arthrobacter species / А. А. Костеневич, И. О. Тамкович, Л. И. Сапунова // Биология – наука I века: тез. докл. 14-й Междунар. Пущинской школы-конф. мол. ученых, Пущино, 19–23 апреля 2010 г. – Пущино, 2010. – Т. 1. – С. 261.

17. ptimization of protease activity of alkaliphilic bacteria isolated from an alkaline lake in India / P. P. Kanekar [et al.] // Bioresourse echnol. – 2002. – Vol. 85. – P. 87–93.

18. Michotey, V. Characterization of an endoserine protease secreted by Arthrobacter aureus / V. Michotey, C. Blanco // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60. – P. 341–343.

19. Hofstein, B. V. An extracellular proteolytic enzyme from a strain of Arthrobacter. I. ormation of the enzyme and isolation of mutant strains without proteolytic activity / B. V. Hofstein, C. jeder // Biochem. Biophys. Acta. – 1965. – Vol. 110. – P. 576–584.

20. Hofstein, B. V. An extracellular proteolytic enzyme from a strain of Arthrobacter. II. Purification and chemical properties of the enzyme / B. V. Hofstein, H. Vankley,. Eaker // Biochem. Biophys. Acta. – 1965. – Vol. 110. – P. 585–598.

21. Hofstein, B. V. An extracellular proteolytic enzyme from a strain of Arthrobacter. II. tability and substrate specificity / B. V. Hofstein, B. Reinhammar // Biochem. Biophys. Acta. – 1965. – Vol. 110. – P. 599–607.

22. Sacchi, E. Purification and characterization of two extracellular proteinases from Arthrobacter nicotianae 9458 / E. macchi, P.. ox, M. obbetti // EM Microbiol. ett. – 1999. – Vol. 170. – P. 327–333.

23. Bjare, U. Cell bound proteolytic enzymes of Arthrobacter / U. Bjare, B. V. Holstein, A.-Ch. Rydn // Biochim. Biophys. Acta. – 1970. – Vol. 220. – P. 134–136.

24. Rydn, A.-Ch. eparation and characterization of three proline peptidases from a strain of Arthrobacter / A.-Ch. Rydn // Acta Chem. cand. – 1971. – Vol. 25. – P. 847–858.

25. Bockelann, W. evelopment of defined surface starter cultures for the ripening of smear cheeses / W. Bockelmann // Int. airy J. – 2002. – Vol. 12. – P. 123–131.

26. Purification and characterization of an extracellular proline iminopeptidase from Arthrobacter nicotianae 9458 / E. macchi [et al.] // EM Microbiol.

ett. – 1999. – Vol. 178. – P. 191–197.

L. I. SAPUNOVA, A. G. LOBANOK, A. M. PAULYUK, L. V. YARKHOVA, А. А. KASTSIANEVICH

SYNTHESIS OF BETA-GALACTOSIDASE AND PROTEINASE

IN BACTERIA OF ARTHROBACTER GENUS GROWING IN MEDIA

OF DIFFERENT COMPOSITION

Laboratory of enzyes Evaluation of beta-galactosidase and proteinase activity in collection bacterial cultures of genus Arthrobacter grooving in media of various compositions was performed. trains Arthrobacter sp. BIM -2239, BIM -2240, BIM -2241 and BIM -2242 distinguished by elevated level of beta-galactosidase/proteinase synthesis were selected as promising producers of fodder with decreased lactose/ casein content from milk and dairy processing wastes.

УДК 579.083.13 Т. А. ПУЧКОВА, Т. В. ЧЕРНООК, О. О. СЕРОВА, В. В. ЩЕРБА

ВЛИЯНИИЕ ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

НА РОСТ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИЦЕЛИЯ

КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

Лаборатория экспериментальной микологии и биоповреждений Изучено влияние индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) на рост, биохимический состав и антиоксидантную активность экстрактов глубинного мицелия ксилотрофных базидиомицетов Lentinus edodes 198 и Pleurotus ostreatus

69. Установлено, что при низких концентрациях ИУК (0,0001–0,001 мг/л) наблюдалось положительное действие: повышение количества биомассы и полисахаридов у P. ostreatus 69, общих фенольных соединений у L. edodes 198.

Об активизации ростовых процессов свидетельствовало увеличение содержания белка и антиоксидантной активности экстрактов мицелия.

Введение. Фитогормоны – низкомолекулярные органические вещества, образуемые растениями и выполняющие регуляторные функции. Важнейшими группами фитогормонов являются ауксины, абсцизины, гиббереллины, цитокинины, этилен, брассиностероиды и др. Они составляют биохимическую основу системы гормональной регуляции растительного организма и вызывают различные физиологические и морфологические изменения в чувствительных к их действию частях растений в достаточно низких концентрациях [1–3].

Ауксины ответственны за деление, растяжение и дифференциацию растительных клеток и тканей, стимулируют прорастание семян и клубней, ускоряют процессы ксилеммо- и корнеобразования, управляют процессами вегетативного роста, тропизма, цветения и плодоношения растений, а также влияют на фотосинтез, образование пигментов, биосинтез различных метаболитов и устойчивость растений к стрессовым факторам.

Наибольшая биологическая активность обнаружена у -индолилуксусной кислоты (ИУК), хотя известно, что в растениях имеются и другие вещества с гормональной активностью, которые в большинстве своем являются индолами, близкими по строению к ИУК. Такие индольные вещества могут быть предшественниками ИУК или продуктами ее дальнейшей трансформации [4].

Фитогормоны присутствуют не только у растений. Способность к синтезу ИУК обнаружена у многих ризосферных и эпифитных бактерий, цианобактерий, водорослей, фитопатогенных и микоризообразующих грибов [5–7].

Фитогормонам принадлежит важное место в дифференциации грибной культуры. Процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе ИУК. Исследование роли фитогормональных веществ в метаболизме очень важно на стадии, предшествующей плодоношению [8]. Изменение уровня гормонов в грибной культуре может отражаться на интенсивности метаболизма клеток и протекании защитных реакций [9, 10].

В литературе очень мало сведений об образовании фитогормональных соединений индольной природы ксилотрофными базидиомицетами и их влиянии на рост и морфогенез. В зависимости от концентрации ИУК может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на рост мицелия грибов, при этом значения концентраций, благоприятных для роста различных видов, могут различаться.

Согласно данным [11, 12], применение ИУК оказывает положительное влияние на рост колоний грибов на агаризованных средах, способствует повышению скорости обрастания мицелием субстрата, сокращению срока начала появления плодовых тел и увеличению их количества. Изучению действия фитогормонов, в частности ИУК, при глубинном культивировании ксилотрофных базидиомицетов на жидких питательных средах посвящено относительно немного публикаций [13, 14].

Исследование влияния фитогормонов на накопление и химический состав мицелия культивируемых грибов имеет большое значение для создания практических разработок, направленных на интенсификацию получения грибной биомассы с высоким содержанием биологически активных соединений.

Интерес к грибам рода Pleurotus и Lentinus обусловлен не только высокой питательной ценностью и вкусовыми качествами плодовых тел, но и лекарственными свойствами, благодаря которым они используются в народной медицине стран Юго-Восточной Азии.

Цель исследования – изучение влияния ИУК на рост, биохимический состав и антиоксидантную активность экстрактов мицелия ксилотрофных базидиомицетов Lentinus edodes 198 и Pleurotus ostreatus 69.

Объекты и методы исследования. В работе использовали грибы, относящиеся к классу Basidioycetes, родам Pleurotus и Lentinus, которые хранятся в коллекции культур лаборатории экспериментальной микологии и биоповреждений Института микробиологии НАН Беларуси.

Культуры грибов поддерживали на скошенном сусло-агаре (4 °Б). Для глубинного культивирования грибов использовали глюкозо-пептонную среду (г/л: глюкоза – 30,0; КН2РО4 – 1,0;

К2НРО4 – 1,0; Мg4 – 0,25; дрожжевой экстракт – 3,0). Грибы выращивали в колбах Эрленмейера на круговой качалке (180 об/мин).

Температура культивирования – 24–26 °С.

Для исследования влияния концентраций ИУК на рост грибов ее спиртовые растворы в стерильных условиях вносили в предварительно простерилизованную питательную среду непосредственно перед посевом грибов.

После выращивания грибов на жидких питательных средах мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную ткань, высушивали при температуре 60 °С и использовали для последующих анализов.

Белок в мицелии определяли по Кьельдалю [15], эндополисахариды – по [16], экзополисахариды – по [17], общие фенольные соединения – по [18].

Антиокислитительную активность (АОА) спиртовых экстрактов определяли по [19, 20]. Об антиокислительных свойствах грибов судили по способности экстрактов тормозить образование продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКактивных продуктов). За 100% принимали величину АОА ионола – известного антиоксиданта.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических функций Microsoft Excel, уровень значимости – 95%.

Результаты и их обсуждение. При выращивании на жидкой полусинтетической питательной среде гриба P. ostreatus 69 низкие концентрации ИУК (0,001–0,0001 мг/л) стимулировали выход биомассы (на 11–17%) и образование внеклеточных полисахаридов (на 10–25%) (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. Влияние концентрации ИУК в среде на рост и образование полисахаридов P.

ostreatus 69 Экзополисахариды Концентрация ИУК Выход биомассы, Эндополисахариды, в среде, мг/л г/л % в АСБ г/л г/г АСБ 1 9,8 12,9 1,5 0,153 0,1 10,1 19,1 1,6 0,158 0,01 10,5 20,1 1,7 0,162 0,001 11,7 20,2 2,0 0,171 0,0005 13,6 20,7 2,3 0,169 0,0001 14,3 21,7 2,5 0,175 Контроль 11,2 19,9 2,0 0,178 В мицелии гриба повышалось содержание внутриклеточных полисахаридов на 4–9%. Концентрации ИУК 0,01–1 мг/л ингибировали рост гриба. В опытных образцах наблюдалось увеличение количества белка на 12–28% (табл. 2), что свидетельствовало об активации ростовых процессов. Повышение содержания общих фенольных соединений (на 20%) наблюдалось только при концентрации ИУК 0,1 мг/л.

Т а б л и ц а 2. Влияние концентрации ИУК в среде на содержание у P.

ostreatus 69 белка, общих фенольных соединений и антиокислительную активность экстрактов мицелия Концентрация ИУК в среде, мг/л Белок, % Общие фенольные соединения, мг% АОА, %

–  –  –

Т а б л и ц а 4. Влияние концентрации ИУК в среде на содержание у L.

edodes 198 белка, общих фенольных соединений и антиокислительную активность экстрактов мицелия Концентрация ИУК в среде, мг/л Белок, % Общие фенольные соединения, мг% АОА,% 1 13,70 708,6 55,2 0,1 13,99 722,0 72,4 0,01 14,18 735,0 75,4 0,001 15,68 744,3 77,9 0,0005 17,54 1098,4 82,8 0,0001 17,18 1178,8 79,3 Контроль 14,01 802,5 74,9 Наиболее высокая антиоксидантная активность спиртовых экстрактов мицелия L. edodes 198 по отношению к ионолу (75,4– 82,8%) отмечалась при концентрациях ИУК 0,0001–0,001 мг/л.

Повышение содержания ИУК в питательной среде до 0,01– 1 мг/л приводило к замедлению роста гриба и снижению количества полисахаридов и антиоксидантной активности спиртовых экстрактов мицелия.

Полученные данные о том, что ИУК в определенных концентрациях может оказывать положительное влияние на рост грибов в условиях глубинного культивирования, согласуются с результатами других исследователей. При внесении ИУК в состав жидкой питательной среды у грибов Pleurotus sajor-caju наблюдалось увеличение массы мицелия и содержания в нем белка [13], а у Phellinus linteus – повышение образования экзополисахаридов [14].

Заключение. Таким образом, установлено положительное влияние ИУК в низких концентрациях (0,001 мкг/мл) на рост и биохимический состав глубинного мицелия L. edodes 198 и P. ostreatus 69:

повышение количества биомассы (на 18–27%) и полисахаридов у P. ostreatus 69, общих фенольных соединений – у L. edodes 198 (на 35–47%). Об активизации ростовых процессов свидетельствовало увеличение содержания белка на 12–28% и антиоксидантной активности экстрактов мицелия. Высокие концентрации ИУК ингибировали рост обоих грибов.

Дальнейшая работа по изучению влияния фитогормонов на накопление и состав мицелия культивируемых ксилотрофных базидиомицетов, формирование плодовых тел составит фундаментальную основу развития практических разработок, направленных на интенсификацию получения грибной биомассы с высоким содержанием биологически активных соединений, а также найдет применение в практическом грибоводстве.

