WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

«Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я: член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук Э. И. Коломиец, академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, ...»

-- [ Страница 4 ] --

Проникновение бактерий к эпителию затрудняется поверхностно лежащими слоями гликокаликса и муцина. Это одна из причин того, почему большинство микроорганизмов преимущественно взаимодействует с наружным слизистым слоем, ограничиваясь условной или незавершенной адгезией. Популяции, проникшие к гликокаликсу и щеточной каемке, способны использовать соответствующие сайты мембранных рецепторных зон [11, 12].

Способность штаммов нормофлоры связываться с теми или иными рецепторами поверхности слизистой обеспечивает конкуренцию за эти рецепторы с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [13–15]. Гистадгезивная биоспецифическая комплементарность представляет собой многокомпонентную систему с множеством дублирующих элементов, направленных на поиск и реализацию индивидуальной совместимости штамма и биотопа конкретного хозяина. Так, было показано, что энтеробактерии, лактобациллы и бифидобактерии, вегетирующие во влагалище рожениц, отличались по плазмидному и биохимическому профилю от аналогичных видов, изолированных из мочеполового тракта нерожавших женщин [16–18].

Теории механизма бактериальной адгезии. Первой работой по изучению механизма бактериальной адгезии принято считать эксперименты Дж. Дьюгида из Медицинской школы больницы Найнуэллс в Данди (Великобритания), начатые еще в 1950-е гг.

и показавшие, что некоторые штаммы Escherichia coli прикрепляются к клеткам эпителиальной выстилки тканей и к эритроцитам [19]. Мощным толчком к изучению бактериальной адгезии стало предположение, высказанное в 1977 г. И. Офеком, Д. Мирелманом и Н. Шароном о том, что адгезия бактерий опосредована лектинами на поверхности бактериальной клетки, связывающимися с комплементарными сахарами на клетках организма-хозяина [20, 21]. Механизмы адгезии микроорганизмов весьма разнообразны и включают как неспецифические, так и специфические (лиганд-рецепторные) взаимодействия с участием специальных адгезинов.

Неспецифическая гистадгезия. Согласно ДЛФО-теории, неспецифическая адгезия основана на электростатических и Вандер-Ваальсовых взаимодействиях. Исходя из этой теории, несмотря на отрицательные заряды на поверхности бактериальной клетки и муцинового слоя, адгезия возможна, так как Ван-дерВаальсовы силы сильнее электростатического отталкивания [22, 23]. Однако в настоящее время считается, что ДЛФО-теория применима только к твердым субстанциям, но не к бактериальным клеткам [24]. В теории неспецифической адгезии важную роль отводят гидрофобным молекулам на поверхности бактерии, которые препятствуют электростатическому отталкиванию и позволяют бактериальной клетке приблизиться к отрицательно заряженному муцину. Неспецифическая адгезия объясняется также гидрофобными взаимодействиями и наличием водородных связей [11, 25].

Специфическая гистадгезия. Процессы, отвечающие за специфическую адгезию индигенных микроорганизмов, в последние годы интенсивно исследуются. Основой взаимодействия служит лиганд-рецепторное узнавание, при котором меньшее по размерам и молекулярной массе соединение называют лигандом (адгезины клеточной стенки бактерий), а его более крупный комплементарный партнер рецептором (сайты связывания на энтероцитах).

Каждый бактериальный адгезин подходит к клеточному рецептору мишени как «ключ к замку», поэтому бактерии адгезируют не к любым клеткам, а только к тем, которые имеют соответствующие рецепторы. Однако специфические адгезины характерны и для ряда патогенных микроорганизмов [5, 26–28]. Такая ситуация представляется на первый взгляд очень неоднозначной и является одной из наиболее дискуссионных проблем микроэкологии и медицинской микробиологии. В этот вопрос была внесена ясность, когда при изучении механизма действия различных микробных токсинов было замечено, что рецепторы, ранее рассматривавшиеся как специфичные для некоторых токсинов, на самом деле служат клеткам для распознавания других сигнальных макромолекул, в частности гормонов и ростовых факторов [29, 30].





Более того, между рядом гликопротеидных гормонов и некоторыми токсинами выявилось большое сходство как в их строении, так и в эффекторных функциях, например в способности активировать локализованную в плазматической мембране аденилатциклазу [31].

Бактериальный гликокаликс несет отрицательный заряд и представляет собой фибриллы полипептидной или полисахаридной природы толщиной 7–10 нм, тесно связанные с капсульным веществом. Сиаловые кислоты (N- или -ацетилпроизводные нейраминовой кислоты), -фукоза, N-ацетил--глюкозамин, -, -галактоза, --глюкоза, входящие в состав гликокаликса, способны образовывать специфические рецепторные зоны. Несмотря на видовую неоднородность химического строения оболочки эпителия при физиологических значениях рН концевые олигосахаридные фрагменты всегда отрицательно заряжены (нейраминовая, гиалуроновая кислоты). Чтобы адгезия стала возможной, необходимо предварительное отщепление отрицательно заряженных фрагментов. Соответствующим ферментным аппаратом (нейраминидазы, гиалуронидазы) обладают сахаролитические бактерии, к которым относятся бифидобактерии и молочнокислые бактерии [32].

Бактериальные адгезины соединения белковой, гликопротеиновой, гликолипидной или липополисахаридной природы, которые локализованы на поверхности бактерий или на фимбриях, как у Еscherichia сoli. Адгезины как медиаторы гистадгезии способны проявлять специфическую углеводсвязывающую активность, образуя рецепторные зоны, комплементарные таковым на структурах слизистой оболочки. Показано, что бактерии вида Lactobacillus acidophilus имеют на поверхности лектиноподобные белковые структуры, которые участвуют в процессе адгезии, связываясь с углеводами мукозного слоя тонкого кишечника. Мукозный слой, покрывающий эпителий кишечника, богат гликопротеинами и гликолипидами, которые и образуют углеводные сайты связывания для адгезии бактерий [33, 34].

Бактерии связываются не только с концевыми сахарами поверхностных углеводов, иногда они связываются с моносахаридными остатками, расположенными во внутренней части углеводной молекулы. На клеточной поверхности может быть экспонирована лишь какая-то часть молекулы олигосахарида, и с данной клеткой будут связываться бактерии только одного вида [11, 12, 34, 35].

Поэтому способность клеточных поверхностных сахаров служить местом прикрепления бактерии зависит не только от самого факта их наличия, но также от их доступности и характера их представления. Физико-химические механизмы, обеспечивающие адгезию бактериальных клеток и слизистой оболочки кишечника, еще до конца не изучены, поэтому исследования в данном направлении представляют несомненный интерес. Также актуальны исследования химической структуры бактериальных адгезинов.

Экспериментальные доказательства адгезивных свойств пробиотических бактерий.

Существует три варианта методических подходов к изучению in vitro адгезии микробных клеток к мишеням:

1. Регистрация факта взаимодействия клеток с помощью микроскопа.

2. Приемы культивирования для учета жизнеспособных микроорганизмов, адгезировавших к клеткам-мишеням.

3. Введение изотопной метки (3Н или 18С) и дальнейший учет связавшихся микробных клеток по этой метке.

В работах японских ученых 13 штаммов бифидобактерий были проверены на способность адгезировать к различным типам коллагена, ламинину, фибронектину. Штамм Bidobacteriu adolescentis BB-119 адгезировал к I и V типам коллагена, причем интенсивность связывания падала после обработки бактерий протеазами. Было показано, что адгезия осуществлялась посредством белков с молекулярной массой 36 и 52 кДа, входящих в состав клеточной стенки бифидобактерий данного штамма [36].

В другом эксперименте также 13 штаммов бифидобактерий проверялись на способность адгезировать к клеткам линии Сасо-2 (энтероцитоподобные клетки), а также к слизи, продуцируемой клеткам линии H29-M (секретирующие слизь клетM M ки). Высокий уровень кальцийзависимой адгезии был выявлен у штаммов Bidobacteriu breve 4 и Bidobacteriu infantis 1.

Посредством сканирующей электронной микроскопии было установлено, что бактерии взаимодействуют с микроворсинками на поверхности клеток линии Сасо-2. Адгезия к этим клеткам не является кальцийзависимой, она связана с фактором адгезии белковой природы [37].

При изучении адгезивных свойств различных видов и штаммов лактобацилл к кишечному эпителию крыс, фибронектину, муцину было показано, что только 23% из исследуемых штаммов Lactobacillus ferentu способны к адгезии к кишечному эпителию. Адгезия к муцину показана для 21% штаммов Lactobacillus plantaru. Из исследуемых штаммов Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis и Lactobacillus fermentum с муцином активно связывались некоторые штаммы Lactobacillus ferentu. Сродством к фибронектину (гликопротеин, присутствующий на поверхности кишечного эпителия) обладали 88% лактобацилл. Можно предположить, что многие популяции лактобацилл колонизируют муциновые отложения, не осваивая зону щеточной каемки (незавершенная бактериальная гистадгезия). Но для ряда популяций, способных к завершенной гистадгезии, фибронектин является необходимым рецептором [38]. Адгезивная функция установлена для липополисахаридов, гликолипидов, гликопротеинов, липотейхоевых кислот клеточной стенки бактерий [39].

Полярные липиды пробиотических бактерий. В настоящее время специалисты акцентируют внимание на анализе химической структуры гликоколипидов и фосфолипидов, которые, во-первых, участвуют в адгезии пробиотических микроорганизмов в кишечнике, во-вторых, могут быть использованы в качестве хемотаксономических маркеров для идентификации микроорганизмов различных систематических групп, в-третьих, являются антигенными детерминантами клеток пробиотических бактерий [40–42]. Одним из новых направлений в разработке пробиотических препаратов является изучение возможности использования при лечении дисбиотических нарушений не интактных клеток пробиотических микроорганизмов, а их отдельных структурных компонентов или метаболитов. Нами ранее было показано, что ростстимулирующей активностью по отношению к представителям нормальной микрофлоры обладают препараты клеточных стенок пробиотических бактерий, полисахариды, глико- и фосфолипиды, выделенные из биомассы пробиотических бактерий [43, 44]. Гликолипиды бифидобактерий представлены галактолипидами – моно-, ди-, тригалактозилдиглицеридами, моноацил- и диацилдериватами моногалактозилдиглицеридов и моноацилдериватами дигалактозилдиглицеридов. Моногалактозил- и дигалактозилмоноглицериды представлены в незначительных количествах [45]. Для клеточной стенки лактобацилл характерны моногликозилмоногалактозилдиглицериды (обнаружены у Lactobacillus casei, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermenti) и тригликозилмоногалактозилдиглицериды (обнаружены у Lactobacillus helveticus и Lactobacillus acidophilus).

В клеточной стенке Lactobacillus casei присутствуют также дигликозилмоногалактозилдиглицериды [46, 47]. Основными гликолипидами Lactococcus lactis и пропионовокислых бактерий являются дигликозилглицериды [48]. В составе клеточной стенки Escherichia coli кроме моногликозилмоногалактозилдиглицеридов обнаруживаются также тетраацилгликозилглицериды [49]. Жирные кислоты в составе глицеридов пальмитиновая, стеариновая и олеиновая [50].

Для Bidobacteriu и Lactobacillus различия по составу фосфолипидов, в основном, полиглицеролфосфолипидов и аминоацилфосфатидилглицеролов, являются веским основанием для хемотаксономической дифференциации данных микроорганизмов на уровне рода. Основными фосфолипидами бифидобактерий являются дифосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин и полиглицеринфосфолипиды. В значительно меньших количествах обнаружены моно-, ди-, триацил-, бис-(глицерофосфорил)глицерин, аланилфосфатидилглицерин и фосфатидная кислота [51]. Мажорные фосфолипиды лактобацилл – фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин, лизофосфатидилглицерин. В меньших количествах обнаруживается фосфатидная кислота, дигликозилдиацилглицерин, фосфогликолипиды. Не обнаружен лизофосфатидилглицерол у представителей Lactobacillus delbrueckii и Lactobacillus helveticus [52]. Фосфатидилглицерин характерен для клеточных стенок Propionibacterium, Escherichia coli, у пропионовокислых бактерий обнаружен также фосфатидилэтаноламин [50].

Изучение роли липидных соединений в реализации адгезивной и иммунотропной функций пробиотических микроорганизмов в качестве представителей нормальной микрофлоры и в составе препаратов предполагает поиск эффективных методик изоляции полярных липидов из биомассы бактерий.

Методы изоляции полярных липидов из бактериальной биомассы. Известно множество способов экстракции липидов из клеток пробиотических бактерий с использованием органических растворителей. Среди них метод изоляции гликолипидов из клеток Lactobacillus casei ACC 7469, заключающийся в экстракции бактериальной биомассы метанолом с тремя последующими циклами экстракции в смеси хлороформ-метанол (2:1). Очистка экстракта проводится методом колоночной хроматографии на ephadex G с последующим фракционированием на колонке с EAE целлюлозой [40]. Также известен метод изоляции липидов из клеток Propionibacterium shermanii. Данный метод заключается в четырех последовательных экстракциях биомассы бактерий, которые длятся от 18 до 48 ч. На первой стадии используется смесь хлороформа с метанолом в пропорции 1:1, на последующих этапах – смесь хлороформ-метанол в пропорции 2:1. Очистка липидных фракций выполняется последовательно на колонках с EAE целлюлозой и силикагелем [41]. Известен метод выделения липидов из клеток бифидобактерий, который заключается в трех последовательных экстракциях смесью хлороформ-метанол (2:1), длящихся 2 ч, с последующей очисткой на колонках с ephadex -25 и силикагелем, а также фракционированием на колонке с EAE-целлюлозой [42, 53].

Описаны методики выделения полярных липидов из биомассы молочнокислых бактерий (Lactobacillus, Lactococcus), согласно которым экстракция проводится смесью хлороформ-метанол (2:1) в два этапа (первый 24 ч, второй – 8 ч), затем следует очистка экстрактов на колонке с силикагелем и фракционирование на колонке с EAE-целлюлозой с использованием градиенцеллюлозой та хлороформа в метаноле в качестве элюента [54]. Недостатки всех вышеперечисленных методов: длительность и трудоемкость процедуры экстракции и очистки целевого продукта, использование большого количества органических растворителей, недостаточно высокий выход липидов. Альтернативным методом выделения липидов является экстракция с использованием сверхкритических жидкостей (флюидов). Сверхкритическая флюидная экстракция широко используется для выделения биологически активных компонентов из растительного сырья, однако часть работ также посвящена использованию сверхкритического оксида углерода для изоляции бактериальных компонентов [55, 56].

Сверхкритическая экстракция характеризуется рядом преимуществ по сравнению с классическими методами:

сверхкритические жидкости имеют относительно низкую вязкость и поэтому более эффективно диффундируют в материал, предназначенный для экстракции;

экстрагирующую способность сверхкритических жидкостей можно варьировать, изменяя условия экстракции (температура, давление);

при использовании сверхкритических жидкостей значительно сокращаются сроки экстракции;

при экстракции не используются органические растворители (либо используются в небольших количествах) [57].

Сотрудники лаборатории «Коллекция микроорганизмов»

Института микробиологии НАН Беларуси совместно с Техническим университетом г. Лунд (Швеция) впервые применили метод сверхкритической флюидной экстракции с использованием сверхкритического оксида углерода для изоляции полярных липидов из пробиотических бактерий (Bidobacterium adolescentis, B. longum, B. angulatum, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis) [58–60]. Были подобраны оптимальные условия для изоляции глико- и фосфолипидов из биомассы пробиотических бактерий, при которых выход полярных липидов был в 2–3 раза выше по сравнению с классическими методиками.

Наиболее эффективно проходит экстракция при следующих условиях:

скорость потока оксида углерода – 5 г/мин; температура экстракции – 45 °С; давление – 250 bar; в качестве модификатора – 10% смеси метанол:вода (9:1).

