WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |

«The X International Conference “Plant Cell Biology In Vitro and Biotechnology” ABSTRACTS Kazan, October 14-18, 2013 УДК [581.17+663.1](063) The X International ...»

-- [ Страница 2 ] --

Полученные данные указывают с одной стороны на общность процессов биосинтеза полисахаридов в культуре клеток и в нативном растении. В то же время, существуют особенности биосинтеза и постсинтетической модификации пектиновых веществ в культивируемых клетках растений, которые, по-видимому, связаны с переходом клеток к дедифференцированному состоянию, их генетическими особенностями и с условиями культивирования каллусных культур.

–  –  –

Institute of Physiology, Komi Research Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, ul. Pervomaiskaya 50, 167982 Syktyvkar, Russia, fax: (8212) 241001, tel.: (8212) 241001, e-mail: gunter@physiol.komisc.ru Comparative biochemical characteristic of the cell cultures and native plants was studied. It was shown that callus cultures of campion Silene vulgaris (M.) G., Silene tatarica L., duckweed Lemna minor L. and tansy Tanacetum vulgare L. as well as native plants synthesize pectin substances as follows homogalacturonan and rhamnogalacturonan I (RG-I). The polysaccharide contents into the cell cultures may exceed those into native plants significantly.

Undifferentiated cells of different plant species and plant classes produce pectines similar as well as different from the native plants pectines. Pectines of cell cultures and native plants consist of smooth and hairy regions. The contents of linear 1,4- -D-galacturonan vary into pectines obtained from different cell cultures. The hairy regions of macromolecule represented by RG-I. RG-I has various structures in different pectines. The cell culture pectines from different plant species were distinguished in molecular weight, methylesterification degree and the side chain structure. The pectines from the duckweed water plant were shown to have more developed hairy regions of RG-I macromolecule than pectines from investigated callus cultures obtained from land plants.

Distinctions in pectin structure of L. minor and S. tatarica callus and native plants were discovered. In particular, pectines obtained from callus and native plants vary in structure of hairy regions of macromolecule. Duckweed pectin in comparison with native plant was shown to have more galactose and arabinose residues into the RG-I side chains and less apiose residues. Pectin from S. tatarica was found to have higher molecular weight, more galactose and arabinose residues and less galacturonic acid residues in comparison with pectin from native plant.

In addition to pectines callus cultures synthesize acidic arabinogalactanes (AG) which differ in structure of side chains. AGs from both S. vulgaris and S. tatarica calluses have higher contents of galactose residues than AGs from both L. minor and T. vulgare calluses. AGs from both S. vulgaris and L. minor have higher contents of arabinose residues. The content of galacturonic acid residues was higher in AG from S. tatarica. Extracellular AGs differ in molecular weight and have sugar composition similar to intracellular AGs.

These data indicate that processes of polysaccharide biosynthesis in cell culture and native plant are overall on the one hand. On the other hand there are features of biosynthesis and post synthetic modification of pectic substances in cultured plant cells. Apparently these features connected with turn cells into undifferentiated status, their genetic peculiarities and culture conditions of callus culture.

This work was supported by the Basic Research Program of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (project No. 12-C-4-1006) and by the Russian Academy of Sciences Presidium Program “Molecular and Cell Biology”.





–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва, 127276, ул. Ботаническая, 35, факс: (499)977-80-18, тел: (499) 231-83-34, e-mail: gsc@ippras.ru Генетическая изменчивость, индуцированная условиями культивирования in vitro, известная как сомаклональная изменчивость, представляет интерес для селекции, но становится нежелательным явлением, если целью является клональное микроразмножение или генетическая трансформация растений. Поэтому важно знать частоту, распределение по геному, механизмы и факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость. Мы изучили генетическую изменчивость маркеров ДНК, полученных в ходе полимеразной цепной реакции, в культивируемых тканях и растениях-регенерантах Arabidopsis thaliana, Zea mays and Triticum aestivum. Исходная линия кукурузы А188 и полученные из нее сомаклоны были проанализированы с использованием 38 RAPD и 10 ISSR праймеров. Ни с одним из использованных праймеров не было выявлено различий между индивидуальными растениями линии А188. Однако среди сомаклонов были обнаружены вариации в ПЦР-спектрах, в частности, 22 RAPD и 6 ISSR праймеров выявляли их отличия от исходной линии. На основе некоторых RAPD и ISSR ампликонов были созданы SCAR маркеры. Их наследование было прослежено в потомстве от самоопыления на протяжении 2-4 поколений, а также при гибридизации с линией А188 в F1 и F2. Полиморфные маркеры были секвенированы. Биоинформационный поиск, проведенный с целью выяснения молекулярной природы обнаруженных у сомаклонов генетических изменений, показал, что все мутации произошли в некодирующих последовательностях. Среди выявленных изменений были инсерции или вырезание транспозонов, микроделеции, рекомбинации и изменения в пуле митохондриальной ДНК.

В двух группах независимо полученных сомаклонов были обнаружены вариации одних и тех же фенотипических признаков и молекулярных маркеров, что подтверждает существование «горячих точек» в геноме. Уровень генетической изменчивости, определенный с помощью RAPD и ISSR в культуре клеток A. thaliana был в несколько раз ниже, чем у кукурузы. Сомаклональная изменчивость может быть вызвана стрессовыми воздействиями во время культивирования in vitro. Например, при криосохранении клетки испытывают стресс, вызванный дегидратацией и замораживанием. Для изучения влияния процедур, связанных с подготовкой образцов к криосохранению, проанализировали вариабельность ISSR и REMAP маркеров в каллусной ткани и растениях-регенерантах пшеницы. Предкультивирование с сахарозой и замораживание не повлияли на генетическую стабильность растительного материала. Но после этапа дегидратации в одной из проб в спектре REMAP фрагментов появился новый ампликон. Как показали результаты секвенирования полиморфного фрагмента, наиболее вероятной причиной его появления была индуцированная дегидратацией инсерция ретротранспозона рядом с микросателлитной последовательностью, комплементарной ISSR праймеру.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-04-00950

–  –  –

K.A.Timiryazev Institute of Plant Physiology RAS, Moscow, 127276, Botanicheskaya str, 35, fax: (499)977-80-18, tel: (499)231-83-34, e-mail: gsc@ippras.ru The genetic variability induced by in vitro conditions known as somaclonal variation is of practical interest due to its potential uses in plant breeding but if clonal micropropagation or transformation is main goal, it becomes an unwelcome phenomenon. Thus, it is important to know frequency, the genomic distribution, the mechanisms and factors influencing somaclonal variation. We studied variability of PCR-based DNA markers of cultured tissues and regenerated plants of Arabidopsis thaliana, Zea mays and Triticum aestivum. The original A188 line of maize and the somaclones obtained were tested using 38 RAPD and 10 ISSR primers. No A188 plants showed variation in the RAPD and ISSR spectra for any of the primers used. However, the PCR spectra obtained from the somaclones demonstrated some variations, i.e., 22 RAPD primers and 6 ISSR primers differentiated at least one somaclonal variant from the progenitor line. Six SCAR markers were developed based on several RAPD and ISSR fragments. The inheritance of these SCAR markers was verified in the selfing progeny of each somaclone in the R1–R4 generations and in the hybrids, with A188 as the parental line in the F 1 and F2 generations. These markers were sequenced and performed bioinformatic searches to understand the molecular events that may underlie the variability observed in the somaclones. All changes were found in noncoding sequences and were induced by different molecular events, such as the insertion or excision of transposons, microdeletion, recombination, and a change in the pool of mitochondrial DNA. In two groups of independently produced somaclones, the same features (morphological, molecular) were variable, which confirms the theory of ‘hot spots’ occurring in the genome. The level of genetic variability as measured using RAPD and ISSR in cell culture A. thaliana was several times lower than in maize. Stress during tissue culture can induce somaclonal variation. For example, during cryopreservation cells are under stress caused by dehydration and freezing. To study the effect of the procedures relating to the preparation of samples for cryopreservation, we analyzed the variability of ISSR and REMAP markers in calli and regenerated plants of wheat. Precultivation with sucrose and freezing did not affect the genetic stability of the plant material. But after the stage of dehydration in one of the samples in the range of REMAP fragments, a new amplicon was detected. As the results of the sequencing of the polymorphic fragments, the most likely cause of his appearance was induced by dehydration insertion of retrotransposon near the microsatellite sequence complementary to the ISSR primer.

This work was supported by RFBR grant № 13-04-00950

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, 127276, ул. Ботаническая, 35 факс: (499) 977-80-18, тел. (499) 977-94-33, e-mail: phenolic@ippras.ru Фенольные соединения относятся к числу одних из наиболее распространенных в высших растениях представителей вторичного метаболизма, которые в последние годы привлекают большое внимание, как исследователей, так и практиков. В значительной степени это обусловлено их высокой антиоксидантной активностью и возможностью использования в фармакологии и медицине.

Известно, что в условиях in vitro клетки сохраняют способность к образованию соединений фенольной природы, характерных для интактных растений. Несмотря на уже давнюю «историю» этого вопроса, до сих пор получение клеточных и суспензионных культур из различных фармакологически-ценных видов и изучение накопления в них полифенолов, в том числе и с оценкой их состава, остается важным направлением исследований по биологии и биотехнологии.

Каллусные и суспензионные культуры успешно используются для выяснения механизмов адаптации к действию различных стрессовых факторов (УФ-Б радиации, тяжелых металлов, температур и др.). И в этом случае уделяется внимание не только изучению фенольных соединений, но и всей антиоксидантной системы клеток.

Важным аспектом является исследование прооксидантной и антиоксидантной активности полифенолов. В этом случае часто используют экзогенное воздействие различных их представителей на культуры in vitro.

Все это свидетельствует о важной роли фенольных соединений в жизнедеятельности растительных клеток, необходимости изучения их образования в условиях in vitro, а также поиска подходов для повышения продуктивности клеточных культур, как биофабрик для получения фармакологически ценных биопродуктов.

–  –  –

Timiriazev Institute of Plant Phisiology, Russian Academy of Sciences, Botanicheskaya ul., 35.