Литература

1. Регуляторы роста растений: внутриклеточная гормональная сигнализация и их применение в аграрном производстве. Второй междунар. симп.

(Киев, 8–12 сент. 2007 г.) / В. С. Кравец [и др.] // Физиология растений. – 2008. – Т. 55, № 4. – С. 629–640.

2. Романов, Г. А. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов / Г. А. Романов, С. С. Медведев // Физиология растений. – 2006. – Т. 53. – С. 309–319.

3. Han, H. A review on the molecular mechanism of plants rooting modulated by auxin / H. Han,. Zhang,. un // African Journal of Biotechnology. – 2009. – Vol. 8, N 3. – P. 348–353.

4. Микроорганизмы – продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение (обзор) / Е. А. Цавкелова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – Т. 42, № 2. – С. 133–143.

5. Дерфлинг, К. Гормоны растений. Системный подход / К. Дерфлинг. – М.: Мир, 1985. – 304 с.

6. Каменева, С. В. Генетический контроль процессов взаимодействия бактерий с растениями в ассоциациях / С. В. Каменева, Е. М. Муронец // Генетика. – 1999. – Т. 35, № 11. – С. 1480–1494.

7. Plant hormones promote growth in lichen-forming fungi /. Y. Wang [et al.] // Mycobiology. – 2010. – Vol. 38, N 3. – P. 176–179.

8. Muszyska, B. Indole compounds in fruiting bodies of some edible Basidioycota species / B. Muszyska, K. ukowska-Ziaja, H. Ekiert // ood Chemistry. – 2011. – Vol. 125, N 4. – P. 1306–1308.

9. Медь (II) индуцирует продукцию индольных соединений в периодической культуре гриба шиитаке / О. М. Цивилева [и др.] // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. – Вып. 2. – С. 35–36.

10. Биосинтез биологически активных производных индола ксилотрофным базидиомицетом / О. М. Цивилева [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы VII Междунар. конф. (Минск, 31 мая – 4 июня 2010 г.). – Минск: Беларус. навука, 2010. – С. 174–176.

11. Dey, R. C. Effect of different hormone, media and variety on mycelia growth of mushroom / R. C. ey, K. M. Nasiruddin, M. A. Z. Al Munsur // J. Bangladesh Agril. Univ. – 2007. – Vol. 5, N 2. – P. 181–187.

12. Ala, N. Efficacy of five different growth regulators on the yield and yield contributing attributes of Pleurotus ostreatus (Jacquin ex r.) Kummer / N. Alam,. M. Ruhul Amin, N. C. arker // Bangladesh J. Mushroom. – 2007. – Vol. 1, N 1. – P. 51–55.

13. Enhancement of biomass production of edible mushroom Pleurotus sajorcaju grown in whey by plant growth hormones / R. Mukhopadhyay [et al.] // Process Biochemistry. – 2005. – Vol. 40. – P. 1241–1244.

14. Guo, X. Effects of phytohormones on mycelial growth and exopolysaccharide biosynthesis of medicinal mushroom Phellinus linteus /. uo,. Zou, M. un // Bioprocess Biosyst Eng. – 2009. – Vol. 32, N 5. – P. 701–707.

15. Ермаков, А. И. Методы биохимического исследования растений / А. И. Ермаков. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 256 с.

16. Tang, Y. J. ed-batch fermentation of Ganodera lucidu for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid / Y. J. ang, J. J. Zhong // Enzyme and Microbial echnology. – 2002. – Vol. 31, N 1–2. – P. 20–28.

17. Exopolysaccharides of some medicinal mushrooms: production and composition / V.. Babitskaya [et al.] // Int. J. of Medicinal Mushrooms. – 2000. – Vol. 2. – P. 51–54.

18. Запрометов, М. Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращение, функции / М. Н. Запрометов // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 143–162.

19. Антиокислительная активность экстрактов мицелия настоящей губки / А. Н. Капич [и др.] // Весці НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1991. – № 5. – С. 58–62.

20. Капич, А. Н. Антиоксиданты грибного происхождения – модификаторы радиоустойчивости / А. Н. Капич, Ю. М. Леонтьев // Радиобиол. последствия аварии на Чернобыльской АЭС: тез. докл. Всесоюз. конф., Минск, 30 окт. – 1 нояб. 1991 г. / Акад. наук Беларуси, Ин-т радиобиологии. – Минск, 1991. – С. 50–51.

T. A. PUCHKOVA, T. V. CHERNOOK, O. O. SEROVA, V. V. SHCHERBA

EFFECT OF INDOLYL-3-ACETIC ACID ON GROWTH

AND BIOCHEMICAL COMPOSITION OF XYLOTROPHIC

BASIDIOMYCETES MYCELIUM

Laboratory of experiental ycology and biodeterioration Effect of indolyl-3-acetic acid (IAA) on growth, biochemical composition and antioxidant activity of submerged mycelium extracts from xylotrophic basidial fungi L. edodes 198 and P. ostreatus 69 was examined. It was found that at low IAA concentrations (0.0001–0.001 mg/l) favorable influence was observed: rising levels of biomass accumulation, polysaccharides in P. ostreatus 69, total phenolic compounds in L. edodes 198. Activation of growth processes was demonstrated by increased protein content and antioxidant activity of mycelium extracts.

МИКРОБНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

УДК 579.64+632.9

Э. И. КОЛОМИЕЦ1, В. Н. КУПЦОВ1, Н. В. СВЕРЧКОВА1, Н. В. ЕВСЕГНЕЕВА1, М. Н. МАНДРИК-ЛИТВИНКОВИЧ1, Л. Т. МИШИН2, Д. В. ВОЙТКА3, А. И. РАПОПОРТ4, Г. М. ХРУСТАЛЕВА4

БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS AURANTIACA БИМ В-446 –

ОСНОВА БИОПРЕПАРАТА ЭКОГРИН ДЛЯ ЗАЩИТЫ

ОВОЩНЫХ И ЗЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ

В УСЛОВИЯХ МАЛООБЪЕМНОЙ ГИДРОПОНИКИ

Лаборатория средств биологического контроля, Центр аналитических и генно-инженерных исследований Института микробиологии НАН Беларуси, Институт защиты растений НАН Беларуси, Институт микробиологии и биотехнологии Латвийского университета Изучена способность бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 заселять минеральный субстрат, используемый для выращивания растений огурца, и торфогрунт – для зеленных культур в условиях малообъемной гидропоники.

Определен качественный и количественный состав микрофлоры ризосферы растений петрушки и укропа, выращиваемых способом проточной гидропоники на торфогрунте и корневой системы огурцов, выращиваемых на минеральном субстрате. Установлена эффективность действия препарата Экогрин в отношении патогенов овощных и зеленных культур в исследуемых условиях. Показано, что физиологическая активация жидкой культуры P. aurantiaca БИМ В-446 под действием теплового шока способствует повышению фитозащитных свойств препарата на 6–13%. Установлена высокая биологическая эффективность препарата Экогрин против стеблевой формы серой гнили огурца и корневой гнили укропа и петрушки.

Введение. Малообъемные гидропонные технологии культивирования овощных и зеленных культур благодаря высокой экономической эффективности являются реальной альтернативой грунтовым способам выращивания. Так, в Скандинавских странах овощными культурами, выращиваемыми по новой технологии, занято более 80% общей площади теплиц, в Нидерландах – более 50%. В последние годы технология малообъемной гидропоники находит все более широкое применение и в Беларуси.

Освоение новых технологий культивирования незамедлительно требует дополнительных исследований, направленных на разработку соответствующих способов защиты овощных и зеленных культур, выращиваемых в условиях гидропонных систем, от наиболее распространенных заболеваний, вызываемых грибами рода Pythiu, Fusariu, Rhizoctonia, Sclerotinia, Botrytis.

В связи с этим активизируются работы по созданию экологически безопасных ресурсосберегающих технологий, основанных на использовании бактерий-антагонистов для контроля грибных и бактериальных патогенов в условиях малообъемной гидропоники. Известно об использовании агентов биологического контроля при гидропонном возделывании огурца для подавления черной микосфереллезной и корневой гнили (Pythiu aphanidermatum) и зеленных культур, в частности салата-латука, для защиты от таких болезней, как увядание (P. aphanidermatum), серая гниль (Botrytis cinerea) и гипертрофия жилок (Olpidiu brassicae) [1–5].

Однако широкому распространению биометода препятствует ряд причин, в частности, недостаточная стабильность разрабатываемых микробных препаратов, отсутствие научно-аргументированной технологии применения, неспособность их конкурировать с химическими средствами защиты по эффективности действия. С целью повышения эффективности, стабильности и технологичности биопрепаратов активно проводятся исследования по изучению влияния различных стресс-факторов на физиологическую активность микроорганизмов – продуцентов биологически активных соединений [6, 7]. Исследования подтверждают возможность направленного изменения ряда функциональных свойств микробной клетки – адаптогенности к природным условиям, выживаемости и продукции специфических метаболитов. К примеру, шведскими и канадскими исследователями на примере бактерий Streptococcus mutans показано пятикратное увеличение синтеза специфических и неспецифических белков под воздействием окислительного стресса (Н2О2), пониженной кислотности среды, голодания, солевой (NaCl) и теплоNaCl)) вой обработки [8].

Исходя из вышеизложенного, исследования, направленные на повышение антагонистической активности, оценку приживаемости и фитозащитного действия бактерий-антагонистов P. aurantiaca БИМ В-446 (основа препарата Экогрин) на субстратах в условиях гидропонных систем, являются актуальными, так как способствуют конкурентоспособности отечественных биопрепаратов и более широкому их использованию в системе защиты растений.

Объекты и методы исследования. В работе были использованы фитопатогены овощных культур рода Botrytis, Fusariu, Colletotrichu, Pythiu, Pseudomonas, выделенные из пораженных растений сотрудниками лаборатории средств биологического контроля Института микробиологии НАН Беларуси и лаборатории микробиологического метода защиты растений от вредителей и болезней Института защиты растений НАН Беларуси.

В качестве объекта-антагониста фитопатогенной микрофлоры использованы бактерии P. aurantiaca БИМ В-446, характеризующиеся высокой антимикробной активностью в отношении широкого спектра возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в том числе овощных.

Глубинное культивирование бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 осуществляли на питательной среде Мейнелла с мелассой в колбах Эрленмейера на качалке (200 об/мин, при температуре 28–30 °С) в течение 48 ч. Фитопатогенные грибы выращивали на жидкой картофельно-глюкозной среде на качалке (200 об/мин, при температуре 28–30 °С) в течение 48 ч.

Определение титра клеток бактерий P. aurantiaca БИМ Б-446 в питательном растворе проводили методом предельных разведений [9] путем высева на агаризованный мясо-пептонный бульон, содержащий антибиотики доксициклин и эритромицин в концентрации 5 и 700 мкг/мл среды соответственно. Антагонистическую активность оценивали методом лунок [10].

Изучение физиологической активации бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 под воздействием теплового шока проводили на терморегулируемой качалке путем прогрева колб с 50 мл односуточной жидкой культуры в течение 10 мин в интервале температур от 37 до 50 °С. В качестве контроля использовали бактериальную культуру, выдержанную 10 мин на качалке при 28 °С. Прогретую при различных температурных режимах жидкую культуру бактерий использовали в качестве посевного материала для инокуляции свежей питательной среды. Учет антагонистической активности проводили через 48, 72, 96 ч культивирования при 28 °С. В опытно-промышленных условиях оценку влияния теплового воздействия на бактериальную культуру P. aurantiaca БИМ В-446 проводили в ферментере «Biotron ilus P-120»

(Южная Корея) емкостью 120 л на базе Биотехнологического центра Института микробиологии НАН Беларуси.

Оценку защитного действия препарата Экогрин проводили в УП «Минский парниково-тепличный комбинат» на культуре укропа (сорт old Crown) и петрушки (сорт Mooskrause) при выращивании их способом проточной гидропоники, а также на культуре растений огурца при выращивании его на инертных субстратах. Используя общепринятые методики, проводили биометрические исследования растений, оценку их пораженности фитопатогенами и биологическую эффективность препарата [11].

При статистической обработке результатов экспериментов проводили определение средних арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95% [12].