Варьируя время экстракции (2–12 ч), можно выделить главные и минорные гликолипиды из биомассы пробиотических бактерий, а также значимое количество фосфолипидов. Кроме того, установлено, что полярные липиды, выделенные с использованием метода сверхкритической флюидной экстракции, обладают в 20–30 раз большей иммунореактивностью по сравнению с липидами, выделенными классическим методом, что говорит о высокой чистоте липидов и может найти применение в серологической диагностике. Разработанные новые подходы к выделению полярных липидов найдут применение в ходе современных исследований, посвященных биологически активным структурам микроорганизмов-пробиотиков.

Заключение. Изучение структур клеточных стенок бактерий является одним из приоритетных направлений современной биохимии. В настоящее время остаются невыясненными некоторые вопросы, касающиеся взаимодействия представителей нормофлоры и клеток эпителия кишечника, в частности, интерес представляет изучение свойств и функций компонентов клеточной стенки микроорганизмов-пробиотиков.

Исследование структуры и функций бактериальных адгезинов будет способствовать пониманию механизмов реализации положительного эффекта пробиотических микроорганизмов на организм-хозяин. Разработка новых эффективных методик изоляции биологически активных соединений позволит оптимизировать процессы получения соединений из бактериальной биомассы, а также повысить чистоту и качество конечного продукта.

Литература

1. Lu, L. Pathologic and physiologic interactions of bacteria with the gastrointestinal epithelium /. u, W. A. Walker // Am. J. Clin. Nutr. 2001. Vol. 73 (suppl.). – P. 1124–30.

2. Овод, В. В. Адгезивность бактерий / В. В. Овод, А. Е. Вершигора // Успехи соврем. биологии. – 1982. Т. 94, № 2. С. 313–324.

3. Костюкова, Н. Н. Начальный этап инфекционного процесса – канонизация и пути ее предотвращения // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. – 1989. № 9. С. 103–110.

4. Molecular approach for the study of uropathogenesis /. choolnik [et al.] // Bacteria-Host Cell Interaction. New York, 1987. P. 201–211.

5. Сидоренко, С. В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / С. В. Сидоренко // Болезни и возбудители. 2001. № 6. С. 10–24.

6. Бобин, В. Н. Молекулярные аспекты симбиоза в системе хозяин-микрофлора / В. Н. Бобин, О. Н. Минушкин // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998. № 6. – С 76–82.

7. Воробьев, А. А. Бактерии нормальной микрофлоры биологические свойства и защитные функции / А. А. Воробьев, Е. А. Лыкова // Журн. микробиологии. 1999. № 6. С. 102–105.

8. Григорьев, П. Я. Изменения родового состава кишечной микрофлоры и степени обсемененности кишечника бактериологическая характеристика, клиническое значение, вопросы терапии / П. Я. Григорьев, В. И. Коровина // Практикующий врач. 1999. № 3. – С. 14–18.

9. Хавкин, А. И. Пробиотические продукты питания и естественная защитная система организма / А. И. Хавкин // Русс. мед. журнал. 2009.

№ 4. С. 241–245.

10. New binding assay and preparative trial of cell-surface lectin from Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria / A. Matsumura [et al.] // J. airy ci. – 1999. – Vol. 82. – P. 2525–2529.

11. Beachey, E. H. he adherence of bacteria to mucosal surfaces (authors transl.) / E. H. Beachey // Immun. Infect. 1982. Vol. 10, N 2. P. 51–56.

12. Beachey, E. H. Bacterial adherence: adhesin-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surface / E. H. Beachey // J. Infect. is.

1981. Vol. 143, N 3. P. 325–345.

13. Mechanism of colonisation and colonisation resistance of the digestive tract / I. Adlerberth [et al.] // Microb. Ecol. Health is. 2000. N 11.

P. 223–239.

14. Benno, Y. evelopment of intestinal microflora in humans and animals / Y. Benno,. Mitsuoka // Bifidobact. Microflora. 1986. N 5. P. 13–25.

15. Покровский, В. И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь // Вестн. РАМН. 2000. № 11. С. 3–6.

16. Antonio, M. A. he identification of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species / M. A. Antonio,. E. Hawes,.. Hillier // J. Infect. is. 1999. Vol. 180, N 6. P. 1950–1956.

17. A study of the microbial flora of the anterior vagina of normal sows during different stages of the reproductive cycle / M. R Bara [et al.] // Aust. Vet. J. 1993. – Vol. 70, N 7. P. 256–259.

18. Corbishley, C. M. Microbial flora of the vagina and cervix / C. M. Corbishley // J. Clin. Pathol. 1977. Vol. 30, N 8. P. 745–748.

19. Hemagglutination, adherence and surface properties of vaginal Lactobacillus species / A. Andreu [et al.] // J. Infect. is. 1995. Vol. 171, N 5.

P. 1237–43.

20. Ofek, I. Adherence of Escherichia coli to human mucosal cells mediated by mannose receptors / I. fek,. Mirelman, N. haron // Nature. 1977. Vol. 265.

P. 623–625.

21. Firon, N. Interaction of mannose-containing oligosaccharides with the fimbrial lectin of Escherichia coli / N. iron, I. fek, N. haron // Biochem. Biophys.

Res. Commun. 1982. Vol. 105, N 4. P. 1426–1432.

22. Russel, W. B. Colloidal ispersions (Cambridge Monographs on Mechanics) / W. B. Russel,. A. aville, W. R. chowalter. – New York: Cambridge University Press. 1998. – 219 p.

23. Jacob, N. Israelacvili / N. Jacob // Intermolecular and urface orces.

ondon, 2007. – 367 p.

24. Tuoola, E. M. Chemical, physical and enzymatic pretreatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoprotein / E. M. uomola, A. C. uwehand,. J. alminen // Int. J. ood Microbiol. 2000.

Vol. 60. P. 75–81.

25. An, Y. H. Mechanisms of bacterial adhesion and pathogenesis of implant and tissue infections / Y. H. An, R. J. riedman // Handbook of bacterial adhesion: Principles, Methods and Applications. Humana Press, 2000. – 79 p.

26. Isolation of mannose-specific lectin from E. coli and. its role in the adherence of the bacteria to epitelial cells / Y. Eshdat [et al.] // Biochem. Biophys. Res.

Commun. 1978. Vol. 85. P. 1551–1559.

27. Eshdat, Y. he molecular basis of bacterial adherence to epithelial cells / Y. Eshdat, N. haron // ectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry.

1983. Vol. 3. P. 667–675.

28. Rasin, S. Adhesion and microorganisms pathogenicity /. Rasin, I. Kahane, M. Banai // Proc. of the CJBA ound. ymp. Bath, 1981. P. 98–118.

29. Keusch, G. T. Pathogenesis of Shigella diarrhea: evidence for on N-linked glycoprotein Shigella toxin receptor and receptor modulation by 3-galactosidase /.. Keusch, M. Yacevicz, A. onohue-Rolfe // J. Infect. iseases. 1986.

Vol. 153, N 2. P. 238–248.

30. Knowles, B. H. ectin-like binding of Bacillus thuringiensis var. кurstaki lepidopteranspecific toxin is an initial step in insecti-cidal action / B. H. Knowles, W. E. homas,. J. Ellar // EB ett. 1984. Vol. 168, N 2. P. 197–202.

31. Григорьев, А. В. Бактериальная гистадгезия / А. В. Григорьев // Медичний Всесвіт. 2003. № 2. С. 19–31.

32. Adhesion and Microorganisms Pathogenecity / N. haron [et al.]. – ondon:

Pitman Press, 1981. P. 119–134.

33. Далин, M. B. Адгезины микроорганизмов / М. В. Далин, И. Г. Фиш // Итоги науки и техники. Сер. Микробиология. 1985. Т. 16. 108 с.

34. Sharon, N. Mannose specific bacterial surface lectins / N. haron, I. fek // Microbial ectins and Agglutinins. New York: Wiley, 1986. P. 55–82.

35. Wadstro, Т. Bacterial urface ectins /. Wadstrom,. rust,. Brooks // ectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry /. C. Bog-Hansen,. A. pengler (eds.). Berlin; New York: Walter de ruyter, 1983. Vol. 3.

P. 479–494.

36. Mukai, T. Collagen Binding of Bidobacteriu adolescentis /. Mukai,. oba, H. hori // J. Microbiol. 1997. Vol. 34, N 5. P. 326–331.

37. Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions / M.. Bernet [et al.] // Appl. Envirom. Microbiol. 1993. Vol. 12. P. 4121– 4128.

38. Tuoola, E. M. Chemical, physical and enzymatic pretreatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoprotein / E. M. uomola, A. C. uwehand,. J. alminen // Int. J. ood Microbiol. 2000.

Vol. 60. P. 75–81.

39. Mayra-Makinen, A. he adherence of lactic acid bacteria to the columnar epithelial cells of pigs and calves / A. Mayra-Makinen, M. Manninen, H. yllenberg // J. Appl. Bacteriol. 1983. Vol. 55. P. 241–245.

40. Shaw, N. he glycolipids of Lactobacillus casei A.. C. C. 7469 / N. haw, K. Heatherington, J. Baddiley // Biochem J. 1968. Vol. 107, N 4. Р. 491–496.

41. Prottey, C. iacyl myoinositol monomannoside from Propionibacteriu shermanii / C. Prottey, C. E. Ballou // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 23.

Р. 6196–6201.

42. Brundish, D. E. Bacterial glycolipids. lycosyl diglycerides in gram-positive bacteria /. E. Brundish, N. haw, J. Baddiley // Biochem J. 1966. Vol. 99, N 3. Р. 546–549.

43. Ижик, А. В. Влияние препаратов клеточных стенок пробиотических микроорганизмов на активность роста бактериальных культур после лиофилизации и низкотемпературной консервации / А. В. Ижик, Г. И. Новик, Е. П. Киселева // Актуальные проблемы современной микробиологии: сб. тез.

докл. V молодежной школы-конф. с междунар. участием (Москва, 26–27 окт.

2009 г.). M.: Макс-Пресс, 2009. С. 109–110.

44. Гликолипиды Lactococcus lactis subsp. cremoris / А. В. Ижик [и др.] //

Актуальные проблемы современной микробиологии: сб. тез. докл. V молодежной школы-конф. с междунар. участием (Москва, 26–27 окт. 2009 г.). M.:

Макс-Пресс, 2009. С. 25–27.

45. Exterkate, F. A. Biochemical changes in Bidobacteriu bidu var.

Pennsylvanicus after cell wall inhibition. Composition of lipids /. A. Exterkate, J. H. Veerkamp // Biochem. Biophys. Acta. 1969. Vol. 176. P. 65–77.

46. Ikawa, M. Nature of the lipids of some lactic acid bacteria / M. Ikawa // J. Bacteriol. 1963. Vol. 85. P. 772–781.

47. he glycolipids of Lactobacillus casei ACC 7469 / N. K. haw [et al.] // Biochem. J. 1968. Vol. 107. P. 491–496.

48. Shaw, N. Bacterial glycolipids / N. haw // Bacteriol Rev. 1970. Vol. 34, N 4. P. 365–377.

49. Acylglucoses in Escherichia coli, Saccharoyces cereisviae and Agaricus bisporus / P. J. Brennan [et al.] // ed. Eur. Biochem. oc. – 2002. ett. 8. – P. 322–324.

50. Ikawa, M. Bacterial phosphatides and natural relationships / M. Ikawa // Bacteriol. Rev. 1967. Vol. 31. P. 54–64.

51. Comparison of the phospholipids composition of Bidobacteriu and Lactobacillus strains /. A. Exterkate [et al.] // J. of Bacteriol. 1971. Vol. 106, N 3. P. 824–829.

52. OLeary, W. M. he chemistry and metabolism of microbial lipids / W. M. eary. – Cleveland: he World Publishing Co, 1967. 245 p.

53. Изоляция и сравнительный анализ фракций гликолипидов бифидобактерий / Г. И. Новик [и др.] // Микробиология. 2005. Т. 74, № 5. С. 1–8.

54. Изоляция гликолипидов из Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ В-493-Д и Lactobacillus plantarum БИМ В-495-Д / А. В. Ижик [и др.] // Биотехнология. 2012. № 1. С. 31–42.

55. Marr, R. Use of supercritical fluids for different processes including new developments – a review / R. Marr,. amse // Chemical Engineering and Processing.

2000. Vol. 39. P. 19–28.

56. Application of supercritical carbon dioxide (cC2) for the extraction of lipopolysacchairides (P) from Salonella enterica subsp. eneterica (PCM 2266) / J. Rybka [et al.] // J. upercritical f luids. 2008. Vol. 45.

P. 51–56.

57. Lang, Q. upercritical fluid extraction in herbal and natural product studies – a practical review / Q. ang, C. M. Wai // alanta. 2001. Vol. 53.

P. 771782.

58. A novel procedure for the isolation of glycolipids from Bidobacteriu adolescentis 94 BIM using supercritical carbon dioxide /. Novik [et al.] // Journal of Biotechnology. 2006. Vol. 121. P. 555–562.

59. Rakhuba, D. Application of supercritical carbon dioxide (cC2) for the extraction of glycolipids from Lactobacillus plantaru B-01 /. Rakhuba,. Novik, E. zwajcer ey // J. upercrit. luids. 2009. Vol. 49.

P. 45–51.

60. Izhyk, A. V. Extraction of polar lipids from bifidobacteria by supercritical carbon dioxide (cC2) / A. V. Izhyk,. I. Novik, Е. zwajcer ey // J. upercrit.

luids. – 2012. Vol. 62. – Р. 149–154.

А. V. IZHYK, G. I. NOVIK

HISTOLOGICAL ADHESION OF BACTERIA:

ROLE OF LIPIDIC COMPOUNDS

Microbial collection laboratory his review is devoted to the mechanisms of bacterial histological adhesion, the role of lipidic compounds in the mechanism of adhesion of probiotic bacteria in the intestines, as well as the methods of isolation and study of the polar lipids.

УДК 579.61:616–078 Е. П. КИСЕЛЕВА1, Г. И. НОВИК2

ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТИТЕЛА КРОЛИКA

К АНТИГЕНАМ ЛАКТОБАКТЕРИЙ:

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПЕРСПЕКТИВЫ

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОДУКТОВ

ПИТАНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК,

МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Лаборатория «Коллекция микроорганизмов»

Института микробиологии НАН Беларуси Получены поликлональные антитела (ПАТ) кроликов, иммунизированных целыми клетками. plantarum БИМ B-495. ПАТ имеют высокий титр (1/8000), взаимодействуют с родоспецифичными антигенами микроорганизмов, используемых для иммунизации, и не проявляют перекрестной реакции к антигенам других грамположительных бактерий. По показателям сродства и специфичности ПАТ пригодны для использования в качестве компонента двух тест-систем для конкурентного иммуноферментного анализа. Одна из них предназначена для количественного определения клеток лактобактерий в культуральных средах (или других жидкостях) и найдет применение в производстве продуктов питания и фармакологических препаратов пробиотического действия. Вторая тест-система предназначена для количественного определения антител к лактобактериям в сыворотке крови человека и может быть использована в практической медицине для выявления дисбактериоза в целях его своевременной профилактики и лечения.

Введение. Симбиотная микрофлора – один из ведущих факторов внешней среды, оказывающих влияние на физиологический, биохимический и иммунный статус человека [1]. Исследования в этой области являются стимулом для развития индустрии производства продуктов питания и фармакологических препаратов, содержащих в своем составе клетки, клеточные фракции или компоненты пробиотических микроорганизмов. В соответствии с формулировкой, принятой Всемирной организацией здравоохранения [2], пробиотиками считаются живые микроорганизмы, способные при использовании в адекватных дозах оказывать положительные эффекты на здоровье человека. Наибольший интерес вызывают лактобактерии – наиболее изученные представители симбионтной микрофлоры человека, традиционно используемые в технологиях производства продуктов питания и биологически активных добавок пробиотического действия [3, 4]. Актуальной задачей является разработка точных, воспроизводимых, простых и быстрых в исполнении методов количественного определения клеток этих и других пробиотических микроорганизмов в культуральных средах, основанных на использовании высокоспецифичных антител к бактериальным антигенам [5].