Moscow. 127276 Russia; fax: (499) 977-80-18, tel. (499) 977-94-33, e-mail:

phenolic@ippras.ru Phenolic compounds are among some of the most common in higher plants, representatives of secondary metabolism, which in recent years attracted great attention of both researchers and practitioners. This is largely due to their high antioxidant activity and the ability to use in pharmacology and medicine.

It is known that the in vitro cells retain the ability to form of phenolic compounds typical for intact plants. Despite the already long "history" of this question is still obtaining callus and cell cultures from various pharmacologically-value species and investigation of phenolic compounds remains an important area of research in biology and biotechnology.

Сallus and suspension cultures used to elucidate the mechanisms of adaptation to a variety of stress factors (UV-B radiation, heavy metals, temperature, etc.). In this case, attention is paid not only to phenolic formation, but also antioxidant systems.

An important direction is the study of prooxidant and antioxidant activity of polyphenols. In this case, frequently used influence of phenolic compounds on cultured in vitro.

All of this suggested an essential role of phenolics in the life of the plant cells, the need to study their formation, as well as the search for approaches to increase the productivity of cell cultures as biofactories for pharmacologically valuable compounds.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова, Саратов, 410012, Театральная пл.

1, факс: (8452)26-27-83, тел.:

(8452)23-46-97, e-mail: kostinaee@yandex.ru Для обеспечения сельского хозяйства высокоурожайными и высокомасличными сортами и гибридами недостаточно традиционных методов селекции, так как они связаны с затратами времени и ресурсов. Ускорение и оптимизация селекционного процесса возможны на основе использования биотехнологических приёмов, в том числе методов получения гаплоидов в культуре пыльников и микроспор in vitro. Это позволяет сократить продолжительность этапов селекционного процесса, увеличить спектр генетического разнообразия и повысить эффективность отбора.

Процесс гаплоиндукции зависит от ряда взаимосвязанных факторов, среди которых решающая роль принадлежит генотипу донорных растении. Необходим поиск универсальной методики для получения гаплоидов подсолнечника из любых генетических систем.

Целью наших исследований было оптимизировать методику получения гаплоидов подсолнечника на основе изучения влияния различных генов и углеводов в составе индукциионной питательной среды.

Объектами исследований являлись самофертильная линия ЮВ-28Б и набор из экспериментальных высокобеккроссных линий подсолнечника, созданных в генофоне этой линии и несущих 10 различных генов короткостебельности и 5 генов окраски язычковых цветков.

Донорные растения исследуемых генотипов выращивали в полевых условиях. Из крайних внешних рядов корзинки диаметром 4-5 см вычленяли неокрашенные цветки размером 3-5 мм.

Пыльники помещали на питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга с увеличенным содержанием нитрата калия КNO3 3,1 г/л и добавлением -индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д) 2 мг/л, 6 бензиламинопурин (БАП) 0,5 мг/л, гидролизата казеина 400 мг/л. Использовали различные варианты сред с содержанием сахарозы 30 и 60 г/л или мальтозы 30 г/л.

В каждую пробирку помещали по 15 пыльников. Анализ полученных на пыльниках новообразований проводили на 30 сутки. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа.

Эффекты генов рассчитывали путем сопоставления величины признака у линии с геном и исходной линии ЮВ 28Б.

Цитологический анализ пыльников и новообразований на различных этапах культивирования позволил проследить процесс формирования эмбриоидов из микроспор и соматических тканей пыльника. Установлено, что степень и характер формирования структур зависит как от состава питательной среды, так и от генотипа растения-донора. Увеличение концентрации сахарозы не оказывает достоверного положительного влияния на каллусогенез и формирование эмбриоидов подсолнечника. Замена сахарозы в индукционной питательной среде на мальтозу приводит к снижению эффективности калусогенеза и эмбриогенеза. Скрининг экспериментальных линий подсолнечника выявил, что ряд генов короткостебельности и генов, контролирующих окраску язычковых лепестков, могут существенно повышать выход каллусов, морфогенных структур и регенерантов в культуре пыльников подсолнечника in vitro.

–  –  –

Vavilov Saratov State Agrarian University, 1 Teatralnaya Ploshchad, Saratov 410012, Saratov, Fax: +7(8452)26-27-83, tel.: +7(8452)23-46-97; e-mail: kostinaee@yandex.ru Traditional breeding methods are not enough for providing agriculture with highyielding and high-oleic varieties and hybrids as they relate to time and resources expenses.

Acceleration and optimization of breeding process are possible using biotechnological techniques, including haploids producing methods in anther culture and microspores in vitro. It allows reducing of stages length of breeding process, enhancing of genetic diversity range and increasing of selection efficiency.

Haploinduction process depends on number of interconnected factors, among which the leading role belongs to donor plants genotype. Search of universal technique is necessary for sunflower haploids producing from any genetic systems.

The aim of our researches was to optimize the technique of sunflower haploids producing based on studying of various genes and carbohydrates influence as a part of induction basal medium.

Objects in study were self-fertile line YuV-28B and range of experimental advanced backcross lines of sunflower created in this line genetic background and bearing 10 various genes of short-stemness and 5 genes of ray flowers coloring.

Donor plants of genotypes in study were grown up in field conditions. Uncoloured flowers of 3-5 mm in size were selected from outer external rows of capitula of 4-5 cm in diameter. Anthers were placed in Murashige-Skoog basal medium supplemented with 3,1 g/l potassium nitrate KNO3 and 1 mg/l -indole-3-acetic acid (IAA), 2 mg/l 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D), 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurine (BAP), 400 mg/l casein hydrolysate. There were used various mediums containing 30 and 60 g/l sucrose or 30 g/l maltose.

15 anthers were placed in each test tube. Analysis of the tumors in the anthers was performed on the 30th day. Data were processed by analysis of variance method. Genes` effects were calculated by comparing the character value in gene line and baseline YuV- 28B.

Cytological analysis of anthers and tumors at different stages of cultivation makes it possible to trace the formation of embryoids out of microspores and anther somatic tissues. It was defined that the degree and nature of structure formation depends both on basal medium structure and donor plant genotype. The increase in sucrose concentration does not have significant positive impact on of callogenesis and formation sunflower embryoids. Replacement of sucrose in the induction basal medium to maltose reduces the efficiency of callogenesis and embryogenesis. Screening of experimental sunflower lines revealed the fact that a number of short-stemness genes and genes controlling the color of ray flowers, can significantly increase calli production, morphogenic structures and regenerants in sunflower anther culture in vitro.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань, 420111, ул.

Лобачевского, 2/31, факс: (843) 292 -73-47, тел. (843) 231-90-42, e-mail: j.kostyukova@mail.ru Каллусные культуры представляют собой удобный объект для изучения процессов морфогенеза. Важным фактором в получении морфогенных каллусных культур является выбор экспланта. Эмбриогенные каллусные культуры гречихи татарской относятся к нодулярному типу каллусов и образованы проэмбриональными клеточными комплексами (ПЭКК) и мягким каллусом. Наибольший выход нодулярных каллусов наблюдали при использовании в качестве эксплантов зародышей длиной 2-2.5 мм (65.5%), в то время как для семяпочек и незрелых зародышей длиной 1-1,5мм этот показатель не превышал 33-35%, а для зародышей 3.0-3.5 мм Можно предположить, что формирование нодулярных каллусов гречихи определяется степенью дифференцированности клеток экспланта, которая выражается в различной компетентности клеток разных тканей семядолей незрелых зародышей к гормональным условиям среды культивирования. Предположительно, развитие компетентности в отдельных клетках определенной ткани семядолей достигает максимума у зародышей определенного размера. С целью выяснения причин различной способности незрелых зародышей гречихи к формированию нодулярных каллусов были проведены гистологические, гистохимические и электронномикроскопические исследования тканей семядолей незрелых зародышей различной длины. Показано, что с увеличением размера зародыша изменяется цвет экспланта от прозрачного (1мм), к белому (1мм, 2мм), желтеющему (2мм, 3мм). Возрастает дифференциация клеток семядолей на столбчатый и губчатый мезофилл, в клетках увеличивается количество пластид с крахмалом и фенольных включений в вакуолях клеток. Окрашивание клеток семядолей Суданом II показало, что увеличение размера зародыша коррелирует с увеличением количества сферосом в клетке. Увеличение синтеза липидов, фенолов и крахмала подтверждают и электронномикроскопические исследования. Наибольшее содержание липидов и фенольных соединений было отмечено в эпидермальных клетках абаксиальной поверхности семядолей. Наименьшие изменения в ультраструктуре клеток с увеличением размера зародыша были отмечены в эпидермальных и субэпидермальных клетках адаксиальной поверхности семядолей незрелых зародышей.

Проведенные гистологические исследования показали, что формирование ПЭКК происходит из эпидермальных и субэпидермальных клеток адаксиальной поверхности семядолей (зародыши 1 мм, 2 мм, 3 мм) и прокамбиальных тяжей (зародыши 2 мм). Тогда как формирование ПЭКК из клеток абаксиальной поверхности – редкое явление и наблюдается у зародышей длиной 1.5 - 2мм. Такая разница, вероятно, связана с тем, что клетки абаксиального эпидермиса рано дифференцируются, что подтверждают наши цитологические исследования, и становятся не компетентными к экзогенным гормонам. Полученные результаты позволяют заключить, что наиболее оптимальными для получения нодулярного каллуса являются зародыши 1,5 - 2мм, так как в этих эксплантах компетентностью к гормонам среды культивирования обладают клетки адаксиального эпидермиса, клетки прокамбиальных тяжей, а также в редких случаях – клетки абаксиального эпидермиса. Необходимо отметить, что степень дифференциированности клеток экспланта также коррелировала с возрастанием в клетках веществ вторичного метаболизма, присутствие которых, вероятно, необходимо для дальнейшего роста ПЭКК.

