WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я: член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук Э. И. Коломиец, академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, ...»

-- [ Страница 3 ] --

Нормальная микрофлора кишечника оказывает выраженное детоксицирующее действие как в отношении соединений, попадающих извне, так и образующихся в организме хозяина. Процесс детоксикации с участием нормальной микрофлоры идет по нескольким направлением: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов; микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрой деструкции в печени; изменение полярности соединений таким образом, что изменяется скорость их экскреции в окружающую среду или транслокации в кровяное русло.

Нормальная микрофлора как «естественный биосорбент» способна также аккумулировать значительное количество токсичных продуктов, включая металлы, фенолы, яды растительного, животного и микробного происхождения, ксенобиотики. Все процессы детоксикации с вовлечением нормальной микрофлоры проходят преимущественно в условиях анаэробиоза за счет гидролитических и восстановительных реакций [20].

Среди биологически активных веществ, синтезируемых бифидобактериями, несомненный интерес представляют ферменты.

В состав пробиотиков, предназначенных для молодняка животных, рекомендуется включать бактерии с высокими показателями ферментативной активности, способные расщеплять высокомолекулярные полисахариды и протеины кормов. В этом отношении перспективны препараты, включающие специально отобранные штаммы микроорганизмов. Показано, что использование таких препаратов в период доращивания молодняка повышает перевариваемость корма и благоприятно сказывается на содержании в крови животных гемоглобина, общего белка, -глобулинов, глюкозы, фосфора, витамина А, снижает затраты корма, увеличивает прирост массы тела и выход мясной продукции [25–27].

В разработанном препарате Билавет-С на основе лиофильно высушенных клеток бифидо- и молочнокислых бактерий жизнеспособные клетки после реактивации продуцируют весь комплекс биологически активных соединений, который способствует нормализации качественного и количественного состава микробиоценоза желудочно-кишечного тракта организма-хозяина и более полному усвоению питательных веществ кормов, повышению продуктивности молодняка сельскохозяйственных животных и птицы. Для создания криозащитной среды Билавет-С в качестве стабилизаторов используются сахароза и сухое молоко.

Культуры бифидо- и молочнокислых бактерий в составе разработанных нами комплексных пробиотических препаратов Билавет и Билавет-С, отличаются множественной антибиотикорезистентностью, желчеустойчивостью и продукцией внеклеточных пектиназ, амилаз, пептидаз, галактозидаз и других гидролаз.

Отобранные штаммы антагонистически активны по отношению к условно патогенным и патогенным микроорганизмам родов Salonella, Klebsiella, Proteus, Pasteurella, Staphylococcus, Streptococcus, а также E. coli, вызывающим кишечные заболевания у животных. Производственные испытания, проведенные в хозяйствах Гродненской области, показали высокую лечебнопрофилактическую эффективность препаратов Билавет и Билавет-С при диарейных болезнях, гиповитаминозах и нитратных токсикозах молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.

Литература

1. Митюшин, В. В. Диспепсии новорожденных телят / В. В. Митюшин.

2-е изд., перераб. и доп. М.: Росагропромиздат, 1988. – 126 с.

2. Влияние лактогенного иммунитета на иммунологический статус новорожденных телят / В. А. Мищенко [и др.] // Ветеринарная патология. – 2005. – № 3. – С. 80–84.

3. Обрывков, В. А. Процессы пищеварения у телят при использовании препарата на основе молочнокислых бактерий: автореф. дис. … канд. биол.





наук / В. А. Обрывков. – Боровск, 1992. – 24 с.

4. Данилевская, Н. В. Фармакостимуляция продуктивности животных пробиотическими препаратами: автореф. дис. … д-ра ветеринар. наук: 16.00.04 / Н. В. Данилевская; Моск. гос. акад. ветеринар. мед. и биотех. им. К. И. Скрябина.

М., 2007. – 43 с.

5. Алёшкин, В. А. Научные исследования и практические разработки пробиотических препаратов. Основные направления и некоторые итоги деятельности ГУ «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского МЗ РФ» / В. А. Алёшкин // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования. – М., 2002. – С. 5–6.

6. Малик, Н. И. Пробиотики и биобезопасность / Н. И. Малик, А. Н. Панин // Клиническое питание. – 2007. – № 1–2. – С. А51.

7. Малков, А. В. Производство и применение нативных пробиотиков в животноводстве / А. В. Малков, Ю. В. Козьминых, С. И. Юран // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования. – М., 2002. – С. 63–64.

8. Целесообразность пробиотикотерапии при диарейных заболеваниях животных / Г. Ф. Бовкун [и др.] // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования. – М., 2002. – С. 60–61.

9. Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В. М. Бондаренко [и др.] // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. – 2004. – № 3. – С. 83–87.

10. Повышение эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков / В. А. Несчисляев [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 12. – С. 369–370.

11. Журавлев, М. Н. Пробиотические препараты в животноводстве / М. Н. Журавлев, В. Г. Сурдина // Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологий и меры борьбы с ними: материалы науч.-практ.

конф., Новосибирск, 2001. – Новосибирск, 2001. – С. 86–88.

12. Зернов, В. С. Сравнительное изучение пробиотических препаратов для телят молочного периода выращивания / В. С. Зернов, Г. Ф. Алиев, В. М. Косолапов // Науке нового века – знания молодых: тез. докл. 1-й гор. науч. конф. аспирантов и соискателей, Киров, 2001. – Киров, 2001. – С. 59–60.

13. Бондаренко, В. М. О совершенствовании пробиотических препаратов / В. М. Бондаренко // Клиническое питание. – 2007. – № 1–2. – С. А24.

14. Бабина, М. П. Пробиотики в профилактике желудочно-кишечных заболеваний и гиповитаминозов животных и птицы / М. П. Бабина, И. М. Карпуть;

Белорус. науч. центр информации и маркетинга агропром. комплекса. – Минск, 2001. – С. 11–16.

15. Определение физиологических свойств комплексной культуры с целью создания нового микробного препарата для животноводства: отчет / А. В. Платонов; ВНИИ бакпрепаратов. – М., 1981. – 14 с.

16. Макарова, А. П. Молочнокислые бактерии – естественные пробиотики и перспективы их использования в ветеринарной практике / А. П. Макарова, А. А. Акимова // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование: материалы межрегион. науч.-практ. конф., посв. 90-летию со дня рожд. проф. А. Г. Гриневич, 27–28 окт. 2004 г. – Иркутск, 2004. – С. 83–86.

17. Денисенко, В. В. Молочнокислые бактерии – основа препаратов пробиотического действия / В. В. Денисенко, И. А. Найденко // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. / Нац.

Акад. наук Беларуси, Ин-т микробиологии. – Минск, 2007. – Т. 1. – С. 233–241.

18. Головнева, Н. А. Бактериоцины грамположительных бактерий и перспективы их практического использования / Н. А. Головнева, В. А. Щетко, М. В. Грель // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. / Нац. Акад. наук Беларуси, Ин-т микробиологии. – Минск, 2007. – Т. 1. – С. 247–268.

19. Kailasapathy, K. urvival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bidobacteriu spp. / K. Kailasapathy, J. Chin // Immunol. Cell Biol. – 2000. – Vol. 78, N 1. – P. 80–88.

20. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation / C. Maldonado [et al.] // Journal of Appl. Microbiol. – 2004. – Vol. 97, N 4. – P. 673.

21. unctional modulation of human intestinal epithelial cell responses by Bifidobacterium infantis and Lactobacillus salivarius / A. M. Hara [et al.] // Immunology. – 2006. – Vol. 118, N 2. – P. 202–215.

22. Урсова, Н. И. Перспективы применения пробиотиков метаболитного типа в педиатрии / Н. И. Урсова // Consilium Medicum. Прилож. Гастроэнтерология. – 2003. – Т. 5, № 6. – С. 3–6.

23. Walker, W. A. iet and bacterial colonization: role of probiotics and prebiotics / W. A. Walker,. C. uffy // J. Nutr. Biochem. – 1998. – Vol. 9. – P. 668–675.

24. Guarner, F. he colon as an organ: habitat of bacterial flora /. uarner // Nutr. Hosp. – 2002. Vol. 17, N 2. – P. 7–10.

25. Тараканов, Б. В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных / Б. В. Тараканов // Ветеринария.

– 2001. – № 1. – С. 47–48.

26. Использование микроорганизмов-пробиотиков в ветеринарии / М. А. Каврус и [и др.] // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания: материалы междунар. конф., Москва, 2004. – М., 2004. – С. 137–138.

27. Пробиотики для животноводства и механизмы их лечебного действия / Н. Е. Рябая [и др.] // Ветеринарная наука – производству: науч. труды / под ред.

А. П. Лысенко; РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С. Н.

Вышелесского НАН Беларуси». – Минск, 2005. Вып. 38. – С. 448–449.

N. A. GOLOVNYOVA, N. E. RYABAYA, V. A. SHCETKO, A. A. SAMARTSEV, A. N. MOROZOVA

PROBIOTIC PREPARATIONS FOR IMMUNOCORRECTION,

STIMULATION OF GROWTH AND DEVELOPMENT

OF YOUNG FARM STOCK AND POULTRY

Laboratory of lactic acid bacteria and bidobacteria Complex probiotic preparations Bilavet and Bilavet C were developed for agriculture and veterinary practice. he constitutient cultures of bifido- and lactic acid bacteria are distinguished by multiple antibiotic and bile resistance, production of a broad spectrum of extracellular hydrolases. he selected strains display antagonistic activity towards strictly antagonistic activity towards strictly and facultatively pathogenic microorganisms of genera salmonella Klebsiella, Proteus, Pasteurella, Staphylococcus, Streptococcus, E. coli. Bilavet and Bilavet C preparations showed high therapeutic-prophylactic efficiency in treatment of diarrhea, hypovitaminosis and nitrate toxicosis in young farm stock and poutry.

УДК 579.083.13+579,8

А. Д. ГЕРАСИМОВИЧ1, Г. И. НОВИК1, Э. И. КОЛОМИЕЦ2

ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ

ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Лаборатория «Коллекция микроорганизмов», Лаборатория средств биологического контроля В обзоре представлен анализ имеющихся литературных данных об особенностях строения и распространения бактериофагов фитопатогенных бактерий, а также о механизмах их взаимодействия с бактериальной клеткой.

Введение. Бактериофагия, развивавшаяся вначале как узкая область медицинской микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение. Всесторонние исследования бактериофагов позволили широко использовать их для решения многих вопросов в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии и других направлениях биологических исследований. В настоящее время найдены фаги, лизирующие клетки микроорганизмов, принадлежащих ко всем систематическим группам. Вирусы бактерий – удобная модель для изучения тонкой структуры генов и сущности генетического кода, молекулярной основы спонтанных и индуцированных мутационных изменений, действия ионизирующего излучения и других факторов, влияющих на наследственные структуры организма. Кроме того, являясь основным средством естественной передачи генетической информации, фаги обеспечивают трансдукцию нуклеотидов [1].

В промышленности и сельском хозяйстве интерес к бактериофагам обусловлен возможностью их использования для контроля популяций бактерий, приносящих вред на производствах и поражающих сельскохозяйственные растения [2]. Фитопатогенные бактерии вызывают заболевания большинства культивируемых человеком и множества дикорастущих растений. Применение химических средств защиты не всегда эффективно и небезопасно в экологическом отношении. С помощью бактериофагов, специфичных к штаммам фитопатогенных бактерий, осуществляют профилактику и борьбу с бактериальными болезнями сельскохозяйственных растений. Препаратами на основе бактериофагов обрабатывают инфицированные семена, больные растения или почву, на которой выращиваются растения.

Препараты также добавляют в оросительную воду и почву [3]. Исходя из широкого распространения фагов, изучение особенностей строения и функционирования бактериофагов фитопатогенных бактерий представляет большой интерес с теоретической и практической точки зрения. Полученные данные расширяют представления о фагах, активных в отношении наиболее распространенных видов фитопатогенных бактерий.

Классификация. Современная классификация объединяет бактериофаги в один порядок, который состоит из 13 семейств и 31 рода. Принадлежность к тому или иному семейству определяется главным образом природой нуклеиновой кислоты и общей морфологией вириона.

Бактериофаги с отростком, выделенные в отряд Caudovirales, – самая многочисленная и широко распространенная группа фагов. Головки фагов данного отряда имеют форму правильного или вытянутого икосаэдра. Капсид состоит из белковой оболочки и линейной двухцепочечной ДНК. Они разделяются на три семейства в зависимости от размеров, гибкости и сократимости хвостов: Myoviridae, с длинными, сокращающимися хвостами (25% от общего количества фагов отряда Caudovirales) [4], Siphoviridae, с длинными несокращающимися хвостами (61%) и Podoviridae, с короткими хвостами (14%). Капсид фагов семейства Myoviridae несколько больше, чем у остальных двух семейств, и содержит больше ДНК [5]. Семейства Siphoviridae и Podoviridae являются близкородственными, их главное отличие состоит в длине отростка.

Фаги, не имеющие отростка, включают около 190 известных видов и подразделяются на 10 семейств, которые иногда состоят из одного вида и одного рода. Представители этих семейств различаются по форме и типу нуклеиновой кислоты (однонитевая, двухнитевая, ДНК или РНК).

Фаги, лишенные отростка, морфологически разделяются на три типа:

1. ДНК- и РНК-содержащие фаги с капсидом многогранной формы, обладающие кубической симметрией и относящиеся к семействам: Microviridae (однонитевая молекула ДНК, фаги не окружены оболочкой); Corticoviridae (двухнитевая молекула ДНК);

Tectiviridae (двухнитевая молекула ДНК); Leviviridae (однонитевая молекула РНК, вирионы не окружены оболочкой); Cystoviridae (двухнитевая молекула РНК, частицы окружены липидной оболочкой) [6].

2. ДНК-содержащие нитевидные фаги со спиральным видом симметрии, относящиеся к семействам: Inoviridae (семейство включает два рода и 29 видов различных по морфологии фагов, содержащих однонитевую молекулу ДНК); Lipothrixviridae (семейство включает шесть фагов экстремально термофильных архебактерий. Фаговые частицы окружены липидной оболочкой и содержат двухнитевую молекулу ДНК); Rudiviridae (семейство включает два вида фагов разной длины, не окруженных оболочкой и содержащих двухнитевую молекулу ДНК) [6].

3. ДНК-содержащие фаги различной формы, без явной оси симметрии, относящиеся к семействам: Plasmaviridae (семейство представлено одним видом, паразитирующим на микоплазмах. Фаг MV2 (2), содержащий двухнитевую молекулу ДНК, не имеет капсида, но покрыт липидной оболочкой); Fuselloviridae (представители данного семейства имеют вид оси с короткими шипами на конце. Тип нуклеиновой кислоты – двухнитевая ДНК) [6].

Большинство фагов семейств Fuselloviridae, Inoviridae, Lipothrixviridae и Plasmaviridae лизогенны. Кроме того, многие бактериофаги содержат липидные оболочки либо внутрикапсидные липидные везикулы, что приводит к низкой плавучей плотности и чувствительности вирионов к хлороформу и эфиру [6].

Бактериофаги как агенты биологического контроля фитопатогенных бактерий. Среди многообразия бактерий, обитающих на Земле, около 400 видов обладают способностью паразитировать на растениях. Но число бактериальных заболеваний сельскохозяйственных культур ограничивается несколькими десятками. Наиболее распространенные и вредоносные бактериальные болезни – сосудистый бактериоз капусты, угловатая пятнистость листьев огурца, черная ножка картофеля, бактериальный ожог плодовых деревьев и др. [7].

Эффективность биологического контроля, осуществляемого с помощью бактериофагов, обусловлена тем, что фаги обладают высокой специфичностью. Строго вирулентные, нетрансдуцирующие бактериофаги являются экологически безопасным средством контроля фитопатогенных бактерий [9, 10].

В настоящее время препараты фагов, выделенные из поврежденных растений, используют для снижения вероятности заражения бобов и листьев фасоли бактериями Pseudomonas syringae.

Кроме того, разработаны препараты фагов, поражающих Ralstonia solanacearum и Xanthoonas capestris pv. visicatoria – возбудителей бактериального увядания и бактериальной пятнистости томатов соответственно. В полевых условиях смесью фагов поливают почву под посевами растений в возрасте 6–8 недель, в теплицах фаги добавляют в оросительную воду. В результате потеря листьев на всех обработанных фагами растениях составляет менее 12% [11].

Колонизация Erwinia herbicola и P. syringae, по мнению авторов [12], способствует восприимчивости некоторых видов растений к повреждению тканей под воздействием низких температур.

Бактериофаги, активные в отношении этих двух видов, обеспечивают снижение популяции бактерий на листьях растений и увеличение морозоустойчивости растений. Например, растения, зараженные E. herbicola и обработанные фагами, специфичными к данному виду бактерий, подвергаются воздействию болезнетворных микроорганизмов на 20–25% меньше по сравнению с растениями, экспериментально зараженными E. herbicola, но не обработанными фагами [12]. Таким образом, бактериофаги – перспективные агенты биологического контроля возбудителей болезней растений бактериальной этиологии.

Бактериофаги Pseudomonas sp. Фитопатогенные бактерии рода Pseudomonas наносят существенный экономический ущерб сельскохозяйственному производству, поражая бобовые, злаковые, овощные, плодовые и другие культуры, снижая урожайность до 50% с одновременным ухудшением качества продукции. Они способны вызывать у растений пятнистости, некрозы, опухоли и гнили, которые обусловлены изменением метаболизма растительной клетки под влиянием веществ (ферменты, гормоны, токсины), выделяемых патогенами [7].

Бактериофаги, инфицирующие бактерии рода Pseudomonas, объединяют представителей всех морфологических групп и принадлежат ко всем трем семействам отряда Caudovirales по современной классификации. Они очень разнообразны по структуре и морфологии и имеют широкий круг хозяев. В среднем содержание Г-Ц пар в структуре бактериофагов, инфицирующих бактерии Pseudomonas sp. составляет 54,4% [13].