Эффективность пробиотического действия продуктов питания и фармпрепаратов, содержащих клетки и компоненты микроорганизмов-симбионтов, зависит от ряда факторов, в частности от иммунного статуса человека. Основа симбиоза – иммунологическая толерантность организма-хозяина по отношению к нормофлоре [6]. Формирование иммунологической толерантности происходит у индивидуума в период его внутриутробного развития в результате «предъявления» лимфоцитам плода антигенов, циркулирующих в крови матери. Поскольку возможность индукции толерантности определяется массивностью антигенной дозы, дефицит кишечной индигенной микрофлоры в организме беременной женщины создает предрасположенность к развитию иммунного ответа на экзогенные пробиотические микроорганизмы у новорожденного ребенка [7]. Следствием этого является невозможность нормальной колонизации микроорганизмами кишечника младенца и его предрасположенность к дисбактериозу. Актуальна задача разработки методов определения антител к симбионтной микрофлоре в сыворотке крови беременной женщины, что будет способствовать своевременной организации профилактики дисбактериоза новорожденного путем максимального насыщения кишечника матери пробиотическими микроорганизмами до родов и в начальный период после родов [7].

Цель исследования – получение и тестирование поликлональных антител (ПАТ) животных к лактобактериям с целью их использования в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем (1) для количественного определения клеток указанных микроорганизмов в культуральных средах в интересах производства продуктов питания и биологически активных добавок пробиотического действия и (2) для количественного определения специфических антител в сыворотке крови человека в интересах практической медицины.

Объекты и методы исследования.

Получение клеток бактерий для иммунизации и иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали культуры третьей генерации Lactobacillus plantarum БИМ B-495, L. plantarum БИМ B-1005, L. plantarum БИМ B-196, L. rhamnosus БИМ B-189, Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ B-493, Bidobacteriu bidu БИМ В-791 и Bacillus cereus БИМ B-491 из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси. Осаждали клетки центрифугированием при 2000 g в течение 20 мин и промывали трижды 0,02 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 0,2 М NaCl (буфер 1). Клетки суспендировали в H2О, переносили в ампулы (по 0,5 мл) и лиофилизовали в условиях, обеспечивающих потерю клетками жизнеспособности.

Получение бесклеточной фракции (БФ). Живые клетки L. plantarum БИМ B-495 после промывки гомогенизировали гомогенизатором «Wheaton» (США) в буфере 1 и обрабатывали ульWheaton» США) n» ) тразвуком с использованием диспергатора УЗДН-2Т (п/я В-2613, СССР) 6 раз по 30 с при частоте 22 кГц. Фракцию клеточных стенок осаждали центрифугированием при 40 000 g в течение 30 мин. БФ (супернатант) хранили при температуре –20 °С.

Непосредственно перед использованием уравнивали БФ двух штаммов посредством разведения буфером 1 до равных значений оптической плотности раствора при длине волны 260 нм (D260).

Иммунизацию шестимесячных самцов-кроликов осуществляли на 1-й, 14-й, 28-й, 60-й день от начала процедуры. Содержимое каждой ампулы с лиофилизованными клетками L. plantarum БИМ B-495 суспендировали в 1 мл стерильного 0,15 M NaCl. 0,1 мл суспензии смешивали с 2 мл полного адъюванта Фрейнда и вводили животным подкожно в область лопаток. Отбор крови осуществляли на 40-й, 72-й, 100-й день. Кровь инкубировали при 37 °С в течение 30 мин и при 4 °С в течение 4 ч, а затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. Сыворотку хранили при –70 °С.

Сравнение количества клеток в лиофилизованных препаратах бактерий. Содержимое ампул с лиофилизованными клетами L. plantaru БИМ B-495, B. bidu БИМ В-791 и B. cereus B-491 суспендировали в 500 мкл H2О. Суспензии клеток каждого штамма вносили по 50, 100, 200 мкл в три пробирки, добавляли H2 до 200 мкл и 3 мл 30%-ной серной кислоты. Каждую пробу на основе B. bidu БИМ В-791 разводили дополнительно 30%-ной серной кислотой в 11 раз. Выдерживали 1 ч. Определяли D260.

Строили графики зависимости значений D260 от содержания исходной суспензии в анализируемом образце. Для каждого штамма определяли содержание исходной суспензии в анализируемом образце, соответствующее значению D260 равному 1. Рассчитывали соотношение указанных показателей для трех штаммов. В дальнейшем для использования клеток трех штаммов в ИФА содержимое ампул с лиофилизованными клетками уравнивали посредством их суспендирования в равном объеме буфера 1, отбора необходимого количества каждой суспензии в соответствии с рассчитанной пропорцией и доведения их тем же буфером до равных объемов.

ИФА. Для определения рабочего титра ПАТ использовали планшеты «reiner bio-one» (Германия) с иммобилизованными клетками L. plantarum БИМ B-495. Содержимое одной ампулы суспендировали в 2 мл буфера 1, разводили тем же буфером в 250 раз и вносили по 100 мкл в лунки планшетов. Иммобилизацию проводили в течение ночи при 4 °С. После промывки лунок буфером 1 инкубировали иммобилизованные клетки со специфической сывороткой кролика, предварительно разведенной в определенное число раз в диапазоне 1/2000 – 1/360 000 2 ч при (18–25) °С. Иммуноглобулины (Ig) на твердой фазе выявляли с использованием антител барана против Ig кролика, полученных в Институте биоорганической химии НАН Беларуси (Беларусь) и меченных пероксидазой из корней хрена (ПХ) «Biozyme» (Великобритания). Конъюгат получали методом синтеBiozyme» »

за, основанным на окислении олигосахаридных цепей ПХ перйодатом Na [8]. После проведения и остановки ферментативной реакции [9] определяли оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм (D450) в лунках с использованием многоканального спектрофотометра «Униплан» (Россия).

Для количественного определения бактерий в культуральных средах в соответствующие серии пробирок вносили по 0,06 мл гомогенной суспензии клеток L. plantarum БИМ B-495 с известными концентрациями в диапазоне 6 102–1 107 клеток/мл.

Суспензию получали в результате последовательного разведения культуральной средой культуры клеток L. plantarum БИМ B-495, концентрация которых была предварительно определена с использованием камеры Горяева. В качестве контроля использовали пробирку, содержащую 0,06 мл культуральной среды. В каждую пробирку добавляли 0,24 мл раствора ПАТ, специфичных к данным микроорганизмам. Титр ПАТ в конечном объеме пробы составлял 1/8000. Инкубировали 1,5 ч при 37 °С.

Добавляли в каждую пробирку 0,05 мл 50%-ной суспензии ephadex -25 fine «Pharmacia» (Швеция) и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПн-3 (СССР). В 2 лунки планшетов с иммобилизованной БФ L. plantarum БИМ B-495 вносили по 0,1 мл надосадочной жидкости из каждой пробирки и инкубировали 1,5 ч при 37 °С. Лунки промывали и завершали ИФА как указано выше.

Результаты и обсуждение. В результате иммунизации кроликов целыми клетками L. plantarum БИМ B-495 получены и охарактеризованы образцы сыворотки крови, содержащие поликлональные антитела (ПАТ) к антигенам указанных микроорганизмов. В связи со сходством результатов определения титров и специфичности ПАТ трех животных далее представлены типичные результаты на примере ПАТ одного из кроликов.

Титр ПАТ определяли ИФА, используя планшеты с иммобилизованными лиофилизованными клетками L. plantarum БИМ B-495. После промывки лунок инкубировали иммобилизованные клетки со специфической сывороткой кролика, отобранной на определенной стадии иммунизации и предварительно разведенной в определенное число раз в диапазоне 1/1000–1/800 000.

Выявляли Ig на твердой фазе с использованием антител барана против Ig кролика, меченных ферментом (рис. 1).

Рабочий титр тестируемых ПАТ находится в области, соответствующей максимальному наклону соответствующих графиков (рис. 1).

Очевидно, что титр ПАТ возрастает по мере процедуры иммунизации и в конце этого Рис. 1. Концентрационная зависимость процесса соответствует консвязывания ПАТ кроликов с клетками центрации антисыворотки L. рlantarum БИМ B-495, иммобилизо- (АС) в пробе, равной (0,005–

-495, ванными на твердой фазе. (1–4) – АС после 1–4-й стадии иммунизации соот- 0,02)%, или диапазону разведений АС 1/5000–1/20 000 ветственно (рис. 1, линия 4). Рабочим титром считали разведение ПАТ 1/8000, обеспечивающее в ИФА значение D450, равное 2.

Стандартный метод определения перекрестной реакции антител ИФА состоит в следующем. Используют две серии планшетов, в лунках которых иммобилизован антиген, специфичный к тестируемым антителам. В лунках планшетов первой серии находится раствор, содержащий одновременно антитела к иммобилизованному антигену и антиген, идентичный иммобилизованному на твердой фазе, в виде ряда концентраций (Вn). Контрольная проба не содержит антигена в растворе (В0). В лунках планшетов второй серии в растворе находится другой антиген, потенциально способный к перекрестной реакции с тестируемыми антителами. Графически определяют концентрации специфического и перекрестно реагирующего антигенов, соответствующие значениям Вn/В0, равным 50%. Соотношение этих концентраций, рассчитанное в процентах, является показателем перекрестной реакции антител.

Мы модифицировали метод определения перекрестной реакции антител, адаптировав его для использования в качестве перекрестно реагирующих антигенов целых клеток других грамположительных микроорганизмов. Для тестирования ПАТ, специфичных к L. plantarum БИМ B-495, в качестве потенциально перекрестно реагирующих антигенов использовали клетки B. bidu БИМ В-791 и B. cereus БИМ B-491.

Предварительно была отработана методика сравнения количества клеток в лиофилизованных препаратах трех микроорганизмов, не требующая использования микроскопа. Методика основана на растворении клеток в 30%-ной серной кислоте и определении значения D260, являющегося показателем концентрации нуклеиновых кислот. Мы исходили из того, что содержание нуклеиновых кислот в клетках родственных штаммов, культуры которых находятся в одной и той же фазе роста, можно считать равным. Установлено, что значения D260 соответствуют максимумам в спектрах поглощения растворов клеток используемых нами штаммов, записанных в диапазоне длин волн 220–320 нм (данные не представлены), и линейно возрастают по мере увеличения концентрации клеток (рис. 2). На основании графиков для каждого штамма определяли содержание исходной суспензии клеток в анализируемой пробе, соответствующее Рис. 2. Зависимость D260 от концентрации клеток бактерий: 1, 2, 3 – L. рlantarum БИМ B-495, B. bidu БИМ B-791, B. cereus БИМ B-491 соответственно. Концентрацию содержимого одной ампулы в 500 мкл Н2О считали равной 100% значению D260, равному 1. Значения этого показателя, определенные для L. рlantarum БИМ B-495, B. bidu БИМ B-791 и B. cereus БИМ B-491, соотносятся как 13:1:22 (рис. 2). На этом основании для уравнивания в ИФА лиофилизованных клеток трех штаммов бактерий суспендировали их в равном объеме буфера, а затем отбирали количества суспензий L. рlantarum БИМ B-495, B. bidu БИМ B-791 и B. cereus БИМ B-491, соответствующие указанной выше пропорции, и доводили их до объема, соответствующего отобранному объему cуспензии клеток штамма B. cereus БИМ B-491.

В настоящем исследовании ПАТ к антигенам клеток L. plantaru БИМ B-495 в предварительно выбранном рабочем титре параллельно инкубировали с суспензиями, содержащими равные количества клеток специфических или указанных выше потенциально перекрестно реагирующих бактерий. Затем отделяли клетки центрифугированием и вносили каждую пробу в соответствующие лунки планшетов с иммобилизованными клетками специфических бактерий. Рассчитывали показатель перекрестной реакции антител как указано выше. Типичные данные представлены на рис. 3. Очевидно (рис. 3), что ПАТ, специфичные к L. plantaru БИМ B-495, проявляют перекрестную реакцию к B. bidu БИМ B-791 и B. cereus БИМ B-491, не превышающую 1%.

Установлено, что ПАТ, специфичные к АГ L. plantaru БИМ B-495, примерно в равной степени взаимодействуют с клетками указанного штамма и других родственных штаммов Рис. 3. Конкуренция иммобилизованных (L. plantaru БИМ B-1005, на твердой фазе антигенов L. plantaru L. plantaru БИМ B-196, L. rhaБИМ B-495 с находящимися в растворе nosus БИМ B-189, L. lactis антигенами L. plantaru БИМ B-495 (1), subsp. cremoris БИМ B-493) B. bidu БИМ В-791 (2) и B. cereus БИМ B-491 (3) за связывание с ПАТ к Lb. plan- (рис. 4). Следовательно, в сорис.

. ледовательно,, ставе этих ПАТ доминируtaru БИМ B-495 ют Ig, выработанные к родоспецифичным антигенам лактобактерий. Это необходимое условие использования ПАТ к антигенам L. plantarum БИМ B-495 в качестве компонентов тест-системы для количественного определения клеток лактобактерий в культуральных средах (или других жидкостях) методом ИФА.

В такой тест-системе в ходе 1-й стадии анализа происхо- Рис. 4. Концентрационная зависимость дит взаимодействие ПАТ с клет- связывания иммобилизованными БФ ками бактерий (в составе ка- (D260 = 0,2) ПАТ кроликов, иммунизиролибровочных проб (С1–Сn) ванных целыми клетками L. plantarum БИМ B-495: 1, 2, 3, 4, 5 – L. plantarum и анализируемых образцов). БИМ B-495, L. plantarum БИМ B-1005, В качестве контроля использу- L. plantarum БИМ B-196, L. rhamnosus ется проба С0, не содержащая БИМ B-189, L. lactis subsp. cremoris БИМ B-493 соответственно клеток бактерий. Разделение ПАТ, свободных и связавшихся с клетками, достигается в результате осаждения последних центрифугированием. Далее свободные ПАТ, находящиеся в составе надосадочной жидкости каждой из пробирок, переносятся в соответствующие лунки планшетов, содержащие равные количества иммобилизованных антигенов тестируемых микроорганизмов. На 2-й стадии анализа на твердой фазе происходит образование иммунных комплексов. Для их выявления на 3-й стадии анализа используют антитела барана против Ig кролика, меченные ферментом. Количество окрашенного продукта ферментативной реакции прямо пропорционально концентрации свободных ПАТ, находящихся в составе надосадочной жидкости, и обратно пропорционально количеству клеток, находящихся в составе анализируемых образцов и калибровочных проб на первой стадии анализа. Калибровочный график тест-системы для количественного определения клеток лактобактерий методом конкурентного ИФА представлен на рис. 5.

Очевидно (рис. 5), что диапазон определяемых концентраций бактерий составляет 104 –106 клеток/мл. В соответствии с пожеланиями потребителя он может быть смещен в область более низких или высоких концентраций посредством изменения количества бактериальных антигенов, иммобилизованных на твердой фазе, и концентраций ПАТ на 1-й стадии ИФА.