Секция 1

–  –  –

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of Kazan Scientific Center of RAS Kazan, 420111, Lobachevsky st., 2/31, факс: (843) 292 -73-47, (843) 231-90-42 e-mail: j.kostyukova@mail.ru The callus cultures are convenient objects for the study of morphogenesis. The selection of explants is an important factor in the establishment of morphogenic callus cultures. The embryogenic cell cultures of tatary buckwheat belong to the nodular type of calli. They consist of proembryonal cell complexes (PECCs) and soft callus. The highest yield of nodular callus formation was obtained from embryo of 2.0-2.5 mm long (65.5%), while the yield of nodular cultures from ovule and immature embryos of 1.0 - 1.5 mm long was not above 33-35% and for embryos of 3.0-3.5 mm long – 52.2%. It may be suggested that the induction of nodular callus of buckwheat depends on the degree of cell differentiation of explants which in turn is expressed in various competence of different cotyledon tissues to the hormonal conditions of culture medium. Probably, the development of competence in some cells of certain cotyledon tissue reaches the high degree in embryo of fixed length. The histological, histochemical and electron microscopic studies of cotyledon tissue of immature buckwheat embryos having different length were used to determine the causes of different abilitiy of immature embryos to form the nodular cell culture.

It was shown that the color of immature embryos from transparent (at 1mm), through white (at 1mm and 2mm) to yellowish (at 2mm and 3mm) changed with increasing embryo in size. During embryo growth the differentiation of cotyledon cells to the columnar and sponge mesophyll increased. The bigger was an embryo, the bigger content of storage substances it had.

As a whole, the number of plastids with starch grains, vacuoles with phenolic inclusions and spherosomes in cells of cotyledons of embryo are increased with embryo length. The most content of lipids and phenolic inclusions was shown to accumulate in the epidermal cells of abaxial surface of cotyledons. The smallest increase in number of lipids and phenolic inclusions was observed in epidermal and subepidermal cells of adaxial surface of cotyledon of immature buckwheat embryos.

The histological study showed that the formation of PECCs arised from epidermal and subepidermal cells of adaxial surface of cotyledon (immature embryos of 1mm, 2 mm, and 3 mm long) and procambial bands (immature embryos of 2mm long). The formation of PECCs from cells of abaxial epidermis was very rare event and was observed in immature embryos of 1.5-2 mm long. This difference, probably, is connected with early differentiation of cells of abaxial epidermis as confirmed by our cytological studies, which became non-competent to the exogenic hormones.

Our results led us to conclusion that immature embryos of 1.5-2mm long were the best explants to induce the nodular callus in buckwheat, because at this stage of embryo development different cells of cotyledons (adaxial epidermis, procambial bands and, even, the cells of abaxial epidermis) had a lowest degree of differentiation, and were competent to the hormones of culture medium.

It is necessary to note that the level of differentiation of explant cells and the increase in content of reserved substances were correlated. The presence of these substances seems to be necessary for further PECC growth.

Секция 1

АЛЬБИНИЗМ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO ПШЕНИЦЫ И

ТРИТИКАЛЕ: СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМА

Мозгова Г.В., Зайцева О.И., Лемеш В.А.

Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси», Минск, 220072, ул. Академическая, 27 факс: +(375)(17) 284 -19-17, тел. +(375)(17) 294-91-82, e-mail: g.mozgova@igc.bas-net.by Получение гаплоидных растений и удвоенных гаплоидов с применением метода культуры пыльников позволяет значительно сократить сроки создания гомозиготного материала и новых сортов растений. Явление эмбриогенеза и впоследствии регенерации растений из микроспор пыльника, помещенных на питательные среды, также успешно используется для отбора клеточных линий, устойчивых к различным химическим соединениям, выделения жизнеспособных протопластов, экспериментов по генетической инженерии. Процесс культивирования генеративных тканей злаковых культур имеет ряд особенностей, отличающих его от культивирования соматических тканей. К ним относится низкая частота индукции эмбриогенеза, каллусогенеза и формирования зеленых растений у отдельных генотипов, а также регенерация альбиносных растений.

Тот факт, что развитие эмбриоида или каллуса в культуре пыльников Triticum aestivum L. и Triticosecale Wittm. может идти из вегетативной клетки, позволяет предполагать, что основные нарушения, приводящие к формированию альбиносного фенотипа, должны происходить в геноме хлоропластов. В связи с этим целью нашего исследования являлось изучение структурных перестроек ДНК, затрагивающих хлоропластные гены, связанные с процессами фотосинтеза, и поиск участков хлоропластного генома, в которых изменения данных генов происходят с высокой частотой.

Объектом исследования служили 84 альбиносных растения, регенерировавшие в культуре пыльников 27 генотипов ярового тритикале и мягкой яровой пшеницы.

Использование для исследований особенностей морфогенеза in vitro искусственно созданного гибрида пшеницы и ржи – тритикале и сравнение полученных данных с результатами исследований по пшенице, может дать принципиально новые знания о закономерностях и механизмах формирования альбиносного растения.

У альбиносных растений, полученных методом культуры пыльников, проведено исследование частоты возникновения структурных изменений пластидного генома, затрагивающих гены, связанные с фотосинтезом (rbcL, psaA, psbA, psbB, psbC, psbD, petA, atpB, atpE, trnE). Выявлено, что гены psbA, psbC, psbD фотосистемы 2 амплифицируются практически у всех исследованных растений пшеницы и тритикале. Это подтверждает полученную ранее информацию о сохранении области включающей данные гены в пределах большого однокопийного региона хлоропластной ДНК. У хлорофиллдефектных растений пшеницы и тритикале ген atpB, кодирующий -субъединицу CF1комплекса АТФ-азы, не выявляется с высокой частотой. Ранее было установлено, что структурные изменения плазмона имеют, в основном, характер делеций различной протяженности и локализации в зависимости от пути возникновения растениярегенеранта in vitro. Это позволяет нам утверждать то, что происходит делеция гена atpB либо участка хлоропластной ДНК, включающего данный ген. Следует отметить, что ген atpB расположен в области хлоропластного генома, в которой с наибольшей частотой происходят делеции и инсерции у пшеницs и эгилопсов, полученных в естественных условиях. Делеция гена atpB может являться одной из главных причин андрогенетического альбинизма, поскольку затрагивает ключевой процесс, связанный с фотосинтезом, и может привести к нарушению экспрессии других генов фотосинтеза и синтеза хлорофилла в ядерном или хлоропластном геноме.

–  –  –

State Scientific Institution «Institute of Genetics and Cytology at the National Academy of Sciences of Belarus», Minsk, 220072, Akademicheskaya street 27 fax:+(375)(17)284-19-17, tel.

+(375)(17) 294-91-82, e-mail: g.mozgova@igc.bas-net.by Production of haploid plants and double haploids using the anther culture method allows considerable shortening of the time for developing homozygous material and new plant cultivars. Embryogenesis and subsequent plant regeneration from anther microspores placed an nutrient media are successfully used for selection of cell lines resistant to different chemical compounds, isolation of viable protoplasts and for genetic engineering experiments. The process of grain crops generative tissues culturing has a number of features distinguishing it from culturing somatic tissues. А low frequency of embryogenesis and callusing induction, formation of green plants in some genotypes as well as regeneration of albino plants are among them. The fact that development of embryoid or callus in anther culture of Triticum aestivum L. and Triticosecale Wittm. can take place from vegetative cell allows supposition that basic disturbances resulting in formation of albino phenotype should take place in a chloroplast genome. In this connection the goal of our research was to study structural DNA rearrangements affecting chloroplast genes related to the photosynthesis processes and to search for chloroplast genome sites where changes in the given genes occur with a high frequency.

84 albino plants, regenerated in the anther culture of 27 genotypes of spring triticale and spring common wheat, were taken as a research object. Study on morphogenesis features in vitro of artificially developed wheat and rye hybrid (triticale) and comparison between the obtained data and the results of wheat study can give in essence new knowledge of regularities and mechanisms of albino plant formation in these important agricultural crops.

The analysis of the frequencies of plastid genome structural rearrangements affecting the genes involved in the photosynthesis (rbcL, psaA, psbA, psbB, psbC, psbD, petA, atpB, atpE, trnE) was conducted. It was revealed that genes psbA, psbC, psbD of the photosystem 2 are amplified practically in all the studied plants of wheat and triticale. The results verifies the earlier obtained information about conservation of the region including the given genes within the limits of a large single-copy region of chloroplast DNA. AtpB gene, encoding -subunit of CF1-complex of ATP synthase, was not detected with a high frequency in chlorophyll-deficient plants of wheat and triticale. Earlier studies have shown that structural changes in plasmon have primarily a deletion pattern of a different extent and localization depending on the way of regenerant plant development in vitro. It allows to claim, that deletion of the gene atpB or the chloroplast DNA site containing the given gene proceeds. It should be noted that the gene atpB is located in the chloroplast genome region were deletions and insertions take place with the higher frequency in wheat and aegilops produced under natural conditions. Deletion of the gene atpB can be one of the major causes of androgenetic albinism since it affects the key process associated with photosynthesis that can result in expression disturbance of other genes of photosynthesis and chlorophyll synthesis in nuclear and chloroplast genomes.

–  –  –

МЕХАНИЧЕСКАЯ ДИСАГРЕГАЦИЯ ЭМБРИОГЕННЫХ КУЛЬТУР

КЛЕТОК МОРКОВИ И СЛАДКОГО АПЕЛЬСИНА КАК СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

МЕЛКОАГРЕГИРОВАННЫХ ФРАКЦИЙ, СОХРАНЯЮЩИХ СПОСОБНОСТЬ К

СОМАТИЧЕСКОМУ ЭМБРИОГЕНЕЗУ

Моисеева Н.А., Серебрякова В.Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва, 127276, ул. Ботаническая, 35, факс: (495)9778018, тел. (499)2318329, e-mail: morphogenesis@mail.ru Культура клеток моркови длительный период времени была единственной, которая считалась удобной модельной системой для изучения организации соматического эмбриогенеза в культуре in vitro на организменном, клеточном и молекулярных уровнях.

Именно на этой культуре впервые было продемонстрировано, что использование в качестве источника соматических зародышей мелкоагрегированной фракции, выделенной из эмбриогенной суспензии путем ее фракционирования через сетчатые фильтры, имеет ряд преимуществ. Прежде всего это возможность проведения как качественной оценки, т.е. регистрации структурных изменений, происходящих в связи с соматическим эмбриогенезом в исходно достаточно гомогенной популяции, так и количественной оценки эмбриогенного потенциала, т.е. определение числа культивируемых единиц, способных в заданных условиях эксперимента к регенерации соматических зародышей.