Результаты и их обсуждение. В связи с особенностями условий культивирования растений в гидропонных системах одним из необходимых этапов является изучение приживаемости бактерий-антагонистов P. aurantiaca БИМ В-446 в кубиках с минеральной ватой, используемых для выращивания огурца, а также в торфогрунте, применяемом в проточной системе выращивания петрушки и укропа. Установлено, что титр бактерий, внесенных в состав питательного раствора в кубики с минеральной ватой, зависит от сорта огурца, что свидетельствует о возможном влияния экссудатов корней на колонизирующую способность антагониста (табл. 1). Так, для огурцов сорта Афина наблюдается увеличение титра клеток бактерий в течение 10 дней в 3,4 раза до уровня 3,4 106 КОЕ/мл питательного раствора, в то время как средний титр клеток антагониста под сортом Концерта за тот же период снижается в 5,8 раза и составляет 7,7 105 КОЕ/мл.

Т а б л и ц а 1. Динамика численности бактерий P.

aurantiaca БИМ В-446 в кубиках с рассадой огурцов сорта Афина и Концерта

–  –  –

Полученные данные указывают на способность бактерий-антагонистов заселять минеральный субстрат, что является важной предпосылкой для защиты корневой системы огурца от фитопатогенных микроорганизмов в условиях малообъемной гидропоники.

Анализ бактериальной микрофлоры ризосферы растений петрушки и укропа показал, что исследуемая культура антагониста, внесенная в концентрации 2%, в условиях проточной системы культивирования постепенно вымывается из торфогрунта (табл. 2). Так, исходный титр бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 под укропом и петрушкой через неделю наблюдений снижался в 3,8–8,8 раза, а к концу 2-й недели – в 14–33 раза соответственно, что свидетельствует о необходимости проведения повторных обработок препаратом.

Т а б л и ц а 2. Динамика численности бактерий P.

aurantiaca БИМ В-446 в торфе под зеленными культурами Титр КОЕ/мл питательного раствора Вариант исходный 7 сут 14 сут 5,3 ± 0,1 105 1,4 ± 0,1 105 3,8 ± 0,2 104 Укроп 5,3 ± 0,3 107 3,7 ± 0,2 106 1,8 ± 0,1 105 Петрушка Полученные данные о приживаемости бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 в субстратах были учтены при разработке рекомендаций по применению препарата на растениях огурца и зеленных культурах в условиях малообъемной гидропоники.

Качественный и количественный анализ грибной микрофлоры ризосферы растений огурца, выращиваемых гидропонным способом на минеральном субстрате, выявил, что доминирующими видами являются грибы родов Penicillium и Сolletotrichum, титр которых достигает 1,4 102 – 1,1 103 КОЕ/мл питательного раствора.

Установлено, что добавление Экогрина в питательный раствор в концентрации 2% приводит к ингибированию развития возбудителя антракноза растений огурца (Colletotrichu sp.). Так, к концу исследуемого периода (14 сут) титр КОЕ гриба снижался на 8%, в то время как в контрольном варианте без применения биопрепарата содержание патогена увеличивалось в 2 раза.

Качественный и количественный анализ грибной микрофлоры ризосферы растений петрушки и укропа, выращиваемых способом проточной гидропоники на торфогрунте, выявил, что доминирующими видами являются сапрофитные грибы родов Penicillium и Trichodera, титр которых достигает 1,6 103 – 1,2 104 КОЕ/мл питательного раствора. Среди фитопатогенных микроорганизмов преобладает гриб Pythiu sp. (1,0 101 – 1,2 102 КОЕ/мл питательного раствора). При использовании препарата Экогрин на растениях укропа и петрушки к концу исследуемого периода (14 сут) титр КОЕ гриба уменьшается в 2,5 и 10 раз соответственно. Для контрольного варианта характерно увеличение титра КОЕ гриба в питательном растворе в 9 раз под растениями укропа и снижение в 1,5 раз для петрушки.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования препарата Экогрин для защиты растений огурца и зеленных культур (укропа и петрушки) при выращивании в условиях малообъемной гидропоники.

С целью повышения фитозащитных свойств препарата Экогрин нами было исследовано влияние температурного воздействия на антимикробную активность бактерий P. aurantiaca БИМ В-446.

Так, под действием термического шока (10-минутная выдержка жидкой культуры при температурах 37, 42, 47 и 50 °C) наблюдались изменения в антимикробной активности штамма.

Наибольшее увеличение антибактериальной (на 53–77%) и антифунгальной (на 25–48%) активности достигнуто при использовании трехкратной температурной обработки инокулюма при 37, 42 и 50 °C (табл. 3).

Т а б л и ц а 3. Антимикробная активность P.

aurantiaca БИМ В-446

–  –  –

Диаметр зоны задержки роста бактерии Pseudoonas syringae, % Диаметр зоны задержки роста гриба Fusariu oxysporu NR 259,% Температурная обработка суточного инокулюма бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 путем последовательного повышения температуры с 37 до 50 °С апробирована в опытно-промышленных условиях на базе Биотехнологического центра Института микробиологии НАН Беларуси и была рекомендована в качестве обязательной технологической стадии получения препарата Экогрин. В процессе исследования установлено, что на 24-е сутки культивирования титр термически обработанной культуры в 2,3 превышает показатели контрольного варианта (без термической обработки) (см. рисунок), а антимикробная активность в отношении возбудителя антракноза растений огурца (Colletotrichum sp.) возрастает на 6–13%.

Следует отметить, что наибольшую восприимчивость к стрессовому воздействию проявляет культура в стадии экспоненциального роста (в период с 4-го по 8-й час культивирования, соответствующей максимальной скорости роста и быстрому накоплению антимикробных метаболитов).

Производственные испытания, проведенные в УП «Минский парниково-тепличный комбинат» при использовании 2%-ной культуральной жидкости препарата Экогрин, подтвердили эффективность его действия. Биологическая эффективность по отДинамика роста бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 при использовании необработанного (1) и обработанного (2) посевного материала ношению к корневой гнили на растениях укропа и петрушки равнялась 24,4–69,8 и 20,9–40,2% соответственно, причем наблюдалось увеличение высоты растений петрушки на 12%, длины корня – на 5,2–17,5%, а укропа – на 9,7–10,2 и 5,1–18,1% соответственно. Эффективность применения препарата против стеблевой формы серой гнили огурца (Церез F1) составила 49–64%, а прибавка урожая в конце вегетации – 10,3%.

Заключение. В результате проведенных исследований установлена способность бактерий P. aurantiaca БИМ В-446 – основы препарата Экогрин – заселять минеральный субстрат и торфогрунт, используемые соответственно для выращивания огурца и зеленных культур в условиях малообъемной гидропоники. Качественный и количественный состав микрофлоры ризосферы растений петрушки, укропа и корневой системы растений огурца показал, что при внесении препарата Экогрин в питательный раствор титр КОЕ патогенных грибов Сolletotrichum sp. снижается на 8% (на растениях огурца), а Pythiu sp. – в 2,5 (на укропе) и 10 раз (на петрушке).

Физиологическая активация жидкой культуры P. aurantiaca БИМ В-446 под действием теплового шока способствует повышению фитозащитных свойств препарата на 6–13%. Биологическая эффективность препарата Экогрин против стеблевой формы серой гнили огурца (Церез F1) составляет 49–64%, корневой гнили укропа и петрушки – 24,4–69,8 и 20,9–40,2% соответственно.

Таким образом, использование биопрепарата Экогрин для выращивания овощных и зеленных культур является перспективным и экологически безопасным методом борьбы с фитопатогенами в условиях малообъемной гидропоники.

Литература

1. Utkhede, R. S. Evaluation of biological and chemical treatments for control of gummy stem blight on cucumber plants grown hydroponically in greenhouses / R.. Utkhede, C. A. Koch // BioControl. – 2004. – Vol. 49, N 1. – P. 109–117.

2. Utkhede, R. S. Chemical and biological treatments for control of gummy stem blight of greenhouse cucumbers / R.. Utkhede, C. A. Koch // Eur. Journal of Plant Pathology. – 2002. – Vol. 108. – P. 443–448.

3. Utkhede, R. S. Pythiu aphanideratu root rot in hydroponically-grown lettuce and the effect of chemical and biological agents on its control / R.. Utkhede,. inh, C. A. vesque // Can. J. Plant Pathol. – 2000. – Vol. 22. – P. 139–144.

4. Aer, G. A. evelopment of formulations of biological agents for management of root rot of lettuce and cucumber /. A. Amer, R.. Utkhede // Can.

J. Microbiol – 2000. – Vol. 46, N 9 – P. 809–816.

5. Evaluation of microorganisms for biocontrol of grey mould on lettuce /. Card [et al.] // New Zeland Plant Protection. – 2002. – Vol. 55. – P. 197–201.

6. Лосева, С. А. Культивирование дрожжей Saccharoyces cerevisiae в условиях окислительного стресса / С. А. Лосева, А. Е. Кузнецов, С. В. Каленов // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы IV Моск.

Междунар. конгр., Москва, 12–16 марта 2007 г. – М.: Экспо-биохимтехнологии, 2007. – С. 76–77.

7. Canaas, T. P. Impact of mild heat treatments on induction of thermotolerance in the biocontrol yeast Candida sake CPA-1 and viability after spray-drying /. P. Canamas, I. Vinas, J. Usall // Journal of Applied Microbiology. – 2008. – Vol. 104, N 3. – Р. 767–775.

8. Svensater, G. Multiple stress responses in Streptococcus utans and the induction of general and stress-specific proteins /. vensater, B. jogreen, I. R. Hamilton // Microbiology. – 2000. – Vol. 146. – P. 107–117.

9. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда. – М.: Мир, 1984. – Т. 3. – 264 с.

10. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги.– М.: Колос, 1983. – 253 с.

11. Буга, С. Ф. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве / С. Ф. Буга. – Несвиж: МОУП «Несвижская укрупненная типография им. С. Будного», 2007. – 511 с.

12. Рокицкий, П. Ф. Биологическая статистика / П. Ф. Рокицкий. – Минск:

Вышэйш. школа, 1973. – 320 с.

E. I. KOLOMIETS1, V. N. KUPTSOV1, N. V. SVERCHKOVA1, N. V. EVSEGNEEVA1, M. N. MANDRYK-LITVINKOVICH1, L. T. MISHIN2, D. V. VOITKA3, A. I. RAPOPORT4, G. M. KHRUSTALYOVA4

BACTERIA P. AURANTIACA BIM В-446 – THE BASIS OF BIOPESTICIDE

ECOGREEN INTENDED FOR CONTROL OF VEGETABLE

AND GREEN CROP PATHOGENS IN LOW-SCALE HYDROPONICS

Laboratory of biological control agents, Center of analytical and genetic engineering studies, Institute of Microbiology, National Acadey of Sciences of Belarus, Institute of Plant Protection, National Acadey of Sciences of Belarus, Institute of Microbiology and Biotechnology, Latvian University Ability of bacteria P. aurantiaca BIM В-446 to colonize mineral substrate used for growing cucumbers and peat soil used for cultivating green crops in small-scale hydroponics was investigated. Quantitative and qualitative composition of rhizosphere microorganisms in parsley and dill grown by hydroponic flow technique on peat substrate and in root system of cucumbers cultivated on mineral substrate was defined. Ecogreen efficiency to control vegetable and green crops pathogens was established under greenhouse condition. It was shown that physiological activation of liquid culture of P. aurantiaca BIM В-446 with heat shock enhances phytoprotective properties of preparation by 6–13%. High biological efficiency of Ecogreen against grey rot of cucumber stem and root rot of dill and parsley was demonstrated.

УДК 579.852.11-579.62

Н. В. СВЕРЧКОВА, Н. С. ЗАСЛАВСКАЯ, М. С. КОЛОСОВСКАЯ, Т. В. РОМАНОВСКАЯ, Э. И. КОЛОМИЕЦ

ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

ДЛЯ КОРМОПРОИЗВОДСТВА НА ОСНОВЕ

СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS

Лаборатория средств биологического контроля Проанализированы литературные данные по использованию пробиотических препаратов, основу которых составляют спорообразующие бактерии рода Bacillus, в составе кормов для сельскохозяйственных животных и птицы, а также новые направления в получении пробиотических препаратов для кормопроизводства на основе бактерий рода Bacillus.

Развитие отечественного животноводства определяется состоянием кормовой базы и особенно качеством кормов. Экономические исследования и практический опыт показывают, что именно этот показатель определяет успех производства животноводческой продукции. Рацион кормов должен быть сбалансированным и обеспечивать эффективный рост и развитие животного за возможно короткий промежуток времени. Повышенная концентрация питательных веществ в рационе зачастую приводит к дисбалансу желудочно-кишечного тракта. Температурная обработка или гранулирование также изменяют микробиологический баланс кормов. Кроме того, корма растительного происхождения используются животными не полностью, что приводит к снижению эффективности кормления, увеличению расхода корма и, как следствие, возрастанию расходов на доставку и раздачу. Так, клетчатка и некоторые другие полисахариды практически не перевариваются в желудочно-кишечном тракте свиней.