Рис. 5. Калибровочный график тестКроме того, полученные системы для количественного определения клеток лактобактерий в культу- ПАТ к L. plantaru БИМ ральных средах (или других жидко- B-495 могут найти применестях) методом ИФА. На твердой фазе ние в качестве компонента иммобилизованы клетки L. plantarum тест-системы для количеБИМ B-495 ственного определения антител к антигенам бактерий рода Lactobacillus в сыворотке крови человека методом конкурентного ИФА. В такой тест-системе в ходе анализа происходит конкуренция очищенных ПАТ, меченных ферментом, и антител человека в составе анализируемых проб (или немеченых ПАТ в составе калибровочных проб) за образование иммунных комплексов с иммобилизованными антигенами Lactobacillus. Количество меченых ПАТ, связавшихся с иммобилизованным антигеном, обратно пропорционально количеству антител человека в анализируемых пробах.

Для использования в такой тест-системе ПАТ должны удовлетворять двум критериям: 1) в их составе должны доминировать Ig, выработанные к родоспецифичным антигенам лактобактерий; 2) эпитопная специфичность ПАТ должна быть идентична этитопной специфичности антител человека, выработанных в результате естественного иммунного ответа на лактобактерии.

Данные, свидетельствующие о соответствии ПАТ первому критерию, представлены выше (рис. 4).

С целью проверки соответствия ПАТ второму критерию использовали образцы сыворотки пациентов кафедры гастроэнтерологии и нутрициологии Белорусской медицинской академии последипломного образования, принадлежащие пациентам с хроническими заболеваниями кишечника (n = 90). У таких лиц велика вероятность нарушения целостности кишечного эпителия, а следовательно, проникновения клеток симбионтной микрофлоры и их компонентов через эпителиальный барьер и развития патологического иммунного ответа на антигены симбионтной микрофлоры. В ИФА использовали планшеты с иммобилизованными клетками L. plantaru БИМ B-495 (серия 1), БФ того же микроорганизма (серия 2) и общими Ig человека, иммобилизованными из растворов с концентрациями (0,015–2) мкг/мл (серия 3). В лунки серий 1 и 2 вносили разведенные в 100 раз образцы сыворотки крови человека (выборка 1, n = 90), а затем детектировали Ig, связавшиеся с иммобилизованными веществами (лунки серий 1 и 2) и Ig, иммобилизованные в лунках серии 3, с использованием конъюгата моноклональных антител мыши против Ig человека с ПХ «Хема» (Россия).

Оказалось, что коэффициент корреляции массивов значений D450 в лунках серий 1 и 2, рассчитанный средствами программы Microsoft Excel, составляет 0,91. Таким образом, в тест-системе для количественного определения антител к антигенам молочнокислых бактерий в качестве источника антигенов могут быть использованы как клетки, так и БФ L. plantaru БИМ B-495.

Обнаружено также, что 42 образца сыворотки крови человека (47% выборки) имеют значения D450, не превышающие 0,2. Это значение D450 соответствовало фоновому связыванию, характерному для данного ИФА. Значения D450 в остальных лунках серии 2 (выборка 2, n = 48) и значения D450 в лунках серии 3 представлены на рис. 6. На основании данных рис. 6 можно предположить, что концентрации антител к антигенам молочнокислых бактерий в сыворотке крови человека в норме не превышают 0,2 мг/л, но при патологии достигают 1,3 мг/л и более. Даже в этом случае Ig указанной специфичности составляют менее 1% от концентрации общих Ig человека, соответствующей 7–16 г/л [10].

Далее проводили ИФА с использованием планшетов с иммобилизованной БФ L. plantaru БИМ B-495, в лунках которых на первой стадии анализа находились ПАТ в рабочем титре и разведенные в 25 раз образцы сыворотки крови человека (выборка 2, n = 48), отобранные по критерию наличия антител к антигенам молочнокислых бактерий как указано выше. Контрольные лунки содержали вместо сывоРис. 6. Результаты количественного определения антител к молочнокис- ротки крови человека буферлым бактериям в сыворотке крови че- ный раствор (В0). ПАТ, связавловека методом прямого ИФА: 1 и 2 – шиеся с иммобилизованной иммобилизованные БФ L. plantarum БФ, выявляли с использованиБИМ B-495 и общие Ig человека соем антител барана против Ig ответственно кролика, меченных ферментом. Для каждого образца сыворотки крови определяли показатель Вn /В0, характеризующий способность антител к антигенам лактобактерий, содержащихся в данной сыворотке, к конкуренции с ПАТ. Оказалось, что значения Вn /В0, находящиеся в диапазонах 90–95%, 80–90%, 60–80% и менее 60% характерны для 18, 26, 2 и 2 образцов сыворотки крови, или 38,3; 53,1; 4,3 и 4,3% выборки 2. Полученные данные позволяют считать, что естественный иммунный ответ у человека и иммунный ответ у кроликов, иммунизированных целыми клетками лактобактерий, приводит к выработке антител к сходным антигенным детерминантам, т. е. ПАТ соответствуют второму из указанных выше критериев.

Конкурентный ИФА антител к антигенам бактерий рода Lactobacillus в сыворотке крови человека, основанный на использовании ПАТ кроликов к клеткам L.

plantaru БИМ B-495 и БФ или клеток L. plantaru БИМ B-495 в качестве источника бактериальных антигенов, позволяет исключить получение ложноположительных результатов, возможных в прямом ИФА. Это связано с тем, что клетки молочнокислых бактерий содержат лектиноподобные белки [11] и биополимеры, избирательно взаимодействующие с антителами человека определенной специфичности [9], а следовательно, в прямом ИФА возможно образование на твердой фазе (и последующая детекция) комплексов Ig человека с веществами бактерий, отличных от комплексов антиген–антитело.

Заключение. Получены поликлональные сыворотки (ПАТ) кроликов, иммунизированных целыми клетками L. plantarum БИМ B-495. По результатам ИФА ПАТ имеют высокий титр (1/80 000), взаимодействуют с родоспецифичными антигенами микроорганизмов, используемых для иммунизации, и не проявляют перекрестной реакции к антигенам других грамположительных бактерий. По показателям сродства и специфичности ПАТ пригодны для использования в качестве компонента двух тест-систем, основанных на использовании метода конкурентного ИФА. Одна из них предназначена для количественного определения клеток лактобактерий в культуральных средах (или других жидкостях) и найдет применение в производстве продуктов питания и фармакологических препаратов пробиотического действия на основе клеток и компонентов указанных микроорганизмов. Вторая тест-система предназначена для количественного определения антител к лактобактериям в сыворотке крови человека и может быть использована в практической медицине для выявления дисбактериоза в интересах его своевременной профилактики и лечения.

Литература

1. he human microbiome project / P. J. urnbaugh [et al.] // Nature. – 2007. – Vol. 449. – P. 804–809.

2. Probiotics – identification and ways of action / N. Corcionivoschi [et al.] // Innovative Romanian ood Biotechnology. – 2010. – Vol. 6. – P. 1–11.

3. pecific metabolite production by gut microbiota as a basis for probiotic function / R. P. Ross [et al.] // International airy Journal. – 2010. – Vol. 20. – P. 269–276.

4. Oelschlaeger, T. A. Mechanisms of probiotic action – A review /. A. elschlaeger // Int. Journal of Medical Microbiology. – 2010. – Vol. 300. – P. 57–62.

5. Production and characterization of anti-bifidobacteria monoclonal antibodies and their application in the development of an immuno-culture detectiom method /. Amrouche [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 2006. – Vol. 65. – P. 159–170.

6. Evolution of mammals and their gut microbes / R. E. ey [et al.] // cience. – 2008. – Vol. 320. – P. 1647–1651.

7. Дисбактериоз как следствие нарушения иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре / С. М. Попкова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2007. – № 3 (55), прилож. – С. 57–62.

8. Immunofluorescence and Related taining echniques / W. Knapp [et al.] (eds.). – Amsterdam: Elsevier, 1978. – P. 215.

9. he role of components of Bidobacteriu and Lactobacillus in pathogenesis and serologic diagnosis of autoimmune thyroid diseases / E. P. Kiseleva [et al.] // Beneficial microbes. – 2011. – Vol. 2. – P. 139–154.

10. Shakib, F. Human Ig subclasses in health and disease. Part I /. hakib,. R. tanworth // a ricerca in clinica e in laboratorio. – 1980. – Vol. 10. – P. 463–479.

11. Лектины, адгезины, лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидобактерий / B. M. Лакшин [и др.] // Вестн. Рос. акад. мед. наук. – 2006. – № 1. – С. 28–34.

E. P. KISELEVA1, G. I. NOVIK2

POLYCLONAL RABBIT ANTIBODIES

TO ANTIGENS OF LACTIC ACID BACTERIA:

PRODUCTION, FEATURES, PROSPECTS FOR USING IN FOODS

AND DRUGS TECHNOLOGY AND MEDICAL DIAGNOSIS

Institute of Bioorganic Cheistry, National Acadey of Sciences of Belarus, Microbial collection laboratory, Institute of Microbiology, National Acadey of Sciences of Belarus Rabbit polyclonal antibodies (PAb) were obtained by immunization with the whole cells of L. plantaru BIM B-495. he PAb have a high titre (1/8000) in EIA, interact with genus-specific antigens of lactic acid bacteria, show no cross-reaction to the antigens of other gram-positive bacteria and compete with the natural human serum antibodies against lactic acid bacteria. In terms of affinity

and specificity the PAb are suitable for use in the two competitive EIA test kits:

(1) for determination of whole cells of Lactobacillus in cultures and others media and (2) for determination of antibodies to lactic acid bacteria in human serum. he EIA test kits are intended for use (1) in foods and drugs technology and (2) in medical diagnosis of dysbiosis.

БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

УДК 579.222.2:579.262+504.6:61/69

А. С. САМСОНОВА, Е. М. ГЛУШЕНЬ, Н. Г. КЛИШЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И РЕКОНСТРУКЦИЯ БИОПЛЕНОЧНЫХ

АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ –

ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТИ

Лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Исследования последнего десятилетия показали, что большинство бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих планктонных клеток, а в виде специфически организованных прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Развитие биопленок – одна из основных стратегий выживания бактерий в окружающей внешней среде.

Биопленочные микроорганизмы, разрушающие нефть и нефтепродукты, выделили из пластовых вод нефтяных месторождений Беларуси (скважина № 127 Вишанского месторождения, скважина № 33 Северо-Домановичского месторождения); из почв, загрязненных в естественных условиях, а также накопительных культур, созданных в лабораторных условиях.

На жидкой среде и абиотической поверхности – полистироле – получены биопленочные микроорганизмы, активно использующие в качестве источников питания углеводороды нефти.

Введение. В процессах биоремедиации природных экосистем и производственных объектов, в частности от компонентов нефти, используют два основных подхода: биостимуляцию аборигенной микрофлоры путем аэрации среды и обогащения ее дополнительными источниками питания в виде солей азота, фосфора и калия, а также биоаугментацию – введение (интродукцию) в изучаемую экологическую систему высокоактивных природных или генно-модифицированных микроорганизмов.

В последнем случае, как правило, используют смесь микроорганизмов, способных к биодеградации загрязняющих веществ, с целью повышения эффективности этого процесса. Примерами препаратов, предназначенных для борьбы с нефтяными загрязнениями, могут служить препарат российского производства Деворойл [1], представляющий собой смесь пяти углеводородокисляющих бактерий и дрожжей, а также ряд препаратов, включающих микроорганизмы одного и того же рода (например Родер (Российская Федерация), препараты Экобел и Родобел, разработанные в Институте микробиологии НАН Беларуси), представленные различными видами бактерий рода Rhodococcus.

Взаимодействие микробных компонентов в препаратах основано на различной активности составляющих их микроорганизмов в отношении различных фракций нефти. В природных субстратах нефтеокисляющие микроорганизмы взаимодействуют с различными представителями аборигенных популяций. Взаимодействие, механизмы которого, как правило, неизвестны, может оказать как положительное, так и отрицательное влияние на эффективность деградации нефтепродуктов [2].

В нефтяных месторождениях нефтеокисляющие микроорганизмы входят в трофические цепи, где они играют роль «первичных продуцентов», так как поставляют продукты деградации нефти другим, неспособным к окислению нефти «спутникамконсументам» [3]. Метаболическая зависимость спутников от продуцентов очевидна. Однако можно предполагать, что в таких сообществах должно (может) существовать и обратное воздействие спутников на продуценты, активирующее их жизнедеятельность и обеспечивающее спутникам дополнительное количество пищевых субстратов.

При исследовании микрофлоры нефтяных месторождений анализу, как правило, подвергают суспензии клеток, вымываемые водой из нефтяных пластов.

Между тем, есть убедительные свидетельства того, что в природных местах обитания 90–98% популяций микроорганизмов существует в виде структурированных сообществ:

микробных матов, обрастаний, осадков и т. д., для которых применяется общий термин «биопленки» (biofilms).

Согласно современным представлениям, биопленка – это непрерывный мультислой бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу и заключенных в биополимерный матрикс. Межклеточные коммуникации в биопленке осуществляются при участии регуляторного механизма, получившего название «чувство кворума» [4].

Популяции в биопленках отличаются от суспензионных культур рядом существенных особенностей: высокой плотностью, сниженной чувствительностью к воздействию стрессовых факторов и биоцидов, повышенной физической, химической и метаболической стабильностью, генетической гетерогенностью, обусловленной повышенной частотой горизонтального переноса генов [5]. Этим особенностям в значительной мере могут быть найдены объяснения при изучении взаимодействия микробных компонентов в структурированных сообществах – биопленках.

Роли биопленок в окружающей среде в последнее время уделяется особое внимание. Микроорганизмы образуют биопленки на любых биотических и абиотических поверхностях. Серьезную опасность представляют биопленки для системы питьевого водоснабжения в связи с возможностью заражения питьевой воды патогенными микроорганизмами из-за низкой чувствительности биопленочных бактерий к биоцидам. Эта же особенность биопленок является существенным положительным свойством при использовании их в очистке сточных вод фармацевтических и других производств, содержащих высокие концентрации биоцидов.

Таким образом, наряду с отрицательными последствиями микробной колонизации объектов окружающей среды имеются и положительные стороны этого процесса, связанные с практическим применением биопленок, в том числе для удаления токсических загрязняющих веществ.

Важнейшей особенностью биопленок, привлекающей внимание исследователей при разработке на их основе препаратов для биодеструкции нефти, является их устойчивость к внешним воздействиям, характеризуемая термином «персистенция». Она во многом обусловлена физиолого-биохимическими свойствами входящих в состав биопленок микроорганизмов, которые фенотипически отличаются от тех же микроорганизмов, существующих в виде планктонных популяций. Биопленочный фенотип создается, по мнению ряда исследователей, путем воздействия на культуру микроорганизмов факторов плотности популяции, а также в результате взаимного влияния входящих в биопленку организмов [6].

Актуальность изучения природных структурированных сообществ микроорганизмов заключается в необходимости постоянного совершенствования методов очистки окружающей среды от ксенобиотиков путем создания экологически сбалансированных технологий.

Цель исследования – выделить консорциум, состоящий из микроорганизмов-деструкторов углеводородов и их природных бактерий-спутников, перспективных для создания комплексного (ассоциативного) микробного препарата для биоремедиации сред, загрязненных нефтью и продуктами ее переработки.

Объекты и методы исследования.

Объекты исследования:

пластовые воды нефтяных месторождений, буровые и солевые растворы, образцы нефтезагрязненной почвы в качестве объектов выделения микроорганизмов-деструкторов нефти;

44 биопленочные ассоциации микроорганизмов, выделенных из пластовых вод нефтяных месторождений и накопительных культур с нефтью и нефтепродуктами.

В качестве источников выделения микроорганизмов использовали образцы почвы с различной степенью и сроками давности загрязнения в естественных условиях. Образцы почвы, отобранные на территории НГДУ «Речицанефть» РУП

ПО «Белоруснефть», характеризуются следующими показателями загрязнения:

отвал грунта с места прорыва трубопровода недельной давности (12,77 мг нефти/г почвы);

почва с обваловки амбара давностью загрязнения более 20 лет (58,1 мг нефти/г почвы);

почва из отвала давностью загрязнения 5 лет (40,7 мг нефти/г почвы);

почва с территории нефтедобывающей скважины после прорыва коллектора (33,1 мг нефти/г почвы);

почва с места свежего прорыва трубопровода (24,7 мг нефти/г почвы).