Эмбриогенные культуры клеток разных видов растений обычно различаются по своей морфоанатомической структуре. По всей вероятности эти различия связаны с тем, что в культуре in vitro мультипликация соматических зародышей может осуществляться на разных стадиях их развития. В эмбриогенной культуре клеток моркови этот процесс происходит при достижении соматическим зародышем предглобулярной стадии развития.

В связи с этим эмбриогенная культура клеток моркови имеет типичную для неорганизованно растущих культур клеток растений структуру и состоит из различающихся по размеру и форме одиночных клеток и клеточных агрегатов. В эмбриогеннной культуре клеток сладкого апельсина процесс мультипликации происходит на уровне глобулярного зародыша, поэтому в ней присутствуют исключительно крупные клеточные комплексы с гранулярной структурой. Механическая дисагрегация эмбриогенной ткани является довольно простым способом искусственного получения мелкоагрегированных клеточных фракций оптимального размера. Совмещая этот способ с последующим фракционированием были выделены «связанные», т.е. находящиеся в составе крупных клеточных комплексов, фракции клеток моркови размером 100-38мкм и клеток сладкого апельсина размером 150-50мкм. Результаты проведенных физиологических экспериментов свидетельствуют, что в морфогенетическом отношении (частоте регенерации соматических зародышей) «свободная», т.е. естественно присутствующая в эмбриогенной культуре, и «связанная» фракции 100-38мкм клеток моркови не различались. Показано, что в жидкой среде, традиционно используемой для стимуляции адвентивного эмбриогенеза, из агрегатов, образующих «связанную» фракцию 150-50мкм клеток сладкого апельсина, формируется популяция соматических зародышей, находящихся на глобулярной стадии развития. Последовательное использование трех сред, содержащих разные концентрации не проникающего плазмолитика, обеспечивает дальнейшее развитие глобулярных зародышей, которое осуществляется путем прямого морфогенеза.

Секция 1

–  –  –

Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Botanicheskaya ul.35,

Moscow,123276 Russia, fax: 7(495)9778018, tel. (499)2318329, e-mail:

morphogenesis@mail.ru For a long time carrot cell culture was the only one that has been considered and has been applied intensively as a model system to study somatic embryogenesis at organismal, cellular and molecular levels. Size-fractionation technique was first adapted to carrot embryogenic suspension culture. It was found that small size fraction isolated from initial suspension could be used as a source of somatic embryos. The primary advantage of small size fractions i.e. proembryogenic masses (PEM), is their adaptability as embryogenic suspension cultures. PEMs allow to increase output of the single somatic embryos and give possibilities to evaluate both the structural alterations coincided with somatic embryo development and quantification of small size fraction units capable for somatic embryogenesis.

It is known that embryogenic cultures of various plant species can have different morphology and anatomy. This variation could occur due to propagation of somatic embryos in vitro at various stages of their development. In embryogenic carrot cultures the propagation started prior to globular stage. It results in the formation of suspension composed of various size single cells and cell aggregates. Repetitive embryogenesis in sweet orange embryogenic cultures occurs at the globular embryo stage. In connection with this there is not small size fraction in sweet orange embryogenic culture and it consists of only large cellular conglomerates with granular structure.

We have worked out the protocol, in which the large cell aggregates of carrot and sweet orange embryogenic cultures were mechanically dispersed and then were fractionated on sieves for separation of optimal size cell fractions. In the case of carrot embryogenic culture there were obtained two fractions: “free” fraction 100- - naturally present in embryogenic suspension and “dispersed” fraction 100- - bound up with large cell aggregates. The results of our physiologic experiments showed that the regeneration frequency of somatic embryos was similar in “free” and “dispersed” fractions 100traditionally applied for the stimulation of repetitive embryogenesis in citrus cultures it was demonstrated the ability of “dispersed” sweet orange cell fraction 150globular somatic embryos. We succeed to stimulate the further development of the sweet orange globular embryos transferring them to consecutive media containing various concentrations of non-permeable plasmolytic.

Секция 1

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ЭМБРИОГЕННЫХ И НЕЭМБРИОГЕННЫХ

КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ

Никонорова Н.А.1, Костюкова Ю.А.1,Нигматуллина Л.Р.1,Ризванов И.Х.2, Румянцева Н.И.1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, 420111, г. Казань, ул.

Лобачевского, д. 2/31 e-mail: nikonorova_nat@mail.ru Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической и физической химии Казанского научного центра РАН, 420088, г. Казань, ул. Арбузова, д. 8 e-mail: rizvanov@iopc.ru Культура клеток растений служит не только удобным объектом для решения практических задач клеточной и генной инженерии, но и модельной системой для изучения фундаментальных вопросов клеточной биологии и биологии развития. Однако при работе с культурой клеток существует ряд проблем, одной из которых является постепенное снижение эмбриогенной способности клеток при длительном культивировании, вплоть до ее полной утраты. Исследователи разных стран, используя различные методы, пытаются выяснить, какие молекулярные и биохимические пути при этом включаются и/или выключаются. Протеомика уже довольно давно зарекомендовала себя как мощный системный подход к анализу экспрессируемыхв клетке белков. В настоящее время происходит существенных рост количества работ, посвящённых протеомному анализу культивируемых клеток растений, чему в значительной степени способствует постоянное совершенствование протеомных методик.

Однакокрайне важным является правильный подбор модельной системы, в которой:

1. эмбриогенная культура должна сохранять способность к формированию полноценных зародышей при длительном культивировании;

2. неэмбриогенная культура должна быть получена из эмбриогенной.

Это позволяет использовать эмбриогенные и полученные из них неэмбриогенные культуры для изучения механизмов морфогенеза и его регуляции. В связи с этим, целью нашей работы была идентификация белков эмбриогенных и неэмбриогенных каллусных культур гречихи татарской и последующий их анализ.

Для изучения белков эмбриогенной и неэмбриогенной культуры был проведен двумерный гель-электрофорез и последующий сравнительный анализ полученных белковых спектров. Для дальнейшего изучения нами были отобраны 135 хорошо разделенных белков, среди которых были как общие белки, так и специфичные для каждого типа культуры. Из них методом пептидного фингерпринта был идентифицирован 91 белок. Используя белковую базу знаний Uniprot, идентифицированные белки были разделены на группы в зависимости от их локализации и функции в клетке.

Большая часть специфичных белков имела пластидную и ядерную локализацию и была связана с метаболизмом белков, регуляцией, защитой и ответными реакциями на стрессоры.

Тот факт, что большинство белков, идентифицированных в нашей работе, являлись пластидными и ядерными, может свидетельствовать о серьезных изменениях в этих органеллах. Это предположение также подтверждается ультраструктурным и цитогенетическим анализом клеток. В отличие от эмбриогенной культуры, для которой характерны преобладание диплоидного набора хромосом и нормальная форма ядер и пластид, в неэмбриогенной культуре наблюдаются очень высокий уровень анеуплоидии и полиплоидии, лопастные ядра, а также амебоидные и чашеобразные пластиды.

Работа частично поддержана грантом РФФИ № 13-04-97136-р_поволжье_а

Секция 1

IDENTIFICATION OF PROTEINS OF EMBRYOGENIC AND NONEMBRYOGENIC TATARY BUCKWHEAT CALLUS CULTURES

Nikonorova N.A.1, Kostukova J.A.1, Nigmatullina L.R.1, Rizvanov I.H.2, Rumyantseva N.I.1 Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of the Kazan Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia e-mail: nikonorova_nat@mail.ru Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of the Kazan Scientific Center of Russian Academies of Sciences, Kazan, Russia e-mail: rizvanov@iopc.ru Plant cell culture is not just a convenient object for practical purposes such as cell and genetic engineering. It is also a model system for the study of the fundamental problems of cell biology and developmental biology. However, there are some problems concerning the usage of cell cultures.
One of the main problems is gradual decrease of embryogenic capacity during long-term cultivation. Sometimes this leads to complete inability to embryogenesis or another type of morphogenesis. Scientists all over the world, using various methods, are trying to understand which molecular and biochemical pathways switch on and/or switch off during this process. Proteomics is a powerful approach to protein expression analysis. Nowadays there is an essential increase of studies concerning proteome analysis of cultivated plant cells triggered by continued improvement of proteomic techniques. On the other hand there is another important step such as right selection of model system in which: embryogenic culture should maintain the capacity to form proper embryos during long-term cultivation non-embryogenic culture should be derived from embryogenic one.

This allows to use embryogenic and derived from them non-embryogenic cultures for studying the mechanisms of morphogenesis and its regulation. Thus, the aim of our study was identification and further analysis of proteins of embryogenic and non-embryogenic tatary buckwheat callus cultures.

To study of embryogenic and non-embryogenic cell cultures proteins two-dimensional gel electrophoresis followed by comparative analysis of proteins were performed. For further study 135 well-separated common and specific for both cell culture types proteins were selected.

Using peptide mass fingerprint 91 proteins were identified and according to protein knowledgebase Uniprot they were separated on groups depending on their localization and function.

The most of specific proteins belonged to plastid and nuclear proteins and took part in protein metabolism, regulation and stress response and defense. The fact that the most of differentially expressed proteins identified in our study were plastid and nuclear may indicate some crucial alterations in these organelles. This is also confirmed by ultrastructural and cytogenetical analyses. Unlike cells of embryogenic culture with diploid chromosome set and normal shape plastids and nuclei, in non-embryogenic callus cells there is a high level of aneuploidy and polyploidy. In non-embryogenic callus, nucleus are lobed and hypertrophied with very irregular shape and plastids are mainly amoeboid-like or cup-shaped (with irregular shape and cytoplasmic inclusions).

This work was partially supported by RFBR grant № 13-04-97136

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет, Мичуринск, 393760, ул. Интернациональная, 101, факс (47545) 5-26-35, тел. (47545) 5-31e-mail: parom10@mail.ru Необходимым инструментом современной селекции является экспериментальная полиплоидия. Полиплоидия - достаточно широко распространенная в природе геномная мутация, которая может дать дополнительные возможности для выживания организма в экстремальных неблагоприятных условиях среды.

Целью работы являлось выявление цитологических особенностей последействия оризалина и колхицина при полиплоидизации ежевики кустистой (Rubus fruticosus).