Представители вида Р. syringae являются возбудителями ряда заболеваний у 180 видов растений, в том числе всех видов сливы, груши, дуба и других древесных растений, а также пасленовых. Характер вызываемых заболеваний определяется видом растения. Бактериофаг 6, специфичный к данным микроорганизмам, имеет двухнитевую РНК и инфицирует клетки Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Нуклеокапсид, состоящий из трех частей молекулы РНК, окружен белково-липидной оболочкой. Она содержит пять вирусоспецифических белков (Р3, Р6, Р9, Р10, Р8), два из которых (Р3 и Р6) связаны друг с другом и формируют структуру, узнающую и присоединяющуюся к клетке-хозяину. Белок Р8 формирует поверхностный каркас нуклеокапсида, а его двенадцатигранный скелет состоит из белка Р1. Белки Р2, Р4 и Р7 ассоциированы с белком Р1, а белки Р1, Р2 и Р4 необходимы для активности фаговой РНКполимеразы [14].

Бактерии Pseudomonas fluorescens – возбудители бактериоза корней различных сельскохозяйственных растений. При бактериозе большинство пораженных корней ослизняется и размягчается, что приводит к гибели растений [7]. Бактериофаг IBB-P7A обладает высокой активностью в отношении большого количества штаммов бактерий P. fluorescens. Вирус принадлежит к подсемейству Autographivirinae семейства Podoviridae и состоит из капсида размером около 63 нм в диаметре и коротким несокращающимся отростком размером 13 8 нм. Латентный период и период выхода фагов из клетки (эклипс-фаза) короткие, их продолжительность составляет 10 и 15 мин соответственно.

Скорость адсорбции IBB-P7A 5,58 1010 мл/мин–1. Гибель бактерий наступает через 50 мин после добавления фага в культуру. Геном вируса представлен линейной двухцепочечной молекулой ДНК, размером 40,973 п. н., с длинными концевыми повторами (985 п. н.) и 52 открытыми рамками считывания, размером от 137 до 3995 нуклеотидов, охватывающими 94,6% генома. Содержание Г-Ц пар составляет приблизительно 56%. Размер основных белковых последовательностей фага находится в пределах 16–140 кДа. Около 46,7% структурных белков, кодируемых IBB-P7A, гомологичны белкам фага gh-1, однако по сравнению с геномом фага gh-1 последовательность IBB-P7A больше и соP7A P7A 7A A держит больше генов с неопределенными функциями [15].

Бактерии Pseudomonas putida являются возбудителями бактериозов растений, а также грибов. Они могут ингибировать рост мицелия и вызывать образование желтых и желто-коричневых слизистых пятен на шляпках грибов [7]. Бактериофаг gh-1, активный в отношении бактерий P. putida C1, состоит из капсида гексагональной формы шириной 50 мкм и клиновидного отростка с двумя прикрепленными к нему нитями. Морфология фага сходна со строением колифагов Т3 и Т7. На твердом агаре бактериофаг образует гладкие негативные колонии, размером 4–6 мм в диаметре. Геном представлен двухцепочечной молекулой ДНК с содержанием Г-Ц пар около 57%. Вирус лизирует большое количество штаммов бактерий P. putida и не проявляет активности против P. fluorescens, P. syringae и P. aeruginosa. Продолжительность латентного периода составляет 21 мин, гибель клеток наступает через 60 мин после внесения фага в культуру [16, 17].

Бактериофаги Erwinia sp. Среди представителей рода Erwinia практически все виды являются фитопатогенами. Бактерии этого рода встречаются как на поверхности растений, так и в почве. Они способны вызывать гнили, увядания, некрозы и язвы [7].

E. aylovora, представитель семейства Enterobacteriacea, относится к наиболее вредоносным патогенам, вызывающим увядание растений. Бактерии являются карантинным объектом.

Они поражают около 180 видов растений семейства розоцветных. Плодовые деревья имеют вид обгоревших, поэтому данное заболевание называют бактериальным ожогом. Наиболее часто поражение происходит весной. Цветки высыхают, чернеют, но остаются на деревьях; пораженные плоды коричневеют и сморщиваются. После инфицирования активное размножение бактерий приводит к разрушению паренхимы и клетки бактерий перемещаются в ткани растений, вызывая типичные симптомы бактериального ожога: некрозы и увядание [18].

Стандартные методы борьбы с бактериальным ожогом в настоящее время основаны на интенсивной обрезке деревьев и обработке антибиотиками [19, 20]. Однако наиболее эффективным методом борьбы с заболеваниями, вызываемыми E. aylovora, является применение вирусов, которые способны инфицировать данные бактерии.

Первое сообщение о возможной роли бактериофагов в эпидемиологии бактериального ожога, вызванного E. aylovora, было сделано Erskine в 1973 г. В дальнейшем фаг Eal, специфичный к E. aylovora, успешно использовали для лечения или профилактики бактериального ожога саженцев яблони, инокулированных E. aylovora. Кроме того, было установлено, что обработка деполимеразой фага полисахаридов бактериальной клетки ослабляет симптомы бактериального ожога у груш, пораженных E. aylovora [20].

Бактериофаги E. aylovora относятся к семействам Myoviridae и Podoviridae отряда Caudovirales. Фаги семейства Myoviridae имеют длинный сокращающийся отросток, одинаковую морфологию негативных колоний (крупные с большим ореолом), но различаются по размерам. По внешнему виду данные частицы напоминают вирусы бактерий Pseudoonas sp. Бактериофаги, принадлежащие к семейству Podoviridae, имеют короткий несокращающийся отросток. В этом семействе морфология фагов варьируется от коротких отростков до едва видимых образований [21].

Фаги E. aylovora можно обнаружить в воздушных пробах вокруг пораженных деревьев (РЕа1, PEa10–2, PEa10–6), в тканях их плодов (Ea1, Ea7, Ea100, Ea125, Ea116C), а также в почве (PEa21–1, PEa31–1, PEa35–2, PEa10–7). Показано, что бактериальные вирусы, обитающие в почве, устойчивы в данной среде обитания благодаря адсорбции к заряженным коллоидным частицам, таким как глина. Кроме того, почва предохраняет их от высушивания и ультрафиолетового света. Размер генома данных вирусов колеблется от 35 до 180 т. п. н. Диаметр капсида составляет приблизительно 58–95 нм. Фаги сохраняют жизнеспособность на высоком уровне после 12 мес. хранения при 4 °С [22, 23].

Бактериофаг Еа2809, обитающий на поверхности листьев яблони, относится к семейству Myoviridae и способен размножаться как в клетках фитопатогенных бактерий Erwinia aylovora, так и на клетках эпифитных бактерий Erwinia herbicola. Нуклеиновая кислота фага представляет собой двухцепочечнцю молекулу ДНК, содержащую сайты рестрикции HindIII, DraI, TasI, VspI. В состав капсида бактериофага входит довольно большое количество белков – около 10 (масса колеблется в пределах 17–120 кДа) [24].

Фитопатогенные бактерии E. carotovora – возбудители мягких гнилей растений преимущественно овощных культур. Фаги данных бактерий являются представителями семейств Myoviridae и Podoviridae отряда Caudovirales. Оптимальная температура лизиса бактерий для данных фагов – 28 °С. Гибель клеток наступает примерно через 12 ч после внесения фага в культуру хозяина. Продолжительность латентного периода составляет около 1,5 ч [25].

Бактериофаги Xanthomonas sp. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas поражают наиболее важные сельскохозяйственные культуры, такие как рис, рожь, ячмень и др. Наиболее вредоносный вид – бактерии X. capestris, вызывающие сосудистый бактериоз у различных сельскохозяйственных растений, в результате чего они отстают в росте, наблюдается почернение сосудов, на листьях появляются желтые пятна [7].

Использование химических бактерицидных препаратов помогает контролировать развитие этих патогенов, однако в ряде случаев эффективность их применения весьма низка, и зачастую эти препараты небезопасны для растений и окружающей среды.

Бактериофаг 7, инфицирующий клетки X. campestris pv.

сampestris, принадлежит к семейству Siphoviridae. Фаг состоит из икосаэдрического капсида, размером 53,2 нм в диаметре и длинного несокращающегося отростка длиной 156 нм. Геном 7 представлен линейной двухнитевой молекулой ДНК и содержит 44 080 пар оснований. Содержание Г-Ц пар в геноме составляет 56% [26].

Нитевидный бактериофаг f активен строго в отношении X. campestris pv. сampestris и принадлежит к семейству Inoviridae.

Данный вирус содержит кольцевую однонитевую молекулу ДНК размером 6008 оснований с десятью открытыми рамками считывания. Оптимальной температурой культивирования является 28 °С, однако вирусы сохраняют жизнеспособность на протяжении 6 мес. при 4 °С и выдерживают нагревание до 80 °С в течение 10 мин. На чашках частицы образуют негативные колонии размером 1 мм в диаметре. Обработка фагов 10%-ным хлороформом, этанолом или ацетоном приводит к полному утрачиванию инфицирующей способности, а воздействие метанола и этила инактивирует 99% фаговых частиц [27].

Геном вирулентных фагов Хр10, Хр12, ОР1, ОР2 и Хор411 представлен линейной двухцепочечной ДНК. Данные фаги активны в отношении бактерий X. oryzae pv. oryzae – возбудителей бактериальных ожогов листьев риса. Размер генома составляет 44–45 т. п. н. с 60 открытыми рамками считывания. Содержание Г-Ц пар – 51–52% [28].

Особенности взаимодействия бактериофагов с бактериальной клеткой. Фаги – один из наиболее подходящих объектов для глубокого изучения ряда вирусологических проблем, в частности, взаимоотношения вируса с клеткой-хозяином. При их использовании можно моделировать как явно выраженную продуктивную инфекцию, так и потенциальное вирусоносительство в форме лизогении. В настоящее время отношения фага с клеткой рассматривают как процесс, состоящий из ряда последовательных этапов: адсорбция фага на поверхности клетки хозяина и проникновение фаговой нуклеиновой кислоты внутрь клетки, наработка внутри клетки составных частей вируса и сборка большого количества вирионов, лизис бактериальной клетки и освобождение фага [29].

Инфицирование бактерий Pseudomonas sp. Известно, что конкретный штамм бактериофага способен инфицировать очень узкий круг хозяев либо конкретный вид или штамм микроорганизма. Данное явление обусловлено специфичностью адсорбции, которая, в свою очередь, зависит от природы и особенностей строения рецепторов на поверхности бактерии, их количества и локализации [30].

РНК-содержащий бактериофаг 6 адсорбируется на пилях P. syringae, которые, втягиваясь, позволяют вириону контактировать с внешней мембраной клетки-хозяина. Было показано, что эти структуры кодируются генами, локализованными в хромосоме хозяина. Процесс инфицирования инициируется прикреплением фага к 6-специфичным пилям клетки с последующим слиянием мембраны фага и бактериальной внешней мембраны [14].

Среди фагочувствительных индикаторных штаммов и их фагоустойчивых мутантов не обнаружено различий состава белков внешней мембраны P. syringae, хотя некоторые 6-устойчивые мутанты штамма НВ насчитывают все три класса пилей. Иногда F-пили теряют способность адсорбировать маленькие РНКсодержащие фаги, но остаются чувствительными к нитевидным фагам, которые используют верхнюю часть пилей в качестве рецепторов.

При проникновении в клетку P. syringae, помимо нуклеиновой кислоты, 6 внедряет в нее РНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку клетка хозяина не способна транскрибировать фаговую РНК. Основным рецептором для 6 служат пили IV типа, к которым фаг прикрепляется посредством белка P3.

Интегральный белок Р6, локализованный в толще плазматической мембраны вириона, инициирует слияние внешней мембраны хозяина и липидной оболочки фага. Вирусный литический фермент (эндопептидаза Р5), локализованный между мембраной фага и его нуклеокапсидом, локально разрушает пептидогликан клеточной стенки, позволяя нуклеокапсиду достигать цитоплазматической мембраны [31].

Большинство процессов слияния мембран фага и бактериальной клетки происходит на 5–20-й минуте инфицирования.

Слияние происходит после осуществления белок Р3-зависимой адсорбции на бактериальных пилях. Активность процесса слияния сильно изменяется после удаления белка Р3. Если же удалить и белок Р6 (гидрофобный мембранный белок, способный связываться с белком Р3), то процесс слияния не наблюдается вовсе. Однако Р3, Р6 частицы, тем не менее, способны к слиянию в присутствии полиэтиленгликоля [31].

Согласно наблюдениям, последняя стадия проникновения вируса в клетку происходит посредством образования мембранной везикулы, внутри которой заключен нуклеокапсид фага [14].

Особенность взаимодействия фага IBB-P7A c P.

fluorescens заключается в том, что процесс адсорбции протекает в две стадии:

стадия очень быстрой адсорбции, в течение первых 5 минут, и стадия медленной адсорбции, которая продолжается 10 мин.

Общая скорость адсорбции составляет 5,58 1010 мл/мин–1 [15].

Процесс транскрипции ДНК фага gh-1при инфицировании P. putida также имеет несколько особенностей. Во-первых, РНКполимераза P. putida транскрибирует ДНК фага в течение всего процесса инфицирования [17]. Предполагается, что это происходит вследствие того, что фаг не способен самостоятельно ингибировать РНК-полимеразу хозяина. Наличие данной полимеразы не является жизненно необходимым фактором, поскольку при ее ингибировании (добавлении рифампицина в зараженную культуру) процесс инфицирования не нарушается. Во-вторых, комплементарная РНК синтезируется только в конце инфекционного процесса. На поздней стадии инфицирования РНК-полимераза бактерий модифицируется таким образом, что использует промотеры на тяжелой цепи ДНК, синтезируя комплементарную цепь [17].

Заключение. Фаги играют важную роль в контроле заболеваний растений, вызываемых бактериями. Вирусы, осуществляющие биологическое регулирование численности видов фитопатогенных бактерий, успешно применяются против таких фитопатогенов, как Xanthoonas pruni, Xanthoonas capestris, Ralstonia solanacearu, Pseudomonas tolaasii и др. [2].

В настоящее время в США запатентован препарат для борьбы с бактериальным ожогом растений, вызываемым Erwinia aylovora. В его состав входит фаг, лизирующий E. aylovora, и продуцируемый этим фагом ферментный белок, вызывающий деполимеризацию бактериального полисахарида. Из тканей растений, пораженных P. syringae, и почвы выделено 23 фага этой бактерии. Выделенные фаги обладают широким кругом хозяев, лизируя 2/3 различных патоваров P. syringae. Препарат стабилен в течение года при хранении в условиях пониженной температуры (+ 4 °С). В Японии, Китае и других восточных странах не прекращаются попытки использовать бактериофаги для борьбы с бактериозами риса [32].

Каждый бактериофаг обладает уникальными свойствами, определяющими характер взаимодействия с клеткой-хозяином.

Накопление и обобщение знаний о механизмах процесса инфицирования фагами бактериальной клетки – основа для разработки научной стратегии биологической защиты растений от болезней с помощью биопрепаратов на основе бактериофагов.

Литература

1. Бактериофаги и их использование в диагностике инфекционных болезней животных и человека / И. А. Бакулов [и др.] // Фаги листерий и их практическое применение / под ред. В. С. Русалеева. – Ульяновск: УГСХА, 1998. – С. 4–24.

2. Fuhran, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects / J. A. uhrman // Nature. – 1999. – Vol. 399. – P. 541–548.

3. Sioes, M. Monitoring the effects of biocide treatment of Pseudoonas fluorescens formed under different flow regimes / M. imoes, M. Pereira, M. J. Vieira // Water ci. echnol. – 2003. – Vol. 47. – P. 217–223.

4. Ackerann, H.-W. requency of morphological phage descriptions in the year 2000 / H.-W. Ackermann // Arch. Virol. – 2001. – Vol. 146. – Р. 843–857.

5. Ackerann, H.-W. ailed bacteriophages. he order Caudovirales / H.-W. Ackermann // Adv. Virus Res. – 1999. – Vol. 51. – Р. 135–201.

6. Ackeran, H. W. Bacteriophage classification / H. W. Ackerman // Bacteriophages. Biology and application / E. Kutter, A. ulakvelidze. – CRC Press, 2004. – P. 81–122.

7. Микроорганизмы – паразиты растений / Ю. Т. Дьяков [и др.] // Фундаментальная фитопатология / под ред. Ю. Т. Дьякова. – М.: UR (Красанд), 2012. – С. 22–58.

8. Kara, J. D. Bacteriophages: the viruses for all seasons of molecular biology / J.. Karam // Virol. J. – 2005. – Vol. 2. – P. 19–20.

9. Bacteriophages and their implications on future biotechnology: a review / I. Haq [et al.] // Virol. J. – 2012. – Vol. 9. – P. 9–23.

10. Casjens, S. R. Comparative genomics and evolution of the tailed-bacteriophages /. R. Casjens // Curr. pin. Microbiol. – 2005. – Vol. 8. – P. 451–458.

11. Fox, J. L. Phage treatments yield healthier tomato, pepper plants / J.. ox // AM News. – 2000. – Vol. 66. – P. 455–456.

12. Kozloff, L. M. Ice nucleating activity of Pseudoonas syringae and Erwinia herbicola /. M. Kozloff, M. A. chofield, M. ute // J. Bacteriol. – 1982. – Vol. 153, N 1. – P. 222–231.

13. Comparative enomic Analysis of 18 Pseudoonas aeruginosa Bacteriophages /. Kwan [et al.] // J. Bacteriol. – 2006. – Vol. 188, N 3. – Р. 1184–1187.

14. Roantschuk, M. he nucleocapsid of bacteriophage 6 penetrates the host cytoplasmic membrane / M. Romantschuk, V. M. lkkonen,. H. Bamford // he EMB J. – 1988. – Vol. 7, N 6. – P. 1821–1829.