Для постановки накопительных культур использовали почву, модельно загрязненную в лабораторных условиях:

загрязненную дизельным топливом (1, 5, 10%);

загрязненную нефтью различной вязкости (1, 10%);

загрязненную нефтешламом (10%).

Выделение биопленочных микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, провели также с использованием пластовых вод нефтяных месторождений Беларуси (скважина № 127 Вишанского месторождения, скважина № 33 Северо-Домановичского месторождения).

Образцы помещали в жидкую минеральную среду Е-8 с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 0,1%. Накопительные культуры получали путем 10-кратных пассажей в условиях повышающихся концентраций нефти в среде от 0,1 до 1% в течение 6 мес. Культуры накопления рассевались на поверхности агаризованной минеральной среды Е-8 с нефтью (0,1%). Для выявления деструкторов выросшие изолированные колонии вносили в жидкую минеральную среду Е-8 с нефтью (0,1%). Отобранные активно растущие в жидкой среде культуры проверяли на чистоту, рассевая на МПА с последующим микроскопированием на Jenaval (Германия). Далее методом адаптивной селекции, увеличивая концентрацию нефти в селектирующей среде от посева к посеву до 5%, получали штаммы с повышенной деструктивной активностью в отношении нефти. Способность выделенных микроорганизмов расти на углеводородах нефти различного строения устанавливали ауксанографически на агаризованной минеральной среде Е-8 с углеводородами. Нефть, дизельное топливо и гексадекан добавляли в среду в качестве единственного источника углерода после стерилизации в количестве 1–10 г/л.

Микроорганизмы-деструкторы выявляли ауксанографически на средах с гексадеканом, нефтью и дизельным топливом.

Чашки Петри засевали штрихом, результаты учитывали на 14-е сутки.

Реконструкцию биопленок и изоляцию чистых культур провели с использованием проб пластовых вод нефтяных месторождений (скважина № 127 Вишанского месторождения, скважина № 33 Северо-Домановичского месторождения), хранившихся при 4–5 °С.

Стерильные полистирольные пластины помещали на поверхность твердой среды в чашках Петри. Состав среды варьировали в зависимости от поставленной задачи. Для первичной реконструкции биопленок использовали среду М9 с парафинами.

На фильтры наносили 25–50 мкл пластовой воды и почвенной водной вытяжки, содержащей суспензию клеток микроорганизмов, вымываемых из нефтяного пласта и образцов загрязненной почвы. Чашки инкубировали при 28–29 °С в течение 5–10 сут для формирования биопленок. Биопленки подвергали диспергированию в жидкой среде или в солевом растворе и высевали разведения суспензии на твердые среды различного состава (Е-8 и М9) с гексадеканом и дизельным топливом в качестве единственного источника углерода. Полученные колонии («микробиопленки») вновь подвергали диспергированию и рассеву до получения чистой культуры микроорганизма.

Выделенные микроорганизмы поддерживали на скошенной плотной среде ПД и B с 0,5% гексадекана. Для галотолерантных и галофильных микроорганизмов в среду добавляли 5–10% NaCl.

Результаты и их обсуждение. Из буровых растворов, различающихся по плотности ( = 1,10; 1,15; 1,20), уровню рН (5,0;

5,8; 5,9) и солесодержанию (Ca2 + и Mg2 + – 21292,5–59118,0 и 1591,0–17620,4 мг/л соответственно), а также накопительных культур, созданных на основе почвы, загрязненной нефтепродуктами в естественных (срок давности 1–20 лет) и модельных условиях (концентрация нефти 1, 10, 20%), выделено 44 ассоциации микроорганизмов – деструкторов нефти.

Из них 27 биопленочных ассоциаций получены из пластовых вод; 3 – из буровых растворов; 2 – из солевых растворов;

10 – из почвы, загрязненной нефтью; 4 – почвы, загрязненной дизельным топливом. Внешний вид биопленок, полученных из различных проб пластовых вод, а также из почвенных вытяжек, представлен на рис. 1, 2. В отличие от бактериальных макрокоРис. 1. Примеры реконструированных биопленок

Рис. 2. Вид реконструированной биопленки на чашке Петри

лоний, имеющих гомогенную структуру, полученные биопленки при исследовании в световом микроскопе обнаруживали значительную гетерогенность (рис. 3), обусловленную формироваРис. 3. Клетки разных микроорганизмов из микроколоний в реконструированных биопленках (световая микроскопия, фазовый контраст)

–  –  –

Биопленка Нефть Гексан Тетрадекан Пентадекан Гексадекан Бензол Толуол Мазут БП-1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ БП-2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ БП-3 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + ++ БП-4 +++ +++ ++ ++ +++ + + – БП-5 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + ++ БП-6 +++ +++ ++ ++ +++ + + + БП-7 +++ +++ +++ ++ +++ ++ – + БП-8 +++ ++ + ++ +++ + + – Заключение. Скрининг активных биопленочных микроорганизмов – деструкторов нефти вели среди ассоциаций, выделенных из накопительных культур, пластовых вод, бурового и солевого растворов. Из выделенных 44 ассоциаций микроорганизмов – деструкторов нефти 27 ассоциаций получены из пластовых вод; 3 – из буровых растворов; 2 – из солевых растворов;

10 – из почвы, загрязненной нефтью; 4 – из почвы, загрязненной дизельным топливом. Проверка способности выделенных изолятов к развитию на средах с нефтью и гексадеканом в концентрации 1% позволила выявить 8 культур, хорошо растущих на данных субстратах. Полученные биопленки характеризуются высокой деструктивной активностью в отношении нефти и таких углеводородов, как гексан, тетрадекан, пентадекан, гексадекан, бензола, толуол, тяжелые продукты переработки нефти (мазут).

Литература

1. Использование микроорганизмов в биотехнологии повышения нефтеизвлечения / С. С. Беляев [и др.] // Микробиология. – 2004. – Т. 73, № 5. – С. 687–697.

2. Использование бактерий рода Azotobacter для биодеградации почв, загрязненных нефтью / Н. Б. Градова [и др.] // Прикл. биохимимя и микробиология. – 2003. – Т. 39, № 3. – С. 318–321.

3. Зависимость способности микроорганизмов к окислению парафинов от состава реконструированных биопленок / М. В. Журина [и др.] // Междунар.

науч. конф. «Микроорганизмы и биосфера», Москва, 19–20 нояб. 2007 г.: тез.

докл. – М., 2007. – С. 46.

4. Miller, M. B. Quorum sensing in bacteria / M. B. Miller, B.. Bassler // Ann.

Rev. Microbiol. – 2001. – Vol. 55. – P. 165–199.

5. Гинцбург, А. Л. «Quorum sensing», или социальное поведение бактерий / А. Л. Гинцбург, Т. С. Ильина, Ю. М. Романова // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. – 2003. – № 5. – C. 86–93.

6. Взаимоотношения микроорганизмов нефтяных месторождений в реконструированных биопленках / В. К. Плакунов [и др.] // IV Моск. Междунар.

конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: тез. докл. – М., 2007. – С. 343–344.

A. S. SAMSONOVA, E. M. HLUSHEN, N. G. KLISHEVICH

PRODUCTION AND RECONSTRUCTION OF BIOFILM

ASSOCIATIONS MICROORGANISMS – OIL DEGRADERS

Laboratory of xenobiotic degradation and bioreediation of natural and industrial edia Investigation of latest decade have demonstrated that most bacteria do not exist in natural ecosystems as free flowing plankton cells, they form spcially arranged films immobilized on the substrates and film generation is a complicated strictly controlled biological process. evelopment of the biofilms is one of the main survival strategies for bacteria in surrounding environment.

Biofilm microorganisms degrading oil and derived products were isolated from formation waters of Belarusian oil fields (well 127 of Vishany deposit, well 33 of Nothern omanovichy deposit), from naturally polluted soils, from lab enrichment cultures.

Microorganisms utilizing oil hydrocarbons as nutrition sources actively adhered to polystyrene abiotic surface in liquid media to shape biofilms.

УДК 579.695

А. С. САМСОНОВА, Е. М. ГЛУШЕНЬ, М. С. ЧИРИКОВА, Г. М. ПЕТРОВА

МИКРООРГАНИЗМЫ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ

ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ЖИРОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Проведен скрининг микроорганизмов – деструкторов жировых веществ в лабораторной коллекции культур – деструкторов ксенобиотиков среди 40 штаммов. В качестве активных микроорганизмов – деструкторов жиров – рекомендованы штаммы бактерий Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП, депонированные в Коллекции непатогенных культур Института микробиологии НАН Беларуси.

Исследование деструктивной активности показало, что модельная сточная вода с исходным химическим потреблением кислорода (ХПК) 2000 мг О2/л, очищается при совместном использовании вышеперечисленных микроорганизмов до ХПК – 450 мг О2/л (78%), а штаммами Bacillus sp. 6/2 АПФ-1, Rhodococcus ruber 2B, Rhodococcus erythropolis Р1-3ФН и Pseudoonas putida 10 АП – на 73, 49, 50 и 60% соответственно.

Введение. Проблема очистки хозяйственно-бытовых и промышленных сточных вод сохраняет свою актуальность. Однако в настоящее время из-за возрастающей антропогенной нагрузки, особенно в густонаселенных районах и крупных городах, ее решение приобретает особый смысл. Нерегулируемый сброс неочищенных бытовых и промышленных стоков вызывает определенные сложности в работе биологических очистных сооружений, ведущих очистку сточных вод с помощью активного ила. Компоненты биоценоза активного ила не способны справляться с высокими концентрациями загрязняющих веществ.

На очистных станциях аэрации проблемы очистки стоков связаны, в частности, с присутствием в воде значительного количества жировых отходов. Бытовые сточные воды и стоки предприятий пищевой промышленности, содержащие различные жиры и масла растительного и животного происхождения, очищаются от указанных веществ только механическим способом (жироловушки и т. д.), что в дальнейшем приводит к проблеме захоронения собранных жировых отходов.

Сточные воды, содержащие технические и пищевые масла и жиры в высоких концентрациях, являются проблемными для биологической очистки с помощью активного ила. Для обработки таких сточных вод в последнее десятилетие все активнее предлагаются способы с использованием активных штаммов бактерий – деструкторов жиров и масел.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмы активно синтезируют липолитические и другие ферменты, разлагающие органические вещества. При этом жировые вещества превращаются в безвредные для окружающей среды продукты.

Широко развитое в Республике Беларусь производство мясомолочной продукции, обширная сеть производств по переработке сельскохозяйственной продукции способствуют образованию гигантского количества производственных сточных вод, содержащих высокие концентрации жировых веществ. Отсутствие препаратов отечественного производства для интенсификации очистки таких сточных вод приводит в ряде случаев к сбросу их в водоемы республики и нанесению таким образом значительного экологического ущерба.

Цель исследования – скрининг и исследование активности микроорганизмов-деструкторов жировых веществ.

Объекты и методы исследования.

Объекты исследования:

отобранные из рабочей коллекции лаборатории 40 штаммов бактерий, способных расти на питательных средах, содержащих жировые вещества в различных концентрациях;

модельная сточная вода, содержащая масла растительного, животного и синтетического происхождения с ХПК, равным 2000 мг О2/л;

производственная сточная вода, представленная водным абсорбентом, образующимся в установке очистки вентвоздуха от барабана сушки стружки на РУП «Белцветмет». Данная производственная вода содержит в качестве загрязняющих ингредиентов масло моторное, углеводороды и ПАВ. Вода представлена в двух вариантах с ХПК 7000 и 8000 мг О2/л.

Оценку эффективности роста бактериальных культур на средах осуществляли ауксанографически на агаризованной сточной воде, содержащей 1% жировых веществ. Культивирование бактерий проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл среды Е-8, содержащей в качестве источника углерода 0,1% жировых веществ, в аэробных условиях на качалке, обеспечивающей 180 об/мин при температуре 29 °С. В каждую колбу добавляли 10% посевного материала.

Предварительное выявление липолитической активности отобранных микроорганизмов осуществляли на агаризованном 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4 (агар 2%) [1]. В качестве индикатора использовали метиловый красный (0,01%), а Твин-80 (2%) в качестве субстрата. Об активности судили по величине зоны гидролиза вокруг колоний.

Определение активности липазы проводили методом Ота, Ямада [2]. За единицу ферментативной активности липазы принимали такое количество фермента, которое освобождает 21 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37 °С в течение 1 ч.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05 н раствора NaH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липолитическую активность культур ЛС (в ед/г) определяли по формуле ЛС = А Т 50, (1) В где ЛС – липолитическая активность, ед/г; А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;

Т – титр щелочи; В – концентрация образца ферментного раствора, г/мл.

Для определения ХПК брали 1–5 см3 профильтрованной воды, прибавляли 2,5 см3 0,25 н раствора бихромата калия, 0,4 г сульфата ртути (II), 0,2–0,4 см3 сульфата серебра и при перемешивании приливали концентрированную серную кислоту (7,5 см3 на 1 см3 пробы, 15 см3 на 5 см3 пробы) [3]. При этом температура раствора поднимается до 100 °С. Через 2 мин раствор охлаждали до комнатной температуры, приливали 100 см3 дистиллированной воды и титровали избыток бихромата калия 0,25 н раствором соли Мора в присутствии 10–15 капель N-фенилантраниновой кислоты или 3–4 капель ферроина. Изменение окраски в первом случае от красной до изумрудно-зеленой, во втором – от голубовато-зеленой до красно-голубой.

Параллельно проводили контрольный опыт без сточной воды. ХПК выражали в миллиграммах кислорода на 1 л воды (мг О2/л).

Расчет производили по формуле (2):

ХПК = (V1–V2)ЧkЧ0 25Ч8Ч 1000 / V, (2) где ХПК – химическое потребление кислорода, мг О2/л; V1, V2 – объемы 0,25 н раствора соли Мора, израсходованные на титрование в контрольном опыте и пробы сточной воды, мл.

Результаты и их обсуждение. Скрининг микроорганизмов, использующих в качестве источника питания жиры и масла, в рабочей коллекции лаборатории провели среди 40 культур (табл. 1).

Хороший рост на средах, содержащих в качестве источника жировых веществ растительные масла и животные жиры, проявили 10 культур, среди которых доминировали 4 штамма.

Т а б л и ц а 1. Рост музейных культур на агаризованной среде Е-8, содержащей жиры и масла в качестве единственного источника углерода

–  –  –

Изучена способность четырех наиболее активных штаммов – Rhodococcus ruber 2B, Rhodococcus sp. Р1–3ФН, Pseudoonas putida 10 АП, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1 – использовать в качестве источника питания масла растительного и животного происхождения. Установлено, что микроорганизмы рода Rhodococcus – R. ruber 2B и R. sp. Р1-3ФН – проявляют большую активность в использовании моторного масла. Масло животного происхождения – сливочное, наиболее активно использует штамм бактерий Bacillus subtilis 6/2-АПФ1. Штамм Pseudoonas putida 10 АП наибольшую активность проявляет в использовании растительного масла.

У отобранных бактериальных штаммов проведено предварительное определение липолитической активности. Результаты первичного обнаружения липазы подтверждают ее наличие у штаммов, активно растущих на жировых веществах. Об этом свидетельствуют различные по диаметру зоны гидролиза, образуемые вокруг колоний исследуемых культур микроорганизмов за счет участия бактериальных экзоферментов. Наибольшей липолитической активностью обладали штаммы Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП, Pseudomonas fluorescens 12В, Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus erythropolis 70Ф, Rhodococcus erythropolis 23Ф, Rhodococcus opacus 100В, Rhodococcus opacus 29Д, Rhodococcus ruber 1В, Rhodococcus ruber 2B, обраB,, зующие зоны гидролиза более 15 мм. У активно гидролизующих Твин-80 культур микроорганизмов наличие зон гидролиза фиксируется через 24 ч инкубирования. Малоактивные в отношении данного субстрата культуры образуют зоны гидролиза менее 15 мм спустя 96 ч роста.