Важнейшая задача кормопроизводства – создание и применение в практике таких кормовых смесей, которые бы максимально усваивались организмом животного для обеспечения его жизненных функций и обладали профилактическими свойствами [1].

Возможности увеличения продуктивности животных и птицы на основе более полного усвоения питательных веществ кормов, стимуляции роста и развития животных и птицы, повышения неспецифического иммунитета могут быть реализованы за счет использования новых биологически активных препаратов:

ферментных, пробиотических, пребиотических, комбинированных ферментно-пробиотических, а также комплексных пробиотических препаратов, обогащенных фитокомпонентами [2–4].

Введение животным и птице в составе препаратов пробиотических бактерий, которые являются антагонистами патогенной микрофлоры, помогает восстановить кишечный баланс, биологический статус, иммунный ответ, повышает эффективность вакцинаций и, таким образом, способствует высокой рентабельности животноводства и птицеводства [3].

Пробиотики – это живые микробные добавки, которые оказывают благоприятное действие на организм человека и животного путем улучшения кишечного микробного баланса, стимулируют обменные и иммунные процессы [5].

Механизм действия пробиотиков может проявляться через антагонистическое действие против специфических групп микроорганизмов (образование антибиотических веществ, бактериоцинов), конкуренцию за питательные вещества, изменение микробного метаболизма (увеличение ферментативной активности, стимуляция иммунной системы и др.) [6].

Исторически сложилось так, что первоначальное внимание производственников было обращено главным образом на молочнокислые бактерии – представителей нормофлоры кишечника животных. Хорошо известно их положительное влияние на поддержание микробного баланса кишечника. Однако они чувствительны к высокой температуре при гранулировании кормов.

Поэтому при современных технологиях выращивания животных необходимы специальные микробиологические добавки, не теряющие жизнеспособности в процессе производства кормов.

В настоящее время ведутся интенсивные исследования по разработке и изучению эффективности использования в составе кормов пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus.

Род Bacillus объединяет обширную группу строго аэробных или факультативно анаэробных грамположительных хемоорганотрофных микроорганизмов, образующих термоустойчивые эндоспоры. Особенностью этой группы бактерий является широкий диапазон G + C пар оснований – от 32 до 69 моль%.

Культуральные особенности видов, выросших на разных средах, сильно варьируются. На твердых питательных средах бактерии образуют колонии диаметром от 1–2 до 5 мм и более: гладкие, зернистые, пленчатые, складчато-морщинистые и сухие, слизеобразующие и пастообразные с характерной структурой края. На жидких питательных средах образуют хлопьевидный, комковатый осадок, иногда растут в виде пленки.

Клетки бацилл обычно палочковидной формы с закругленными или «обрубленными» концами, подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков, располагаются одиночно, в парах, реже в виде цепочек. Поперечный размер вегетативных клеток варьируется в пределах 0,5–2,5 мкм, длина – 1,2–10,0 мкм.

Размножаются поперечным делением клеток. Широко распространены в почве, воде, воздухе [7–10].

В качестве субстратов окисления бациллы используют простые углеводы (моно- и дисахариды), некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), органические кислоты и спирты, а также сложные высокомолекулярные углеводы, в частности пектин.

Так, бактерии B. subtilis способны разлагать ксилан (гемицеллюлозу), усваивать лигнин, целлюлозу [11]. Метаболизм бродильного или дыхательного типа.

У бактерий рода Bacillus преобладает гликолитический путь расщепления углеводов (диссимиляция глюкозы) независимо от наличия в среде кислорода. В аэробных условиях клетки B. subtilis могут использовать до 60–70% глюкозы по схеме Эмбдена– Мейергофа, остальную часть – гексозомонофосфатным путем.

Для большинства видов бацилл лучшими источниками азотного питания являются пептон, гидролизат казеина, автолизат дрожжей. Наряду с органическими бациллы могут усваивать и минеральные соединения азота – аммонийные соли, нитраты.

Для нормального роста и развития бактериям рода Bacillus необходимы микроэлементы, которые играют важную роль в ферментативных реакциях, происходящих в клетке, и в процессах спорообразования. Потребности в фосфоре у бацилл настолько велики, что многие из них способны переводить нерастворимые соединения фосфора в растворимые. Некоторые бациллы способны анаэробно усваивать фосфит и гипофосфит на глюкозоминеральной среде. Утилизация этих минеральных соединений сопровождается накоплением в среде фосфатов [12].

Спорообразующие бактерии рода Bacillus обладают рядом преимуществ перед другими представителями экзогенной микрофлоры: подавляющее большинство представителей рода безвредны для макроорганизма даже в высоких концентрациях;

способны повышать неспецифическую резистентность организма хозяина; проявляют антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают высокой ферментативной активностью; устойчивы к литическим ферментам, что обусловливает высокую жизнеспособность в желудочно-кишечного тракте; технологичны в производстве; стабильны при хранении; экологически безопасны. Бактерии рода Bacillus способны выделять в культуральную жидкость сигнальные молекулы, иммуноактивные протеины [13], биологически активные пептиды, в число которых входят не только пептидные антибиотики, но и гормоноподобные вещества. В экстрактах клеток и культуральной жидкости Bacillus subtilis показано присутствие соматостатинподобных пептидов, являющихся факторами межклеточной коммуникации [14, 15].

Вышеперечисленные свойства бактерий-антагонистов рода Bacillus обусловили их применение для создания препаратов пробиотического действия как для медицины, так и для ветеринарии.

Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus можно условно разделить на четыре группы: 1 – монобациллярные, имеющие в составе один штамм; 2 – полибациллярные, имеющие в составе два и более штамма рода Bacillus; 3 – комплексные, в составе которых помимо представителей рода Bacillus, присутствуют другие микроорганизмы; 4 – иммобилизованные на сорбенте (сорбированные) живые бактерии [5, 16].

Для создания монобациллярных препаратов чаще используют штаммы B. subtilis, B. pulvifaciens, а также B. licheniformis, B. cereus, Bacillus sp.

Сотрудниками Института проблем экологии им. А. Н. Северцова РАН получена серия кормовых пробиотических добавок на основе штамма Bacillus subtilis 8130 для повышения эффективности комбикормов. Коммерческими формами пробиотиков на основе штамма являются препараты Пробиоцелл, Про-А, Про-Н [17–19].

Технология получения препарата Пробиоцелл основана на факультативно-анаэробной биотрансформации клетчатки растительного сырья непатогенным штаммом B. subtilis 8130, выделенным из кишечника моногастричных растительноядных животных [17]. Препарат содержит клетки спорообразующих бактерий, их метаболиты, продукты ферментации бактериями сырой пивной дробины и пшеничных отрубей, обогащен селеном в органической форме ДАФС-25 (диацетофипилселенид, содержащий 25% селена).

Основой препарата Про-Н является отделенная от супернатанта биомасса бактерий B. subtilis 8130, полученная после глубинной ферментации, которая используется для факультативно-анаэробной биотрансформации клетчатки сырой пивной дробины и пшеничных отрубей [17, 18]. Титр клеток B. subtilis 8130 после высушивания продукта ферментации путем доведения его до равновесной влажности смешиванием с сухим носителем составляет 5 109 КОЕ/г. Норма ввода в комбикорма – 0,2%, или 2 кг/т.

В отличие от Про-Н для получения препарата Про-А путем твердофазной ферментации растительного сырья (сырой пивной дробины, пшеничных отрубей, облепихового шрота) используется культуральная жидкость бактерий B. subtilis 8130 после глубинного культивирования, содержащая как клетки, так и метаболиты культуры. Высушивание влажного концентрата осуществляли конвекционным способом в полочной сушилке. Титр клеток B. subtilis 8130 составлял 2 1010 КОЕ/г, норма ввода в комбикорма – 0,1%, или 1 кг/т [19].

По результатам научно-хозяйственных опытов установлено, что наиболее эффективными являются препараты Пробиоцелл и Про-А. С технологической точки зрения более удобным является пробиотик в форме Про-А, так как более низкая норма ввода в комбикорма (0,1%) позволяет включать его в 1%-ный премикс [19].

Эффективность действия пробиотика Про-А изучена на молодняке свиней, находящихся на доращивании и откорме. Применение пробиотика Про-А в рационах свиней способствует нормализации обменных процессов, следствием чего является повышение продуктивности животных. Использование его в комбикормах (0,1% по массе) позволяет при выращивании поросят с 60- до 120-дневного возраста повысить среднесуточные приросты массы на 9,5–9,9%, снизить на 9,0–9,2% затраты комбикорма на 1 кг прироста, при откорме свиней – на 23,1 и 18,7% соответственно [17, 19].

Ежедневное введение в корм животных живой культуры B. subtilis 534 повышает продуктивность и сохранность поросят [16].

На основе штамма B. coagulans разработан пробиотический препарат, который используется как добавка в корм животным [16].

В составе кормов для сельскохозяйственных животных и птиц применяются также препараты Проваген, Ветом 1.1, БиоПлюс 2Б, Моноспорин [16].

Фирмой «ohmann Animal Health» (Германия) разработана кормовая добавка пробиотического действия Тойоцерин, основу которой составляют споры бактерий Bacillus cereus var. toyoi.

Использование Тойоцерина в кормах позволяет поддерживать естественный бактериальный баланс микрофлоры в кишечнике.

Преобладание полезной микрофлоры в кишечнике приводит к укреплению кишечной стенки. Экспериментально показано, что Тойоцерин увеличивает длину ворсинок кишечного эпителия, поверхность всасывания питательных веществ и, соответственно, снижает потери воды в пищеварительном тракте [20].

Стимулируя развитие полезной микрофлоры в кишечнике, Тойоцерин нормализует процесс пищеварения, увеличивает поедаемость корма и улучшает его конверсию, что приводит к повышению продуктивности. Споровая оболочка обеспечивает термоустойчивость бактерий в процессе производства кормов (более 90% спор выдерживают температуру, превышающую 90 °С), а также толерантность к низким значениям рН в желудке (рН = 2) и в подкисленных смесях и кормах. Эти особенности упрощают процесс хранения Тойоцерина как в премиксах, так и в готовых кормах. Препарат совместим с кормовыми антибиотиками, витаминами, минералами и органическими кислотами, а также со всеми стандартными ингредиентами при условии использования его в соответствии с рекомендациями по применению.

В настоящее время Тойоцерин широко применяется в Японии, странах Юго-Восточной Азии и в Европе как в животноводстве (свиноводство, крупный рогатый скот), так и в птицеводстве [20].

На рынке пробиотиков особенно востребованы комбинированные препараты. Входящие в комплексный пробиотик штаммы бактерий объединяются по способности продуцировать различные ферменты, биологически активные вещества так, чтобы они дополняли друг друга. Кроме того, для получения новых поликомпонентных биологически активных препаратов комбинируют пробиотики с пребиотическими веществами.

Известен ферментно-пробиотический препарат Бацелл – биологическая кормовая добавка, полученная на основе твердофазной ферментации подсолнечного шрота либо продуктов переработки зерновых или зернобобовых культур микроорганизмами, проявлющими целлюлолитическое, пробиотическое и пребиотическое действие (Ruinococcus albus, Lactobacillus sp., Bacillus subtilis 8130). По внешнему виду Бацелл представляет собой сыпучий порошок, содержащий не менее 3 108 КОЕ бактерий в 1 г.

Применение кормовой добавки позволяет повысить продуктивность животных и птиц, на 10–15% снижает расход кормов и на 20% – их стоимость на единицу продукции, улучшить показатели воспроизводства, повысить сохранность поголовья, снизить затраты на лечебные препараты и улучшить экономические показатели [21].

К наиболее прогрессивным формам препаратов относятся сорбированные формы пробиотиков, содержащие бактерии, иммобилизованные на частицах твердого сорбента. За счет химических и электростатических сил взаимодействие таких форм со стенкой кишечника выше. Сорбент ускоряет дезинтоксикацию и репаративный процесс. Наиболее часто используются природные сорбенты – угли, цеолиты, кремнеземы. Они обладают относительно хорошей сорбционной и ионообменной способностью, имеют сильно развитый поверхностный каркас с порами разного диаметра, способны взаимодействовать с различными веществами и клетками пробиотической культуры. Биологическая активность таких препаратов связана с тем, что микробная масса живых пробиотических бактерий иммобилизована на сорбенте, благодаря чему они лучше выживают и быстрее заселяют кишечник [22–24]. В препаратах, иммобилизованных на сорбенте, титр бактерий составляет 1 109 –1 1010 КОЕ/г.