15. Sillankorva, S. Isolation and characterization of a 7-like lytic phage for Pseudoonas fluorescens /. illankorva, P. Neubauer, J. Azeredo // BMC Biotechnol. – 2008. – Vol. 8. – P. 80–90.

16. Lee, L. F. Characterization of bacteriophage gh-1 for Pseudoonas putida /.. ee, J. A. Boezilucy // J. Bacteriol. – 1966. – Vol. 92, N 6. – Р. 1821–1827.

17. Lee, L. F. edimentation analysis of Pseudoonas putida A.3.12 bacteriophage gh-1 deoxyribonucleic acid /.. ee, J. A. Boezilucy // J. Virol. – 1967. – Vol. 1, N 6. – Р. 1274–1276.

18. Vanneste, J. L. Migration of Erwinia aylovora in host plant tissues / J.. Vanneste,. Eden-reen // ire blight: the disease and its causative agent, Erwinia aylovora / ed. by J.. Vanneste. – New York: CAB International, 2000. – P. 73–83.

19. Sobiczewski, P. ire Blight (Erwinia aylovora) / P. obiczewski,. eckers, J. Pulawska // ome aspects of epidemiology and control / Research Institute of Pomology and loriculture. – kiernievice, 1997. – N 390.

20. Paulin, J.-P. Erwinia aylovora: general characteristics, biochemistry and serology / J.-P. Paulin // ire blight: the disease and its causative agent, Erwinia aylovora / ed. by J.. Vanneste. – New York: CAB International, 2000. – P. 87–117

21. he species concept and its application to tailed phages / H.-W. Ackermann [et al.] // Arch. Virol. – 1992. – Vol. 124. – P. 69–82.

22. Novel virulent and broad-host-range Erwinia aylovora bacteriophages reveal a high degree of mosaicism and a relationship to Enterobacteriaceae phages / Y. Born [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2011. – Vol. 77, N 17. – P. 5945–5954.

23. Complete genome of the broad-host-range Erwinia aylovora phage ФEa21–4 and its relationship to Salonella phage elix 1 /. M. ehman [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – Vol. 75. N 7. – P. 2139–2147.

24. Садовская, О. В. Биологические особенности нового бактериофага Erwinia aylovora / О. В. Садовская, А. Л. Лагоненко, А. Н. Евтушенков // Интенсификация плодоводства Беларуси: традиции, достижения, перспективы. – Самохваловичи, 2010. – С. 110–113.

25. Complete genome sequences of three Erwinia carotovora phages isolated in North America and a bacteriophage induced from an Erwinia tasaniensis strain / I. Mller [et al.] // J. Bacteriol. – 2010. – Vol. 193, N 3. – P. 795–796.

26. enomic characterization of the intron-containing 7-like phage phi7 of Xanthoonas capestris / C.-N. ee [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – Vol. 75, N 24. – P. 7828–7837.

27. Characterization of filamentous bacteriophage f from Xanthoonas campestris pv. campestris / Y.-H. seng [et al.] // J. en. Virol. – 1990. – Vol. 71. – P. 1881–1884.

28. Comparisom of genomes of three Xanthoonas oryzae bacteriophages / C.-N. ee [et al.] // BMC enomics. – 2007. – Vol. 8. – P. 442–452.

29. Hershey, A. D. Coordinate effect of electrolyte and antibody on infectivity of bacteriophage / A.. Hershey,. M. Kalmanson, J. Bronfenbrenner // J. Immunol. – 1994. – Vol. 48, N 2. – P. 221–238.

30. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited / H. Nikaido // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2003. – Vol. 67. – P. 593–656.

31. Roantschuk, M. unction of pili in bacteriophage 6 penetration / M. Romanchuk,. H. Bamford // J. en. Virol. – 1985. – Vol. 66. – P. 2461–2469.

32. Hagens, S. Bacteriophage for biocontrol of pathogens: calculations and considerations. /. Hagens, M. J. oessner // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2010. – Vol. 11. – P. 58–68.

A. D. HERASIMOVICH1, G. I. NOVIK1, E. I. KOLOMIETS2

CHARACTERISTIC OF BACTERIOPHAGES OF PHYTOPATHOGENIG

BACTERIA

Microbial collection laboratory, Laboratory of biological control agents he current review contains the analysis of available experimental data about physiological characterictics of bacteriophages of phytopathogenic bacteria, and also about the mechanisms of their interactions.

УДК 579.64:631.46 Г. В. САФРОНОВА1, Л. А. СУХОВИЦКАЯ1, Н. В. КОРОЛЕНОК1, А. А. АУТКО2, АН. А. АУТКО2, О. В. ПОЗНЯК2

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ХЛОРСОДЕРЖАЩИХ

И БЕСХЛОРНЫХ УДОБРЕНИЙ НА РИЗОСФЕРНЫЙ

МИКРОБОЦЕНОЗ КОРНЕПЛОДА МОРКОВИ

Лаборатория взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений Института микробиологии НАН Беларуси, РУП «Институт овощеводства»

Представлены результаты полевых исследований по влиянию новых форм и доз комплексных удобрений с добавками микроэлементов и биологически активных веществ на количественный и качественный состав микробоценоза ризосферы корнеплода моркови.

Введение. Обеспечение населения разнообразной овощной продукцией высокого качества – важная социально-экономическая задача для Республики Беларусь, которая может быть реализована на основе динамичного развития и эффективного функционирования овощеводческой отрасли [1]. С целью увеличения продуктивности овощных культур актуальны разработки новых технологий их возделывания, основанных на снижении норм расхода удобрений, пестицидов и экологической нагрузки на почву и растения.

Важный фактор получения высоких и устойчивых урожаев возделываемых культур – применение удобрений. Результаты научных исследований, зарубежная практика и производственный опыт различных хозяйств свидетельствуют о том, что именно за счет рационального использования удобрений можно получить до 50% прироста продукции растениеводства [2, 3]. На наиболее распространенных в Беларуси дерново-подзолистых почвах урожай сельскохозяйственных культур, в том числе овощных, в первую очередь зависит от обеспеченности их фосфором, калием и азотом [4]. Экспериментально установлено, что растения за период вегетации используют до 50% азота органических и в пределах 40–60%, а в некоторых случаях – до 70% минеральных удобрений [5]. При внесении минеральных азотных удобрений биомасса растений увеличивается интенсивнее, однако качество получаемой продукции часто модифицируется, иногда негативно. Высокие дозы NPK-удобрений представляют опасность для окружающей среды, поэтому в практике овощеводства целесообразно использовать не только минеральные удобрения в высоких дозах, а отдавать предпочтение комплексным удобрениям с определенным соотношением биогенных элементов. Применение высокотехнологичных комплексных азотно-фосфорно-калийных удобрений с оптимальным соотношением макро-, микроэлементов и регуляторов роста растений весьма перспективно на фоне других агротехнических приемов возделывания культур. Основные преимущества их использования заключаются в возможности равномерного и сбалансированного питания растений на всей площади поля, сокращении затрат на подкормку культур и т. д.

Важная роль в процессе трансформации вносимых в почву NPK-удобрений, несомненно, принадлежит почвенным микроудобрений, организмам, которые разлагают многие природные и неприродные соединения, осуществляя их разнообразные химические превращения. Одновременно они принимают участие в превращении отмершей биомассы в доступные растениям минеральные вещества, регулируя тем самым уровень плодородия почвы и обеспечивая функционирование ее как живой системы. Именно почвенные микроорганизмы являются функциональными компонентами экосистем и биологической составляющей почвообразовательных процессов. Вместе с тем, несмотря на уникальную способность комплекса почвенных микроорганизмов приспосабливаться к антропогенным воздействиям, возможности его не беспредельны. Поэтому для понимания функционирования почвы и микробно-растительного взаимодействия в условиях техногенеза важна как количественная, так и качественная характеристика почвенной микробиоты, определяющей ее состав и функциональное разнообразие [6–8]. В связи с этим изучение влияния новых форм используемых в овощеводстве минеральных удобрений на особенности формирования микробных ценозов ризосферы овощных культур как наиболее значимой и динамичной ниши развития микробных популяций требует особого внимания. Рациональное применение комплексных удобрений, соответствующих уровню плодородия почв, биологическим требованиям конкретной овощной культуры и сорта, – путь уменьшения загрязнения окружающей среды и повышения качества овощной продукции.

Цель исследования – изучение влияния новых форм комплексных азотно-фосфорно-калийных хлорсодержащих и бесхлорных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора роста растений Эпин на численность микроорганизмов агрономически ценных групп и общую биогенность ризосферного микробоценоза корнеплода моркови.

Объекты и методы исследования. Исследования проводили в рамках однотипных для всех вариантов полевых экспериментов, заложенных на опытном поле РУП «Институт овощеводства» в п. Самохваловичи Минского района. Почва опытного участка дерново-подзолистая легкосуглинистая, характеризовалась следующими агрохимическими показателями пахотного слоя: реакция среды (рНсол) – 5,21–5,68, содержание подвижных форм фосфора и калия – 331–386 и 194–347 мг/кг почвы соответственно, подвижных форм кальция – 1420–1680, магния – 85–123 г/кг почвы, содержание гумуса – от 2,74 до 3,79%.

Новые формы удобрений в разных дозах вносили в основную заправку почвы.

Полевой мелкоделяночный опыт закладывали по 12-вариантной схеме:

I – без удобрений (контроль);

II – N70P65K102 (смесь удобрений – карбамид, аммонизированный суперфосфат, хлористый калий) – базовый вариант 1;

III–V – комплексные хлорсодержащие удобрения 16–12–20* (первый год) или 13–12–19** (второй-третий годы): III – N40P37K58 комплексное с, B, Cu; IV – N70P65K102 комплексное с, B, Cu;

V – N90P83K131 комплексное с, B, Cu;

VI – N70P38K81 (смесь удобрений – карбамид, аммонизированный суперфосфат, сульфат калия) – базовый вариант 2;

VII–Х – комплексные бесхлорные удобрения 13–7–15: VII – N40P22K46 комплексное с Mg,, B, Cu; VIII – N70P38K81 комплексное с Mg,, B, Cu; IХ – N90P48K104 комплексное с Mg,, B, Cu;

Х – N70P38K81 комплексное с Mg,, B, Cu и регулятором роста растений Эпин;

ХI – N60P60K91 + N10P5K11 ЖКУ (жидкое комплексное удобрение) хлорсодержащее с микроэлементами в хелатной форме (основное) + некорневая подкормка ЖКУ (5 л/га);

ХII – N60P33K71 + N10P5K10 ЖКУ бесхлорное с микроэлементами в хелатной форме (основное) + некорневая подкормка ЖКУ бесхлорным (5 л/га).

В качестве базовых вариантов использовали смесь удобрений:

карбамид, аммонизированный суперфосфат и гранулированный хлористый калий (базовый вариант 1) или сульфат калия (базовый вариант 2). При некорневых подкормках вегетирующих растений применялись жидкие комплексные хлорсодержащие и бесхлорные удобрения с хелатными формами микроэлементов.

Мелкоделяночные полевые опыты закладывали в соответствии с методическими указаниями [9]. Площадь одной опытной делянки – 14 м2, повторность 4-кратная.

Численность микроорганизмов ризосферы корнеплода моркови среднеспелой сорта Лявоніха определяли в середине августа в фазе его интенсивного формирования. Образцы ризосферной почвы отбирали в соответствии с руководством [10].

Плотность популяций микроорганизмов семи агрономически ценных групп (аммонифицирующие, в том числе спорообразующие, усваивающие минеральный азот, в том числе актиномицеты, олигонитрофильные, целлюлозоразрушающие и микромицеты) в ризосфере корнеплода моркови изучали методом поверхностного посева разведений суспензии ризосферной почвы на агаризованные питательные среды [10–12]. Расчет количественного содержания микроорганизмов вели на 1 г абсолютно сухой почвы.

Общую биогенность определяли суммированием количества микроорганизмов семи изучаемых агрономически ценных групп.

Математическая обработка данных – общепринятая для биологических исследований [9, 13]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили при помощи статистического пакета программы Microsoft Excel, урожайных данных – по руководству [9] с использованием программ дисперсионного и корреляционного анализа на ЭВМ.

Результаты и их обсуждение. Микробиологический анализ образцов ризосферной почвы корнеплода моркови проводили в вариантах опыта I, IV, I и (первый год исследований) и в вариантах опыта I, V, VIII и (второй год исследований).

В полевых экспериментах выявлены количественные различия в составе ризосферного микробоценоза корнеплода моркови в зависимости от формы и доз удобрений. Наиболее высокая численность микроорганизмов в микробоценозе культуры в первый год исследований определена в вариантах IV* и, во второй – в вариантах V** и. Так, в первый год изучения в варианте IV* при внесении комплексного хлорсодержащего удобрения 16–12–20 с N70P65K102 и микроэлементами общая биогенность составляла 17,0 млн КОЕ/г абс. сух. почвы, что в 1,7 раза выше контроля (рис. 1).

Рис. 1. Влияние новых форм и доз комплексных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора роста Эпин на общую биогенность ризосферы моркови сорта Лявоніха Биогенность ризосферы корнеплода в варианте при использовании комплексных бесхлорных удобрений 13–7–15 с N70P38K81, Mg,, B, Cu и регулятором роста Эпин, превосходила контроль на 58% и достигала 15,5 млн КОЕ/г абс. сух. почвы. Увеличение дозы NPK (N90P48K104) при использовании комплексных бесхлорных удобрений в варианте I повышало общую биогенность по сравнению с контролем на 13%.

Сравнительный анализ численности исследуемых микроорганизмов отдельных физиолого-биохимических групп свидетельствует, что применение комплексных минеральных удобрений независимо от их дозы и формы в первый год стимулировало развитие в ризосфере моркови бактериальной составляющей, участвующей в трансформации азота. Установлено, что плотность популяции неспорообразующих аммонификаторов возросла в среднем в 2,1 раза, спорообразующих аммонифицирующих бактерий – на 23%, усваивающих минеральный азот – на 12%, олигонитрофильных – в 1,9 раза (табл. 1, рис. 2). Количество же актиномицетов и целлюлозоразрушающих бактерий, наоборот, снизилось в среднем в 2,6 и 3,1 раза соответственно. Число мицелиальных грибов уменьшилось на порядок и более.

Во второй год исследований в образцах ризосферной почвы моркови показатель биогенности при внесении комплексных минеральных удобрений с добавками микроэлементов изменялся в пределах 41,9–75,5 млн КОЕ в 1 г абс. сух. почвы. Общая биогенность в варианте V** составляла 67,3 млн КОЕ/ г абс. сух.

почвы. Максимальные значения (75,5 106 КОЕ/г абс. сух. почвы) определены в варианте (комплексное бесхлорное удобрение 13–7–15 с N70P38K81, Mg,, B, Cu и регулятором роста растений Эпин).

Изменение агрофона во второй год проведения эксперимента позитивно влияло на размножение микроорганизмов всех семи агрономически ценных групп. Более высокое содержание аммонифицирующих, усваивающих минеральный азот и целлюлозоразрушающих микроорганизмов, обнаружено в варианте (комплексное бесхлорное удобрение 13–7–15 с N70P38K81, Mg,, B, Cu и регулятором роста растений Эпин). Численность вышеперечисТ а б л и ц а 1. Численность микроорганизмов агрономически ценных групп в ризосфере моркови сорта Лявоніха при внесении новых форм и доз комплексных минеральных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора роста Эпин

–  –  –

ленных микроорганизмов в данном варианте опыта превышала контроль в 3,2; 2,7 и 1,4 раза соответственно. В этом же варианте интенсивнее развивались и актиномицеты – микотрофная составляющая усваивающих минеральных азот микроорганизмов.

Стимулирующий эффект других форм и доз удобрений на них менее выражен.

Максимум спорообразующих аммонификаторов (2,05 млн КОЕ/г абс. сух. почвы) выявлен в ризосфере моркови, удобренной бесхлорным комплексным удобрением (N70P38K81) с микроэлементами (вариант VIII).

При анализе количественных данных по численности олигонитрофильных микроорганизмов в этот год исследований обращает на себя внимание факт стимуляции размножения олигонитрофилов бесхлорными удобрениями. Их число в среднем в 1,8 раза превышало контроль. Максимальная плотность микроорганизмов этой группы (1,62 ± 0,055) 107 КОЕ/г абс. сух. почвы обнаружена с применением средней дозы комплексного бесхлорного NPK-удобрения (N70P38K81) с микроэлементами и регулятором роста Эпин (вариант ). Выявленное положительное влияние бесхлорных удобрений на развитие олигонитрофилов очень значимо для растений, поскольку представители этой группы микроорганизмов разлагают растительные остатки с широким соотношением С : N и многие из них фиксируют азот атмосферы. В процессе жизнедеятельности они используют как органические, так и неорганические соединения азота и функционируют как аммонификаторы и азотфиксаторы, что способствует обогащению почвы «биологического» азотом. Изучаемое хлорсодержащее удобрение в высокой дозе (N90P83K131) (вариант V**), наоборот, ингибировало размножение олигонитрофильных микроорганизмов: их количество снизилось в 3,2 раза.

Комплексные хлорсодержащие и бесхлорные минеральные туки во второй год исследований также неоднозначно влияли на мицелиальные грибы. Плотность популяции микромицетов в ризосфере моркови при внесении высокой дозы (N90P83K131) комплексного хлорсодержащего удобрения (вариант V**) достигала (4,10 ± 0,175) 104 КОЕ/г абс. сух. почвы и превышала контроль в 1,5 раза. При применении средней дозы (N70P38K81) комплексного бесхлорного азотно-фосфорно-калийного удобрения 13–7–15 с микроэлементами (вариант VIII) их численность была ниже контроля на 28%. Добавка регулятора роста растений Эпин к агрофону комплексного бесхлорного удобрения (вариант ) стиму-) лировала развитие микромицетов: их число возрастало с 19,7 до 72,1 тыс. КОЕ/г абс. сух. почвы и превышало контроль почти в 4 раза. Определение родовой принадлежности микромицетов показало, что в ризосфере корнеплода опытных вариантов преобладали мицелиальные грибы рода Penicillium, многие из которых, как известно, синтезируют антибиотики и, как следствие, очищают почву от фитопатогенов [14].