Для корректного анализа влияния дестабилизирующего мутагенного фактора провели предварительное исследование кариотипа ежевики Whitford Thornless. В результате исследований установлено, что ядра соматических клеток содержат диплоидный набор хромосом (2n=2х=14). У изучаемой формы отмечено 6 пар метацентрических хромосом и 2 пары субметацентрических.

В результате воздействия колхицина и оризалина на растительные ткани ежевики в условиях in vitro обнаружен ряд морфологических аномалий. Негативное влияние колхицина проявляется в появлении некротических участков, оризалина - в нетипичной морфологии корней. С увеличением концентрации негативный эффект воздействия амитотиков усиливается. Под влиянием амитотиков у ежевики, как и у других культур, изменяется ход митотического цикла. Это происходит в результате блокировки тубулинового цитоскелета. Отмечены дифференциально окрашенные структуры, представляющие собой, разрушаемое веретено тубулиновых микротрубочек. Данные структуры не имеют чёткой полярности. При концентрации колхицина в среде 0,5% обнаружены клетки с не полностью разрушенным или дезориентированным веретеном.

Во всех вариантах воздействия колхицина на соматические ткани ежевики наблюдали классическое явление к-митозов. Наибольшее их количество обнаружено при концентрации колхицина 0,5%. Оризалин, как и колхицин деполимеризует веретено деления, но при этом не способствует образованию к-пар. Выявлены перестройки хромосомного типа под влиянием оризалина и колхицина: разрывы отдельных хромотид, слияние разорванных концов, фрагментация хромосом, слипание фрагментированных участков.

Наибольшее число фактов формирования полиплоидных клеток зафиксировано при использовании в качестве полиплоидизирующего агента колхицина в концентрации 0,5% и 1,0%. Оризалин обладает большим цитотоксическим эффектом, в результате этого жизнеспособность эксплантов снижена.

–  –  –

Michurinsk State Agrarian University Michurinsk, Russia 393760 Internationalnaya str., 101, fax (47545) 5-26-35, tel. (47545) 5-25-07, e-mail: parom10@mail.ru The necessary instrument of modern breeding is experimental polyploidy. Polyploidy is widely enough distributed in nature genomic mutation, which may provide additional opportunities for the survival of the organism in extreme disadvantage condition of the ambience.

The purpose of the work is to reveal the cytological particularities of the aftereffect oryzalin and colchicine at polyploidisation of blackberry (Rubus fruticosus).

For correct analysis of the influence of destabilizing factors, including the mutagenic load, a preliminary study of karyotype blackberry Whitford Thornless was carried out. It was found that the nuclei of somatic cells contain the diploid number of chromosomes (2n = 2x = 14). Besides under investigation form 6 pairs of metacentric chromosomes and 2 pairs of submetacentric are found.

As a result of influences of colchicine and oryzalin on plant tissue of blackberry Whitford Thornless in condition in vitro a number of morphological anomalies have discovered.

The negative influence of colchicine reveals itself in appearance necrotic area, oryzalin - in anomalies morphology of the roots. With increase in concentration amitotic negative effect increases.

Under the influence of amitotic on blackberry, as well as on the other cultures, changes the mitotic cycle. The reason is blocking tubulin cytoskeleton. Differentialy painted structures have been found presenting itself, destroyed spindle of tubulin microtubules. The data of the structure have not a clear polarity. At concentration of colchicine 0.5% in the medium detected cells are not completely destroyed or disoriented by spindle.

A classical phenomenon k-mitosis has been observed in all the samples of the colchicine influence on somatic tissues of blackberry. The most amount is discovered at the colchicine concentration - 0.5%. Orizalin, as colchicine depolymerize mitotic spindle, but it does not contribute to the formation of a k-pairs.

Reorganization of the chromosome type under the influence of oryzalin and colchicine has been identified: breakups separate hromotids, merging of torn ends, chromosome fragmentation, sticking of fragmented plots.

The large biggest numbers of evidence of formation of polyploid cells are fixed when using colchicine as as polyploidisation agent in concentrations 0.5% and 1.0%. Oryzalin has high cytotoxic effect the result is reduced viability of the explants.

–  –  –

ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ

СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ С РАЗНОЙ

МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ

Петрова Н.В., Акулов А.Н., Каримова Ф.Г. Румянцева Н.И.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань, 420111, ул.

Лобачевского, 2/31, факс: (843) 292 -73-47, тел. (843) 231-90-47, e-mail: npetrova@inbox.ru Экстраклеточный протеом in vitro представляет собой совокупность белков, выделяемых клетками в среду культивирования. В связи с этим суспензионные культуры, различающиеся по морфогенной способности, являются наиболее удобным объектом для выделения и идентификации секретируемых факторов, вовлеченных в регуляцию морфогенеза in vitro. Суспензионные культуры гречихи татарской были получены из каллусных культур путем помещения их в жидкую питательную среду и выращивании на орбитальном шейкере.

Методами двумерного электрофореза с последующим иммуноблоттингом с моноклональными антителами PY20 было показано, что белки суспензионной культуры гречихи фосфорилируются по остаткам тирозина. Выявлено 27 фосфорилируемых белков молекулярной массой от 12 до 50 кДа и pI от 4 до 8 из более, чем 80 внеклеточных белков.

При этом 15 из них не фосфорилируются внутриклеточно. В неморфогенной суспензии количество внеклеточных фосфорилируемых по тирозину белков было значительно меньше по сравнению с морфогенной суспензией (выявлено 12 белков – из них 6 – общие с морфогенной культурой). В спектре внеклеточных белков морфогенной суспензии особенно интенсивно фосфорилировался белок молекулярной массой 35 кДа и рI 5.2, идентифицированный как фрагмент 23,7 кДа шаперона, выделенного ранее из пшеницы, а также белок молекулярной массой 25 кДа и pI 5.2, имеющий гомологию с разветвленным белком сахарного тростника. В среде культивирования неморфогенных суспензий эти белки не были выявлены.

При индукции соматического эмбриогенеза в мофрогенных культурах гречихи татарской в спектре фосфорилированных по тирозину внеклеточных белков по сравнению с внеклеточными белками суспензионной культуры произошли значительные изменения:

появились новые белки - один молекулярной массой 70 кДа и два молекулярной массой 45 и 46 кДа, экспрессия 14 белков не была выявлена. Важно отметить, что 13 из 16 фосфорилированных по тирозину внеклеточных белков при индукции соматического эмбриогенеза не фосфорилируются внутриклеточно.

Таким образом, насыщенность спектра внеклеточных белков и интенсивность их фосфорилирования существенно выше в морфогенных культурах, Эти результаты позволяют сделать вывод о вовлечении фосфорилирования внеклеточных белков в регуляцию процессов дифференцировки и эмбриоидогенеза in vitro.

–  –  –

Kazan institute of biochemistry and biophysics, Kazan research center, Russian Academy of Sciences, Kazan, 420111, Lobatchevsky str., 2/31, fax: (843) 292 -73-47, tel. (843) 231-90-47, e-mail: npetrova@inbox.ru Extracellular proteome in vitro is a set of proteins that are secreted by cells to the culture medium. In connection with this suspension cultures differing in morphogenic capacity are the most convenient objects to isolate and identify secreted factors involved in morphogenesis regulation in vitro. Suspension cultures of tatar buckwheat were obtained from callus cultures by placing them to liquid medium and grown on an orbital shaker.

Using methods of two-dimensional electrophoresis followed by immunoblotting with monoclonal antibody PY20 it was shown that proteins of buckwheat suspension culture are phosphorylated on tyrosine residues. 27 phosphorylated proteins with a molecular weight from 12 to 50 kD and pI from 4 to 8 was revealed from more than 80 extracellular proteins. Thus 15 of them are not phosphorylated intracellular. In nonmorphogenic suspension the number of extracellular tyrosine phosphorylated proteins was significantly lower compared with morphogenic suspension (12 proteins were identified - 6 from these were common with morphogenic culture). In the spectrum of morphogenic suspension extracellular proteins most intensively was phosphorylated protein 35 kD and pI 5.2, identified as 23.7 kD chaperone fragment isolated previously from wheat, as well as a protein of molecular mass 25 kD and pI 5.2, having homology with a branched protein of sugarcane. In the culture medium of nonmorphogenic suspension these proteins have not been identified.

By the induction of somatic embryogenesis in nonmorphogenic culture of tatar buckwheat the spectrum of tyrosine phosphorylated extracellular proteins have significant changes compared with extracellular proteins of suspension culture: new protein with molecular weight 70 kD and two proteins with molecular weight 45 and 46 kD were revealed and expression of 14 proteins was not identified. Significantly, 13 of 16 tyrosine phosphorylated extracellular proteins by the induction of somatic embryogenesis are not phosphorylated intracellular.

Thus, the spectrum saturation of extracellular proteins and the intensity of their phosphorylation are significantly higher in morphogenic cultures. These results suggest the involvement of extracellular protein phosphorylation to the regulation of processes of differentiation and embryogenesis in vitro.

–  –  –

Институт физиологии генетики НАН Украины, 03022, Киев ул. Васильковская, 31/17 email: Zlenko_lora@ukr.net Ионы тяжёлых металлов (ИТМ) считаются одними из наиболее опасных токсикантов, поскольку могут вызывать обширные патологические изменения во многих тканях растительного организма. Однако, как правило, ИТМ действуют совместно с неблагоприятными абиотическими факторами, усиливая стрессовое давление окружающей среды. И тем самым расширяется спектр стрессовых поражений растения. С другой стороны, устойчивость к ИТМ может сочетаться с устойчивостью к абиотическим стрессам.

ИТМ можно условно подразделить на две категории: первая – ионы, необходимые в микроколичествах; вторая – ионы, вредные в любых дозах. Ко второй относят катионы бария (Ba2+), кадмия (Cd2+) и анионы вольфрамат (WO42-) и ванадат (VO3 -). Ba2+ и Cd2+ оказывают действие на осмотические характеристики клетки; WO42- и VO3 – являются ингибиторами нитратредуктазы (НР. К.Ф. 1.6.6.1).

На селективных средах с добавлением летальных концентраций катионов Ba2+ и Cd2+ и анионов WO42- и VO3 - получены клеточные линии табака, сои, подсолнечника. За всё время культивирования (для некоторых линий продолжительность превышала пять лет) отобранные варианты не теряли своего уровня устойчивости, напротив, в отдельных случаях удалось выделить клоны с повышенным уровнем резистентности. Устойчивые к действию ИТМ клеточные линии тестировали в условиях действия других летальных стрессов.