Адсорбированные на нейтральном фитоносителе клетки пробиотических микроорганизмов Bacillus pantothenticus 1–85 содержатся в препарате кормового назначения Целобактерин-Т (титр 1 1010 КОЕ/г) [25, 26], обладающем высокой целлюлолитической активностью, доза ввода которого в корма составляет 1 кг/т комбикорма. Использование Целлобактерина-Т в составе кормов для телят, коров, свиней, птицы показало высокую биологическую эффективность. Увеличение привесов поросят до постановки на откорм благодаря действию препарата может составлять до 30%. В период откорма свиней препарат позволяет существенно снизить стоимость рационов за счет большого включения шротов и отрубей, уменьшить затраты корма на привес и повысить сохранность.

На основе бактерий B. subtilis и B. licheniformis разработана технология производства пробиотика КД-5 с использованием контактно-сорбционного метода высушивания биомассы бацилл и продуктов их микробного синтеза на пшеничных отрубях.

Титр бактерий в препарате составляет 1,5 109 КОЕ/г. Выявлено положительное влияние пробиотика на перевариваемость и эффективность использования организмом поросят-отъемышей питательных веществ комбикорма, отмечаются приросты живой массы поросят-отъемышей до 40% при его использовании [27].

Новое направление биотехнологии – получение пробиотических препаратов в виде биопленки и использование их в составе кормов [5].

Известен пробиотический препарат Ферм-КМ. Технология получения препарата основана на неполном сбраживании свекловичного жома пробиотической ассоциацией. Конечный продукт состоит из биомассы пробиотиков, продуктов их метаболизма, продуктов биотрансформации фитосубстрата и фитокомпонентов. В состав бактериальной композиции препарата Ферм-КМ включены живые клетки четырех штаммов рода Bacillus (B. subtilis В-1830, B. subtilis 188, B. subtilis 44-р, B. licheniformis МС-12), проявляющих пробиотический эффект в сочетании с эндоглюканазной, протеолитической, амилазной активностями, а также комплекс молочнокислых бактерий. Кроме того, в препарат входят фиточастицы, являющиеся целлюлозным микросорбентом, и пребиотики – пектины свеклы [27]. Пробиотические бактерии находятся в препарате в виде биопленки на поверхности фитосубстрата, что позволяет микроорганизмам сохранять жизнеспособность при высушивании, гранулировании комбикормов и выживать при комбинировании с некоторыми кормовыми антибиотиками [28–34]. Препараты, основанные на твердофазных процессах и получении биопленки, отличаются от аналогов наличием сигнальных веществ бактериального происхождения, влияющих на гомеостаз многоклеточных организмов-хозяев [5].

Препарат Ферм-КМ обеспечивает высокоэффективное использование кормов, увеличивает прирост живой массы, значительно улучшает переваривание животными, рыбами и птицей некрахмалистых полисахаридов из различных видов зерна, повышает резистентность организма к неблагоприятным факторам [5, 28].

Таким образом, применение полнорационных комбикормов в сочетании с ферментными препаратами и пробиотиками позволяет значительно расширить базу комбикормовой промышленности и повысить эффективность производства животноводческой продукции.

В Беларуси препаратов аналогичного действия нет. Проблема улучшения качества кормов и снижения заболеваемости сельскохозяйственных животных актуальна для животноводства Республики Беларусь. Согласно данным Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь для обеспечения в 2012 г. производства 482 тыс. т свинины потребуется 1919 тыс. т комбикорма и в его составе около 200 млн доз пробиотика.

В настоящее время в Институте микробиологии начаты исследования по разработке и изучению эффективности использования в составе кормов препаратов, обладающих пробиотическим действием, основу которых составляют спорообразующие бактерии рода Bacillus. Использование пробиотических препаратов с высокой антагонистической и ферментативной активностью в составе кормов для животных и птицы обеспечит лечебнопрофилактическое действие, позволит снизить обсемененность кормов патогенной и условно-патогенной микрофлорой, повысит их качество, усвояемость и активизирует процессы метаболизма при выращивании животных и птицы.

Литература

1. Богатырев, И. Н. Использование биопрепаратов в кормлении животных для получения экологически чистого сырья / И. Н. Богатырев //

Современное комбикормовое производство и перспективы его развития. – М.:

МПА, 2003. – С. 84–88.

2. Sion, O. Probiotic feed additives – effectiveness and expected modes of action /. imon, A. Jadamus, W. Vahjen // Journal of Animal and eed ciences. – 2001. – Vol. 10. – P. 51–67.

3. Walker, R. Probiotic microbes: the scientific basis / R. Walker, M. Buckley // A report from the American Academy of Microbiology. – 2006. – 22 р.

4. Collins, M. D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M. Collins,. R. ibson // Am. J. Clin.

Nutr. –1999. – Vol. 69, N 5. – P. 1052–1057.

5. Новое поколение пробиотических препаратов кормового назначения / Н. А. Ушакова [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 1. – С. 184–192.

6. Тараканов, Б. В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных / Б. В. Тараканов // Ветеринария. – 2000. – № 1. – С. 47–54.

7. Bergeys manual of systematic bacteriology /.. Williams [et. al.]; еd. by.. Williams. – Baltimore: Williams and Wilkins, 1989. – Vol. 4. – 2545 p.

8. Смирнов, В. В. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ / В. В. Смирнов, С. Р. Резник, И. А. Василевская. – Киев: Наук. думка, 1982. – 280 с.

9. Разработка пробиотических препаратов наружного и внутреннего применения на основе бактерий Bacillus subtilis / Э. И. Коломиец [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб.

науч. тр.; отв. ред. Э. И. Коломиец, А. Г. Лобанок. – Минск: Беларус. навука, 2009. – Т. 2. – С. 231–243.

10. orulating bacteria of genus Bacillus as a basis of novel veterinary probiotic / M.. Kolosovskaya [et. al.] // 4th Congress of European Microbiologists, eneva, witzerland, 26–30 June 2011.

11. Biochemical and molecular characterization of Bacillus ayloliquefaciens, Bacillus subtilis and Bacillus puilus isolated with distinct antagonistic potential against Xanthoonas capestris pv. campestris / E.. Wulff [et al.] // Plant Pathology. – 2002. – Vol. 51, N 5. – P. 574–584.

12. Koloiets, E. I. New approaches in development of biological control products / E. I. Kolomiets,. V. Romanovskaya, N. V. verchkova // Biotechnology: tate of Art and Prospects for evelopment / ed. by. E. Zaikov. – New York: Nova cience Publishers, 2008. – P. 165–174.

13. A linear hexapeptide somatostatin antagonist blocks somatostatin activity in vitro and influences growth hormone release in rats / W. R. Baumbach [et al.] / Mol. Pharmacol. – 1998. – Vol. 54, N 5. – Р. 864–873.

14. Выделение соматостатин-подобного пептида клетками Bacillus subtilis В-8130, кишечного симбионта дикой птицы Tetrao urogallus, и влияние бациллы на животный организм / Н. А. Ушакова [и др.] // Доклады РАН. – 2010. – Т. 434, № 2. – С. 282–285.

15. Hall-Stoodley, L. Bacterial biofilms: from the Natural environment to infectious diseases /. Hall-toodley, J. William, C. toodley // Nature Reviews Microbiology. – 2004. – Vol. 2. – Р. 95–108.

16. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л. Ф. Бакулина [и др.] // Биотехнология. – 2001. – № 2. – С. 48–56.

17. Пробиотик из Bacillus subtilis 8130 кормового назначения – природный стимулятор пищеварения / Н. А. Ушакова [и др.] // Материалы III Моск.

Междунар. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития». – М., 2005. – Ч. 1. – С. 303.

18. Соковых, О. В. Изучение биологических свойств природного штамма бактерий Bacillus subtilis в-8130 и эффективность использования пробиотиков на его основе при откорме свиней: автореф. дис. … канд. биол. наук / О. В. Соковых; 03.00.23, 06.02.02. – Дубровицы, 2006. – 32 с.

19. Попов, Р. М. Эффективность использования в комбикормах для молодняка свиней пробиотика «ПРО-А» различной модификации: автореф. дис. … канд. с.-х. наук / Р. М. Попов; 06.02.02. – Дубровицы, 2009. – 32 с.

20. Желамский, С. В. Новый пробиотик Тойоцерин [Электронный ресурс] / С. В. Желамский // Ценовик. – 2005. – № 2. – Режим доступа: www. tsenovik. ru.

21. Наставления по применению пробиотических добавок «Пролам», «Моноспорин» и «Бацелл» в свиноводстве / Л. Г. Горковенко [и др.]. – Краснодар, 2011. – 15 с.

22. Канбеков, Р. Г. Влияние цеолитов, биотина, пробиотика «Лактобифид»

на микробиоценоз, естественную резистентность, минеральный обмен и продуктивные свойства поросят: автореф. дис. …канд. биол. наук / Р. Г. Канбеков. – Уфа, 2003. – 21 с.

23. Биопрепараты в сельском хозяйстве. Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве / И. А. Тихонович [и др.]. – М.: Россельхозакадемия, 2005. – 154 с.

24. Малик Н. И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н. И. Малик, А. Н. Панин // Ветеринария. – 2001. – № 1. – С. 46–51.

25. Малик, Н. И. Пробиотики – неотъемлемый компонент рационального кормления животных / Н. И. Малик, А. Н. Панин // Ветеринария. – 2006. – № 7. – С. 46–51.

26. Штамм бактерий Bacillus pantothenticus 1–85 для использования в гранулированных кормах: пат. RU № 2235772 / Г. Ю. Лаптев [и др.]. – 2004.

27. Смирнова, Е. А. Технология производства пробиотика КД-5 и его использование в свиноводстве: автореф. дис. … канд. биол. наук / Е. А.

Смирнова; 03.00.23. – М., 2009. – 32 с.

28. Анаэробная твердофазная ферментация растительных субстратов с использованием Bacillus subtilis / Н. А. Ушакова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45, № 1. –С. 70–77.

29. Образование биопленок – пример «социального» поведения бактерий / Ю. М. Романова [и др.] // Микробиология. – 2006. –. 75, № 4. – C. 556–561.

30. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок / Т. А. Смирнова [и др.] // Микробиология. – 2010. –. 79, № 4. – С. 435– 446.

31. Пробиотики. Достижения и перспективы использования в животноводстве / Б. В. Тараканов [и др.] // Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки: Тр. ВИЖа. – 2004. – Т. 3, вып. 62. – С. 6973.

32. Использование биологически активных кормовых добавок для повышения питательных свойств комбикормов и увеличения норм ввода в комбикорма шротов и жмыхов / Д. С. Павлов [и др.] // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2011. – № 1. – С. 89–92.

33. Пробиотики, как элемент технологии производства безопасной продукции животноводства и птицеводства / Л. З. Кравцова [и др.] // Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии: материалы науч.-практ.

конф. – Воронеж, 2004. – С. 19–20.

34. Похиленко, В. Д. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность / В. Д. Похиленко, В. В. Перелыгин // Химическая и биологическая безопасность. – 2007. – № 2–3 (32–33). – С. 20–41.

N. V. SVERCHKOVA, N. S. ZASLAVSKAYA, M. S. KOLOSOVSKAYA, T. V. ROMANOVSKAYA, E. I. KOLOMIETS

PROBIOTIC PREPARATIONS FOR FODDER PRODUCTION BASED

ON THE SPORE-FORMING BACTERIA OF THE GENUS BACILLUS

Laboratory of biological control agents Published data on probiotic preparations based on the spore-forming bacteria of genus Bacillus were analyzed. he emphasis was laid on preparations, used as additives to the rations of of farm animals and poultry, as well as on new trends in the development of probiotics for fodder production based on bacteria of genus Bacillus.

УДК 577.152:579.8

Н. А. ГОЛОВНЕВА, В. А. ЩЕТКО, Н. Е. РЯБАЯ

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ В ВЕТЕРИНАРНОЙ ПРАКТИКЕ

И МЕДИЦИНЕ

Лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Показаны перспективы использования в медицине и ветеринарной практике биопрепаратов на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов.

Отсутствие токсичности, физиологичность действия позволяют рассматривать препараты на основе метаболитов и компонентов клеток пробиотических микроорганизмов в качестве агентов для профилактики и восстановления нормальных функций кишечной микрофлоры, иммунобиотиков, направленных на поддержание иммунной системы макроорганизма, для лечения различных патологических состояний, вызванных инфекционными и злокачественными заболеваниями.