Данные, полученные в первый и второй годы исследований, показали, что новые формы комплексных NPK-удобрений в разных дозах модифицировали не только количественный, но и качественный состав микробного ценоза, т. е. изменяли его структуру.

Так, в первый год исследований в варианте IV* долевое участие аммонификаторов в составе микробоценоза возросло до 41% (в контроле – 32%), олигонитрофильных – до 34% (в контроле – 24%) (рис. 3). Доля усваивающих минеральный азот микроорганизмов в общей биогенности при увеличении их общей численности снизилась до 20% (в контроле – 34%). Уменьшилась также доля актиномицетов (с 3,0 до 0,6%), микромицетов (с 1,56 до 0,08%) и целлюлозоразрушающих микроорганизмов (с 1,69 до 0,53%).

В двух других вариантах опыта выявлена аналогичная тенденция в перестройке ризосферного микробного ценоза.

Во второй год изучения в структуре микробоценоза ризосферы корнеплода моркови при внесении комплексных минеральных удобрений долевое участие неспорообразующих аммонифицирующих и усваивающих минеральный азот микроорганизмов изменялось незначительно (с 20,88 до 25% и с 43,28 до 45,21% соответственно) (табл. 2).

Содержание олигонитрофильных (кроме варианта V**), спорообразующих аммонификаторов, микроскопических грибов, целлюлозоразрушающих микроорганизмов и актиномицетов в общей Рис. 3. Влияние новых форм и доз комплексных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора роста Эпин на структуру микробоценоза ризосферы моркови (первый год исследований), %: 1 – аммонифицирующие; 2 – спорообразующие аммонификаторы; 3 – усваивающие минеральный азот; 4 – актиномицеты; 5 – олигонитрофильные; 6 – микромицеты; 7 – целлюлозоразрушающие микроорганизмы Т а б л и ц а 2. Состав микробоценоза ризосферы моркови сорта Лявонiха при внесении новых форм и доз комплексных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора роста Эпин (второй год исследований)

–  –  –

I (контроль) 20,88 4,51 43,28 7,57 22,70 0,10 0,97 V** 22,58 2,05 38,55 5,84 30,37 0,06 0,55 VIII 23,75 4,90 45,21 6,25 18,96 0,05 0,90 25,00 2,60 44,86 5,71 21,23 0,09 0,50 численности микробного ценоза корнеплода снижалось. Уменьшение в составе изучаемого микробоценоза ризосферы корнеплода моркови доли бактерий, использующих минеральные формы азота, в том числе актиномицетов, в определенной мере свидетельствует о сохранении плодородия почвы при хорошем росте корнеплода.

Из полученных данных следует, что наиболее выраженное стимулирующее влияние за два года исследований на численный состав микробоценоза корнеплода оказало комплексное бесхлорное удобрение (N70P38K81) с микроэлементами и регулятором роста растений Эпин (вариант Х). Выявленное нами позитивное действие этой формы удобрений в дозе N70P38K81, проявилось в максимальном повышении общей биогенности и ускорении развития анализируемой бактериальной микрофлоры цикла азота (аммонифицирующих, усваивающих минеральный азот и олигонитрофильных микроорганизмов).

Урожайность моркови, полученная в опыте, представлена в табл. 3. Полученные урожайные данные коррелируют с данными микробиологического анализа. В вариантах опыта IV* и определены максимальные значения урожайности, общей биогенности и выявлена наибольшая плотность популяций микроорганизмов агрономически ценных групп. Как известно, почва содержит неограниченные запасы биогенных элементов, которые в большой мере не могут использоваться растениями.

Почвенные и ризосферные микроорганизмы переводят эти соединения в доступные для растений формы и тем самым поддерживают плодородие почвы [7]. Вместе с тем эффективное плодородие почвы определяется преимущественно процессами трансформации в ней азота, а модификация этого элемента в значительной степени связана с биологической активностью почв в целом [15] и численностью микроорганизмов группы азота в частности.

Именно поэтому высокая численность исследованных микроорганизмов агрономически ценных групп значима для роста и развития растений, так как они увеличивают поступление в ризосферную почву доступного для растений экологически безопасного азота и восстанавливают почвенное плодородие биологическим путем.

Т а б л и ц а 3. Влияние новых форм и доз комплексных удобрений с добавками микроэлементов и регулятора

–  –  –

H. V. SAFRONAVA1, L. A. SUKHOVITSKAYA1, N. V. KOROLENOK1, A. A. AUTKO2, AN. A. AUTKO2, O. V. POZNYAK2

INFLUENCE OF COMPLEX CHLORINE AND NON-CHLORINE

FERTILIZERS А ROOT CROP ON CARROT RHIZOSPHERE

MICROBIAL CENOS

Laboratory of interactions between soil icroorganiss and higher plants, Institute of Microbiology, National Acadey of Sciences of Belarus, Institute of Vegetable Culture, National Acadey of Sciences of Belarus he results of field studies on impact of new forms and doses of complex fertilizers supplemented with microelements and biologically active substances on quantitative and qualitative composition а root crop of carrot rhizosphere microbial cenos.

УДК 579.85 Т. А. ПУЧКОВА, Т. В. ЧЕРНООК, О. В. ОСАДЧАЯ, А. Н. КАПИЧ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РОСТА

ГРИБОВ РОДА CORDYCEPS

ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ И ГЛУБИННОМ

КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Лаборатория экспериментальной микологии и биоповреждений Отобраны быстрорастущие штаммы грибов рода Cordyceps: C. militaris 403 и C. sinensis 405. Дана их культурально-морфологическая характеристика. При выращивании при температурах 20–25 °С линейная скорость роста C. militaris 403 составила 1,7–2,1 мм/сут, ростовой коэффициент – 6,6–32,4.

У C. sinensis 405 эти показатели составляли, соответственно, 1,4–2,0 мм/сут и 7,2–35,2. При проведении световой микроскопии основными морфологическими признаками грибов рода Cordyceps были отсутствие пряжек на мицелии, конидиальное спороношение и образование хламидоспор. В мицелии C. ilitaris 403 и C. sinensis 405 содержалось, соответственно, 17,8–22,5% общего белка, 8,3–16,2% полисахаридов, 6,2–7,4% липидов, 680–1100 мг% общих фенольных соединений. В культуральной жидкости присутствовало 17,4–17,7 г/л общих углеводов и 0,5–2,3 г/л экзополисахаридов. Антиокислительная активность спиртовых экстрактов мицелия по отношению к антиоксиданту-ионолу составила 72–80%.

Введение. Грибы рода Cordyceps применяются в течение нескольких столетий в народной медицине стран Юго-Восточной Азии. Наиболее известными их представителями являются C. ilitaris и C. sinensis. Лекарственные свойства кордицепса подтверждаются современными научными исследованиями.

Соединения, входящие в состав этого лекарственного гриба, улучшают состояние иммунной системы, усиливают резистентность к различным патогенным микроорганизмам, оказывают противоопухолевое действие, повышают адаптационные возможности организма, обладают антиоксидантной активностью и препятствуют процессам старения. Кордицепс благотворно влияет на нервную, эндокринную, дыхательную и половую системы, обладает антиаритмическим и гипотензивным действием, понижает содержание холестерина, улучшает микроциркуляцию крови в тканях и препятствует тромбообразованию [1–3]. Биологическое действие кордицепса определяют в первую очередь иммуномодулирующие полисахариды, активирующие иммунные клетки, увеличивающие продукцию цитокинов и интерферона, а также производные нуклеозидов: кордицепин (3-дезоксиаденозин) и дидезоксиаденозин. Кордицепин является структурным аналогом аденозина, обладает выраженным противовирусным действием за счет ингибирования синтеза цепей РНК [4–7].

Хотя грибы рода Cordyceps проявляют широкий спектр фармакологического действия, имеется мало сведений об их использовании для создания препаратов для ветеринарии. При проведении исследований на сельскохозяйственных животных по применению биомассы и экстракта кордицепса обнаружено общеукрепляющее и иммуностимулирующее действие, улучшение работы пищеварительной системы и увеличение привесов [8–10]. Большой интерес представляют публикации о повышении фертильности животных при добавлении мицелия кордицепса в кормовой рацион [11, 12].

Ресурсы энтомопатогенных грибов рода Cordyceps в природе ограничены, их сбор происходит в ограниченное время в труднодоступных районах. Для выращивания в искусственных условиях наиболее распространено твердофазное культивирование этого гриба с использованием субстратов на основе шелковичных червей или зерна. Перспективным способом получения биомассы и метаболитов грибов рода Cordyceps является глубинное культивирование, позволяющее за короткое время получать стандартные продукты с заданными свойствами. Однако сведения об образовании полисахаридов и других биологически активных веществ при глубинном культивировании немногочисленны [3, 6, 7, 13].

Цель исследования – сравнительное изучение роста грибовпредставителей рода Cordyceps при поверхностном и глубинном культивировании с целью последующей разработки технологии получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили грибы рода Cordyceps, относящиеся к классу Sordarioycetes (отдел Ascoycota) из коллекции культур лаборатории экспериментальной микологии и биоповреждений Института микробиологии НАН Беларуси. Культуры грибов поддерживали на скошенном сусло-агаре (4 °Б).

Для определения культурально-морфологических свойств грибов их выращивали на сусло-агаре (СА), глюкозо-пептондрожжевом агаре (ГПДА) и картофельно-декстрозном агаре (КДА) при температурах + 4 ± 1, 16 ± 1, 20 ± 1, 25 ± 1, 30 ± 1, 37 ± 1 °С.

Глубинное культивирование грибов проводили на пивном сусле (7 °Б) и полусинтетической питательной среде в колбах Эрленмейера на круговой качалке (180 об/мин). Температура культивирования – 20–30 °С, время – 4–5 сут. При подборе компонентов питательной среды различные источники углерода вносили в среду в количестве 20 г/л, азота – из расчета 0,45–0,5 г/л по азоту. Количество инокулюма – 10%.

Грибной мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную ткань, высушивали при температуре 60 °С и далее использовали для последующих анализов.

Белок в мицелии определяли по Кьельдалю [14], эндополисахариды – [15], экзополисахариды – [16], общие углеводы – [17], общие фенольные соединения – [18].

Антиокислитительную активность (АОА) спиртовых экстрактов определяли по [19]. Об антиокислительных свойствах грибов судили по способности экстрактов тормозить образование продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов). За 100% принимали величину АОА ионола – известного антиоксиданта.

Сотрудниками Института ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины при помощи микроскопа JM-35C (Japan) выполнена сканирующая электронная микроскопия мицелия исследуемых грибов.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических функций Microsoft Excel, уровень значимости – 95%.

Результаты и их обсуждение. В результате скрининга отобраны быстрорастущие штаммы грибов – представителей грибов рода Cordyceps: C. militaris 403 и C. sinensis 405. Исследованы их культурально-морфологические особенности при выращивании на агаризованных средах: СА, КДА, ГПДА.

При температуре + 4 ± 1 °С вегетативный мицелий практически не развивался, наблюдалось легкое опушение посевного инокулюма. После перенесения чашек с культурами в условия, благоприятные для роста мицелия, он начинал расти.

Оптимальная температура роста для исследуемых грибов находилась в пределах 20–25 °С (табл. 1). При 20 °С линейная скорость роста C. militaris 403 составила 1,9–2,1 мм/сут, ростовой коэффициент – 6,6–15,6. У C. sinensis 405 эти показатели составляли, соответственно, 1,5–2,0 мм/сут и 7,2–14,4.

При 25 °С на всех средах наблюдались более высокие и плотные мицелиальные колонии. Хотя линейная скорость роста грибов оказалась несколько ниже (1,7–2,0 мм/сут у C. militaris 403 и 1,4–1,9 мм/сут у C. sinensis 405), чем при 20 °С, значения ростового коэффициента были более высокими. Полное зарастание чашек Петри наблюдалось на 23–25-е сутки инкубации.

Низкая температура культивирования (17 °С) оказалась более предпочтительной для исследуемых штаммов грибов, чем высокая (30 °С), при которой мицелиальный рост наблюдался только в первые пять суток инкубации, после чего прекращался. При 37 ± 1 °С рост не наблюдался, что очень важно в плане безопасности мицелия исследуемых грибов для человека и животных.

При выращивании на плотной питательной среде по показателям линейной скорости роста и ростового коэффициента исследуемые штаммы C. sinensis 405 и C. ilitaris 403 можно отнести к группе медленно растущих грибов.

C. sinensis 405 на всех исследованных средах образовывал высокие ватообразные колонии белого цвета с ровным или слегка волнистым краем. Окраска реверзума цвета среды. Наиболее активный рост наблюдался на СА. На ГПДА отмечались радиальные колонии.

C. militaris 403 на агаризованном пивном сусле также формировал высокие, плотные, опушенные, а на ГПДА и КДА – менее плотные радиальные колонии с выпуклым центром. При выращивании в темноте окраска колоний белая. При освещении мицелия C. militaris видимым светом отмечено образование желтовато-оранжевого пигмента.

Т а б л и ц а 1. Рост колоний грибов рода Cordyceps на агаризованных питательных средах различного состава

–  –  –

Основными морфологическими признаками грибов рода Cordyceps были отсутствие пряжек на мицелии, конидиальное спороношение и образование хламидоспор. При микроскопировании вегетативного мицелия гифы и конидиофоры мицелия гиалиновые с гладкими стенками, конидии цилиндрические, гладкостенные. На поверхностном мицелии формировались споры округлой формы 5–10 мкм в диаметре. При глубинном культивировании C. sinensis 405, в отличие от C. ilitaris 403, уже на 2-е сутки культивирования наблюдалось большое количество спор в культуральной жидкости.

В Институте ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины проведено исследование мицелия C. militaris 403 и C. sinensis 405 методом сканирующей электронной микроскопии. Как показано на рисунке, гифы мицелия септированные, образуют анастомозы. Спорообразование у аскомицетов рода Cordyceps происходит и на мицелиальной стадии роста. При старении культуры или неблагоприятных условиях наблюдается интеркалярное образование хламидоспор крупных овальных клеток с утолщенными оболочками, содержащих запасные питательные вещества. На некоторых гифах наблюдается скопление экзометаболитов, повидимому, экзополисахаридов (см. рисунок).

а б Вегетативный мицелий грибов: а – C. militaris (СЕМ 780); б – C. sinensis (СЕМ 4000) На стандартных питательных средах длительность роста исследуемых грибов составляла не более 4–5 сут. Они накапливали 7,4–12,5 г/л биомассы (табл. 2). Количество образуемых экзополисахаридов у C. ilitaris 403 оказалось более чем в 2 раза выше, чем у C. sinensis 405. В глубинном мицелии исследованных штаммов грибов наблюдалось высокое содержание общих углеводов, липидов и белка. У C. sinensis 405 отмечалось большее количество общих фенольных соединений. В культуральной жидкости присутствовало 17,4–17,7 г/л общих углеводов, 0,5–2,3 г/л экзополисахаридов, а также следовые количества липидов.

Спиртовые экстракты мицелия обоих грибов характеризовались высокой АОА по отношению к антиоксиданту – ионолу.

Т а б л и ц а 2. Накопление биомассы, биохимический состав мицелия и антиокислительная активность грибов рода Cordyceps на разных питательных средах

–  –  –

Проведенные сотрудниками факультета ветеринарной медицины и научно-исследовательской лаборатории Гродненского государственного аграрного университета исследования показали, что образцы культуральной жидкости с мицелием грибов C. sinensis 405 и C. militaris 403 не оказывали острого токсического действия на организм белых крыс, были непатогенными и безвредными для лабораторных животных, не обладали токсичностью, аллергенностью и токсигенными свойствами.

Заключение. Таким образом, проведено сравнительное изучение роста грибов-представителей рода Cordyceps при поверхностном и глубинном культивировании. Изучаемые грибы характеризуются высокой скоростью роста при глубинном культивировании.

Мицелий и культуральная жидкость содержат комплекс биологически активных веществ углеводной, белковой, липидной и фенольной природы. Проведенные сотрудниками факультета ветеринарной медицины и научно-исследовательской лаборатории Гродненского государственного аграрного университета исследования показали, что культуральные жидкости с мицелием грибов C. sinensis и C. militaris непатогенны и нетоксигенны и могут использоваться в микробиологическом производстве.

Литература

1. Russell, R. Cordyceps – a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory? / R. Russell, M. Paterson // Phytochemistry. – 2008. – Vol. 69. – P. 1469–1495.

2. Ng, T. B. Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine /. B. Ng, H.. Wang // J. of Pharmacy and Pharmacology. 2005. Vol. 57, N 12.

P. 15091519.

3. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps ilitaris: Current state and prospects /. K. as [et al.] // itoterapia. – 2010. – Vol. 81, N 8. – P. 961–968.

4. Bioactive substances from insect pathogenic fungi / M. Isaca [et al.] // Acc.

Chem. Res. 2005. Vol. 38. P. 813823.

5. Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products /. Zhou [et al.] // J. of Pharmacy and Pharmacology. – 2009. – Vol. 61. – P. 279–291.

6. Ki, H. O. A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps ilitaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures / H.. Kim, J. W. Yun. // J. Appl. Microbiol. 2005.

Vol. 99, N 4. P. 728–738.

7. Polysaccharides of Cordyceps species /. Zhong [et al.] // ood echnol.

Biotechnol. – 2009. – Vol. 47, N 3. – P. 304–312.

8. Koh, J. H. Hot-water extract from mycelia of Cordyceps sinensis as a substitute for antibiotic growth promoters / J. H. Koh, H. J. uh,.. Ahn // Biotechnol.

ett. – 2003. – Vol. 25. – P. 585–590.