Липолитическая активность микроорганизмов, использующих в качестве единственного источника углерода жировые вещества, выявлена в культуральной жидкости исследуемых бактериальных штаммов (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Активность липазы у микроорганизмов, растущих на жировых веществах

Штамм Активность, ед/мг

Bacillus subtilis 6/2-АПФ1 0,68 Pseudomonas putida 10АП 0,65 Pseudomonas fluorescens 12В 0,30 Rhodococcus sp. Р1-3ФН 0,72 Rhodococcus erythropolis 70Ф 0,51 Rhodococcus erythropolis 23Ф 0,50 Rhodococcus opacus 100В 0,47 Rhodococcus opacus 29Д 0,52 Rhodococcus ruber 1В 0,60 Rhodococcus ruber 2B 0,70 Максимальная липолитическая активность среди исследованных 10 штаммов микроорганизмов обнаружена у Rhodococcus sp.

Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП. Липолитическая активность у этих штаммов соответствовала 0,650,70 ед/мг. Штаммы с более низкой липолитической активностью проявляли ее на уровне 0,3–0,6 ед/мг.

Штаммы Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП были оценены нами как наиболее перспективные для использования в разработке биотехнологии получения микробного препарата для интенсификации очистки сточных вод от жировых веществ.

Мировая практика микробной очистки сточных вод, содержащих в своем составе не более 3% жироподобных веществ, традиционно использует способы аэробной их обработки с помощью иммобилизованной и свободноплавающей бактериальной массы штаммов деструкторов липидов. Для исследований деструктивной активности отобранных штаммов микроорганизмов создавалась модельная сточная вода, содержащая масла растительного, животного и синтетического происхождения. ХПК модельной сточной воды доводили до 2000 мг О2/л.

Исследования деструктивной активности 4 штаммов провели в делительных воронках объемом 0,5 л в условиях постоянного поддержания стойкой эмульсии.

Установлено, что модельная сточная вода с исходным ХПК, равным 2000 мг О2/л, очищается при совместном использовании вышеперечисленных микроорганизмов до ХПК 450 мг О2/л (78%).

Каждый из индивидуально использованных в очистке модельной воды штаммов проявил различную активность в деструкции, содержащихся в ней жировых веществ. Использование Bacillus sp. 6/2 АПФ-1 способствовало очистке модельного стока на 73%, Rhodococcus ruber 2B – на 49%, Rhodococcus erythropolis Р1-3ФН – на 50%, Pseudoonas putida 10 АП – на 60%.

Культивирование микроорганизмов – Rhodococcus ruber 2B, Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Pseudoonas putida 10 АП, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1 осуществляли также на производственной сточной воде, представленной водным абсорбентом, образующимся в установке очистки вентвоздуха от барабана сушки стружки на РУП «Белцветмет». Данная производственная вода содержит в качестве загрязняющих ингредиентов масло моторное, углеводороды и ПАВ. Вода представлена в двух вариантах с ХПК 7 и 8 г О2/л.

Установлено, что в варианте выращивания культур на производственной воде с ХПК, равным 7000 мг О2/л, количество биомассы за 3 сут увеличилось в 2,5 раза, а ХПК снизилось до 4000 мг О2/л.

Увеличение концентрации масла в воде, используемой для выращивания микроорганизмов, вызывает снижение активности роста микроорганизмов и накопления ими биомассы. В производственной воде 2-го варианта через 3 сут ХПК снизилось с 8000 до 5000 мг О2/л при увеличении объема биомассы в 2 раза.

Разбавление производственной воды до ХПК 1000 мг О2/л приводит к увеличению скорости развития в ней микроорганизмов – деструкторов жировых веществ и очистке ее до ХПК 200 мг О2/л (ПДК сброса на биологическую очистку) в течение 48 ч.

Заключение. Проведен скрининг микроорганизмов – деструкторов жировых веществ в лабораторной коллекции культур – деструкторов ксенобиотиков среди 40 штаммов. В качестве активных микроорганизмов – деструкторов жиров отобраны штаммы бактерий Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП, депонированные в Коллекции непатогенных культур Института микробиологии НАН Беларуси.

У отобранных бактериальных штаммов проведено предварительное определение липолитической активности. Результаты первичного обнаружения липазы подтверждают ее наличие у штаммов, активно растущих на жировых веществах. Максимальная липолитическая активность среди исследованных 10 штаммов микроорганизмов обнаружена у Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП. Липолитическая активность у этих штаммов соответствовала 0,650,70 ед/мг.

Исследование деструктивной активности показало, что модельная сточная вода с исходным ХПК, равным 2000 мг О2/л, очищается при совместном использовании вышеперечисленных микроорганизмов до ХПК 450 мг О2/л (78 %), а индивидуально штаммом Bacillus sp. 6/2 АПФ-1 – на 73%, Rhodococcus ruber 2B – на 49%, Rhodococcus erythropolis Р1-3ФН – на 50%, Pseudoonas putida 10 АП – на 60% соответственно.

Литература

1. Пидопличко, Г. А. Выделение экстрацеллюлярных липидов из культуры дрожжей / Г. А. Пидопличко // Микроорганизмы – продуценты биологически активных веществ: сборник. Минск: Наука и техника, 1973. С. 15–18.

2. Ota, J. ipase from Candida paralipolytica. Part.1. Anionik surfactants as the esseutial activator in the systems emulsified by polyvinyl alcopol / J. ta, K. Jamada // Agric. Biol. Chem. – 1966. Vol. 30, N 4. P. 351–358.

3. Лурье, Ю. Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод / Ю. Ю. Лурье. – М.: Химия, 1984. – С. 288–302.

A. S. SAMSONOVA, E. M. HLUSHEN, M. S. CHYRYKOVA, G. M. PETROVA

MICROORGANISMS INTENSIFITING DEGRADATION

OF LIPID SUBSTANCES IN WASTEWATERS

Laboratory of xenobiotic degradation and bioreediation of natural and industrial edia creening for lipid decomposition ability was performed among 40 strains maintained at laboratory collection of cultures degrading xenobiotics. Bacterial strains Rhodococcus sp. R1-3N, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АP1, Pseudoonas putida 10АP deposited in Collection of non-pathogenic cultures, Institute of Microbiology, National Academy of ciences, Belarus were recommended as active lipid degraders. tudies on degradation activity have shown that mixed culture of afore-mentioned microbial strains brought down C level in model waste water from 2000 mg 2/l to 450 mg 2/l (78% decontamination efficiency), while purifying effect of single cultures Rhodococcus sp. R1-3N, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis 6/2-АP1, Pseudoonas putida 10АP constituted 73, 45, 50 and 60% respectively.

УДК 579.66;602.6

И. А. ГОНЧАРОВА, И. С. ВАЖИНСКАЯ, А. Н. КАПИЧ, А. А. БАЛЮТА, Н. В. ИКОННИКОВА, О. В. ОСАДЧАЯ

ПЛЕСНЕВОЕ ПОРАЖЕНИЕ

МИНЕРАЛОВОЛОКНИСТЫХ ПЛИТ

Лаборатория экспериментальной микологии и биоповреждений Проведено микологическое обследование минераловолокнистых плит «Неман» подвесного потолка с очагами плесневого поражения. Показано, что агентами биоповреждения плит стали грибы родов Aspergillus, Penicillium, Ulocladiu. Установлено, что новые плиты «Неман», хранящиеся в полиэтиленовой упаковке, обладают фунгистатической активностью, но после воздействия кислотных паров способны стимулировать рост плесневых грибов.

Исследована грибостойкость минераловолокнистых плит различных марок.

Показано, что наиболее легко подвержены плесневому поражению плиты «Байкал», в их составе присутствуют компоненты, которые могут служить источником углеродного питания для плесневых грибов. Высокую грибостойкость в условиях повышенной влажности, даже в присутствии минеральных загрязнений и после кислотного воздействия, проявили плиты «acla» и «Ecomin».

Введение. Подвесные потолки типа Армстронг из минераловолокнистых плит пользуются в настоящее время большой популярностью благодаря легкости, пожаробезопасности, высокой тепло- и звукоизоляционной способности и другим положительным качествам, обусловленным в первую очередь свойствами минеральной основы их базальтовых волокон [1]. В состав плит входят также перлит, вспенивающий волокна, связующие добавки, наполнители (глина, гипс, отработанная макулатура).

Связующие добавки, в качестве которых обычно используют крахмал или латекс, оказывают большое влияние на технические характеристики потолка. Например, преобладание латекса делает панели влагостойкими, присутствие крахмала повышает влагоемкость. Готовые минераловолокнистые плиты после грунтовки и окраски водоэмульсионными красками имеют гладкую, тисненую или перфорированную поверхность, обеспечивающую высокое звукопоглощение [2].

Большинство минераловолокнистых плит плохо переносят влажную атмосферу. Потолок из неводостойких минераловолокнистых плит при относительной влажности воздуха более 70% может провисать или коробиться [2].

Отмечаются также случаи колонизации навесных потолков типа Армстронг плесневыми грибами.

Цель исследования – оценка стойкости к плесневому поражению минераловолокнистых плит различных марок.

Объекты и методы исследования. Образцы минераловолокнистых плит были предоставлены для исследования строительными организациями г. Минска. Выделение плесневых грибов из пораженных плит проводили на среде Чапека–Докса.

Идентификацию доминирующих культур производили с помощью соответствующих определителей [3–5].

Оценку устойчивости минераловолокнистых плит к поражению плесневыми грибами проводили экспресс-методом «агаровая сетка», позволяющим создавать условия влажности, оптимальные для развития грибов [6]. Длительность испытания – 7 сут.

Для формирования на образцах агаровой сетки использовали:

а) среду Чапека–Докса с сахарозой в концентрации 2% (имитация органических загрязнений); б) агаризованную среду Чапека– Докса без источника углерода (имитация минеральных загрязнений); в) агаровый гель (повышенная влажность в отсутствии загрязнений). Плиты доставали непосредственно из упаковки, вырезали образцы размером 20 20 5 мм, и помещали в чашки Петри с увлажненными бумажными фильтрами, расположив так, чтобы верхняя поверхность являлась 1) лицевой стороной, 2) внутренней волокнистой частью, 3) обратной стороной плит.

Питательную среду, инокулированную спорами тест-культуры гриба, переносили на испытуемые образцы, находящиеся в чашках Петри с увлажненными бумажными фильтрами, и равномерно распределяли по поверхности образцов в присутствии сетчатого шаблона. После снятия шаблона на образце оставалась «агаровая сетка», представляющая собой тонкий слой питательной среды, разделенный на микроблоки сетью борозд.

Чашки Петри инкубировали в термостате при температуре 28 °С. Ежедневно 2–3 ячейки агаровой сетки переносили на предметные стекла и микроскопировали в проходящем свете для определения стадии развития плесневых грибов. При этом использовали следующие обозначения: «–» – проросшие споры отсутствуют, «±» – у единичных спор едва заметные проростковые трубки, «+» – массовое прорастание спор, «++» гифы образуют сеть, – обрастание или спороношение, видимое невооруженным глазом. Критерием грибостойкости служила лаг-фаза, т. е. время от нанесения агаровой сетки на образцы до начала массового прорастания спор (+).

Для имитации воздействия на минераловолокнистые плиты атмосферных выбросов кислотной природы образцы помещали в эксикатор, на дне которого находился 1,0%-ный раствор азотной кислоты. После 7 сут экспозиции образцы высушивали и использовали вместе с контрольными для определения их фунгитоксичности по ГОСТ 9.049-91, сущность которого состоит в том, что материал заражают спорами плесневых грибов в водном растворе минеральных солей [7]. Стадии развития грибов определяли по шестибалльной шкале: 0 – абсолютно чистые образцы при визуальном осмотре и под микроскопом; 1 – визуально чистые образцы, при осмотре под микроскопом видны проросшие споры и незначительно развитый мицелий; 2 – виден развитый мицелий, возможно спороношение; 3 – невооруженным глазом мицелий и/или спороношение едва видны, но отчетливо видны под микроскопом; 4 – невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрывающих менее 25% испытуемой поверхности; 5 – невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрывающих более 25% испытуемой поверхности.

Результаты и их обсуждение. Навесные потолки типа Армстронг из минераловолокнистых плит «Неман» (Китай), смонтированные в многоэтажном общественном здании, при производстве внутренних строительных работ с работающей системой центрального отопления в течение года находились в удовлетворительном состоянии. Затем практически одновременно на потолочных плитах появились очаги плесневого поражения, при этом коробления плит, свидетельствующего о намокании, нигде не наблюдалось.

Осмотр демонтированных плит выявил очаги интенсивного развития плесневых грибов в виде колоний, покрытых спорами зеленого, черного или желто-бурого цвета (рис. 1).

Идентификация изолятов показала, что в очагах плесневого поражения доминировали представители родов Penicillium и Aspergillus, из которого были идентифицированы до вида A. niger, A. flavus, A. ochraceus. Редкие крупные черные колонии принадлежали Ulocladiu chartarum.

В настоящее время для монтажа подвесных потолков в Беларуси наиболее часто используют минераловолокнистые плиты «Байкал» (Россия), совмещающие эксплуатационные достоинства с низкой стоимостью. Минераловолокнистые плиты «Неман»

а б Рис. 1. Внешний вид минераловолокнистых плит, колонизированных микроскопическими грибами: а – плесневое поражение подвесного потолка типа Армстронг; б – колонии грибов на минераловолокнистых плитах «Неман»

китайского производства появились на рынке стройматериалов лишь недавно.

Сравнительное исследование структуры сухих образцов минераловолокнистых плит марок «Неман» и «Байкал», хранящихся в полиэтиленовой упаковке, выявило их значительное сходство по внешнему виду. Однако после часового намачивания образцов в дистиллированной воде стали заметны различия в структуре плит. В плитах «Байкал» появились шаровидные гранулы органической добавки (рис. 2).

Для оценки грибостойкости минераловокнистых плит в качестве тест-культуры использовали гриб A. niger, выделенный из очага плесневого поражения плиты «Неман». Однако в агаровой сетке полноценной среды Чапека–Докса, нанесенной на красочное покрытие плит «Неман», споры A. niger даже не проросли, тогда как интенсивное обрастание образцов плит «Байкал»

было хорошо видно невооруженным глазом.

Данный факт послужил основанием для проведения проверки грибостойкости и других минераловокнистых плит, представленных на рынке стройматериалов Республики Беларусь.

Оценка интенсивности прорастания спор гриба A. niger в агаровой сетке среды Чапека–Докса показала, что фунгистатическую активность проявляют лишь плиты «Неман» в отличие от исследованных образцов плит других марок (табл. 1).

Рис. 2. Структура минераловолокнистых плит «Неман» и «Байкал»

Т а б л и ц а 1. Время от посева до начала роста A.

niger на образцах минераловолокнистых плит с агаровой сеткой различного состава

–  –  –

П р и м е ч а н и е. Обозначения: ЧДА – среда Чапека–Докса, МА – минеральные компоненты среды Чапека–Докса, ГА – агаровый гель.

На питательной среде, находящейся в контакте с образцами «Неман», за все время испытания формирования полноценных гиф не наблюдалось, развитие единичных проростков остановилось на начальной стадии. На поверхности других плит наблюдалось только замедление развития гриба, в разной степени выраженное по сравнению с контролем.

В агаровой сетке минеральных компонентов среды Чапека– Докса наблюдалось сравнительно активное развитие грибов на обратной стороне и внутренней части плит «Байкал» и «une».