Желудочно-кишечные заболевания молодняка сельскохозяйственных животных, проявляющиеся диарейным синдромом, являются наиболее распространенными в условиях современного промышленного животноводства Беларуси. В общей структуре заболеваний болезни органов пищеварения достигают 75–80%, что приносит значительный экономический ущерб. Причинами возникновения гастроэнтеритов животных могут быть нарушение условий содержания, недоброкачественное кормление, незрелость микрофлоры кишечника, применение антимикробных препаратов, что сопровождается активизацией условно-патогенной микрофлоры. Многочисленными исследованиями доказано, что частое применение антибиотиков нарушает кишечный микробиоценоз, приводит к сдвигу в количественном и качественном составе условно-патогенной и нормальной кишечной флоры, вызывает дисбактериоз, являющийся одним из основных факторов развития заболеваний с диарейным синдромом.

В последнее время широкое развитие получила концепция бактериотерапии и бактериопрофилактики с помощью пробиотиков – препаратов живых микроорганизмов из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза. Пробиотики используются в медицине и ветеринарной практике для поддержания и коррекции баланса кишечной микрофлоры, предупреждения дисфункций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека и животных после антимикробной терапии. Живые культуры полезной микрофлоры, входящие в состав пробиотиков, обладают антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, иммуностимулирующим и корригирующим действием. Использование лечебно-профилактических препаратов пробиотиков в ветеринарии рассматривается как альтернатива антибиотикотерапии, позволяет исключить употребление кормовых антибиотиков в животноводстве, способствует восстановлению пищеварения, снижению общей заболеваемости. При этом улучшаются санитарно-технологические свойства мясо-молочной продукции, продукты животноводства становятся более конкурентоспособными как по качеству, так и по цене.

В составе пробиотических препаратов широко используются бифидо- и лактобактерии – грамположительные анаэробные бактерии, преобладающие по численности и физиологической значимости в кишечнике млекопитающих и птиц. Возможность быстрого восстановления нормофлоры с помощью пробиотиков обусловлена рядом физиолого-биохимических свойств, определяемых метаболической активностью пробиотических микроорганизмов, а также непосредственным антагонистическим воздействием бактерий и их метаболитов в ЖКТ на широкий спектр патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В настоящее время общепризнано, что биологические бактериальные препараты – пробиотики – являются наиболее физиологичными для коррекции и профилактики дисбиотических изменений микрофлоры человека и животных. Нормальная микрофлора кишечника сформировалась в процессе эволюции в результате отбора определенных видов микроорганизмов, способных к прикреплению и колонизации слизистых оболочек. Резидентная микрофлора пищеварительного тракта является гетерогенной микробной экосистемой, содержащей до 1 1014 КОЕ/мл бактерий [1]. Пробиотические микроорганизмы реализуют свое положительное влияние на физиологические функции и биохимические реакции макроорганизма, обеспечивая метаболическую активность соответствующих органов и тканей, регулируя функционирование биопленок на слизистых оболочках кишечного эпителия бактерий, продукции ферментов, витаминов, олигосахаридов и других веществ [2, 3].

Продукты и препараты, изготовленные с применением бактерий – представителей нормофлоры ЖКТ, обладают противоопухолевым, антихолестериногенным, иммуностимулирующим и другими позитивным воздействием на состояние макроорганизма [4].

Пробиотики используют для стимуляции неспецифического иммунитета и восстановления нормофлоры ЖКТ после лечения антибиотиками и другими антибактериальными, химиотерапевтическими средствами; для замены антибиотиков в комбикормах для молодняка крупного рогатого скота, пушных зверей и птицы; для ускорения адаптации животных к высокоэнергетическим рационам и небелковым азотистым веществам; для повышения эффективности использования корма и продуктивности животных [5, 6].

Принцип использования пробиотиков основан на заселении кишечника конкурентноспособными штаммами бактерий-пробионтов, осуществляющих неспецифический контроль за численностью условно-патогенной микрофлоры путем вытеснения ее из состава кишечной популяции и сдерживания развития факторов патогенности [2, 7]. В результате антигенной стимуляции кишечными бактериями в организме создается общий пул иммуноглобулинов [8, 9]. Показано, что молочнокислые и бифидобактерии играют немаловажную роль не только в предупреждении заболеваний, ассоциированных с чрезмерной контаминацией кишечной стенки макроорганизма условно-патогенными бактериями с повышенными вирулентными свойствами, но и в предупреждении транслокации возбудителей токсикоинфекций из кишечника организма-хозяина в его органы и ткани [10, 11].

В ветеринарной медицине и животноводстве для профилактики и терапии желудочно-кишечных заболеваний животных применяются пробиотики Лактобактерин, Диалакт, Лактобиф и др.

Однако, несмотря на доступность технологии изготовления, бактериальные препараты на основе живых микроорганизмов не всегда оказываются достаточно эффективными. Это связано в первую очередь с отсутствием толерантности у некоторых штаммов пробиотических микроорганизмов к воздействию желчных кислот, высокой кислотности среды и другим факторам, а также с элиминацией нежизнеспособных лиофилизированных клеток в случае использования сухих форм препаратов.

Более того, многие исследователи отмечают низкую колонизационную и антибактериальную активность лиофилизированных форм бактерий, представляющих основу многих пробиотиков.

Решению этих проблем может способствовать разработка и внедрение в ветеринарную и медицинскую практику принципиально новых препаратов, созданных на основе микробных метаболитов, названных по современной классификации пробиотиками метаболитного типа. Концепция пробиотических препаратов, содержащих микробные метаболиты, основана на экспериментальных данных о биологической активности продуктов метаболизма нормальной микрофлоры человека и животных [1].

Экзометаболиты молочнокислых и бифидобактерий, включающие антибиотические вещества различной природы, витамины, аминокислоты, ферменты, иммуномодуляторы, стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют развитие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуют регенерации и питанию эпителиальных тканей оболочки кишечника, оказывают иммунокорригирующее действие. Микробные метаболиты непосредственно участвуют в осуществлении регуляторных и трофических связей макроорганизма и его нормальной микрофлоры и поддерживают эту систему в состоянии симбиотического равновесия [2, 3].

Антагонистическая активность нормофлоры по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям является важным звеном механизма действия пробиотиков на макроорганизм. Антимикробные взаимодействия оказывают влияние как на структуру микробиоценоза, т. е. на состав и разнообразие видов бактерий, так и на их функционирование. Антагонистические свойства лактобацилл и бифидобактерий важны для характеристики симбиотических отношений пробиотических микроорганизмов с организмом хозяина и с микроорганизмами других таксономических групп, что необходимо учитывать при создании многокомпонентных препаратов-пробиотиков. Свойства микроорганизмов-пробиотиков, состав секретируемых ими метаболитов существенно различаются в зависимости от родовых, видовых и штаммовых характеристик, содержания в препаратах живых и инактивированных бактериальных клеток, химического состава и структурно-функциональных свойств биополимеров клеточной стенки, метаболической активности бактерий, продукции ферментов, витаминов, олигосахаридов и других веществ.

Антимикробный эффект молочнокислых и бифидобактерий обусловлен комплексом их антагонистических свойств и определяется способностью ингибировать адгезию патогенных бактерий, а также продукцией таких метаболитов, как летучие жирные кислоты, молочная кислота, перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и др.

Основные биологически активные компоненты фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов молочнокислых и бифидобактерий – короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК). Кроме того, препараты содержат молочную, фосфорную кислоты, буферные соли (фосфорнокислый натрий и калий), лактозу и ряд аминокислот. Содержание биологически активных веществ в одной капле фильтрата культуральной жидкости соответствует количеству метаболитов из 1010 бактерий. Механизм действия препарата опосредован входящими в него компонентами.

Летучие жирные кислоты (монокарбоновые кислоты с длиной цепи до 8 атомов углерода) – конечные продукты ферментации углеводов, белков и жиров анаэробной микрофлорой, важное звено в ряде физиологических и патологических процессов.

Благодаря летучим жирным кислотам создается оптимальный pH в просвете кишечника, что ингибирует рост условно-патогенных микроорганизмов, предупреждает транслокацию возбудителей токсикоинфекций из кишечника организма-хозяина в органы и ткани, повышает колонизационную резистентность слизистой оболочки толстой кишки, является мягким регулятором моторной функции кишечника [12–14].

На примере L. acidophilus и Bidobacteriu spp. показано, что пробиотические бактерии образуют молочную кислоту и бактериоцины, которые ингибируют рост патогенных микроорганизмов.

Молочная кислота является естественным метаболитом обмена веществ и полностью ассимилируется в организме животных.

Препараты на основе молочной кислоты широко применяются в ветеринарии, используются в качестве противобродильного средства преджелудков жвачных и желудка лошадей. Специалисты по кормлению сельскохозяйственных животных и птицы рекомендуют введение в корма подкисляющих агентов. Закисление среды приводит к ингибированию роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также восстановлению роста нормофлоры, что, в свою очередь, способствует исчезновению диареи, метеоризма и других диспепcических симптомов.

Эти свойства сделали молочную кислоту одним из наиболее популярных средств в животноводстве и птицеводстве. Продукты на основе молочной кислоты используют для уничтожения в кормах патогенных бактерий родов Capylobacter, Salonella, Pseudomonas, что уменьшает нагрузку на иммунную систему и стабилизирует деятельность пищеварительной системы. Результатом этого является повышение продуктивности, увеличение темпов роста и ежедневных привесов животных. Известно, что энергетическая потребность организма травоядных животных на 50–75% обеспечивается КЖК микробного происхождения, которые всасываются в системный кровоток. Содержащиеся в фильтратах культуральной жидкости КЖК способствуют нормализации кишечного микробиоценоза и обеспечивают регенерацию поврежденных эпителиальных клеток кишечной стенки, в значительной мере восполняют энергетические потребности клеток эпителия кишечника [15–19]. Этому способствуют и буферные соли, восстанавливающие рН среды до необходимых физиологических значений [20].

Помимо органических кислот представители нормальной микрофлоры ЖКТ продуцируют и более сложные соединения – бактериоцины, микроцины, антибиотики, которые обеспечивают антимикробную защиту макроорганизма [21–23].

Способность продуцировать специфические антибиотические вещества пептидно-белковой природы – бактериоцины – установлена у бактерий различных таксономических групп.

В отличие от известных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, активны против бактерий того же или филогенетически родственных видов. В естественных условиях бактериоциногения является одним из факторов, влияющих на формирование микробного ценоза, так как бактериоциногенные штаммы обладают селективным преимуществом и в условиях микробных ассоциаций подавляют развитие бактерий со сходными пищевыми потребностями. Бактериоциногенность нормальной микрофлоры человека и животных также может служить одним из факторов защиты организма в условиях in vivo.

Продукция бактериоцинов, как и других биологически активных веществ, зависит от условий культивирования бактерий (состава питательной среды, рН, температуры) и определяется фазой роста бактериальных штаммов. Для эффективного коммерческого применения бактериоцинов и продуцирующих их штаммов грамположительных бактерий необходимо детальное изучение факторов и условий, влияющих на продукцию бактериоцинов, а также оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов.

Анализ литературных данных показывает, что многие из исследованных бактериоцинов являются первичными метаболитами, их синтез происходит в экспоненциальной стадии роста культуры с максимумом продукции в середине или конце этой фазы [24]. В некоторых случаях продукция бактериоцинов продолжается и в стационарной стадии роста бактерий, однако их количество сильно снижается [25]. Продукция бактериоцинов на поздних стадиях роста микроорганизмов может быть вызвана различными внешними воздействиями. Только для двух бактериоцинов – педиоцина и низина – доказано, что они являются вторичными метаболитами, и основная продукция данных бактериоцинов происходит в стационарной стадии роста [26].

Влияние условий культивирования грамположительных бактерий на синтез бактериоцинов наиболее полно изучено на примере низина [27], педиоцина, энтероцина 1146 [28], лактоцина S, энтерококцина [29], курвацина [30] и некоторых других.

Установлено, что максимальная продукция бактериоцинов обычно происходит при культивировании бактерий на сложных, богатых питательными веществами средах [31], хотя некоторые антибактериальные пептиды могут накапливаться и на относительно простых питательных средах [32].

Показано, что различные источники углерода, азота, фосфора, другие питательные компоненты оказывают значительное влияние на продукцию бактериоцинов [33]. Так, увеличение концентрации источников азота и углерода в среде культивирования лактококков подавляет синтез низина [34], а изменение количества фосфора в среде не оказывает влияния на накопление этого бактериоцина. Продукция педиоцина, наоборот, ингибируется при увеличении концентрации фосфора, но практически не зависит от концентрации углеводов и азота. Повышение количества дрожжевого экстракта и триптона в среде вызывает усиление роста Lactobacillus sakei и уровня накопления сакацина Р [35].