Так, Ba- и Cd-устойчивые клеточные линии (УКЛ) нормально пролиферировали в условиях различных осмотических стрессов (засоление, водный стресс), независимо от условий (стресс или норма) их предыдущего выращивания. При этом жизнеспособность клеток поддерживалась за счёт адаптации к конкретному стрессовому агенту.

V-УКЛ и W-УКЛ табака и сои тестировали на чувствительность/устойчивость к действию альтернативних анионов-ингибиторов НР. Данные варианты на стрессовом фоне росли и наращивали биомассу за счёт усвоения нитратной формы азота. При этом на V- и W-средах усвоение нитратов, вероятно, происходило различным способом, о чём свидетельствовало отличие в динамике синтеза белка. Редукция нитратов происходила в условиях, исключающих действие нитратредуктазы обычного типа и вызывающих гибель клеточных культур дикого типа. Общее свойство метаболизировать нитраты сочеталось с адаптацией к типу стресора (WO42- или VO3 -).

Регенеранты табака R0, полученные из Ba-УКЛ и Cd-УКЛ, развивались на фоне продолжительных солевого и водного стрессов in vitro или выдерживали обезвоживание in vivo. Жизнеспособность целостного растения обеспечивалась комплексом адаптивных реакций клеточного уровня: компартментацией неорганических ионов и колебаниями уровня (синтез/деградация) свободного пролина.

Из растений R0 получено семенное поколение R1. Испытание семян in vitro (всхожесть, выживание, восстановление) при действии 20,0г/л солей морской воды и 0,5М маннита выявило повышенный уровень устойчивости поколения R1.

Регенеранты табака, полученные из V-УКЛ и W-УКЛ, характеризовались повышенной активностью НР при культивировании in vitro на контрольной среде, а также активностью фермента при стрессе, репрессирующем НР у растений дикого типа.

Клеточная селекция с использованием летальних доз ионов тяжёлых металлов может быть перспективным методом получения растительных форм с улучшенными показателями.

Секция 1

–  –  –

Institute of Plant Physiology and Genetics NAS Ukraine, 03022 Kyiv, Vasylkivska st. 31/17 e-mail: Zlenko_lora@ukr.net Heavy metal ions (HMI) – are the most dangerous toxicants because they can product vast pathological alterations in different tissues of plant organism. But usually HMI act together with abiotic stresses and their joint action is more hazardous. From the other hand, the tolerance to HMI and abiotic stresses may be combined.

HMI are divided into two categories. Physiologically essential elements are belong to one group. Another – are toxic at trace concentrations. Ba2+, Cd2+ cations and WO42-, VO3oxyanions are members of the second group. Ba2+, Cd2+ disorganize various osmotic cell parameters; WO42- VO3- repress activity of the nitrate reductase (NR, E.C. 1.6.6.1).

On selective media with the addition of lethal doses of Ba2+, Cd2+, WO42-, VO3- ions cell lines of tobacco, soybean, sunflower were obtained. Those clones retain their initial level of their resistance during whole period of cultivation (five and more years). Cell variants with higher levels of the resistance appeared among them. HMI-resistant plant cello lines were tested under alternative lethal stresses.

Ba- and Cd-resistant cell lines (RCL) grew normally under osmotic stresses (salinity, water stress) after their transfer either from normal or from ion-containing media. The cells viability is maintained by adaptation to specific stressor.

V-RCL and W-RCL of tobacco and soybean were tested for their sensitivity/resistance to the inhibitory effects of the NR repressors. These variants under stress pressure grew and increased biomass by nitrate assimilation. Nitrate assimilation in cells cultivated on V- and Wcontaining media are fulfilled in different manners. Those processes were reflected at protein biosynthesis. The pathway of nitrate reduction/assimilation took place under crucial conditions that inhibited usual nitrate reductase and lead to death of wild type cultures. Common ability of RCL-es – nitrate reduction – is combined with the adaptation to the individual stressor.

R0 regenerants of tobacco from Ba-RCL and Cd-RCL grew in vitro under modeling salinity or water stress and challenged desiccation in vivo. The viability of intact plants was supported through number of cellular reactions of adaptation: compartmentation of inorganic ions and fluctuations of the free proline levels (synthesis/degradation).

Seeds and seed progeny R1 were obtained. In vitro young shoots survive under salinity (20,0g/l sea water salts) and water stress (0,5M mannitol). Such doses were toxic for control.

Regenerants of tobacco from V-RCL and W-RCL showed the high level of the nitrate reductase activity (two times over than that parameter of wild type) during cultivation in vitro on control medium. Plants also assimilated nitrates under stress that inhibited the nitrate reductase activity of wild type plants.

Cell selection with heavy metal ions in lethal doses is the advanced method of improving plants.

–  –  –

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ Н2О2 И NO В КЛЕТКАХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ

ТАТАРСКОЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ГОРМОНОЗАВИСИМОСТИ И

СКОРОСТИ РОСТА

Сибгатуллина Г.В., Нигматуллина Л.Р., Румянцева Н.И.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань, 420111, ул.

Лобачевского, 2/31, факс: (843) 292 -73-47, тел. (843) 231-90-42, e-mail: kam-guz@yandex.ru Пролиферация клеток – это сложно программируемый процесс, зависящий как от внутренних, так и внешних стимулов. Как правило, под действием ростовых факторов инициируется каскад событий, включающий изменение активности и экспрессии транскрипционных факторов, протеинкиназ и других белков, участвующих в регуляции генов клеточного цикла. Известно также, что в этих процессах участвуют активные формы, как кислорода (АФК), так и азота (АФА). Изучение взаимодействия АФК и АФА с гормонами может способствовать пониманию механизмов клеточной пролиферации.

Каллусные культуры, различающиеся по митотической активности и гормонозависимости, являются удобными моделями для таких исследований. Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики содержания активных форм кислорода и азота в каллусных культурах, различающихся по гормонозависимости и пролиферативной активности.

В качестве объектов исследования были использованы неморфогенные каллусы (НК) гречихи татарской и полученные из них гормононезависимые неморфогенные каллусы (НК бг). Митотический индекс и средний размер клеток НК бг были в 2 раза ниже по сравнению с НК. При этом на 14-е сут культивирования прирост биомассы НК составлял 650%, а НК бг – только 200%. Было установлено, что для НК характерно высокое содержание перекиси водорода в клетках (до 110 мкМ/г сух веса), тогда как в НК бг содержание перекиси водорода было в 1,5 - 5 раз ниже. Содержание NO в клетках НК составляло 0,1- 0,5 мкМ/г сухого веса, в НК бг – 0,01-0,3 мкМ/г сухого веса. Таким образом, исследования показали, что в каллусах, растущих на среде с гормонами, выше митотический индекс и скорость нарастания биомассы, что коррелирует с высоким содержанием, как перекиси водорода, так и NO по сравнению с культурами, растущими на среде без добавления гормонов. Было сделано предположение, что экзогенное добавление гормонов способствует образованию как АФК, так и АФА, при этом происходит двойная активация пролиферации - через редокс-сигнальные каскады и гормональные каскады.

Вероятно, высокое содержание перекиси водорода обеспечивает интенсивное растяжение клеток, тогда как NO может выступать в качестве индуктора деления клеток.

–  –  –

DYNAMIC OF H2O2 AND NO CONTENT IN TATAR BUCKWHET CELL

CULTURES WITH DIFFERENT HORMONE-DEPENDENCE AND GROWTH RATE

Sibgatullina G.V., Nigmatullina L.R., Rumyantseva N.I.

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Kazan, 420111, Lobachevsky st., 2/31, fax: (843) 292 -73-47, tel. (843) 231-90-42, e-mail: kam-guz@yandex.ru Cell proliferation is the complicated programmable process depends on both the internal and external stimuli. Typically, the action of growth factors initiates a cascade of events, including changes in the activity and the expression of transcription factors, protein kinases and other proteins involved in the regulation of cell cycle genes. It is also known that reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) are involved in this process. The study of the interaction of ROS and RNS with hormones may contribute to the understanding of the mechanisms of cell proliferation. Callus cultures that differ in the mitotic activity and the hormonal requirement are the suitable models for such studies. The aim of the present work was to study the dynamics of the ROS and RNS in the callus cultures that differ in hormonal requirement and proliferative activity.

As objects, non-morphogenic callus (NC) of tatar buckwheat and derived from its nonmorphogenic habituated (NCH) callus were used. Mitotic index and average cell size of NCH cells were about 2-fold lower compared to NC. After 14 days of culture, biomass level of NC was increased up to 650% of fresh weight, while in NCH it was changed only up to 200%. It has been found that intracellular hydrogen peroxide content in NCH was about 1.5 - 5 times lower that the content of hydrogen peroxide in NC. The NO content in NC cells was 0.1 - 0.5 mM / g dry weight, in NCH - 0.01-0.3 mM / g dry weight. Thus, our studies have shown that calli grown on medium with hormones, have higher mitotic index and biomass growth as compared with the ones grown on medium without hormones. These characteristics correlate with the high intracellular content of hydrogen peroxide as well as NO content. It has been suggested that the addition of exogenous hormones promotes the formation of ROS and RNS. Thus, a double activation of proliferation - via redox and hormonal signal transduction cascades occurs. It appears that high level of hydrogen peroxide provides intensive cell extension, whereas NO can serve as an inducer of cell division.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН; Россия, 142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 2; тел.: 7 496 773 18 37, факс.: 7 496 733 05 32, e-mail: smap49@mail.ru Проведен сравнительный анализ полученных экспериментальных данных по влиянию экзогенного аммония на содержание общего белка, хлорофилла, структурную организацию хлоропластов, количество рибосомальных структур и экспрессию рибосомальных генов кодирующих белок малой субъединицы rps6 и 18S pРНК в клетках миксотрофной каллусной культуры сои (Glycine max) и одноклеточной зеленой водоросли хламидомонады (Chlamydomonas reinhardtii). Сравнительный анализ показал, что под влиянием экзогенного аммония увеличение количества рибосомальных структур в клетках каллуса сои, как и в клетках водоросли, не вызваны увеличением активности соответствующих рибосомальных генов. Однако клетки каллуса сои и хламидомонады по-разному реагировали на присутствие аммонийного компонента в составе питательной среды. Так, например, содержание общего белка и хлорофилла в клетках каллуса сои существенно снижалось, если среда на которой они выращивались не содержала аммонийного компонента, тогда как в клетках водоросли хламидомонады эти показатели практически не менялись в зависимости от наличия или отсутствия экзогенного аммония.