Аналогичное явление наблюдалось и в сетке агарового геля. Это дает основание говорить о наличии в их составе компонентов, которые могут служить источником углеродного и минерального питания для плесневых грибов. При отсутствии внешнего источника углерода грибы не развивались на плитах «acla» и «Ecomin».

С целью изучения причины, почему плиты «Неман» за год нахождения на потолках здания, строящегося на оживленной магистрали г. Минска, утратили фунгитоксичность, было исследовано воздействие на данные плиты, а также плиты «Байкал», «acla»

и «Ecomin» газообразных соединений кислотного характера.

Оценку грибостойкости после воздействия паров азотной кислоты из разбавленного раствора проводили по ГОСТ 9.049-91 (табл. 2).

Результаты испытания показали, что плиты «Неман» при подкислении теряют свои фунгитоксические свойства, стимулируя при этом рост плесневых грибов. При воздействии паров кислоты на минераловолокнистые плиты «Байкал», «acla»

и «Ecomin» их грибостойкость практически не изменилась (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Оценка грибостойкости минераловолокнистых плит до и после воздействия паров кислоты по ГОСТ 9.

049–91

–  –  –

Заключение. Минераловолокнистые плиты подвесных потолков в процессе эксплуатации подвержены опасности плесневого поражения. В том случае, если минераловолокнистые плиты содержат биоцидные добавки, необходимо учитывать, что их эффективность во многом зависит от экологической обстановки и других внешних условий. Предварительная проверка грибостойкости плит в моделируемых условиях позволит избежать экономических потерь, связанных с биокоррозией материалов.

Литература

1. Перспективы использования отходов горных пород в товарах народного потребления / О. С. Татаринцева [и др.] // Горный журнал. – 1998. – № 7. – С. 40–41.

2. Сбитнева, Е. М. Отделочные работы / Е. М. Сбитнева. – М.: Вече, 2005. – 103 с.

3. Литвинов, М. А. Определитель микроскопических почвенных грибов / М. А. Литвинов. – Л.: Наука, 1967. – 303 с.

4. Compendium of soil fungi / K. H. omsch [et al.]. – ondon: Acad. Press, 1980. – Vol. 1. – 859 p.

5. Билай, В. И. Аспергиллы: Определитель / В. И. Билай, Э. З. Коваль;

АН УССР, Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного. – Киев:

Наук. думка, 1988. – 204 с.

6. Гончарова И. А. Экспресс-оценка эффективности защиты материалов от плесневых грибов / И. А. Гончарова, А. Г. Мицкевич, Н. М. Ровбель // III Всерос.

конгр. по мед. микологии «Успехи медицинской микологии», Москва, 24–25 марта, 2005 г.: материалы. – М.: Нац. акад. микологии, 2005.– Т. 5.– С. 61–63.

7. ГОСТ 9.049–91: «Материалы полимерные и их компоненты. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов». – М.: Госстандарт, 1995. – 16 с.

I. А. GONCHAROVA, I. S. VAZHYNSKAYA, A. N. КAPICH, N. V. IKONNIKOVA, A. A. BALIUTA, O. V. OSADCHAYA

MOULD DAMADE OF MINERAL FIBER CEILING TILES

Laboratory of experiental ycology and biodeterioration Micromycetes belonged to genera Aspergillus, Penicilliu, Ulocladiu were isolated from ceiling panels «Neman». Resistance of mineral fiber ceiling tiles to mould fungi was investigated. It was shown that activity of biocide additives in ceiling panels «Neman» depends on environmental conditions. Ceiling tiles «acla»

and «Ecomin» do not favour the development of mould fungi.

УДК 579.23+579.22

И. И. АЛЕШКЕВИЧ, Г. И. НОВИК

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕВЫХ

КУЛЬТУР ИЗ ФИЛЛОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ РАЗЛИЧНЫХ

РЕГИОНОВ БЕЛАРУСИ

Лаборатория «Коллекция микроорганизмов»

Выделено 150 изолятов дрожжевых грибов из филлосферы растений различных регионов Беларуси. Исследованы морфологические и физиолого-биохимические свойства культур дрожжей вида Saccharoyces cerevisiae. Отобрана и идентифицированна наиболее активная культура дрожжей Saccharoyces cerevisiae АЛЕ 2, отличающаяся высоким уровнем продукции этанола и накопления биомассы.

Введение. Дрожжи и дрожжеподобные грибы очень широко распространены в природе. Дрожжи активно размножаются в тех субстратах, где имеются доступные растворимые источники углерода – сахара, спирты, органические кислоты, т. е. в соках, сиропах, на плодах, в нектаре цветов, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в воде и почве. Отдельные виды дрожжей могут быть возбудителями заболеваний насекомых, теплокровных животных и человека.

С давних времен дрожжи используют в заквасках для получения хлеба и кисломолочных продуктов, при изготовлении пива, сидра, виноградных и ягодных вин, спирта и крепких напитков. Из дрожжей получают липиды и полисахариды, белки и многоатомные спирты, органические кислоты, витамины и ферменты. Дрожжевые препараты находят применение в медицине, фармакологии и в качестве кормовых добавок.

Экологические особенности, отражающие адаптацию дрожжевых популяций к специфическим условиям среды обитания, могут служить одним из критериев в дифференциации видовых таксонов [10]. Дрожжи являются хемоорганогетеротрофами и используют органические соединения как для получения энергии, так и в качестве источника углерода. Для практического применения важны продукты вторичного метаболизма дрожжей, выделяемые в небольшом количестве в среду: сивушные масла, ацетон, диацетил, масляный альдегид, изоамиловый спирт, диметилсульфид и др.

Дрожжи и дрожжеподобные грибы – представители микробиоценоза филлосферы растений различных географических широт. Сведения литературы об эпифитных микроорганизмах довольно немногочисленны. Так, приводятся данные о смене видового состава дрожжей в течение вегетативного периода в зависимости от погодных условий и стадий развития растения, а также об их функциональной роли в жизнедеятельности растений [1–4]. Установлено, что на листьях растений в умеренной полосе доминируют базидиомицетовые дрожжи. Основную долю среди них составляют филобазидиевые и тремелловые криптококки (Cryptococcus albidus, Cr. laurentii); краснопигментированные виды рода Rhodotorula; баллистоспоровые дрожжи вида Sporoboloyces roseus. Среди аскомицетовых дрожжей в филосфере наиболее обильны анаморфные виды рода Candida [5–8]. Особенно интенсивно дрожжи развиваются в сопряженных с филлосферой субстратах, характеризующихся высоким содержанием сахаров, особенно в нектароносных цветках, сочных плодах [9]. В то же время особенности экологии эпифитных дрожжей изучены далеко не достаточно, особенно с учетом необходимости таких знаний для эффективного скрининга дрожжевых штаммов, представляющих ценность для биотехнологии.

Знания природного местообитания и особенностей экологической ниши способствуют более широкому пониманию биологии вида, его роли в экосистемах; а также могут быть использованы в биодиагностических целях и для направленного поиска культур дрожжей, необходимых для исследований.

Цель исследования – выделение дрожжей из природных источников, преимущественно филлосферы растений, и характеристика физиолого-биохимических свойств выделенных культур.

Объекты и методы исследования. Материалом для исследований служили образцы филлосферы растений, отобранные на территории 7 районов Минской области, 5 районов Могилевской области, 5 районов Брестской области, 5 районов Гомельской области. Анализ проводили в течение жизненного цикла растения, начиная от зачаточных почечных листьев и заканчивая отмирающими листьями в подстилке. Цветки изучали начиная от момента образования бутонов, во время активного цветения, увядания и образования плодов. Отбор проб для микробиологического анализа проводили путем смыва или отпечатка с твердой поверхности частей растения: листа, цветка или плодов. Присутствие дрожжей в жидких образцах устанавливали путем микроскопирования препаратов. Использовали также метод концентрирования образцов на центрифуге Hermle Z32 НК при 2000 g в течение 15–20 мин с последующим микроскопированием препаратов.

Посевы проводили непосредственно в день сбора образцов или в течение 2–3 последующих дней.

Смыв дрожжевых культур производили стерильной водой непосредственно с поверхности частей растений, помещая образец в колбу. Суспензионную жидкость встряхивали и проводили высев на плотную питательную среду. Для выделения дрожжей листья и цветки измельчали, отбирали из каждого образца 3–4 навески, заливали аликвотным количеством стерильной воды и обрабатывали на приборе «Bio Vortex» в течение 10 мин. Полученную суспензию высевали на чашки с питательной средой.

Для изоляции культур дрожжей применяли также метод отпечатков. Для этого исследуемые растительные объекты прижимали к поверхности плотной питательной среде, затем образец удаляли, а чашки со средой инкубировали в термостате [11].

Исследуемые образцы высевали на глюкозо-пептонную среду (5 г/л дрожжевого экстракта; 10 г/л пептона; 20 г/л глюкозы;

20 г/л агара), подкисленную для предотвращения роста бактерий молочной кислотой до рН 4–4,5 [12]. Опыты проводили в трех повторностях. Чашки с посевами инкубировали при температуре 26–28 °С в течение 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а затем переворачивали чашки во избежание попадания на поверхность агара капель конденсата с крышки. Выросшие колонии дрожжей с помощью бинокулярной лупы разделяли по морфологическим признакам [11, 13].

Получение чистых культур дрожжей проводили методом посева на агаризованные среды. Посевы проводили из суспензии пипеткой либо петлей по принципу «истощающего штриха». Каплю суспензии, содержащую дрожжевые клетки, наносили на поверхность застывшей подсохшей среды в чашке Петри. Стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяли каплю по поверхности. Этим же шпателем засевали еще 2–3 чашки на случай, если в первой чашке будет обильный рост колоний. Посев «истощающим штрихом» проводили петлей, прожигая петлю после каждого посева штриха. Процесс выделения чистой культуры заканчивали пересевом из отдельной выросшей изолированной колонии в пробирку со свежей питательной средой.

Контролем чистоты выделенной культуры служили однородность клеток под микроскопом и однотипность колоний на чашке при последующем рассеве [11].

Проводили скрининг полученных изолятов по признаку скорости роста колоний на плотной питательной среде. Для определения уровня накопления биомассы дрожжи культивировали на глюкозо-пептонной среде в колбах Эрленмейера на качалке со скоростью вращения ротора 130 об/мин при 28 °С. Уровень накопления биомассы определяли нефелометрически, путем измерения оптической плотности 72-часовой культуры (контролем служила стерильная среда) при длине волны 590 нм (D590).

Активность кислотообразования определяли потенциометрически. Статистический анализ данных проводили с использованием пакета программ Microsoft ffice Excel 2003.

Для первичной идентификации определяли способность исследуемой культуры сбраживать сахара. Для этого использовали трубки Дунбара. Для исследования готовили 2%-ные растворы сахаров: D-арабинозы, D-галактозы, глюкозы, декстрозы, ксилозы, лактозы, мальтозы, мелибиозы, мелезитозы, -метилглюкозида, рамнозы, раффинозы, рибозы, сахарозы, солодового экстракта, трегалозы, целлобиозы в дистиллированной воде. Растворы сахаров разливали в стерильные трубки Дунбара по 5 мл так, чтобы в слепом колене трубки не было пузырьков. Инокуляцию посевов производили культурами, выращенными на сусло-агаре (по 1 петле d 3 мм). Инкубация длилась до 24 ч. О способности культуры к сбраживанию сахаров судили по интенсивности газообразования [14–18].

Результаты и их обсуждение. Всего в ходе работы из филлосферы растений и растительных субстратов (цветки, плоды, опад) было выделено 150 изолятов дрожжей. В результате разделения в чистую культуру выделено 80 дрожжевых культур, обитающих на поверхности вегетативных и генеративных частей растений.

По признаку скорости роста колоний были отобраны 12 культур (АЛЕ 1, АЛЕ 2, АЛЕ 9, АЛЕ 13, АЛЕ 20, АЛЕ 38, АЛЕ 39, АЛЕ 47, АЛЕ 54, АЛЕ 55, АЛЕ 56, АЛЕ 59) диаметр колоний, которых через 3 сут роста на сусло-агаре составлял 4–5 мм, в то время как диаметр колоний остальных культур не превышал 2–3 мм.

Для отобранных культур дрожжей выполнена сравнительная характеристика морфологических и физиологических свойств.

Колонии на сусло-агаре через 3 сут культивирования при +25 °С молочные, бежевые и светло-розового цвета диаметром 5–6 мм, блестящие и матовые, округлой формы, внутренняя структура гомогенная, консистенция мажущаяся (рис. 1). Для изучения а б

–  –  –

Рис. 1. Макро- (600) и микроморфология (14) культур дрожжей: а, б – культура, выделенная с поверхности ягод крыжовника обыкновенного Ribes uva-crispa;

в, г – культура, выделенная с поверхности ягод земляники садовой Fragria ananssa; д, е – культура, выделенная с поверхности листа сливы домашней Prunus doestica морфологии дрожжевых клеток использовали световую микроскопию (600). При микроскопировании описаны клетки разнообразной формы: округлые, овальные, эллипсовидные или цилиндрические удлиненные (рис. 1).

Изменений морфологии клеток в динамике развития популяции не происходило.

При культивировании отобранных культур дрожжей в колбах на качалке о скорости накопления биомассы в динамике развития популяции судили по показателям оптической плотности культуральной жидкости. Наиболее высокие показатели оптической плотности наблюдали в 1-е сутки культивирования для культур АЛЕ 1 и АЛЕ 2 (1,86 и 1,800 соответственно). На 3-и сутки культивирования для большинства исследуемых культур регистрировали сходное значение оптической плотности культуральной жидкости (2,0), наибольшее количество биомассы накапливали культуры АЛЕ 1 и АЛЕ 2 (рис. 2).

Измерение рН культуральной жидкости исследуемых дрожжей при выращивании на жидкой глюкозо-пептонной среде показало, что на протяжении 24 ч происходило подкисление среды с 6,4 до 4,6 продуктами метаболизма. Через 48 ч происходило подщелачивание в среднем на 0,9 единиц, а через 96 ч периодиРис. 2. Динамика изменения оптической плотности культуральной жидкости дрожжей при выращивании на глюкозо-пептонной среде ческого глубинного культивирования показатель рН снижался для всех исследуемых культур (рис. 3). Такие показатели свидетельствуют об активном усвоении источников углеродного питания – вначале легко усваиваемых, затем более сложных для утилизации.

С целью отбора продуктивной культуры для этанольной ферментации сахаров проверяли сбраживающую активность у изучаемых штаммов. Установлено, что наибольшими показателями сбраживающей активности обладали культуры АЛЕ 2 и АЛЕ 59 (6,3 и 6,2 г/л соответственно), причем максимум продукции этанола наблюдался в 1-е сутки культивирования. В то же время установлено, что максимальная концентрация этанола при развитии культур АЛЕ 54 и АЛЕ 47 наблюдалась только через 48 ч культивирования (рис. 4).

Для дальнейших исследований и идентификации отобрана культура АЛЕ 2, для которой наблюдались наиболее высокие показатели накопления биомассы и продукции этанола.

Рис. 3. Динамика изменения рН культуральной жидкости дрожжей при выращивании на глюкозо-пептонной среде Рис. 4. Динамика изменения содержания этанола в культуральной жидкости дрожжей при выращивании на глюкозо-пептонной среде Описание морфологии культуры АЛЕ 2 проведено с учетом стандартных требований международных кодов. В исследовании для сравнения использовали типовые штаммы дрожжевых грибов вида Saccharoyces cerevisiae из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Макроморфологию дрожжевых колоний изучали на плотной питательной среде – сусло-агаре. Колонии культуры АЛЕ 2 – круглой формы с цельным краем, гладкой и блестящей поверхностью, непрозрачные, светло-палевого цвета. Консистенция колоний маслянистая. Для культуры в жидкой питательной среде характерен кольцевой рост с образованием легко диспергирующего осадка. Мутность жидкой культуры была равномерно дисперсной. С целью изучения морфологии клеток проводили микроскопирование. В поле зрения наблюдали клетки сферической формы, 3–5 мкм в диаметре, расположенные одиночно (рис. 5).