Значительное влияние на синтез антибактериальных пептидов оказывают температура и кислотность среды культивирования. Часто оптимальные для роста бактерий температура и кислотность среды неблагоприятны для максимальной продукции бактериоцинов. Снижение или повышение этих параметров вызывает уменьшение скорости роста бактерий и увеличение уровня накопления бактериоцинов [36].

Установлено, что при неблагоприятных для роста бактерий условиях, таких как экстремальные температура, кислотность среды культивирования, осмомолярность, воздействии токсичных для многих бактерий повышенных концентраций хлорида натрия, этанола, кислорода [37] наблюдается стимуляция бактериоцинпродукции. Стрессовые воздействия на бактериальные клетки могут быть использованы для направленного увеличения синтеза антимикробных пептидов и сокращения времени культивирования бактерий до накопления максимального количества бактериоцинов в среде роста. Стимуляция бактериоцинпродукции в неблагоприятных условиях роста важна при использовании бактерий в качестве заквасок или консервантов, так как многие технологические процессы, такие как производство мясных продуктов, сыров происходят в условиях, неблагоприятных для роста бактериоцинпродуцирующих штаммов.

Важное достижение последних лет – установление иммуномодулирующей активности пробиотических микроорганизмов, их способности защищать макроорганизм от инфекционных заболеваний или уменьшать их выраженность и продолжительность. Иммуногенная активность ряда препаратов-пробиотиков позволяет рассматривать их как фактор естественной иммунизации и один из механизмов поддержания системы иммунного гомеостаза, а также как потенциальное средство профилактической и лечебной иммунизации, восстанавливающей баланс между макроорганизмом и его микрофлорой [38, 39]. Эффективными иммуномодуляторами являются как клетки, так и компоненты клеточной стенки пробиотических бактерий [40]. Иммуностимуляция осуществляется живыми и инактивированными клетками L. сasei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Иммуномодулирующий эффект инактивированных форм пробиотических бактерий показан рядом исследователей. Нежизнеспособные клетки L. acidophilus, сохраняя высокий уровень антагонистической активности, не только способствуют поддержанию микробиоценоза, но и стимулируют иммунитет. Низкая токсичность и физиологичность действия позволяют рассматривать препараты на основе метаболитов и компонентов клеток пробиотических микроорганизмов в качестве перспективных иммунопробиотиков, направленных на поддержание иммунной системы макроорганизма, для лечения различных патологических состояний, вызванных инфекционными и злокачественными заболеваниями [41]. Одним из преимуществ метаболитных препаратов перед пробиотиками, содержащими клетки бактерий, является возможность их применения на фоне антибактериальной терапии.

Современные формы препаратов пробиотического действия включают интерферон, иммуноглобулины, витамины [42]. Созданы фармакологические композиции, включающие антитела к Helicobacter pylori и по меньшей мере один из пробиотических штаммов молочнокислых бактерий [43]. В последние годы все большее значение приобретает исследование биополимеров пробиотических микроорганизмов, обладающих иммунокорригирующим, противоопухолевым, радиопротекторным действием [44–46].

Использование компонентов клеток и биоактивных метаболитов бифидо- и молочнокислых бактерий позволит целенаправленно создавать препараты-пробиотики с определенным спектром биологической активности.

Литература

1. Servin, A. L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens / A.. ervin // EM Microbiology Reviews. – 2004. – Vol. 28, Is. 4. – P. 405–4402.

2. Малик, Н. И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н. И. Малик, А. И. Панин // Ветеринария. – 2001. – № 1. – С. 46–51.

3. axonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition / W. H. Holzapfel [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73. – P. 365–373.

4. Fooks, L. J. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology /. J. ooks, R. uller,. R. ibson // Int. airy J. – 1999. – Vol. 9. – P. 53–61.

5. Валышев, А. В. Факторы персистенции энтеробактерий и влияние на них пробиотиков при дисбактериозе кишечника: автореф. дис. … канд. мед.

наук / А. В. Валышев. – Оренбург, 1997. – 23 с.

6. Богданов, К. С. Профилактика заболеваний животных в промышленных комплексах / К. С. Богданов. – М.: Колос, 1974. – С. 35–39.

7. Квасников, Е. И. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий по отношению к возбудителям кишечных заболеваний домашних птиц / Е. И. Квасников, Т. Н. Шишлевская, Н. К. Коваленко // Микробиол. журн. – 1983. – Т. 45, № 5. – С. 27–32.

8. Бабина, М. П. Пробиотики в профилактике желудочно-кишечных заболеваний и гиповитаминозов животных и птицы / М. П. Бабина, И. М. Карпуть;

Белорус. науч. центр информации и маркетинга агропром. комплекса. – Минск, 2001. – С. 11–16.

9. Prioult, G. Effect of Probiotic Bacteria on Induction and Maintenance of ral olerance to -actoglobulin in notobiotic Mice /. Prioult, I. liss,. Pecquet // Clin. iagn. ab. Immunol. – 2003. – Vol. 10. – P. 787–792.

10. Increased resistance of mice to Salonella enterica serovar yphimurium infection by synbiotic administration of Bifidobacteria and transgalactsylated oligosaccharides /. Asahara [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2001. – Vol. 91, N 6. – P. 985–996.

11. Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infection with shiga toxinproducing Escherichia coli 157: H7 /. Asahara [et al.] // Infect. Immun. – 2004. – Vol. 72. – P. 2240–2247.

12. Kailasapathy, K. urvival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bidobacteriu spp. / K. Kailasapathy, J. Chin // Immunol. Cell Bio. – 2000. – Vol. 78, N 1. – P. 80–88.

13. Adas, M. R. rowth inhibition of food-borne pathogen by lactic and acetic acids and their mixtures / M. R. Adams, C. J. Hall // Int. J. ud. ci. echnol. – 1988. – Vol. 23. – P. 292.

14. Moon, N. J. Inhibition of the growth of acid tolerant yeasts by acetate, lactate and propionate and their mixture / N. J. Moon // J. Appl. Bacteriol. – 1983. – Vol. 55. – P. 455–460.

15. Алиев, А. А. Профилактика нарушений обмена веществ у сельскохозяйственных животных / А. А. Алиев. – М.: Агропромиздат, 1986. – 470 с.

16. Курилов, Н. В. Физиология сельскохозяйственных животных / Н. В. Курилов, А. П. Кроткова, Л. В. Харитонова. – Л.: Наука, 1978. – С. 6–45.

17. Бахтин, А. Г. Желудочно-кишечные болезни свиней / А. Г. Бахтин. – М.: Колос, 1967. – 200 c.

18. Георгиевский, В. И. Физиология сельскохозяйственных животных / В. И. Георгиевский. – Л.: Наука, 1978. – С. 84–126.

19. Поливода, Д. И. Физиология сельскохозяйственных животных / Д. И. Поливода.– Л.: Наука, 1978. – С. 121–144.

20. Бондаренко, В. М. Стабилизирующее действие метаболитного пробиотика хилак форте на нормальную микрофлору кишечника / В. М. Бондаренко // Фарматека. – 2005. – № 1 (97). – С. 36–43.

21. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens / P. Hutt [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2006. – Vol. 100, N 6. – P. 1324–1332.

22. Antagonistic activity of actobacillus bacteria strains against anaerobic gastrointestinal tract pathogens (Helicobacter pylori, Capylobacter coli, Capylobacter jejuni, Clostridiu difcile) / M. trus [et al.] // Med. osw.

Mikrobiol. – 2001. – Vol. 53, N 2. – P. 133–142.

23. Riley, M. A. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary perspectives / M. A. Riley, J. E. Wertz // Biochimie. – 2002. – Vol. 84, N 5–6. – P. 357–364.

24. Production kinetics of acidophilin 801, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus IBB 801 / M. Zamfir [et al.] // EM Microbiol ett. – 2000. – Vol. 190, N 2. – P. 305–308.

25. Production and pH-dependent bactericidal activity of lactocin, a lantibiotic from Lactobacillus sakei 45 / C. I. Mortvedt-Abildgaard [et al.] // Appl.

Inviron. Microbiol. – 1995. – Vol. 61, N 1. – P. 175–179.

26. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H /. R. Biswas [et al.] // Appl. Environ.

Microbiol. – 1991. – Vol. 57, N 4. – P. 1265–1267.

27. Hirsch, A. rowth and nisin production of a strain of Streptococcus lactis / A. Hirsch // J. en. Microbiol. – 1951. – Vol. 5, N 1. – P. 208–221.

28. Influence of pH on the production of enterocin 1146 during batch fermentation / E. Parente [et al.] // ett. Appl. Microbiol. – 1994. – Vol. 19, N 1. – P. 12–15.

29. Effect of nitrogen sources on bacteriocin production by Enterococcus faecium A 2000 / A. Pantev [et al.] // olia Microbiol. – 2002. – Vol. 47, N 6. – P. 659–662.

30. Influence of complex nutrient source on growth of and curvacin a production by sausage isolate Lactobacillus curvatus H 1174 / J. Verluyten [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, N 9. – P. 5081–5088.

31. A comparison of factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria / E. Parente [et al.] // J. Appl. Bacteriol. – 1992. – Vol. 73. – P. 290–298.

32. Production of sacacin P by Lactobacillus sakei in a comletely defined medium /. Moretro [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2000. – Vol. 88, N 3. – P. 536–545.

33. Influence of growth conditions on the production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from kimchi / C. I. Cheigh [et al] // J. Biotechnol. – 2002. – Vol. 93, N 3. – P. 225–235.

34. Nutritional factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria on whey / N. P. uerra [et al.] // Int. J. ood Microbiol. – 2001. – Vol. 70, N 3. – P. 267–281.

35. Influence of complex nutrients, temperature and on bacteriocin production by Lactobacillus sakei CCU 42687 / I. M. Aasen [et al.] // Appl. Microbiol.

Biotechnol. – 2000. – Vol. 53, N 2. – P. 159–166.

36. he presence of salt and a curring agent reduces bacteriocin production by Lactobacillus sakei CC 494, a potential starter culture for sausage fermentation /. eroy [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, N 12. – P. 5350–5356.

37. Primary metabolite kinetics of bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus aylovorus and evidence for stimulation of bacteriocin production under unfavorable growth condition /. e Vuyst [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1996. – Vol. 42. – P. 817–827.

38. Jung, G. antibiotics – ribosomally synthesized biologically active polypeptides containing sulphide bridges and,-didehidro amino acids /. Jung // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 1991. –Vol. 30. – P. 1057–1068.

39. Saier, M. H. Probiotics and prebiotics in human health / M. H. aier, N. M. Mansour // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2005 – Vol. 10, N 1. – P. 22–25.

40. Maldonado, C. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation / C. Maldonado, R. aldeano,. Perdign // Journal of Appl. Microbiol. – 2004. – Vol. 97, N 4. – P. 673–685.

41. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / под ред. Г. Г. Онищенко [и др.]. – М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. – 608 с.

42. Shah, N. P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods / N. P. hah // J. airy ci. – 2000. – Vol. 83, N 4. – P. 894–907.

43. Inactivated probiotic bacteria and methods of use thereof: 20050180962 K. C. United tates Patent Application A1 / E. Raz,. Rachmilewitz – er.

N 742052.

44. Metabolic engineering of lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals. / J. Hugenholtz [et al.] // Antonie Van eeuwenhoek. – 2002. – Vol. 82, N 1–4. – P. 217–235.

45. Hugenholtz, J. Nutraceutical production with food-grade microorganisms / J. Hugenholtz, E. J. mid // Curr. pin. Biotechnol. – 2002. – Vol. 13, N 5. – P. 497–507.

46. Exopolysaccharides produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus / P. Ruas-Madiedo [et al.]. // J. ood Prot. – 2006. – Vol. 69, N 8. – P. 2011–2015.

N. A GOLOVNYOVA, V. A. SHCETKO, N. E. RYABAYA

APPLICATION PROSPECTS OF BIOPREPARATIONS BASED

ON METABOLITES OF PROBIOTIC MICROORGANISMS

IN VETERINARY PRACTICE AND MEDICINE

Laboratory of lactic acid bacteria and bidobacteria Prospects of applying biopreparations based on metabolites of probiotic microorganisms in medicine and veterinary practice have been demonstrated. ack of toxicity and physiological compatibility allow to regard preparations based on metabolites and cell components of probiotic microorganisms as effective agents for prevention (of gut disorders) and recovery of intestinal microflora, for treatments of various pathological states caused by infections and malignant tumor diseases as immunobiotics promoting normal immune status of macroorganisms.