Присутствие аммония в питательной среде влияло на структурную организацию хлоропластов клеток каллуса, но не клеток хламидомонады. На основании полученных результатов обсуждаются возможные механизмы аммонийного воздействия как на содержание рибосом в клетках, так и на содержание в них белка и хлорофилла.

–  –  –

We compared total protein and chlorophyll contents, chloroplast structural organization, the number of ribosomes and expression of two ribosomal genes of the small subunit encoding for rps6 and 18S rRNA in soybean (Glycine max) callus cells and in chlamydomonas (Chlamydomonas reinhardtii) cells. These results demonstrated that decrease in the number of ribosomes in two cell types (plant and alga) were caused by absence of exogenous ammonium was not due to the reduction of the activities of the appropriate ribosomal genes (rps6 and 18S rRNA). The effect of ammonium presence in the culture medium on total protein and chlorophyll contents as well as on structural organization of chloroplasts was different in two types of cells. For example, total protein and chlorophyll contents in callus cells dramatically decreased if they grew without ammonium, however these characteristics of algal cells did not change in the presence or in the absence of ammonium in the medium. The ammonium presence in the medium influenced on chloroplast structure of callus cells but did not influence on chloroplast structure of algal cells. Based on these results, the possible mechanisms of ammonium effect on protein and chlorophyll contents, chloroplast structural organization, the number of ribosomes and the expression level of the ribosomal genes are discussed.

Секция 2

–  –  –

PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL ASPECTS OF REGENERATION CAPACITY

IN HARDWOOD TREES

Park S.Y.1, Moon H.K.2, Shin H.2, Kang K.S.2, Paek KY1 Research Center for the Development of Advanced Horticultural Technology, Department of Horticultural Science, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 361-763 Korea, fax. (82) 43 -271-0414, tel. (82) 261-2531, e-mail: soypark7@cbnu.ac.kr, paeky@cbnu.ac.kr Korea Forest Research Institute, Suwon 441-847 Korea fax (82) 31-290-1163, tel. (82)31-290-1163, e-mail: hkmoon@forest.go.kr Micropropagation, including somatic embryogenesis in woody species, is considered as one powerful approach in cloning elite genotypes and genetic transformation. However, regeneration is difficult to achieve in tissue or cell beyond the mature embryo phase in trees.

Additionally regeneration capacity has often been considered as a species-specific characteristic because of the difficulty to identify the reasons for the problem as it is a consequence of the complex interplay of several factors, so still its physiological process involved are poorly understood.

In an attempt to obtain deeper insight into the variation in embryogenic and organogenic capacity from Kalopanax septemlobus and Populus euramericana which are important, we investigated endogenous metabolites including polyamins (PAs) from embryogenic (EC) and non-embryogenic cells (NEC), and response and recalcitrant genotype. The PA contents were remarkably different between the cell types, the highest levels occurring in the NEC on proliferation medium, when putrescine and spermidine were most abundant. Spermine was present in only minute quantities and showed only a small change. A comparison of metabolic compositions of NEC and EC using GC/MS identified around 50 compounds, partly displaying significant changes in metabolite levels, e.g., highly elevated levels of xanthosine and methyloxazole in EC compared to in NEC. From this analysis, we have identified numerous compounds including PAs involved with the embryogenic state. For organogenesis of P.

euramericana, stem discs cultured on regeneration medium were sampled and the contents of three PAs were analyzed during the entire culture period. Total PA contents were higher in the non-recalcitrant clone than response one, however putrescine(put)/spermidine(spd) is dramatically increased in recalcitrant clone after 18 days of culture. To overcome those recalcitrant characteristics in embryogenesis, pre-treatments with strong concentration of 2,4-D for 1-day and high osmotic stress with 1 M sucrose stimulated embryogenic cell formation from leaf segment in K. septemlobus. For organogenesis, shoot regeneration was improved by 1mM of exogenous Put and Spd, and manipulation of light quality. These results showed that the cellular PAs and Put/Spd ratios are important indicators of the regeneration ability, and morphogenetically poor and recalcitrant species or genotype could be found by metabolite profilings and simply PAs analysis. Furthermore the results showed that regeneration in recalcitrant genotype could be enhanced by manipulation of physiological status of explants.

–  –  –

ИНДУКЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА FRAGARIA X POTENTILLA IN VITRO

Амброс Е.В., Полубоярова Т.В., Новикова Т.И.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, Новосибирск, 630090, ул. Золотодолинская, 101, факс: (383) 330-19-86, тел. (383) 339-98-27, e-mail: ambros_ev@mail.ru В настоящее время при получении новых форм растений широко используются биотехнологические методы, которые позволяют значительно повысить эффективность селекционного процесса. Благодаря тотипотентности растительных клеток под влиянием регуляторов роста индуцируется морфогенез, в процессе которого образуются ткани и органы de novo, способные формировать целый организм. Регенерация растений из зародышевых тканей in vitro используется в селекции плодовых растений для преодоления постгамной несовместимости при получении отдаленных гибридов.

Цель исследования – изучить морфогенетические особенности формирования побеговых структур, полученных в культуре in vitro из незрелых зиготических зародышей Fragaria x Potentilla.

Зародыши извлекали из незрелых семянок в несколько периодов: через 10-15 дней после опыления (ДПО), 15-20 ДПО, 20-25 ДПО, 25-30 ДПО. Затем их разрезали продольно между семядолями и помещали на индукционные модифицированные среды МС с БАП, 2,4-Д и НУК в различных комбинациях и концентрациях. Экспланты выдерживали 4-5 недель в темноте при температуре 250С. После каллусообразования их переносили в условия 16-ти часового фотопериода, при температуре днем 23-25 С, ночью 16-18 С, освещенности 4 клк. Почти у всех эксплантов на 7 день культивирования отмечено появление каллусной ткани с различной морфогенной активностью. На среде МС с 0.2 мг/л БАП + 1.0 мг/л 2,4-Д у 92-97% эксплантов, изолированных на 20-25 и 25-30 ДПО, образовался морфогенный каллус - плотный, молочного цвета, зеленеющий на свету. Гистологический анализ эксплантов культивируемых на индукционной среде показал, что через 2 недели в поверхностном слое каллуса формировались очаги клеток меристематического типа. После 3-5 недель культивирования деление клеток меристематических очагов приводило к образованию бугорков на поверхности каллуса.

Затем экспланты помещали на среду для дифференциации (МС с БАП 0.75 мг/л + 0.1 мг/л ГК3), на которой через 6-8 недель появлялись многочисленные побеги, находящиеся на разных стадиях развития. На гистологических срезах в этот период отмечено формирование меристем адвентивных побегов, заложение листовых примордиев, а также рост почек и развитие побегов из почек.

Таким образом, морфогенез в культуре каллусной ткани Fragaria x Potentilla реализуется путем геммогенеза. Установлено, что морфогенным потенциалом обладают поверхностные слои клеток экспланта. Получение морфогенного каллуса оказалось возможным только при использовании в качестве исходного материала эксплантов, изолированных из семянок на 20-25 и 25-30 ДПО при культивировании на модифицированной среде МС с 0.2 мг/л БАП и 1.0 мг/л 2,4-Д. Наиболее компетентными к развитию оказались зародыши, выделенные из семянок через 25-30 ДПО. Этот период изоляции эксплантов обеспечил наибольший выход растений – регенерантов на среде для дифференциации (3,8% побегов).

–  –  –

Central Siberian Botanical Garden of the Siberian Branch, RAS, Novosibirsk, 630090,

Zolotodolinskaya st., 101, fax (383) 330-19-86, tel. (383) 339-98-27, e-mail:

ambros_ev@mail.ru At present biotechnological methods allowing increase efficiency of breeding process are widely used for obtaining new forms of plants. Due to totipotency of plant cells under the influence of plant growth regulators the morphogenesis is induced. During this process de novo tissues and organs capable of forming a whole organism appear. Plants regeneration from in vitro embryo tissues is used in breeding of fruit plants for overcoming postgamic incompatibility when obtaining remote hybrids.

The aim of this reseach is to study the morphogenetic characteristics of shoot structures obtained in tissue culture from immature Fragaria x Potentilla zygotic embryos.

Embryos were taken from immature seeds during in several periods: 10-15 days after pollination (DAP), 15-20 DAP, 20-25 DAP, 25-30 DAP. Then these embryos were cut between cotyledons and placed on modified induction MS media supplemented with BA, 2,4-D and NAA in various combinations and concentrations. Explants were incubated for 4-5 weeks in the dark at 250C and were transferred at 23-25/ 16-180C for 16/8 hours (day/ night) photoperiod at 4 Klux light intensity after callus formation. Morphogenic callus activity of most of explants was observed on the 7th day of culturing.

Morphogenic callus (dense, milky, becoming green on light) was formed on the MS medium with 0.2 mg l-1 BA and 1.0 mg l-1 2,4-D at 92-97% of the explants isolated in 20-25 and 25-30 DAP. The histological analysis of explants cultivated on the induction medium showed that 2 weeks later cell centers of meristematic type were formed in a surface layer of callus. Cell divisions of the meristematic centers led to formation of protuberances on callus surface after 3weeks of culturing. Then explants were placed on the medium for differentiation (MS with

0.75 mg l-1 BA and 0.1 mg l-1 GA3) where numerous shoots at different developmental stages appeared 6-8 weeks later. Formation of adventitious shoot meristems, initiation of leaf primordial, as well as growth of buds and development of shoots from buds were noted on histological cuts in this period.

Thus, the morphogenesis in callus tissue culture of Fragaria x Potentilla is realized by the gemmogenesis. It has been established that surface layers of explant cells have morphogenic potential. Obtaining morphogenic callus was possible with the use of explants isolated from seeds 20-25 and 25-30 DAP when culturing on the modified MS medium with 0.2 mg l -1 BA and

1.0 mg l-1 2,4-D as an initial material. The embryos isolated from the seeds 25-30 DAP turned out to be most competent to development. This period of explants isolation provided the greatest number of regenerants on the medium for differentiation (3.8% of shoots).