9. Byung-Sung, P. Influence of dietary vegetable wasps with fly pupa on gastrointestinal tract microflora, carcass characteristics and growth performance in broiler chickens / P. Byung-ung // Journal of Animal and Veterinary Advances. – 2011. – Vol. 10, N 22. – P. 2930–2935.

10. Effects of Cordyceps ilitaris mycelia on in vitro rumen microbial fermentation / J. M. Yeo [et al.] // Asian-Aust. J. Anim. ci. – 2009. – Vol. 22, N 2. – P. 201–205.

11. Improvement of perm Production in ubfertile Boars by Cordyceps ilitaris upplement / Am. J. of Chinese Medicine. – 2007. – Vol. 35, N 4. – P 631–641.

12. Effect of Cordyceps ilitaris supplementation on sperm production, sperm motility and hormones in sprague-dawley rats / Y. Chang [et al.] // Am. J. of Chinese Medicine. – 2008. – Vol. 36, N 5. – 849–859.

13. ungal biotechnology in food and feed processing /. horai [et al.] / ood Research International. – 2009. – Vol. 42, N 5–6. – P. 577–587.

14. Ермаков, А. И. Методы биохимического исследования растений / А. И. Ермаков. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 256 с.

15. Tang, Y. J. ed-batch fermentation of Ganodera lucidu for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid / Y. J. ang, J. J. Zhong // Enzyme and Microbial echnology. – 2002. – Vol. 31, N 1–2. – P. 20–28.

16. Babitskaya, V. G. Exopolysaccharides of some medicinal mushrooms: production and composition / V.. Babitskaya [et al.] // Int. J. of Medicinal Mushrooms. – 2000. – Vol. 2. – P. 51–54.

17. Гончарова, И. А. Полисахариды клеточной стенки базидиомицета Coriolus hirsutus / И. А. Гончарова, В. В. Щерба, В. Г. Бабицкая // Прикл. биохимия и микробиология 1996. Т. 32, № 4. С. 434–437.

18. Запрометов, М. Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращение, функции / М. Н. Запрометов // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 143–162.

19. Антиокислительная активность экстрактов мицелия настоящей губки / А. Н. Капич [и др.] // Весці НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1991. – № 5. – С. 58–62.

T. A. PUCHKOVA, T. V. CHERNOOK, O. V. OSADCHAYA, A. N. KAPICH

COMPARATIVE EXAMINATION OF CORDYCEPS FUNGI GROWTH

IN SOLID-STATE AND SUBMERGED CULTURE

Laboratory of experiental ycology and biodeterioration he fast growing strains of the fungi Cordyceps genera were selected: C. ilitaris 403 and C. sinensis 405. heir cultural and morphological properties were investigated.

he growth rates on solid media for C. ilitaris 403 varied between 1.7–2,1 mm/day, growth coefficient – 6.6–32.4. hese parameters for C. sinensis 405 were found to be 1.4–2.0 mm/day and 7.2–35.2 accordingly. he fungi of the Cordyceps genera did not form clamps on the mycelium but chlamydospores and conidia have been found. he mycelium of C. ilitaris 403 and C. sinensis 405 contained accordingly 17.8–22.5% of crude protein, 8.3–16.2% of polysaccharides, 6.2–7.4% of lipids and 680–1100 mg% of total phenolic compounds. 17.4–17.7 g/l of total carbohydrates and 0.5–2.3 g/l of polysaccharides have been found in cultural fluids. Antioxidant activity of the alcohol extracts of mycelium reached 72–80% in comparison to standard antioxidant BH.

УДК 579.852.11-579.62 Н. В. ВОРОНКОВИЧ, И. Н. АНАНЬЕВА, Э. И. КОЛОМИЕЦ

ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

И УСЛОВИЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

БАКТЕРИЙ BАСILLUS SUBTILIS 17 – ОСНОВЫ

БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ

ОТ ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лаборатория средств биологического контроля Выделен и изучен бактериальный штамм Bacillus subtilis 17 – перспективный агент биологической защиты картофеля от болезней. Для обеспечения максимальной антагонистической активности проведена оптимизация состава питательной среды и условий глубинного выращивания культуры в лабораторном ферментере. Изучена кинетика роста В. subtilis 17 в оптимизированных условиях. Показано, что полученный при соблюдении экспериментально подобранных параметров культивирования бактерий В. subtilis 17 опытный образец эффективно ингибирует развитие возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля.

Введение. Картофель – одна из важнейших сельскохозяйственных культур разностороннего использования. Прежде всего это ценный продукт питания, богатый витаминами, микроэлементами, антиоксидантами и незаменимыми аминокислотами, который в Беларуси традиционно считается вторым хлебом.

Оценка ущерба картофелеводства позволяет сделать заключение о том, что биотические стрессовые факторы, проявляющиеся в виде заболеваний, существенно снижают продуктивность этой культуры. Ежегодный недобор урожая от болезней составляет более 30%, а в период хранения потери достигают 30–40% [1–3].

Для подавления развития болезней картофеля в период вегетации растений и во время хранения клубней наиболее действенным и эффективным способом является обработка их химическими препаратами. Однако способ защиты растений с помощью химических препаратов вызывает обоснованные опасения специалистов с точки зрения биологической, экологической и медицинской безопасности. Кроме того, эффект, производимый химическими средствами защиты растений недолговечен из-за развития резистентных форм патогенов [4].

В настоящее время в мире накоплен опыт по использованию экологически безопасных микроорганизмов – антагонистов фитопатогенов для защиты растений от болезней и убедительно показана перспективность биологического метода контроля патогенов [5–11], не оказывающего вредного воздействия на окружающую среду. Замена химических пестицидов биологическими препаратами, не загрязняющими агроландшафты и водные ресурсы, имеет приоритетное значение при защите картофеля, так как чаще всего эта культура возделывается вблизи населенных пунктов и водоохранных зон.

Однако по эффективности действия биологические препараты зачастую уступают химическим, что является сдерживающим фактором биологизации защитных мероприятий. В целях повышения конкурентоспособности биологических агентов представляется необходимым проведение исследований по выяснению и обеспечению их физиологических потребностей, позволяющих достигнуть максимального выхода целевых продуктов.

Объекты и методы исследований. В работе использован выделенный нами штамм бактерий Васillus subtilis 17, отобранный в качестве потенциального агента биологического контроля возбудителей болезней картофеля. Основными тест-объектами для оценки антагонистической активности исследуемых культур служили фитопатогенные грибы и бактерии: Fusariu oxysporum 67/05 и Pectobacterium atrosepticum 3.

Бактерии-антагонисты выращивали на среде Мейнелла следующего состава (г/л): меласса – 30,0; K2HP4 – 7,0; KH2P4 – 3,0;

Mg4 – 0,1; (NH4)24 – 1,5; Na-цитрат – 0,5; вода водопроводная – до 1 л. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на качалке (200 об/мин) в течение 72 ч и оценивали их антагонистическую активность методом лунок. Результаты учитывали после 24–48 ч инкубации при температуре 28 °С по диаметру зон задержки роста тест-культур. Титр колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий определяли методом предельных разведений [12]. Для определения титра спор перед высевом на мясо-пептонный агар проводили термическую обработку разведений бактериальной суспензии при 80 °С в течение 10 мин.

Глубинное культивирование фитопатогенных грибов осуществляли на картофельно-глюкозной среде при 27 °С в течение 48–72 ч, бактерий – на мясо-пептонном бульоне при 27 °С в течение 24–48 ч.

Оптимизацию условий культивирования B. subtilis 17 проводили в лабораторном ферментере АНКУМ-2М емкостью 10 л на базе Биотехнологического центра Института микробиологии НАН Беларуси.

Удельную скорость роста популяции бактерий (µ) рассчитывали по формуле (dx/dt) (1/x), (ч–1), (1) где dx – прирост биомассы за время dt, x – общее количество биомассы за указанный период времени.

Время генерации (g) рассчитывали по формуле g = ln2/µ= 0,693/µ. (2) УФ-спектроскопию бесклеточной культуральной жидкости (КЖ) проводили на спектрофотометре «himadzu UV-2400».

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel. Рассчитывали средние величины и их доверительные интервалы для уровня вероятности 95%. Наименьшую существенную разность (НСР0,5) определяли с использованием дисперсионного анализа [13].

Результаты и их обсуждение. В качестве источников углерода для глубинного культивирования бактерий-антагонистов B. subtilis 17 проверены глюкоза, сахароза, меласса (содержание сахарозы около 50%). В качестве минеральной основы использован солевой состав среды Мейнелла. Исследования показали, что оптимальным источником углерода в питательной среде является меласса, характеризующаяся, наряду с высокой питательной ценностью, низкой стоимостью и гомогенностью (табл. 1).

Для определения оптимальной концентрации данного источника углеродного питания бактериальную культуру выращивали в среде с различным содержанием мелассы. Результаты эксперимента показали, что оптимальным вариантом является использование мелассы в концентрации 3%, так как в данном случае антагонистическая активность B. subtilis 17 повышалась на 4–8% по сравнению с другими вариантами опыта (рис. 1).

Т а б л и ц а 1. Влияние различных источников углерода на КОЕ, титр спор и антагонистическую активность B.

subtilis 17

–  –  –

При изучении влияния различных источников азота в питательной среде на свойства исследуемого бактериального штамма были использованы азотсодержащие вещества: сульфат аммония, нитраты аммония и калия, мочевина, дрожжевой экстракт и пептон. Исходная концентрация азота азотсодержащих солей Рис. 1. Влияние концентрации мелассы на антагонистическую активность B. subtilis 17 задавалась из расчета 0,21 г азота/л среды по аналогии с контрольной средой Мейнелла. Из всех исследованных солей для активного спорообразования бактерий-антагонистов и проявления антимикробной активности оптимальным источником азота был сульфат аммония (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Влияние различных источников азота на КОЕ, титр спор и антимикробную активность B.

subtilis 17

–  –  –

Проведены исследования влияния количественного соотношения источников углерода и азота для получения КЖ бактерий с высоким титром спор и одновременно высокой антагонистической активностью. Для этого варьировали содержание сульфата аммония в питательной среде, содержащей 3% мелассы. Результаты экспериментов показали, что уменьшение соотношения С : N от 40 до 20 приводит к увеличению выхода спор в 12 раз.

При этом зоны задержки роста фитопатогенов возрастают на 9–11% (табл. 3). Таким образом, наилучшие результаты были получены при добавлении в среду сульфата аммония в концентрации 1,5 г/л.

На основании полученных данных для глубинного культивирования бактерий B. subtilis 17 может быть рекомендована среда следующего состава (г/л): меласса – 30,0; K 2HP4·3H2 – 7,0; KH2P4 – 3,0; Mg4 7H2 – 0,1; (NH4)24 – 1,5; Na-цитрат – 0,5; вода водопроводная – до 1 л.

Т а б л и ц а 3. Влияние соотношения источников углерода и азота на титр спор и антимикробную активность B.

subtilis 17

–  –  –

6,0 108 0,75 40 31,0 25,0 1,0 109 1,0 30 33,0 26,0 2,7 109 1,5 20 35,0 33,0 7,8 108 НСР05 – 0,9 1,8 Важный элемент оптимизации условий глубинного культивирования микроорганизмов – обеспечение должного уровня массообмена. Система аэрации должна обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова у разных организмов. Нами оптимизированы условия культивирования B. subtilis 17 в лабораторном ферментере АНКУМ-2М при режимах аэрации 0,5; 1,0 и 1,5 л воздуха на 1 л среды в минуту и скорости вращения мешалки 200 об/мин. Установлено, что оптимальные условия для проявления бактериями максимальной антагонистической активности достигаются при интенсивности аэрации 1,0 л/л среды в минуту диаметр зоны задержки роста Pectobacterium atrosepticum 3–36,0 мм, Fusariu oxysporum 67/05 составил – 34,5 мм (рис. 2, 3).

Спектрофотометрическое исследование фугата КЖ показало, что УФ-спектр бесклеточной КЖ B. subtilis 17 имеет несколько максимумов поглощения: один – в области 285 нм, что свидетельствует о наличии антибиотиков полипептидной природы, три максимума в области 328–385 нм, характерных для веществ полиеновой природы, имеющих в качестве хромофора систему сопряженных двойных связей [14, 15].

При интенсивности аэрации 1,0 л/л среды в минуту также происходит более полное потребление питательного субстрата – содержание остаточных сахаров составляет 3,6 г/л. Как при увеличении, так и при снижении интенсивности аэрации субстрат утилизируется на 19–27% хуже (рис. 4).

Рис. 2. Влияние интенсивности аэрации на антибактериальную активность бактерий B. subtilis 17 (тест-объект – P. atrosepticum 3) Рис. 3. Влияние интенсивности аэрации на антифунгальную активность бактерий B. subtilis 17 (тест-объект – F. oxysporu 67/05) Рис. 4. Динамика потребления сахаров в процессе культивирования бактерий B. subtilis 17 в лабораторном ферментере при различной интенсивности аэрации При оптимальном режиме аэрации максимальная удельная скорость роста исследуемой популяции наблюдается через 6 ч от момента засева и составляет 0,25 ч–1, что соответствует времени генерации g = 2,7 ч (рис. 5). Затем скорость роста заметно снижается, тогда как прирост биомассы продолжается еще в течение 30 ч ферментации. Переход культуры в фазу замедленного роста, по-видимому, связан с недостатком питания. После 14–16 ч замедленного роста культура вступает в стационарную фазу.

Наиболее высокий уровень накопления биомассы (5,5–5,8 г/л) наблюдается к 30–36 ч ферментации, максимальный титр жизнеспособных клеток к 48 ч культивирования составляет 2,5 109 в 1 мл КЖ.

Принципиальной особенностью кинетики микробных популяций является зависимость скорости роста культуры от концентрации одного или нескольких наиболее важных компонентов среды, обеспечивающих биосинтетическую основу метаболизма.

Эти компоненты (лимитирующие субстраты), в определенной Рис. 5. Динамика изменения удельной скорости роста популяции и содержания биомассы в процессе культивирования бактерий B. subtilis 17 в лабораторном ферментере при интенсивности аэрации 1,0 л/л среды в минуту степени регулируют скорость роста популяции. Интенсивный рост B. subtilis 17 и сопутствующее ему активное потребление редуцирующих веществ коррелируют со снижением значения рН среды и происходит до 12 ч культивирования, что может быть связано с накоплением в культуральной жидкости продуктов, имеющих кислую реакцию (рис. 6). Последующее защелачивание среды свидетельствует о начавшемся процессе споруляции.

Период наиболее активного спорообразования по времени совпадает с фазой замедленного роста культуры (16–24 ч).

Заключение. Разработан состав питательной среды для глубинного культивирования бактерий B. subtilis 17 – основы биопрепарата для защиты картофеля от комплекса болезней, включающий (г/л): меласса – 30,0; K2HP4 – 7,0; KH2P4 – 3,0; Mg4 – 0,1;

(NH4)24 – 1,5; Na-цитрат – 0,5; вода водопроводная – до 1 л.

Показано, что оптимальные условия для проявления бактериями антагонистической активности достигаются при интенсивности аэрации 1,0 л/л средымин (диаметры зон задержки роста F. oxysporu 67/05 – 34,5 мм, P. atrosepticum 3 – 36,0 мм.

Рис. 6. Динамика потребления сахаров и изменения рН среды в процессе культивирования бактерий B. subtilis 17 в лабораторном ферментере при интенсивности аэрации 1,0 л/л среды в минуту Антимикробная активность культуры обусловлена продукцией антибиотиков полипептидной и полиеновой природы.

При оптимальном режиме аэрации максимальная удельная скорость роста исследуемой популяции наблюдается через 6 ч от момента засева и составляет 0,25 ч–1, что соответствует времени генерации g = 2,7 ч. Интенсивный рост B. subtilis 17 и сопутствующее ему активное потребление редуцирующих веществ коррелируют со снижением значения рН среды и происходит до 12 ч культивирования. Последующее защелачивание среды свидетельствует о начавшемся процессе споруляции. Период наиболее активного спорообразования по времени совпадает с фазой замедленного роста культуры (16–24 ч).

При соблюдении оптимизированных параметров культивирования B. subtilis 17 проявляет максимальную антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам F. oxysporu 67/05 и бактериям P. atrosepticu 3. Проведенная оптимизация состава питательной среды и условий культивирования бактерий позволила повысить антимикробную активность культуры на 17–26%. Полученные данные станут основой разработки технологии получения нового высокоэффективного биопрепарата для защиты картофеля от комплекса болезней.

Литература

1. Иванюк, В. Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / В. Г. Иванюк, С. А. Банадысев, Г. К. Журомский. – Минск: Белпринт, 2005. – 696 с.

2. Недорезков, В. Д. Современные проблемы защиты растений / В. Д. Недорезков // Современный мир: экономика, история, образование, культура. – Уфа, 2003. – Ч. 1. – С. 14–18.

3. Смирнов, О. В. Многоцелевое действие биопрепаратов / О. В. Смирнов // Защита и карантин растений. – 2006. – № 2. – С. 20–21.

4. Биопрепараты в защите растений / М. В. Штерншис [и др.]. – Новосибирск, 2000. – 128 с.

5. Лобанок, А. Г. Фундаментальные и прикладные исследования по разработке микробных пестицидов в Институте микробиологии НАН Беларуси / А. Г. Лобанок, Э. И. Коломиец // Защита растений на рубеже I века: материалы науч.-практ. конф. – Минск, 2001. – С. 403–405.

6. Коломиец, Э. И. Биопестициды: эффективны и экологичны / Э. И. Коломиец // Наука и инновации. – 2011. – № 3. – С. 11–13.

7. Коломиец, Э. И. Биологическая альтернатива удобрениям и средствам защиты растений / Э. И. Коломиец, Л. И. Стефанович, Н. А. Здор // Белорусское сельское хозяйство. – 2011. – № 10. – С. 33–35.