УДК 579.62

Н. А. ГОЛОВНЕВА, Н. Е. РЯБАЯ, В. А. ЩЕТКО, А. А. САМАРЦЕВ, А. Н. МОРОЗОВА

ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ,

СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И РАЗВИТИЯ МОЛОДНЯКА

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Для ветеринарии и сельского хозяйства созданы комплексные пробиотические препараты Билавет и Билавет-С. Культуры бифидо- и молочнокислых бактерий, включенные в их состав, отличаются множественной антибиотикорезистентностью, желчеустойчивостью, продукцией широкого спектра внеклеточных гидролаз. Отобранные штаммы проявляют антагонизм по отношению к условно патогенным и патогенным микроорганизмам родов Salonella, Klebsiella, Proteus, Pasteurella, Staphylococcus, Streptococcus, а также E. coli. Препараты Билавет и Билавет-С показали высокую лечебно-профилактическую эффективность при диарейных болезнях, гиповитаминозах и нитратных токсикозах молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.

В настоящее время значительно возросло число желудочнокишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, обусловленных широким распространением в окружающей среде условно-патогенных микроорганизмов. Борьба с этими болезнями – сложная проблема современной ветеринарной науки. Трудности достижения желаемого эффекта в лечении и профилактике таких заболеваний связаны с их многообразием, полиэтиологичностью, а также необходимостью учета природы стрессовых факторов, оказывающих постоянное воздействие на организм животных в условиях промышленных животноводческих хозяйств. Они осложняются также специфичностью лечения молодняка животных и повышением резистентности микроорганизмов-возбудителей к большинству применяемых химиотерапевтических средств [1].

В период новорожденности, молозивного питания и следующего за ним молочного питания (с 5-дневного возраста до перехода на традиционное, присущее виду животного кормление) происходит становление микрофлоры организма животного. К основным причинам, нарушающим этот процесс, относятся первичные и вторичные иммунодефициты у молодняка, снижение колострального иммунитета, антибиотикотерапия, нарушение условий содержания и кормления матери и потомства, частая вакцинация и др. [2]. Для компенсации физиологического дисбактериоза и более раннего становления колонизационной резистентности организма молодняка после первой выпойки молозива новорожденным животным необходимо назначать пробиотики – препараты на основе живой нормальной микрофлоры кишечника, ее метаболитов и веществ, стимулирующих развитие в кишечнике собственной симбионтной микрофлоры [3].

Сегодня в ветеринарной практике и животноводстве наиболее полно требованиям безопасности и эффективности отвечают пробиотические препараты на основе лактобацилл и бифидобактерий, предназначенные для коррекции микрофлоры организма-хозяина, профилактики и лечения ряда заболеваний. Использование пробиотиков на основе этих микроорганизмов позволяет не только улучшить пищеварение и нормализовать обмен веществ животных, но и повысить конкурентоспособность сельскохозяйственной продукции по качеству и цене [4–6].

В настоящее время известны многокомпонентные пробиотические препараты различного состава, в разных препаративных формах – жидкости, порошки, таблетки, капсулы, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. Выбор формы препарата зависит от его назначения, времени использования и т. д. Наиболее распространенными и часто более эффективными являются жидкие препараты на основе живых бактерий.

Доказана их экологическая безопасность, витаминообразующие, ферментативные и иммунизирующие свойства [7, 8].

Разработанный нами жидкий пробиотический препарат Билавет на основе живых активных клеток бифидо- и молочнокислых бактерий (ТУ BY 100289066.042-2009), предназначен для лечения и профилактики кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птицы.

Однако для современного животноводства и ветеринарии особый интерес представляют бактериальные препараты в сухом виде, что связано с особенностями принятых в настоящее время технологий выращивания животных. Сухие формы препаратов имеют преимущества при хранении, транспортировке, при использовании в составе кормовых, витаминных, минеральных, ферментных добавок. Такие препараты могут использоваться для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний при групповом назначении сельскохозяйственным животным с кормом [9]. При разработке технологических подходов для производства сухих форм пробиотиков особое внимание уделяется подбору условий консервации бактериальной биомассы, которые минимизируют время перехода культур в физиологически активное состояние и позволят сохранить свойства культур, обеспечивающие их лечебно-профилактический эффект [10–12].

Анализ тенденций развития этой области биотехнологий показал, что для получения препаратов в сухой форме наиболее перспективно использовать лиофилизацию высушивание замороженного материала в вакууме. Лиофилизация позволяет получить продукцию с высокой биологической активностью, сохранить специфические свойства белков, свести к минимуму их денатурацию, обеспечить микробным клеткам состояние длительного анабиоза и получить стандартизированные по активности биопрепараты [4, 5, 12]. Преимуществом этого метода также является снижение массы биопрепарата, длительное время хранения.

Наиболее значимые параметры для отбора микроорганизмов в состав пробиотических препаратов: экологическая принадлежность к физиологическим симбионтам, устойчивость к воздействию пищеварительных соков, лизоцима, антимикробных препаратов, высокая адгезивность и антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам [13–17].

Использование молочнокислых и бифидобактерий в качестве биотерапевтических агентов приводит к нормализации микрофлоры кишечника, подавлению развития гнилостной и высоковирулентной микрофлоры, улучшению иммунного статуса организма. На примере пробиотических бактерий L. acidophilus и Bidobacteriu spp. показана продукция молочной кислоты и бактериоцинов, подавление роста условно-патогенных микроорганизмов. При этом создается оптимальный pH в просвете кишечника, что является мягким регулятором моторной функции кишечника, повышает колонизационную резистентность слизистой оболочки толстой кишки, способствует быстрому восстановлению микроэкологического статуса через нормализацию индигенной микрофлоры [16–18].

Иммуномодулирующая активность пробиотических бактерий проявляется в их влиянии на рецепторы клеточной поверхности энтероцитов, что индуцирует синтез специфических цитокинов. Определены условия, необходимые для стимуляции иммунной системы клетками L. сasei. Показано, что иммуностимуляция живыми клетками L. casei была выше, чем неживыми бактериями, исключение составляет L. delbrueckii subsp. bulgaricus [19–22].

Весьма доказательными являются исследования, согласно которым экопатогенные факторы (лекарственные препараты, состав пищевого рациона, функциональные нарушения органов и систем, болезни, многочисленные стрессы и др.) могут инициировать механизмы экспрессии генетически детерминированных атипичных свойств микроорганизмов, повышать уровень мутаций, приводить к созданию нового микроэкологического равновесия, не всегда отвечающего понятию симбиоза [23–24].



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«ГЛОБАЛЬНАЯ ЯДЕРНАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ, 2014 №3(12), С. 11–16 ПРОБЛЕМЫ ЯДЕРНОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ УДК 621.039.5 : 621.311.25 О РАДИАЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ДЕМОНТАЖНЫХ РАБОТ ПРИ ВЫВОДЕ ИЗ...»

«ISSN 1994-0351. Интернет-вестник ВолгГАСУ. Сер.: Политематическая. 2014. Вып. 2 (33). www.vestnik.vgasu.ru _ УДК 504.056 И. К. Яжлев МЕХАНИЗМ ГАРАНТИРОВАННОЙ ЛИКВИДАЦИИ НАКОПЛЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО УЩЕРБА ПРИ РЕ...»

«Министерство культуры Российской Федераци ФГБУК "Государственный историко-архитектурный и этнографический музей-заповедник „Кижи“" Карельский научный центр Российской академии наук Бюллетень экологических исследований на территории музея-заповедника "Кижи" 2013 год Петрозаводск Издательский центр музея-заповедни...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, 3 УДК 633.11+633.3:631.559:631.524 О ВЗАИМОСВЯЗИ УРОЖАЙНОСТИ С СОДЕРЖАНИЕМ БЕЛКА В ЗЕРНЕ У ЗЕРНОВЫХ И БОБОВЫХ КУЛЬТУР (обзор литературы) О.В. КРУПНОВА Рассмотрено современное состояние исследований и причины отрицательной корреляции между величиной урожая...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 12. 10. 2016 459 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Устранение технических ошибок в правоустанавливающих документах о предоставлении земельного участка, принятых органами местного самоуправления" В соответствии с Зе...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины" ГИДРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕК БАССЕЙНА ДНЕПРА (В ПРЕДЕЛАХ ГОМЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ) Гомель 2008 УДК 574.5 (476.2, 282.2 Днепр) ББК 28.082 (4 БЕИ –...»

«ПРАВИЛА ПРОЖИВАНИЯ В КВАРТИРЕ БЛОКИРОВАННОГО ЖИЛОГО ДОМА В ЖИЛОМ КОМПЛЕКСЕ "ПАВЛОВО-2"1. СФЕРА ДЕЙСТВИЯ ПРАВИЛ ПРОЖИВАНИЯ. 1.1. Пользование Квартирой в блокированном жилом доме, приквартирным участком и Единой инфраструктурой поселка осуществляется с учетом соблюдения прав и законных...»

«Семинар-Диалог по оценке коллективных действий в области сохранения биоразнообразия Панахачель, Гватемала | 11-13 июня 2015 Краткий отчет Сопредседателей. Эдгар Сельвин Перес и Мария Шульц. Сопредседатели Правительство Гватемалы и Секретариат Конвенции о Приглашающая сторона Биологическом Разнообр...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@w...»

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 95–100. УДК 615.32 + 582.565.2 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СОКА КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ (CALLISIA FRAGRANS WOOD.) И ЕГО АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ (IN...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО ГОРОДСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ ПОСТАНОВЛЕНИЕ г. Аксай № 1167 26.12.2013г. Об утверждении стоимости услуг, предоставляемых МУП АГП "Аксайское кладбище" согласно гарантированному перечню услуг по погребению В соответствии с Федеральным законом от 12.01.1996 N 8-ФЗ О погребении и...»

«Вестник Тюменского государственного университета. 20 Экология и природопользование. 2016. Т. 2. № 4. С. 20–32 Павел Евгеньевич КАРГАШИН1 Платон Сергеевич ЯСЕВ2 УДК 528.87+528.94 КАРТОГРАФИРОВАНИЕ ПРОМЫШЛЕННОГО ОСВОЕНИЯ ХОХРЯКОВСКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ кандидат географических наук, доцент кафедры картографии и геоинф...»

«Небанковская кредитная организация акционерное общество "НАЦИОНАЛЬНЫЙ РАСЧЕТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ" Руководство пользователя WEB-кабинет Системы управления обеспечением WEB-кабинет Системы управления обеспечением Список изменений № верДата подгот...»

«ФАРОПОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСЕЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА У ДЕТЕЙ С ПСИХОНЕВРОЛОГИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание учено...»

«Конференция учащихся муниципальных образовательных учреждений города Калуги "СТАРТ В НАУКУ" Секция: Экология Если не мы, то кто же? (Спасение лесной орхидеи) Автор: Мозгин Тихон, ученик 2 "А" класса МБОУ "Средняя общеобразовательная школа № 13" г. Ка...»

«ДИКТоФОН Газета государственного бюджетного профессионального образовательного учреждения Дзержинский индустриальнокоммерческий техникум Основана в 2013 году Выпуск № 18 январь 2017 г.Читайте в выпуске: "Строительство и эксплуатация зданий и Ура, Ура,...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 26 (65). 2013. № 4. С. 110-120. УДК 616.12:616.76 ИЗМЕНЕНИЕ МОЗГОВОЙ ГЕМОДИНАМИКИ ПРИ ПАРАВЕРТЕБРАЛЬНОЙ МИОРЕЛАКСАЦИИ У СПОРТСМЕНОВ Маметова О.Б., Савина...»

«1.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Санжарова Н. И., Молин А. А., Козьмин Г. В., Ко Sanzharova N. I., Moline A. A., Koz’min G. V., Ko бялко В. О. Радиационные агробиотехнологии: byalko V. O. Radiation agricultural biotechnologies: приоритетные направления развития и ко...»

«Special material. Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 191 УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ О понятии и классификации видов экологи...»

«Факультет Естественных наук Медико-биологических дисциплин Биологии и экологии Выпускающая кафедра Органической и биологической химии Направление 050100 Педагогическое образование Профиль подготовки Биология и Химия Идентификационный № 11Б1302 г. Тула, 2013 г. Стр. 1 из 20 "Название профиля...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА V. Y. Levanidov's Biennial Memorial Meetings Вып. 1 ЭКОЛОГИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ КРАСНОПЕРОК РОДА TRIBOLODON В БАССЕЙНАХ РЕК ПРИМОРЬЯ Ю.И....»

«Хайбрахманов Тимур Салаватович КАРТОГРАФИЧЕСКАЯ БАЗА ДАННЫХ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКОЛОГО-ГЕОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ Специальность 25.00.33 – картография Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель в.н.с., к.г.н. Лабутина И.А. Москва – 2014 Огл...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.