Для дрожжевых грибов АЛЕ 2 характерно вегетативное размножение многосторонним почкованием, наблюдается также спороношение. Споры дрожжей округлые или овальные, по 1–4 аскоспоры в аске. Процесс образования спор наблюдали на среде Городковой.

а б Рис. 5. Макро- (600) и микроморфология (14) культуры АЛЕ 2 Исследование физиолого-биохимических особенностей культуры проводили в соответствии с общепринятыми методиками. Установлено, что оптимальной температурой роста для культуры АЛЕ 2 является t = 23–26 °С, рН среды в пределах 5,5– 5,7. Установлено, что дрожжи ассимилируют следующие источники углерода: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, мелицитозу, этанол, молочную кислоту и -метил-D-глюкозид. Нитраты не ассимилируют. Рост на безвитаминной среде отсутствует. При культивировании в течение 72 ч культуральная жидкость имеет характерный спиртовой запах. Культура охарактеризована по физиолого-биохимическим признакам согласно таксономическому ключу, приведенному в определителе J. A. Barnett [15]. С использованием универсальных классических методов идентификации дрожжей на основании определителей [14–18] установлено, что культура дрожжей АЛЕ 2 по морфолого- и физиолого-биохимическим характеристикам относится к виду Saccharoyces cerevisiae.

Таким образом, из филлосферы растений и других растительных субстратов (цветки, плоды, опад) было выделено 150 изолятов дрожжей. В результате разделения в чистую культуру выделено 80 культур дрожжей, обитающих на поверхности вегетативных и генеративных частей растений. Отобрана и идентифицированна наиболее активная культура дрожжей Saccharoyces cerevisiae АЛЕ 2, отличающаяся высоким уровнем продукции этанола и накопления биомассы.

Литература

1. Menna di M. E. ome physiological characters of yeasts from soil and allied habitats / M. E. di Menna // J. en. Microbiol. – 1959. – N 1. – P. 20.

2. Возняковская, Ю. М. Эпифитные дрожжевые организмы / Ю. М. Возняковская // Микробиология. – 1962. – Т. 31, № 4. – С. 616–620.

3. Квасников, Е. И. Дрожжевая флора ризосферы и филлосферы растений / Е. И. Квасников, С. С. Нагорная, И. Ф. Щелокова // Микробиология. – 1975. – Т. 44, № 2. – С. 339–345.

4. Нагорная, С. С. Дрожжи ризосферы и филлосферы растений и некоторые особенности их физиологии: автореф. дис. … канд. биол. наук / С. С. Нагорная. – М., 1973. – 24 c.

5. Бабьева, И. П. Состав и численность дрожжей в филлосфере растений / И. П. Бабьева, Б. Ф. Садыков // Микология и фитопатология. – 1980. – Т. 14, № 6. – С. 473–476.

6. Дрожжи в структуре лесных и луговых биоценозов / И. П. Бабьева [и др.] // Вестн. МГУ. Сер. биология, почвоведение. – 1973. – № 6. – С. 67–73.

7. Голубев, В. И. Дрожжи филлосферы в дальневосточном заповеднике «Кедровая падь» / В. И. Голубев // Сибир. биол. журн. – 1992. – № 2. – С. 37–42.

8. Максимова, И. А. Структура сообществ дрожжевых грибов в лесных биоценозах / И. А. Максимова, И. Ю. Чернов // Микробиология. – 2004. – Т. 73, № 4. – С. 558–566.

9. Бабьева, И. П. Биология дрожжей / И. П. Бабьева, И. Ю. Чернов. – М.: Товарищество науч. изданий КМК, 2004. – 221 с.

10. Phaff, H. J. he species concept in yeast: physiologic, morphologic, genetic and ecologic parameters / H. J. Phaff // Abstr. V Int. ymp. on Yeasts, July 20–25, 1980. – ondon; ntario (Canada), 1980. – P. 209–221.

11. Бабьева, И. П. Методы выделения и идентификации дрожжей / И. П. Бабьева, В. И. Голубев. – М.: Пищевая промышленность, 1979. – 120 с.

12. Мудрецова-Висс, К. А. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / К. А. Мудрецов-Висс, С. А. Колесник, Т. И. Гринюк. – М.:

Экономика,1975. – 151 с.

13. Аникеев, В. В. Руководство а практическим занятиям по микробиологии / В. В. Аникеев, К. А. Лукомская. – М.: Просвещение, 1983. – 127 с.

14. he Yeasts. A axonomic tudy. econd revised and enlarged edition / ed.

by J. odder. – elft: North-Holland Publishing Company, 1970. – P. 595–604.

15. Barnett, J. A. A New Key to the Yeasts. A key for identifying yeasts based on physiological tests only / J. A. Barnett, R. J. Pankhurst. – elft: North-Holland Publishing Company, 1974. – 273 p.

16. Barnett, J. A. A guide to identifying and classifying yeasts / J. A. Barnett, R. W. Payne,. Yarrow. – Cambridge: University Press, 1979. – 375 p.

17. he Yeasts. A taxonomic study / ed. by N. J. W. Kreger-van Rij. – Amsterdam:

Elsevier, 1984. – 1040 p.

18. enetic and molecular delineation of three sibling species in the Hansenula polyorpha complex /. I. Naumov [et al.] // ystem. Appl. Microbiol. – 1997. – Vol. 20. – P. 1045–1050.

I. I. ALIASHKEVICH, G. I. NOVIK

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF YEAST CULTURES FROM

PHILLOSPHERE OF PLANTS DIFFERENT REGIONS OF BELARUS

Microbial collection laboratory 150 variants of yeast-like fungi were isolated from phillosphere of plants growing in various regions of Belarus. Morphological, physiological and biochemical properties of yeast cultures affiliated to species Saccharoyces cerevisiae. he most active culture of yeast Saccharoyces cerevisiae AE 2 distinguished by elevated levels of ethanol production and biomass accumulation was selected and identified.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение...................................................... 3 Коломиец Э. И., Здор Н. А., Стефанович Л. И. Эффективность выполнения Государственной научно-технической программы «Промышленные биотехнологии» на 2006–2010 годы................................ 7

МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ

МИКРООРГАНИЗМОВ.......................................... 13 Рымко А. Н., Квач С. В., Кухарская Т. А., Береснев А. И., Зинченко А. И. Создание рекомбинантного штамма-суперпродуцента мутантной кислой фосфатазы Enterobacter aerogenes................................. 13 Береснев А. И., Kвач С. В., Зинченко А. И. Создание рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего пуриннуклеозидфосфорилазу Klebsiella pneumoniae............................................. 22 Бурко Д. В., Квач С. В., Зинченко А. И. Создание штамма Escherichia coli – продуцента рекомбинантной лизил-тРНК-синтетазы Thermus thermophilus и применение ее для синтеза диаденозинтетрафосфата................. 33 Коровашкина А. С., Квач С. В., Зинченко А. И. Создание штаммов-продуцентов рекомбинантной дигуанилатциклазы Thermotoga maritime... 43 Барейко А. А., Сидоренко А. В., Новик Г. И., Синеокий С. П. Физиологобиохимические свойства культур лактококков.................... 52 Сапунова Л. И., Богданова Л. Л. -амилазы бифидо- и молочнокислых бактерий...................................................... 65 Сапунова Л. И., Лобанок А. Г., Павлюк А. Н., Ерхова Л. В., Костеневич А. А.

Синтез бета-галактозидазы и протеиназы бактериями рода Arthrobacter, растущими в средах различного состава........................... 80 Пучкова Т. А., Черноок Т. В., Серова О. О., Щерба В. В. Влияниие индолилуксусной кислоты на рост и биохимический состав мицелия ксилотрофных базидиомицетов............................................. 90

МИКРОБНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА... 98

Коломиец Э. И., Купцов В. Н., Сверчкова Н. В., ЕвсегнееваН. В., МандрикЛитвинкович М. Н., Мишин Л. Т., Войтка Д. В., Рапопорт А. И., Хрусталева Г. М.

Бактерии Pseudomonas aurantiaca БИМ В-446 – основа биопрепарата Экогрин для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники................................... 98 Сверчкова Н. В., Заславская Н. С., Колосовская М. С., Романовская Т. В., Коломиец Э. И. Пробиотические препараты для кормопроизводства на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus................ 107 Головнева Н. А., Щетко В. А., Рябая Н. Е. Перспективы использования биопрепаратов на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов в ветеринарной практике и медицине............................. 119 Головнева Н. А., Рябая Н. Е, Щетко В. А., Самарцев А. А., Морозова А. Н.

Пробиотические препараты для иммунокоррекции, стимуляции роста и развития молодняка сельскохозяйственных животных............ 132 Герасимович А. Д., Новик Г. И., Коломиец Э. И. Характеристика бактериофагов фитопатогенных бактерий.................................. 140 Сафронова Г. В., Суховицкая Л. А., Короленок Н. В., Аутко А. А., Аутко Ан. А., Позняк О. В. Влияние комплексных хлорсодержащих и бесхлорных удобрений на ризосферный микробоценоз корнеплода моркови................ 154 Пучкова Т. А., Черноок Т. В., Осадчая О. В., Капич А. Н Сравнительное изучение роста грибов рода Cordyceps при поверхностном и глубинном культивировании............................................... 169 Воронкович Н. В., Ананьева И. Н., Коломиец Э. И. Оптимизация состава питательной среды и условий глубинного культивирования бактерий Bасillus subtilis 17 – основы биопрепарата для защиты картофеля от грибных и бактериальных болезней............................... 178

БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ.. 190

Зинченко А. И. ДНК как лекарственное средство.................... 190 Циркунова Ж. Ф., Михайлова Р. В., Лобанок А. Г., Войтка Д. В., Прищепа Л. И., Янковская Е. Н. Гидролитические ферменты энтомопатогенных грибов. 203 Ижик А. В., Новик Г. И. Бактериальная гистадгезия: роль соединений липидной природы.............................................. 212 Киселева Е. П., Новик Г. И. Поликлональные антититела кролик к анти- генам лактобактерий: получение, характеристика, перспективы использования в производстве продуктов питания, биологически активных добавок, медицинской диагностике................................... 227

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Похожие работы:

«Приказ Минздрава России от 15.11.2012 N 927н Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пострадавшим с сочетанными, множественными и изолированными травмами, сопровождающимися шоком (Зарегист...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии...»

«Устав зеленых Европы Руководящие принципы Партии зеленых Европы Принят на 2-ом съезде ПЗЕ Женева, 13-14 октября 2006 года Коротко о нас Зеленые Европы с гордостью заявляют, что они сторонники устойчивого развития человечества на Земле, развития, которое основывается на п...»

«Православие Православная версия происхождения зла "Мельников И.В." Православная версия происхождения зла / "Мельников И.В.", 2012 — (Православие) ISBN 978-5-457-19379-6 В основе всех религий лежит понимание того, что такие совершенные и сложно устроенные создания, как мы с вами, не могут прост...»

«ООО "С-Терра СиЭсПи" 124498, г. Москва, Зеленоград, Георгиевский проспект, дом 5, помещение I, комната 33 Телефон/Факс: +7 (499) 940 9061 Эл.почта: information@s-terra.ru Сайт: http://www.s-terra.ru Программный комплекс С-Терра Шлюз Экспортный. Версия 4.1 Руководство администратора Настройка шлюза РЛКЕ.0...»

«НАЗАРЕНКО Александр Владимирович СИСТЕМА ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КОМПЕТЕНТНОСТНО-ОРИЕНТИРОВАННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦИЯ на соискание у...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт неразрушающего контр...»

«Topical issues of law: theory and practice. №26. 2013 вопорядка как объективную необходимость развития государства и общества. Охарактеризованы особенности правоохранительной деятельности по обеспечению внутренней безопаснос...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижневартовский государственный университет" Естественно-географический факультет Рабочая программа дисциплины (модуля) Б1.В.ОД.5 Геоэкологическое картографи...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра геоморфологии и геоэкологии Формирование геолого-геоморфологических понятий в школьных курса...»

«Мензбирлік орнитологиялы оамы л-Фараби атындаы аза лтты университеті азастан Республикасы БМ К "Зоология институты" РМК СОЛТСТІК ЕУРАЗИЯНЫ XIV ХАЛЫАРАЛЫ ОРНИТОЛОГИЯЛЫ КОНФЕРЕНЦИЯСЫ (Алматы, 18-24 тамыз 2015 ж.) I. Тезистер Бізді демеушілеріміз: "Мензбирлік орнитологиялы оамы" "азастанны лтты географиялы оамы (Г) "азастан...»

«1 Уважаемый Сергей Ефимович, Уважаемые коллеги. Особое внимание Службой уделяется работе по обеспечению природоохранного законодательства в районе строительства олимпийских объектов г. Сочи. Результаты нашей текущей деятельности взаимоувязаны с основными экологическими обязательствами в рамка...»

«2015 Географический вестник 2(33) Экология и природопользование ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ УДК 004.6:581.55 П.Н. Бахарев, В.В. Семенов, Д.Н. Андреев27 ГЕОИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА ДАННЫХ ТЕРРИТОРИИ ЗАПОВЕДНИКА "ВИШЕРСКИЙ" В статье приведены результаты...»

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как и выживаемость, привлекает многих ученых. Однако сами эти понятия в русском языке несу...»

«Ольга В. Таглина Илья Мечников http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=4432817 Илья Мечников.: Фолио; Харьков; 2010 Аннотация Жизнь Ильи Ильича Мечникова была необычайно насыщенной, богатой событиями и научными открытиями. Он является не толь...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 574 496 C1 (51) МПК G08G 1/01 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014127098/11, 03.07.2014 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Давыдов Юрий Львович (RU), (24) Дата начала...»

«Внеклассное мероприятие для учеников 1-4 классов " Помоги птицам перезимовать" Цель: Расширить знания детей о птицах, вызвать сочувствие к голодающим и замерзающим зимой птицам, учить проявлять заботу к ним.Задачи: Образов...»

«ISSN 2308-6874 Научно-издательский центр Априори ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА АКТУАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалы IX Международной научно-практической конференции (24 июня 2015 г.) Сборник научных трудов Краснодар УДК 08...»

«ПЕДАГОГИКА ИСКУССТВА ЭЛЕКТРОННЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ УЧРЕЖДЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ОБРАЗОВАНИЯ "ИНСТИТУТ ХУДОЖЕСТВЕННОГО ОБРАЗОВАНИЯ" http://www.art-education.ru/AE-magazine/ №2, 2011 актуальные тенденции в развитии художественного образования Егорычев Александр Михайлович, доктор философских наук, кандидат педа...»

«Иванова Ольга Ярославовна УЧАСТИЕ КАНОНИЧЕСКОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РЕГУЛЯЦИИ ПЛАСТИЧНОСТИ ГИППОКАМПА Специальность 03.03.01 – "Физиология" Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Владимир Александрович Маркевич Москва 2017 ОГЛАВЛЕНИЕ СП...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Казинцев Владимир Але...»

«ЕЖЕГОДНЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ И ОБ ОХРАНЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ГОРОДА ФЕДЕРАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ СЕВАСТОПОЛЯ ЗА 2015 ГОД Приложение УТВЕРЖДЕНО Приказом Севприроднадзора от 01.07.2016 № 105 Правительство Севастополя ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ ГОРОДА СЕВАСТОПОЛЯ (СЕВПРИРОДНАДЗОР) ЕЖЕГОДНЫЙ ДОКЛАД о состоянии и об...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.