8. Мандрик, М. Н. Отбор микроорганизмов-антагонистов к возбудителям болезней зернобобовых культур / М. Н. Мандрик, В. Н. Купцов // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2005. – № 5. – С. 143–145.

9. Koloiets, E. I. New approaches in development of biological control products / E. I. Kolomiets,. V. Romanovskaya, N. V. verchkova // Biotechnology:

tate of the Art and Prospects for evelopment / ed. by. E. Zaikov. – New York:

Nova cience Publishers. – 2008. – Р. 165–174.

10. ludge and lignin as growth media for the production of antimicrobial substances by selected microorganisms / M. Mandryk [et al.] // Arch. of Phytopathol.

and Plant Protection. – 2009. – Vol. 42, N 8 – P. 783–795.

11. ignificance of Cuticle egrading Enzymes With pecial Reference to ipase in Biocontrol of ugarcane Wooly Aphids /. Chavan [et al.] // J. Mycol. Pl.

Pathol. – 2009. – Vol. 39, N 1. – Р. 118–123.

12. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред.

Д. Г. Звягинцева. – М.: МГУ, 1980.

13. Рокицкий, П. Ф. Биологическая статистика / П. Ф. Рокицкий. – Минск:

Вышэйш. школа, 1973. – 320 с.

14. Ветлугина, Л. А. Противогрибковые полиеновые антибиотики / Л. А. Ветлугина, Е. Т. Никитина. – Алма-Ата: Наука, 1980. – 249 с.

15. Карнаухова, Л. И. УФ-спектроскопия биологических макромолекул:

учеб.-метод. пособие / Л. И. Карнаухова, Е. Н. Тупицын. – Саратов: Изд-во Саратов. гос. ун-та, 2002. – 15 с.

N. V. VORONKOVICH, I. N. ANANYEVA, E. I. KOLOMIETS

OPTIMIZATION OF NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION

AND CONDITIONS OF SUBMERGED CULTIVATION OF BACTERIA

BACILLUS SUBTILIS 17 – BASIS OF BIOPREPRATION FOR PROTECTION

OF POTATO FROM FUNGAL AND BACTERIAL DISEASES

Laboratory of biological control agents he bacterial strain Bacillus subtilis 17 a promising agent for biological control of potato diseases was isolated and studied. o ensure the maximum antagonistic activity optimization of nutrient medium composition and submerged fermentation conditions of the culture was conducted in a laboratory fermenter. he kinetics of B. subtilis 17 growth under the optimized conditions was investigated. It was shown that the B. subtilis-based prototype of the preparation, obtained by observing the experimentally selected parameters effectively inhibits the development of fungal and bacterial pathogens, causing potato diseases.

БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ

И ПРОМЫШЛЕННОСТИ

УДК 579.66:577.113.3 А. И. ЗИНЧЕНКО

ДНК КАК ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

Лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы Статья представляет собой мини-обзор литературы, касающейся использования лекарственных средств на основе ДНК. Затронуты аспекты эффективной доставки ДНК в клетки-мишени и стимуляции ею врожденного и адаптивного иммунитета.

Введение. ДНК представляет собой незаменимый компонент всех живых организмов, исключая некоторые РНК-содержащие вирусы. Геномная ДНК – архив генетической информации, которая является важнейшей для всех видов, включая человека, несмотря на то что первичная структура ДНК постоянно изменяется.

Эта нестабильность в течение миллионов лет позволила одним организмам адаптироваться к новым условиям окружающей среды, а других привела к исчезновению. Мутации иногда вызывают заболевания, даже если только один нуклеотид выпадает или заменяется другим. Это происходит в том случае, если такое изменение является критическим для экспрессии того или иного функционального белка. Большинство мутаций ДНК репарируется специальными ферментативными системами. Двухцепочечная структура ДНК делает этот процесс коррекции точным, поскольку матрицей для коррекции служит исправная цепь.

Достигнутые в последние годы успехи физико-химической биологии обусловили существенный прогресс в области разработки наноразмерных систем на основе ДНК, предназначенных для фармацевтического и биомедицинского применения. Предложены такие уникальные структуры лекарственных форм и методы их направленной (пассивной и активной) доставки в клетки-мишени, которые невозможно было себе представить всего несколько лет назад [1–4].

Требования, предъявляемые к ДНК как фармацевтическому соединению. Чтобы проявить свою фармакологическую активность, молекулы экзогенной ДНК должны достичь места своего действия в биологически активном состоянии. Существуют два главных барьера на пути применения молекул ДНК в качестве лекарственных средств: первый – биологическая нестабильность ДНК; второй – ее слабая способность проникать через биологические мембраны. Действительно, ДНК легко деградирует внутри организма, поскольку биологические жидкости, такие как сыворотка, межклеточная жидкость и цитоплазма содержат ДНК-деградирующие ферменты.

При попадании в свой сайт действия ДНК взаимодействует с молекулой-мишенью. Если мишенью является комплементарная ДНК или РНК, размер вводимой ДНК должен быть не менее 15 нуклеотидов. Такая минимальная длина требуется, чтобы в клетке мог сформироваться достаточно прочный дуплекс.

Особое место среди лекарственных средств на основе ДНК занимает Cp-ДНК – иммунотропное соединение, которое проявДНК ляет свою биологическую активность посредством взаимодействия с так называемым oll-like-рецептором № 9 (R9) [5, 6].

Рецептор R9 локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и эндосомно-лизосомных компартментах. Поэтому эндоцитозное поглощение – основной способ поглощения клеткой макромолекул, в том числе молекул ДНК, автоматически обеспечивает доставку Cp-ДНК к субклеточным компартментам, где локаДНК лизуются R9. В этом случае проницаемость мембраны не мешает ДНК проявлять свою биологическую активность.

Проблема биологической нестабильности олигодезоксинуклеотидов (ОДН) часто решается путем химической модификации. Разработаны разнообразные формы химически модифицированных ОДН, например фосфоротиоатные, 2-О-метильные, фосфорамидатные, метилфосфонатные [7]. Разрабатываются так называемые пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), которые не являются ни ДНК, ни РНК, но могут гибридизироваться с комплементарными одноцепочечными ДНК и РНК [8]. Аффинность связывания ПНК с нуклеиновыми кислотами намного выше, чем у ДНК или РНК с той же первичной структурой, из-за отсутствия отрицательного заряда на цепи ПНК. Еще одним подходом к повышению стабильности ОДН может быть ковалентное присоединение других молекул, например холестерина [9]. Эти химически модифицированные ОДН более стабильны, чем природные фосфодиэфирные ОДН. Однако следует обратить внимание на то, что по крайне мере некоторые из них изменяют специфичность взаимодействия ОДН с молекулами-мишенями. Например, фосфоротиоатные ОДН прочнее связываются с белками по сравнению с фосфодиэфирными ОДН [10]. Такие модификации могут способствовать повышению времени полуинактивации ОДН, но в ряде случаев они вызывают повреждение тканей. Именно стабильность модифицированных ОДН обусловливает усиление побочных эффектов по сравнению с фосфодиэфирными ОДН.

Характеризуя вторую проблему – слабую проницаемость мембран для молекул ДНК, необходимо отметить следующее.

Молекулярная масса нуклеотида в ДНК составляет около 310.

Принимая во внимание, что самая маленькая молекула ДНК, используемая в настоящее время в качестве фармацевтического агента (цепочка из 15 нуклеотидов), имеет молекулярную массу почти 5000, даже такая ДНК не может легко пройти через биологические мембраны. Кроме того, фосфат нуклеотидов придает ДНК сильный отрицательный заряд. Поскольку поверхность клеток заряжена отрицательно (из-за присутствия отрицательно заряженных гликолипидов и гликопротеинов), результирующее электростатическое отталкивание также мешает взаимодействию ДНК с клетками.

Проблема доставки ДНК в клетки-мишени. В большинстве случаев ДНК необходимо доставить в цитоплазму или в клеточное ядро, где находится молекула-мишень, такая как белок, РНК или другая ДНК. Как отмечалась выше, внушительные размеры молекулы и отрицательный заряд сильно мешают проникновению ДНК в эти субклеточные компартменты. В связи с этим разработаны и скоро должны будут войти в обиход специальные системы направленного транспорта молекул ДНК к клеткаммишеням [11–13].

Наиболее простой способ доставки ДНК – инъекция препарата ДНК непосредственно в ткань [14]. Этот метод не ограничен короткими молекулами ДНК, такими как антисмысловые ОДН, но может применяться к огромным плазмидным ДНК длиной в несколько тысяч пар оснований. Механизм внутриклеточной доставки этим методом еще не полностью выяснен. Полагают, что при этом важную роль играют повреждения мембраны, вызванные внедрением иглы, и повышенное давление из-за инъекции раствора в экстраклеточное пространство. Этот метод доставки эффективен, но главный недостаток – ограниченное число клеток, воспринимающих ДНК. В публикациях, посвященных доставке генов, сообщается, что после внутримышечной инъекции «голой» плазмидной ДНК только клетки, локализованные в радиусе 5–10 мм от центра инъекции, экспрессируют трансген [15].

Тем не менее рассматриваемый метод может быть эффективным, если число клеток-мишеней относительно мало. Это относится, например, к пятнистой дистрофии роговицы, при которой препараты на основе антисмысловых ОДН непосредственно вводятся в стекловидное тело [16]. Поскольку молекула ДНК заряжена, для доставки ее можно применять ионофорез или электропорацию [17].

Для повышения эффективности доставки к клеткам-мишеням ДНК инкорпорируют в особые векторы, такие как липосомы и наночастицы [18–20]. Инкорпорация ДНК в эти структуры устраняет возможность взаимодействия ДНК с нуклеазами, так что стабильность ДНК заметно возрастает. Формирование комплексов ДНК с катионами, включая катионные липиды и полимеры – еще один подход к повышению стабильности и эффективности доставки ДНК к месту ее действия. Смешивание этих соединений с ДНК приводит к формированию комплексов путем электростатического взаимодействия, причем поверхность образовавшихся структур оказывается положительно заряженной.

Эти комплексы связываются с поверхностью клеток и, в конечном счете, ею поглощаются. На следующей стадии, как правило, требуется высвобождение ДНК из внутриклеточных везикул, с тем чтобы достичь «таргетных» ДНК, РНК или белков. Эксперименты по генотерапии показали, что высвобождение ДНК из эндосом и лизосом в цитоплазму может быть облегчено под действием молекул, которые повреждают или разрушают биологические мембраны [21].

Лекарства на основе ДНК. Благодаря своей разнообразной биологической активности, ДНК может использоваться в качестве фармацевтического средства для лечения самых разнообразных патологий. Широкое применение ДНК видится в области генотерапии, предусматривающей лечение заболеваний путем коррекции функционирования мутантных («болезнетворных») генов или путем введения в организм терапевтических генов [22–24].

К настоящему времени по всему миру уже проведено более полутора тысяч клинических испытаний препаратов для генотерапии [25]. Чаще всего пытались лечить рак (64,5%), сердечно-сосудистые заболевания (8,7%) и моногенные врожденные патологии (8,2%). Большинство испытаний закончилось в фазе I. В клеткимишени вводились гены антигенов, цитокинов, опухолевых супрессоров, факторов роста. Вирусные векторы применялись в 75% случаев. В 18% случаев использовалась голая плазмидная ДНК, в 7% случаев ДНК в комплексе с липидами. Полимерные и неорганические векторы на основе наночастиц пока в основном находятся на доклинической стадии изучения.

В дополнение к функции хранения информации, необходимой для синтеза иРНК и белка, ДНК может выступать в роли биологически активного вещества. Например, одноцепочечная ДНК может комплементарным образом специфически соединяться с цепью другой ДНК или РНК и интерферировать с функцией этих нуклеиновых кислот. Живые организмы используют взаимодействие ДНК с белком во многих биологических процессах. Примером может служить регуляция экспрессии генов, которая контролируется путем присоединения белковых факторов транскрипции к их сайтам связывания в геномной ДНК. В такие взаимодействия можно вмешиваться, вводя извне ДНК с подходящими характеристиками [26].

Различные типы природных и химически модифицированных ДНК предлагаются в качестве возможных фармацевтических средств. Эти категории нуклеиновых кислот включают антисмысловые ДНК, «decoy-ОДН», дезоксирибозимы, аптомеры, Cp-ДНК [16, 27]. Эти соединения проявляют свою фармакологиДНК ческую активность путем взаимодействия со своими молекулами-мишенями. Антисмысловые ДНК предназначены для избирательного связывания с комплементарной иРНК. При этом функция белка, транслируемого с этой иРНК, блокируется.

ecoy-ОДН – короткие (10 пар оснований) двухцепочечные «ДНК-ловушки» для факторов транскрипции, таких как, например, ядерный фактор кВ. Связывание ДНК-ловушкой фактора транскрипции обрывает контролируемый этим фактором сигнальный путь [28, 29]. Когда ДНК связывается с другими белками (а не c факторами транскрипции) и модулирует их функции, она называется аптамером. В качестве аптамеров изучаются ДНК, РНК, химически модифицированные нуклеиновые кислоты и их гибриды размером от 20 до сотен нуклеотидов [30, 31].

В случае повреждения клеток или их гибели ДНК, которая сохраняется в ядре и митохондриях, высвобождается из клеток во внешнюю среду. Находящиеся здесь ДНК-деградирующие ферменты быстро расщепляют эту ДНК на мелкие фрагменты.

Кроме того, некоторые клетки, такие как макрофаги, дендритные клетки и эндотелиальные клетки печени, обладают способностью поглощать внеклеточную ДНК и разрушать ее с помощью лизосомных ДНКаз [32]. Так или иначе, концентрация ДНК вне клеток в норме поддерживается на очень низком уровне [33].

Если гомеостаз нарушается и содержание ДНК в цитоплазме или внеклеточном пространстве повышается, это служит «сигналом опасности» [34]. Количество внеклеточной ДНК увеличивается при различных патологиях, включая рак, ревматоидные артриты, аутоиммунные заболевания [35]. Недавно было показано, что связывание антимикробного пептида 37 с гомологичной ДНК повышает ее устойчивость к нуклеазам и превращает этот инертный биополимер в мощный триггер продукции интерферона [36]. Эти данные указывают на то, что ДНК становится биоактивным соединением как только ее стабильность в биологических жидкостях повышается.

Очень опасно, когда в организм человека проникают патогенные бактерии и вирусы. Для распознавания таких атак врожденная иммунная система человека и животных использует olllike-рецепторы (R) – семейство высококонсервативных белрецепторы R) ) ков, которые эволюция создала для самозащиты млекопитающих [37–39]. R распознают структуры уникальные для микробных патогенов, в том числе липополисахариды, пептидогликаны, двухцепочечные вирусные РНК.

Известно, что ДНК млекопитающих и микроорганизмов различаются по своей первичной структуре. Одно из отличий состоит в том, что в ДНК млекопитающих С5-положение цитозина в Cp-динуклеотидах метилировано [5]. Кроме того, частота встрединуклеотидах чаемости Cp-динуклеотидов в ДНК млекопитающих намного меньше теоретически ожидаемой величины. Этого не наблюдается в случае бактериальных и вирусных ДНК. Обе содержат неметилированные Cp-динуклеотиды (Cp-мотивы) с частотой, близкой к ожидаемому уровню. Указанное различие в частоте встречаемости Cp-мотивов в ДНК млекопитающие используют для обнаружения внедренных в них патогенных микроорганизмов. При этом рецепторами для Cp-мотивов служат молекулы R9. Связывание Cp-мотива с R9 в считанные минуты мобилизует врожденную иммунную систему на противостояние с патогенами.

Под воздействием Cp-ДНК стимулируется ответ по типу h1, оптимальный для защиты от внутриклеточных патогенов.

Так, активация реакций естественного иммунитета, наблюдаемая при введении одной дозы Cp-ДНК, обеспечивает защиту в течение 2–4 недель против летальных доз многих патогенов, включая Listeria onocytogenes, Franciella tularensis, Plasmodium malaria, возбудителя лейшманиоза и шистосоматоза [40].

Иммуностимулирующие ОДН обладают разнообразными терапевтическими эффектами: обеспечивают защиту от инфекционных агентов, действуют как вакцинные адьюванты, предотвращают развитие аллергий, эффективны при иммунотерапии опухолей. Противоопухолевый иммунный ответ, регистрируемый после введения Cp-ДНК, характеризуется преимущественно активацией дендритных клеток, NK-клеток, макрофагов и цитотоксических Т-лимфоцитов [41].

Из наиболее известных противоопухолевых препаратов следует отметить ProMuneTM, в основе которого лежит Cp-7909 (P-3512676) – синтетический фосфоротиоатный ОДН. Препарат разработан фирмой «Coley Pharmaceutical roup» для терапии рака. По последним данным, Cp-7909 успешно зарекомендовал себя при лечении химиорезистентной острой Т-клеточной лимфомы [42]. Результаты весьма впечатляющие: монотерапия привела к полной ремиссии у 32% пациентов; общий ответ – 78% (n = 28).

Новое направление противоопухолевой терапии – использование дендритных клеток, обработанных in vitro Cp-ОДН c послеОДН дующим возвращением в организм пациента. Ученые-онкологи признают, что такой подход является мощным резервом лечения больных злокачественными новообразованиями [41].

Cp-ДНК можно использовать не только для терапии разДНК личных заболеваний, но и для их профилактики, в частности, в качестве адьюванта для вакцин против инфекционных агентов, рака и аллергии [40].

Одно из наиболее интересных и практически значимых свойств Cp-ДНК – ее способность значительно повышать уроДНК вень иммунного ответа даже на очень низкоиммуногенные антигены. ДНК по этому показателю превосходит адъювант Фрейнда. Адъювантную активность Cp-ДНК объясняют ее способностью опосредованно через дендритные или другие антигенпрезентирующие клетки активировать секрецию цитокинов -хелперами 1-го типа. Кроме того, преимуществом CpДНК является то, что в отличие от адъюванта Фрейнда это вещество не обладает выраженной токсичностью [43]. Огромным преимуществом Cp-ДНК как адьюванта является его способДНК ность стимулировать иммунитет у людей со слабым иммунитетом, таких как пожилые люди и младенцы.

Предпринимаются попытки использовать Cp-ДНК для борьДНК бы с вирусом гриппа. В одном из последних исследований на мышиной модели гриппа установлено, что добавление адьюванта JVR-100 (инкапсулированная в липосому плазмидная ДНК) к вакцине против пандемического вируса гриппа H5N1 индуциN1 N11 рует противовирусный ответ, соответствующий ответу на вакцину без адьюванта, концентрированную в 30 раз [44].

Cp-ДНК способна проявлять иммуностимулирующую активДНК ность даже в присутствии других адьювантов. Так, на моделях мышей, морских свинок и обезьян показано, что при добавлении Cpк вакцине Biohrax (антиген Bacillus anthracis, сорбированный на гидроксид алюминия) титр антител против возбудителя сибирской язвы повышается в 10 раз. А саму вакцину можно разводить в 510 раз с сохранением полной защиты от возбудителя [45].

К настоящему времени опубликовано более 600 протоколов доклинического изучения адьювантных свойств Cp-ОДН. В резульОДН.

тате применения этих адьювантов титр антител повышается на 23 порядка. Время формирования иммунитета сокращается в 23 раза. Сейчас проходят клинические испытания Cp-адьюванты для вакцин против гепатита В, пневмонии, меланомы, рака груди, яичников, саркомы, лимфомы [46]. Все эти исследования подтверждают, что Cp-ОДН повышают как гуморальОДН ный, так и клеточный ответы на вакцины против инфекционных заболеваний и опухолей, причем эффект проявляется даже у иммунокомпромиссных индивидуумов.

В русскоязычной научной литературе из лекарственных препаратов на основе ДНК наиболее часто упоминается «Деринат» – натриевая соль низкомолекулярной нативной ДНК, полученной из молок осетровых рыб, производства ЗАО ФП «Техномедсервис» (г. Москва) [47]. Сотрудниками этого же предприятия разработан препарат «Ферровир» комплекс трехвалентного железа с нативной ДНК осетровых рыб. НПФ «Фармзащита» выпускает препарат «Дезоксинат», представляющий собой 0,25%ный раствор натриевой соли частично деполимеризованной ДНК, выделенной из молок осетровых рыб. Область применения этих препаратов весьма обширна: кардиология, пульмонология, онкология, вирусология, дерматология, хирургия, педиатрия, иммунология, гематология.

Следует подчеркнуть, что иммуностимулирующие свойства ДНК, полученных из молок осетровых и лососевых рыб, не связаны, по-видимому, с наличием Cp-мотивов, а обусловлены актимотивов, вацией недавно открытого рецептора цитоплазматической двухцепочечной ДНК, названного IN (timulator of IN enes) [48]. Активация этого рецептора запускает каскад внутриклеточных реакций, ведущих к мощной продукции интерферонов.

Считается, что предназначение рецептора IN – сигнализировать о появлении в цитоплазме геномной ДНК, что случается при повреждении или неконтролируемой гибели клеток.

Заключение. Совокупность изложенных материалов позволяет заключить, что ДНК, помимо функции хранения генетической информации, может выступать как биологически активное вещество.

Благодаря этому на основе природных ДНК и синтетических ОДН создан широкий спектр препаратов, перспективных для применения при генотерапии различных заболеваний, а также стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета. Лекарственные формы таких препаратов в большинстве случаев представляют собой короткие одноцепочечные фосфоротиоатные ДНК, рекомбинантные плазмидные ДНК, в том числе обогащенные Cp-мотивами, коммотивами, плексы Cp-ДНК с катионными соединениями. Некоторые из них уже прошли стадии клинических испытаний. Несмотря на ряд неудач, клинические исследования в целом подтвердили эффекты, выявленные в экспериментах на животных, и указали направление дальнейших исследований. При этом большинство исследователей уверены, что при условии решения проблемы направленной доставки и контролируемого высвобождения ДНК и ОДН в клеткахмишенях практическая медицина обогатится арсеналом высокоэффективных лекарственных средств различного назначения.

Литература

1. Park, S. H. tepwise self-assembly of NA tile lattices using dsNA bridges /. H. Park,. inkelstein,. H. aBean // J. Am. Chem. oc. – 2008. – Vol. 130, N 1. – P. 40–41.

2. A 5-fluorouracil-loaded pH-responsive dendrimer nanocarrier for tumor targeting / Y. Jin [et al.] // Int. J. Pharm. – 2011. – Vol. 420, N 2. – P. 378–384.

3. Виноградова, О. А. Принципы ДНК-архитектоники – конструирования нанообъектов на основе ДНК / О. А. Виноградова, Д. В. Пышный // Успехи химии. – 2012. – Т. 81, № 2. – С. 130–157.

4. Jungann, R. Nanoscale imaging in NA nanotechnology / R. Jungmann, M. cheible,. C. immel // WIREs Nanomed. Nanobiotechnol. – 2012. – Vol. 4. – P. 66–81.

5. Krieg, A. M. Cp motifs in bacterial NA and their immune effects / A. M. Krieg // Annu. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 20. – P. 709–760.

6. irect measurement of the interaction force between immunostimulatory Cp-NA and R9 fusion protein /. C. Klein [et al.] // J. Mol. Rec. – 2012. – Vol. 25. – P. 74–81.

7. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2--methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA / A. rnweller [et al.] // Nucleic Acids Res. – 2003. – Vol. 31. – P. 3185–3193.

8. Ray, A. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future / A. Ray, B. Norden // AEB J. – 2000. – Vol. 14. – P. 1041–1060.

9. Inhibition of expression of the multidrug resistance-associated P-glycoprotein of by phosphorothioate and 5 cholesterol-conjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides /. K. Alahari [et al.] // Mol. Pharmacol. – 1996. – Vol. 50, N 4. – P. 808–819.

10. Effect of phosphorothioate modification of oligodeoxynucleotides on specific protein binding /. A. Brown [et al.] // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269. – P. 26801–26805.

11. Mahato, R. I. evelopment of targeted delivery systems for nucleic acid drugs / R. I. Mahato, Y. akakura, M. Hashida // J. rug arget. – 1997. – Vol. 4. – P. 337–357.

12. NA nanomedicine: Engineering NA as a polymer for therapeutic and diagnostic applications / M. J. Campolongo [et al.] // Adv. rug eliv. Rev. – 2010. – Vol. 62, N 6. – P. 606–616.

13. Elsabahy, M. Non-viral nucleic acid delivery: key challenges and future directions / M. Elsabahy, A. Nazarali, M. oldvari // Curr. rug eliv. – 2011. – Vol. 8, N 3. – P. 235–244.

14. A syringe-focused ultrasound device for simultaneous injection of NA and gene transfer / Y. i [et al.] // J. ene Med. – 2012. – Vol. 14. – P. 54–61.

15. he spread of transgene expression at the site of gene construct injection / A. J. Hara [et al.] // Muscle Nerve. – 2001. – Vol. 24. – P. 488–495.

16. Fattal, E. cular delivery of nucleic acids: antisense oligonucleotides, aptamers and siRNA / E. attal, A. Bochot // Adv. rug eliv. Rev. – 2006. – Vol. 58, N 11. – P. 1203–1223.

17. Aihara, H. ene transfer into muscle by electroporation in vivo / H. Aihara, J. Miyazaki // Nat. Biotechnol. – 1998. – Vol. 16. – P. 867–870.

18. Labert, G. Nanoparticulate systems for the delivery of antisense oligonucleotides /. ambert, E. attal, P. Couvreur // Adv. rug eliv. Rev. – 2001. – Vol. 47. – P. 99–112.

19. elivery of NA vaccines: an overview on the use of biodegradable polymeric and magnetic nanoparticles /.. iang [et al.] // WIREs Nanomed.

Nanobiotechnol. – 2010. – Vol. 2, N 3. – P. 205–218.

20. argeted liposomes to deliver NA to cells expressing 5-H receptors / V. opal [et al.] // Int. J. Pharm. – 2011. – Vol. 419. – P. 347–354.

21. Wagner, E. Application of membrane-active peptide for nonviral gene delivery / E. Wagner // Adv. rug eliv. Rev. – 1999. – Vol. 38. – P. 279–289.

22. Mulligan, R. C. he basic science of gene therapy / R. C. Mulligan // cience. – 1993. – Vol. 260. – P. 926–932.

23. Naldini, L. A comeback for gene therapy /. Naldini // Science. – 2009. – Vol. 326. – P. 805–806.

24. ene therapy: therapeutic applications and relevance to pathology /. Both [et al.] // Pathology. – 2011. – Vol. 43, N 6. – P. 642–656.

25. Sunshine, J. C. Advances in polymeric and inorganic vectors for nonviral nucleic acid delivery / J. C. unshine, C. J. Bishop, J. J. reen // herap. eliv. – 2011. – Vol. 2. – P. 493–521.

26. Wagner, R. W. ene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides / R. W. Wagner // Nature. – 1994. – Vol. 372. – P. 333–335.

27. BN nanospheres as Cp N carriers for activation of toll-like receptor 9 / C. Zhi [et al.] // J. Mater. Chem. – 2011. – Vol. 21. – P. 5219–5222.

28. Toita, N. ranscription factors as molecular targets: molecular mechanisms of decoy N and their design / N. omita,. gihara, R. Morishita // Curr.

rug argets. – 2003. – Vol. 4. – P. 603–608.

29. De Stefano, D. ustained inhibition of I-6 and I-8 expression by decoy N to N-kB delivered through respirable large porous particles in Pstimulated cystic fibrosis bronchial cells /. e tefano // J. ene Med. – 2011. – Vol. 13. – P. 200–208.

30. Nijee, S. M. Aptamers: an emerging class of therapeutics /. M. Nimjee, C. P. Rusconi, B. A. ullenger // Annu. Rev. Med. – 2005. – Vol. 56. – P. 555–583.

31. HMA-targeted phosphorothioate NA aptamers increase sensitivity to gemcitabine chemotherapy in human pancreatic cancer cell lines / M. Watanabe [et al.] // Cancer ett. – 2012. – Vol. 315, N 1. – P. 18–27.

32. ignificant role of liver sinusoidal endothelial cells in hepatic uptake and degradation of naked plasmid NA after intravenous injection / J. Hisazumi [et al.] // Pharm. Res. – 2004. – Vol. 21. – P. 1223–1228.

33. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid NA by conventional and hydrodynamics-based procedures / N. Kobayashi [et al.] // J. Pharmacol. Exp. her. – 2001. – Vol. 297. – P. 853–860.

34. Skoberne, M. anger signals: a time and space continuum / M. koberne, A.. Beignon, N. Bhardwaj // rends Mol. Med. – 2004. – Vol. 10. – P. 251–257.

35. Increased plasma NA integrity in cancer patients / B.. Wang [et al.] // Cancer Res. – 2003. – Vol. 63. – P. 3966–3968.

36. Plasmacytoid dendritic cells sense self-NA coupled with antimicrobial peptide / R. ande [et al.] // Nature. – 2007. – Vol. 449. – P. 564–569.

37. Takeda, K. oll-like receptors / K. akeda,. Kaisho,. Akira // Annu.

Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 21. – P. 335–376.

38. Jaes, C. Pathogen sensing in innate immunity / C. James, K. Ward // Expert. Rev. Vaccines. – 2010. – Vol. 9, N 1. – P. 19–21.

39. Друцкая, М. С. Врожденное распознавание вирусов / М. С. Друцкая, П. В. Белоусов, С. А. Недоспасов // Молекуляр. биология. – 2011. – Т. 45, № 1. – С. 7–19.

40. Серебряная, Н. Б. ДНК как иммуностимулятор / Н. Б. Серебряная, А. А. Новик // Мед. иммунол. – 2001. – Т. 3, № 1. – С. 27–34.

41. Беседнова, Н. Н. Противоопухолевое действие экзогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты / Н. Н. Беседнова, Л. Н. Федянина // Тихоокеан. мед.

журн. – 2009. – № 3. – С. 12–18.

42. Phase I trial of a oll-like receptor 9 agonist, P-3512676 (CP 7909), in patients with treatment-refractory, cutaneous -cell lymphoma / Y. H. Kim [et al.] // J. Am. Acad. ermatol. – 2010. – Vol. 63. – P. 975–983.

43. Беседнова, Н. Н. Действие дезоксирибонуклеиновой кислоты прокариот на гуморальные и клеточные факторы врожденного и адаптивного иммунитета позвоночных / Н. Н. Беседнова, Т. С. Запорожец // Тихоокеан. мед.

журн. – 2009. – № 3. – С. 8–12.

44. Cationic liposome-NA complexes (CC) adjuvant enhances the immunogenicity and cross-protective efficacy of a pre-pandemic influenza A H5N1 vaccine in mice /. onga [et al.] // Vaccine. – 2012. – Vol. 30. – P. 254–264.

45. Marked enhancement of the immune response to Biohrax® (Anthrax Vaccine Adsorbed) by the R9 agonist CP 7909 in healthy volunteers /. Rynkiewicz [et al.] // Vaccine. – 2011. – Vol. 29. – P. 63136320.

46. Cp NA as a vaccine adjuvant / C. Bode [et al.] // Expert. Rev. Vaccine.

2011. Vol. 10. P. 499511.

47. Лекарственные препараты и биологически активные добавки к пище на основе нуклеиновых кислот различного происхождения / Л. Н. Федянина [и др.] // Тихоокеан. мед. журн. 2007. № 4. С. 912.

48. Barber G. Cytoplasmic NA innate immune pathways /. Barber // Immunol. Rev. – 2011. – Vol. 243. – P. 99108.

–  –  –

Laboratory of nucleic copounds biotechnology he article is the mini review concerning application of NA as therapeutic agents. pecial attention was given to matters of efficient NA-delivery to target cells and NA-mediated stimulation of innate and adaptive immunity.

УДК 579.22:577.152.3 Ж. Ф. ЦИРКУНОВА1, Р. В. МИХАЙЛОВА1, А. Г. ЛОБАНОК1, Д. В. ВОЙТКА2, Л. И. ПРИЩЕПА2, Е. Н. ЯНКОВСКАЯ2

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

Лаборатория ферментов Института микробиологии НАН Беларуси, Институт защиты растений НАН Беларуси В результате проведенных исследований изучена способность 17 штаммов энтомопатогенных грибов, принадлежащих к родам Lecanicilliu, Beauveria, Paeciloyces синтезировать гидролитические ферменты. Установлено, что все протестированные культуры в условиях опыта синтезируют комплекс гидролитических ферментов. Состав комплекса и уровень образования гидролаз варьируется у разных грибов и зависит от состава питательной среды. Максимальный уровень образования хитиназ, протеаз, амилаз, -глюканаз, целлюлаз и ксиланаз отмечен у Lecanicilliu lecanii ПV-1, хитозаназ – Beauveria bassiana 21-Б.

Введение. Энтомопатогенные микроорганизмы, в том числе грибы, – естественные регуляторы численности насекомых в природе. Отличительная особенность энтомопатогенных грибов заключается в их способности проникать в организм насекомых через кутикулу. В составе кутикулы содержатся белки, хитин и липиды, поэтому для преодоления этого барьера энтомопатогенные грибы должны продуцировать ферменты, расщепляющие указанные полимеры. В ряде работ продемонстрирована коррелятивная связь между активностью грибных ферментов и вирулентностью грибов [1–4].

Первое детальное изучение ферментов энтомопатогенных грибов было проведено Хубером [5]. В культуральной жидкости (КЖ) Beauveria bassiana, Metarhizlium anisopliae и Cordyceps militaris он обнаружил липазы, протеазы, хитиназы и другие ферменты. Грибы могли использовать в качестве единственного источника углерода животные жиры, гликоген, белки, хитин, крахмал, декстрин, свободные аминокислоты и ряд других органических веществ. Установлено, что характер образования ферментов энтомопатогенных грибов видоспецифичен и зависит от состава питательных сред и способа культивирования [6].

Цель исследования – изучение способности энтомопатогенных грибов синтезировать внеклеточные гидролитические ферменты.

Материалы и методы исследования. Объектами исследований служили 15 штаммов энтомопатогенных грибов, принадлежащих к родам Lecanicilliu, Beauveria, Paeciloyces, выделенных, идентифицированных и охарактеризованных по вирулентности в Институте защиты растений, а также два штамма – P. borysthenicus CMPPB-99 и P. tenuipes № 1, полученные от Б. А. Борисова.

Грибы рода Lecanicilliu выделены из личинок зеленой переной сиковой тли (Lecanicilliu lecanii B-1), цист картофельной нематоды (Lecanicilliu lecanii ПV-1), гусениц бабочки-совки (Lecanicilliu lecanii m.). Биологическая эффективность этих культур по отношению к персиковой тле составляет 40–99%, к паутинному клещу – 92–98%.

Все используемые в работе штаммы Paeciloyces fuosoroumosoroseus (= Isaria fuosorosea Wize) выделены из почвы по методу «насекомого-ловушки» с использованием гусениц большой восковой моли Galleria ellonella. Установлено, что эти грибы вирулентны по отношению к гусеницам большой восковой моли, гибель насекомых составляет 3–40%. Штамм Paeciloyces fumosoroseus 3/1 вирулентен также по отношению к тепличной белокрылке Trialeurodes vaporarioru Westw. (гибель насекомых составляет 77,1–80,0%) и огуречному комарику Bradysia brunnipes Mg. (гибель – 71,5–83,3%).

Грибы рода Beauveria выделены из имаго колорадского жука (Beauveria bassiana 21-Б), гусениц кольчатого шелкопряда (Beauveria bassiana 01-Б), пораженной куколки майского хруща Melolontha melolontha F. (Beauveria bassiana М-07).

Способность грибов продуцировать внеклеточные гидролитические ферменты проверяли при их глубинном культивировании на различных средах. Среда 1 содержала (г/л): нативный крабовый хитин – 5,0; KN3 – 8,0; KH2P4 – 1,0; Mg4·7H2 – 0,5; KCl – 0,5; 20 мл экстракта солодовых ростков; 2 мл 0,05%ного раствора e4·7Н2О, 2,6 мл 0,044%-ного Mn4·5Н2О, 2мл 0,15%-ного раствора Zn4. Среда 2 вместо нативного крабового хитина содержала свекловичный жом (20 г/л) и KN3 в качестве источника азота. Среда 3 содержала свекловичный жом (20 г/л) и (NH4)24 (5,2 г/л).

Экстракт солодовых ростков получали по методу Фертман и Гирса [7].

В качестве посевного материала использовали водную споровую суспензию, полученную после роста грибов на агаре Чапека при 24–26 °С в течение 14 сут, в количестве 1,0–5,0 107 спор на 50,0 мл питательной среды. Подсчет спор проводили в камере Горяева [8].

Грибы культивировали глубинным способом в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке (180–200 об/мин), при температуре 24–26 °С. Длительность глубинного культивирования – 4–5 сут.

По окончании культивирования биомассу грибов отделяли фильтрованием, а КЖ использовали для анализов. Белок определяли по методу Бредфорд [9]. рН измеряли потенциометрически.

Активность внеклеточной протеазы определяли спектрофотометрическим методом [10]. Субстратом для определения кислой протеазы служил 2%-ный раствор гемоглобина (рН 3,0), для щелочной протеазы – 2%-ный раствор казеина (рН 8,0). За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое в условиях реакции давало прирост оптической плотности на 0,01. Протеолитическую активность выражали в ед/мл среды или ед/мг биомассы.

Активность внеклеточной хитиназы определяли по количеству образующихся при гидролизе коллоидного хитина восстанавливающих сахаров по методу [11]. За единицу активности принимали количество фермента, дающее в результате 60 мин гидролиза коллоидного хитина при 40 °С и рН 5,0 количество редуцирующих веществ, эквивалентное 1 мг N-ацетил--глюкозамина.

Хитозаназную активность измеряли методом [11]. Активность фермента выражали в мг/мл -глюкозамина, образовавшегося после 60 мин инкубации субстрата с ферментным раствором при 40 °С и рН 5,0.

Целлюлазную, амилазную, ксиланазную и -глюканазную активность определяли, используя в качестве субстратов натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, растворимый крахмал, ксилан и ячменный -глюкан соответственно. Методы основаны на фотометрическом определении редуцирующих сахаров, образующихся в результате действия ферментов на субстраты.

За единицу амилазной активности принимали активность амилазы, дающую в результате 1 мин гидролиза крахмала при 30 °С и рН 6,9 количество редуцирующих веществ, эквивалентное 1 мкмоль мальтозы.

За единицу целлюлазной активности принято такое количество фермента, при действии которого на субстрат при температуре 40 °С, рН 5,0 в течение 1 мин образуется 1 мкмоль редуцирующих сахаров в пересчете на глюкозу.

За единицу -глюканазной активности принято такое количество фермента, при действии которого на субстрат за 1 мин при температуре 40 °С и рН 5,0 образуется 1 мкмоль редуцирующих сахаров в пересчете на глюкозу.

За единицу ксиланазной активности принято такое количество фермента, при действии которого на субстрат за 1 мин при температуре 40 °С и рН 5,0 образуется 1 мкмоль редуцирующих сахаров в пересчете на ксилозу.

Активность ферментов выражали в ед/мл. Коллоидный хитин готовили из крабового хитина (igma) по методу [11]. Раствор хитозана получали по методу [11].

В работе использовали крабовый хитин (igma) и хитозан (молекулярная масса 495 кДа, степень дезацетилирования 81% (ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково).

Результаты и их обсуждение. При изучении способности энтомопатогенных грибов синтезировать внеклеточные гидролазы в качестве источников углерода использовали нативный хитин и свекловичный жом, а в качестве источников азота – KN3 и (NH4)24 – соответственно физиологически щелочную и кислую соли [12]. Установлено, что активная кислотность КЖ в конце культивирования на средах 1 и 3, содержащих KN3, составила 6,2–7,8, количество белка, синтезированное грибами, находилось в диапазоне 0,215–0,833 и 0,870–2,3 мг/мл соответственно.

При выращивании на среде 1 все продуценты синтезировали хитиназы, хитозаназы, кислые и щелочные протеазы, амилазы и целлюлазы. Что касается -глюканаз и ксиланаз, грибы их либо не синтезировали, либо синтезировали в следовых количествах (табл. 1).

Культивирование энтомопатогенных грибов на среде, содержащей свекловичный жом (среда 2), обеспечивало образование ими комплекса таких ферментов, как хитиназа, хитозаназа, протеаза, амилаза, -глюканаза, ксиланаза. Показано отсутствие синтеза целлюлазы у 70% протестированных культур в условиях опыта (табл. 2).

При выращивании грибов на среде 3 с (NH4)24 в качестве источника азота величина конечного рН КЖ составила 2,7–5,15.

При культивировании грибов на данной среде отмечено, что все исследуемые штаммы продуцировали хитиназы, хитозаназы,

-глюканазы и ксиланазы. Однако 35% протестированных грибов не синтезировали щелочные протеазы, 24% – кислые протеазы, 24% – амилазы и 35% – целлюлазы (табл. 3).

Установлено, что уровень образования гидролитических ферментов зависит от состава питательной среды. Показано, что при культивировании грибов на среде со свекловичным жомом и KN3 (среда 2) происходит более активный синтез хитозаназ, щелочных протеаз, амилаз и целлюлаз, в то время как более оптимальные условия для синтеза -глюканаз и ксиланаз создаются при культивировании грибов на среде 3, а хитиназ – на среде 1.

Максимальный уровень образования хитиназ (0,972 ед/мл, среда 1), целлюлаз (1,395 ед/мл, среда 2), ксиланаз (0,227 ед/мл, среда 3), амилаз (0,214 ед/мл, среда 2) и -глюканаз (0,702 ед/мл, среда

3) отмечен у L. lecanii ПV-1, хитозаназ – B. bassiana 21-Б (0,657 ед/мл, среда 2).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что все протестированные штаммы энтомопатогенных Т а б л и ц а 1. Образование гидролаз энтомопатогенными грибами (среда 1)

–  –  –

1. Павлюшин, В. А. Ферментативная активность и вирулентность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. / В. А. Павлюшин // Микология и фитопатология. – 1977. – Т. 11. – С. 283–289.

2. Xia, Y. regalose hydrolyzing enzymes of Metarhiziu anisopliae and their role in pathogenesis of the tobacco hornworm / Y. ia, J. M. Clarkson, A. K. Charnley // J. Invertebr. Pathol. – 2002. – Vol. 80. – P. 139–147.

3. Charnley, A. K. ungal pathogens of insects: cuticle degrading enzymes and toxins / A. K. Charnley // Adv. Botan. Res. – 2003. – Vol. 40. – P. 241–321.

4. he contribution of surface waxes to pre-penetration growth of an entomopathogenic fungus on host cuticle /.. Jarrold [et al.] // Mycol. Res. – 2007. – Vol. 111. – P. 240–249.

5. Huber, J. Untersuchungen zur Physiologie ensectenttenden Pilze / J. Huber // Arch. Microbiol. – 1958. – Vol. 29. – P. 71–81.

6. Гештовт, Н. Ю. Энтомопатогенные грибы (биотехнологические аспекты) / Н. Ю. Гештовт. – Алматы, 2002. – 288 с.

7. Фертман, Г. Н. Аминокислотный и углеводный состав экстрактов из солодовых ростков / Г. Н. Фертман, В. Т. Гирс // Прикл. биохимия и микробиология. – 1969. – Т. 5, № 5. – С. 563–566.

8. Пименов, М. Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / М. Н. Пименов, Н. Н. Гречушкина, Л. Г. Азова. – М.: МГУ, 1971. – 221 с.

9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72, N 1–2. – P. 248–254.

10. Скрининг мицелиальных грибов-продуцентов протеолитических ферментов / Ж. Ф. Циркунова [и др.] // Материалы VI Междунар. науч. конф.

«Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2–6 июня 2008 г. – Минск: Изд. И. П. Логвинов, 2008. – Т. 1. – С. 276–278.

11. Скрининг мицелиальных грибов – продуцентов хитинолитических ферментов / Ж. Ф. Циркунова [и др.] // Весцi НАН Беларуси. Сер. бiял. навук. – 2010. – № 1 – C. 62–64.

12. Билай, В. И. Основы общей микологии / В. И. Билай. – Киев: Вища школа, 1980. – 360 с.

Zh. F. TSYRKUNOVA1, R. V. MIKHAILOVA1, A. G. LOBANOK1, D. V. VOITKA2, L. I. PRISHCHEPA2, E. N. YANKOVSKAYA2

HYDROLYTIC ENZYMES OF ENTOMOPATHOGENIC FUNGI

Laboratory of enzyes, Institute of Microbiology, National Acadey of Sciences of Belarus, Institute of Plant Protection, National Acadey of Sciences of Belarus he completed investigation allowed to evaluate capacity of 17 entomopathogenic fungal strains belonging to genera Lecanicilliu, Beauveria, Paeciloyces to produce hydrolytic enzymes. It was found that all tested cultures synthesized a complex of hydrolytic enzymes under experimental conditions. Composition of enzyme complex and level of hydrolase generation varied in different fungi and depended on ingredients of the nutrient media. Maximal values of produced chitinases, proteases, amylases, -glucanases, cellulases, xylanases were recorded in Lecanicilliu lecani ПV-1, chitosanases – in Beauveria bassiana 21-Б.

УДК 579.66115

А. В. ИЖИК, Г. И.

НОВИК

БАКТЕРИАЛЬНАЯ ГИСТАДГЕЗИЯ:

РОЛЬ СОЕДИНЕНИЙ ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ

Лаборатория «Коллекция микроорганизмов»

Обзор посвящен механизмам бактериальной гистадгезии, роли соединений липидной природы в механизме адгезии пробиотических бактерий в кишечнике, а также методам изоляции и изучения полярных липидов.

Введение. Бактериальная гистадгезия – это процесс взаимодействия представителей эндотрофной микрофлоры человека с поверхностными структурами слизистой оболочки (в кишечнике муцин, гликокаликс, щеточная каемка эпителия) с целью фиксации микроорганизмов в приемлемом для них микробиотопе или его ярусе без нарушения целостности эпителиальных клеток. В механизме бактериальной гистадгезии в кишечнике принимают участие различные структуры клеточной стенки представителей нормофлоры (белки, гликопротеины, гликолипиды, липополисахариды). Актуальным является изучение структуры данных соединений, их роли в механизме гистадгезии, а также поиск простых и эффективных методов их изоляции и анализа.

Бактериальная гистадгезия лежит в основе формирования любого, в том числе кишечного, микробиоценоза и представляет собой ряд последовательно протекающих стадий. В зависимости от последовательности и завершенности, а также от предпочтительной локализации, силы фиксации и разности в распределении популяций в пристеночном слое или полости бактериальную адгезию можно разделить на отдельные стадии: условную, незавершенную или завершенную [1, 2]. Гистадгезию можно считать завершенной, если бактерии, преодолев позиции условной и незавершенной гистадгезии, далее целенаправленно как биологический объект проникают в нижележащий слой муцинового геля, взаимодействуя с гликокаликсом и щеточной каемкой эпителия. Такой тип адгезии характерен для ограниченного числа представителей эубиотических, паразитарных или оппортунистических видов (штаммов), для которых фиксация на слизистой поверхности является условием существования [3–5].

Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, могут находиться как на поверхности слизистой оболочки кишечника, будучи с ней связанными (индигенная, мукозная или М-флора), так и в просвете кишки (просветная, полостная или П-флора) [6–8]. Представители М-флоры фиксируются к строго определенным рецепторам эпителиальных клеток. Число таких рецепторов на эпителиальных клетках ограничено. Это подтверждается наблюдениями, свидетельствующими о том, что предварительная обработка мишеней лектином или адгезинами бактерий резко снижает количество микроорганизмов, способных фиксироваться на преинкубированных клетках [9, 10].



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«3.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS AGROECOLOGY АГРОЭКОЛОГИЯ Красноперова Е. А., Юлдашбаев Ю. А., Гала Krasnoperova E. A., Yuldashbaev Yu. A., Galatov A. N. тов А. Н. Методологические аспекты экологиза Methodological aspects of ag...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Капцегайтуйская средняя общеобразовательная школа" Рассмотрено Утверждаю На заседании МС Директор МБОУ "Капцегайтуйская СОШ" Протокол № /Н.А.Волгина/ ""_2016 г. Приказ №_ от ""_2017г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА КУРСА "биология" 9 класса...»

«Светлик Михаил Васильевич РОЛЬ ВЫСОКОЧАСТОТНОЙ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЗГА – ГАММА-РИТМА В ПРОЦЕССАХ ВОСПРИЯТИЯ ВРЕМЕНИ 03.00.13 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 20...»

«Аннотация проекта (ПНИЭР), выполняемого в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы" Номер...»

«Для экологического номера Journal of Eurasian Research в 2004 г. Экологическое образование в сообществах Евгений Патаракин, Сергей Шустов Ключевые слова: экологическое образование, сетевые сообщества Введение В последнее время экологическое образование переживает тр...»

«Межгосударственная кластерная интеграция. Санкт-Петербургский Кластер Чистых технологий для городской среды. Interstate cluster integration. Saint-Petersburg Cleantech Cluster for urban environment. Миссия Кластера Mission of the Cluster Cделать Санкт-Петербург Making St. Petersburg экологичным и безопасным envi...»

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 95–100. УДК 615.32 + 582.565.2 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СОКА КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ (CALLISIA FRAGRANS WOOD.) И ЕГО АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ (IN VITRO) * Д.Н. Оленников 1, И.Н. З...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Сорокина Н.В. Териология Учебно-методический комплекс. Рабочая программа для с...»

«Topical issues of law: theory and practice. №26. 2013 вопорядка как объективную необходимость развития государства и общества. Охарактеризованы особенности правоохранительной деятельности по обеспечению внутренней безопасности страны, присущая взаимодействию правоохранительных органов различных ветвей власти. Ключевые сл...»

«59 Biological Bulletin УДК 591.526:598.113.6 Ю. В. Кармышев1, А. Н. Ярыгин2 РЕПРОДУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ НАСТОЯЩИХ ЯЩЕРИЦ (LACERTIDAE) УКРАИНЫ 1Мелитопольский государственный педагогический университет имени Богдана Хмельницкого 2Институт Зоологии и...»

«Администрация города Нижнего Новгорода Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Школа №138"Рассмотрено: Согласовано: Утверждаю: на заседании ШМО Заместитель директора Директор протокол №1 от _Т.Г...»

«Гончаров Владимир Михайлович АГРОФИЗИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВ В КОМПЛЕКСНОМ ПОЧВЕННОМ ПОКРОВЕ Специальность: 06.01.03 – агрофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В....»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 77–97 УДК [597.6+598.1](571.1) Л.А. Эпова1, В.Н. Куранова2, С.Г. Бабина1 Государственный природный заповедник "Кузнецкий Алатау" (г. Междуреченск)...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра геоморфологии и геоэкологии Формирование геолого-геоморфологических понятий...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 12. 10. 2016 459 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Устранение технических ошибок в правоустанавливающих документах о предоставлении земельного участка, принятых органами местного самоуправления...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Учебная ознакомительная практика студентов II курса, специализирующихся на кафедре молекулярной биологии, является составной частью учебного процесса и направлена на подготовку квалифицированных специалистов в обл...»

«ООО "РЗА СИСТЕМЗ" г. Москва Щиты оперативного постоянного тока серии ШОТ1М с ограниченными функциональными характеристиками РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ ЕАБР.656574.003-01 РЭ 2012 г. Наименование Редакция Дата 03.10.11 г. Версия №0 Оригинальное издание 16.05.12 г. Версия №1 Издание №1 Содержание Лист 1. ВВЕДЕНИЕ 2. НАЗНАЧЕНИ...»

«Содержание программы: 1. Пояснительная записка 2. Требования к уровню подготовки учащихся 3. Учебно-тематический план 4. Содержание тем учебного курса 5. Календарно-тематическое планирование 6. Формы и средства контроля 7. Перечень литературы и учебно-методические средства обучения Пояснительная записка Раб...»

«Зорников Данила Леонидович ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОЙ ЛАКТОФЛОРЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 03.02.03 – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Науч...»

«НАЗАРЕНКО Александр Владимирович СИСТЕМА ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КОМПЕТЕНТНОСТНО-ОРИЕНТИРОВАННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦ...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@water.tu...»

«2011 БЕЛКИ ПЕПТИДЫ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Научный совет по биоорганической химии Учреждения Российской академии наук: Институт биологии Карельского научного центра РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Петрозаводский государственный ун...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, 3 УДК 633.11+633.3:631.559:631.524 О ВЗАИМОСВЯЗИ УРОЖАЙНОСТИ С СОДЕРЖАНИЕМ БЕЛКА В ЗЕРНЕ У ЗЕРНОВЫХ И БОБОВЫХ КУЛЬТУР (обзор литературы) О.В. КРУПНОВА Рассмотрено современное состояние исследований и причины отрицательной корреляции между величиной урожая и белковостью зерна....»

«ISSN 2308-6874 Научно-издательский центр Априори ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА АКТУАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалы IX Международной научно-практической конференции (24 июня 2015 г.) Сборник научных трудов Краснодар УДК 082 ББК 72я431 Т 11 Редакционная коллегия: Бисалиев Р.В., доктор медицинских наук, Астраханский государственный технический уни...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Ка...»

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как и выживаемость, привлекает многих ученых. Однако сами эти понятия в русском языке несут, скорее, естественну...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Казанский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра биохимии и клинико-лабораторной диагностики Факультет: Медико-биологический Специальность: медицинская биохимия Кур...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.