–  –  –

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ,

СВЯЗАННЫХ СО СПОСОБНОСТЬЮ К АНДРОГЕНЕЗУ IN VITRO, У ЯРОВОГО

ГЕКСАПЛОИДНОГО ТРИТИКАЛЕ

Антоненко Е.В., Кременевская Е.М., Ермишина Н.М., Лемеш В.А.

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Минск, 220072, ул.

Академическая, 27 факс: (8017) 284-19-17, тел. 8(017) 294-91-82, e-mail:

E.Antonenko@igc.bas-net.by Разработка и совершенствование биотехнологических методов с целью использования их для создания нового исходного материала и ускорения селекционного процесса важнейших зерновых культур в настоящее время приобретает особое значение.

Культура пыльников in vitro является одним из наиболее эффективных методов экспериментальной гаплоидии и применяется в различных селекционных программах для создания гомозиготных линий на основе гибридов ранних поколений. В условиях культуры in vitro возможно не только вовлечение в искусственный отбор огромного числа генотипов, но и создание высокой жесткости отбора в строго контролируемых условиях.

Этот метод лежит в основе создания новых сортов растений, в особенности, хлебных злаков.

Тритикале ( Triticosecale Wittm.) – культура, полученная в результате объединения геномов пшеницы и ржи, которая сочетает в себе ряд хозяйственнобиологических особенностей, присущих исходным видам, таких как высокий потенциал урожайности зерна и зеленой массы, повышенные адаптивные свойства, относительная устойчивость к грибным заболеваниям, высокое содержание белка лизина и крахмала в зерне и т.д. Однако новая сельскохозяйственная культура нуждается в серьезной доработке. Несмотря на то, что с момента получения первых растений-регенерантов тритикале в культуре пыльников in vitro эффективность данного метода значительно увеличилась, он не получил широкого практического применения. Это обусловлено тем, что до сих пор не разработаны подходы массового получения гаплоидов в культуре in vitro и создания гомозиготных линий тритикале. Поскольку одним из лимитирующих факторов, обеспечивающих успех применения метода культуры пыльников является генотип донорного растения, важно разработать эффективную систему отбора науболее перспективных для введения в культуру форм тритикале, которые в дальнейшем можно будет использовать в качестве доноров генов, связанных с высокой отзывчивостью в культуре пыльников in vitro. Локализация генов и генетических систем, связанных с высоким эмбриогенным потенциалом в культуре in vitro, позволит управлять данными процессами и повысить эффективность метода культуры клеток и тканей. Способность к индукции каллусов и регенерации у пшеницы зависит в большой степени от хромосом 2A, 2D, 5A, 5B, 4A, 2B. Поскольку тритикале содержит А и В геномы пшеницы, целью работы было установить целесообразность использования разработанных для пшеницы ДНК-маркеров для скрининга по генам, контролирующим параметры пыльцевого эмбриогенеза у тритикале. Осуществлен анализ полиморфизма микросателлитных локусов, расположенных на пятой хромосоме А-генома у 65 генотипов ярового гексаплоидного тритикале. Были использованы праймеры к 3 микросателлитным локусам, связанным с признаками пыльцевого андрогенеза in vitro у мягкой пшеницы.

Исследуемые микросателлитные локусы равномерно распределены по хромосоме 5А, все они представлены единичными копиями. Полученные данные свидетельствуют о наличии полиморфизма по единственному локусу Xgwm186 у исследованных генотипов ярового гексаплоидного тритикале. Для того, чтобы сделать вывод о пригодности или непригодности использования разработанных для пшеницы ДНК-маркеров для отбора высокоэмбриогенных генотипов тритикале в дальнейшем планируется проведение более комплексного исследования, затрагивающего другие хромосомы генома.

Секция 2

–  –  –

SSI "Institute of Genetics and Cytology", Minsk, 220072, Academicheskaya St., 27 fax: (8017) 284-19-17, phone: 8(017) 294-91-82, e-mail: E.Antonenko@igc.bas-net.by The development and improvement of biotechnological methods that can be used in order to create new starting material as well as to accelerate the breading process of the major crops are acquiring special significance nowadays. Anther culture in vitro is one of the most efficient methods of experimental haploidy which is often used in various breeding programs to create homozygotiс lines on the basis of the hybrids of previous generations. In vitro culture conditions not only is it possible to include a huge amount of genotypes but also to create the rigid selection in strictly controlled condition. In vitro culture conditions is not only a possibility to include a huge amount of genotypes in artificial selection but also to create the rigid selection in strictly controlled condition. This method underlies the creation of new species of plants particularly of crop plants.

Triticale ( x Triticosecale Wittm.) – is a culture obtained by combining genomes of wheat and rye. This culture embodies a number of features inherent to the original species such as high yield potential of grain and vegetative mass, increased adaptive properties, relative resistance to fungal diseases, high content of lisin and starch in grain etc.

Nevertheless this new agricultural culture needs serious selection revision. Despite the fact that since the first regenerants of triticale were obtained in anther culture the efficiency of this method has significantly improved, it still doesn't have wide practical application. This happened due to the fact that the mass production of haploids in cell culture and the creation of homozigotic lines of triticale still haven't been developed. As one of the limiting factors ensuring the success of the application of the anther culture method is the donor plant genotype it's important to work out an effective selection system of the most promising triticale forms to be brought introduced into the culture and later it would be possible to use them as donors of genes associated with high responsiveness in anther culture in vitro.

The localization of genes and genetic systems connected with the high embryogenic potential in vitro culture allows to control the given processes and improve the effectiveness of cell and tissue culture callus induction and regeneration ability of wheat depends mainly on the chromosomes 2A, 2D, 5A, 5B, 4A, 2B. As the triticale contains A and B wheat genomes, the aim of the work was to define advisability of using the DNA markers which were developed for wheat to screen the genes controlling triticale pollen embryogenesis. We analyzed polymorphism of microsatellite loci, located on the fifth chromosome of A genome of 65 genotypes of spring hexaploid triticale. primers to 3 microsatellite loci, connected with the trait of pollen androgenesis in vitro of soft wheat were used. The examined microsatellite loci are evenly spread on chromosome 5A, all of them are represented by single copies. The acquired data indicate the presence of polymorphism on a single locus Xgwm186 in the examined genotypes of spring hexaploid triticale. In order to draw a conclusion about the suitability or unsuitability of wheat developed for DNA markers for selection of highly embryogenic triticale genotypes will be a more comprehensive study of other chromosome of triticale genome.

Секция 2

ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ В УСКОРЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ

TRITICUM AESTIVUM L. НА УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ

БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Анапияев Б.Б1., Искакова К.М1., Бейскенбек Е.Б1., Казкеев Д.Т2., Жанбырбаен Е.А2.

Институт высоких технологии и устойчивого развития КазНТУ им. К.И. Сатпаева МОН РК, Алматы, 050013; ул. Сатпаева 22, Казахстан, E-mail: bak_anapiyayev@mail.ru Институт биологии и биотехнологии растений МОН РК, Алматы, 050013, ул.

Тимирязева, 45 Проблема устойчивости культурных растений к неблагоприятным факторам внешней среды, наряду с ростом численности населения Земли, признана глобальной проблемой. Перед учеными стоит важная задача по ускоренному созданию новых сортов основных продовольственных культур, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды.

Современные разработки андроклинии, одного из направлений гаплоидной биотехнологии, в основе которого лежит метод культуры изолированных пыльников и микроспор, позволяют создавать константные гомозиготные удвоенные гаплоидные линии из гибридных популяций растений за 1-2 года, в то время как методом традиционной селекции для получения стабильных линий необходимо затратить 8-10 лет.

Проведен мониторинг генотипов пшеницы в условиях Южного Казахстана на устойчивость к ржавчинным заболеваниям в естественном и инфекционном питомнике. В качестве инфицирующего агента использовали расы Puccinia graminis, Puccinia striiformis, Puccinia recondita. Интенсивность поражения ржавчиной учитывали по шкале Питерсона и др. визуально по всем растениям делянки. Высокую устойчивость к ржавчинным болезням показали следующие генотипы: Triticum kihara, Triticum diccocum, Triticum thimofeevi, Almaly, Naz, Taza и другие. Отобранные устойчивые генотипы были использованы для скрещивания и создания перспективных межсортовых и межвидовых отдаленных гибридов. Было создано более 120 гибридных комбинаций. Полученные гибриды были генетически стабилизированы методом гаплоидной биотехнологии на основе культуры изолированных пыльников и микроспор in vitro. Были модифицированы составы питательных сред на основе Blaydes и №6 с добавлением активированного угля и амилодекстрина. В следующей серии экспериментов устойчивые и восприимчивые к ржавчинным болезням родительские формы, созданные гибридные формы и новые гаплоидные линии были проанализированы на уровне ДНК с использованием молекулярных маркеров. В результате SSR-анализа и изогенных линий на основе Thatcher установлено, что устойчивые к ржавчинным болезням генотипы и линии имеют ген Lr 24.

В заключительной стадии новые перспективные дигаплоидные линии были тестированы на устойчивость к ржавчинным болезням на естественном и искусственном фонах в двух областях Южного Казахстана (Алматинская и Жамбылская). Среди изученных дигаплоидных линий выделены номера DHL 1057, DHL 1050, DHL 1045 и DHL 1027, которые оказались устойчивыми к ржавчинным заболеваниям и характеризуются высокой урожайностью и качеством зерна.

На основе проведенных исследований и использования гаплоидной биотехнологии впервые в Республике Казахстан был создан новый высокопродуктивный сорт пшеницы «Нуреке», который был районирован в Алматинской и Жамбылской области Южного Казахстана.

Секция 2

HAPLOID BIOTECHNOLOGY IN RAPID BREEDING OF TRITICUM

AESTIVUM L. FOR ADVERSE BIOTIC ENVIRONMENTAL FACTORS RESISTANCE

Anapiyayev B.B1., Iskakova K.M1., Beisenbek E.B1., Kazkeev D.T2., Zhanbirbayev E.A.2 Institute of High Technologies & Sustainable Development KazNTU, Kazakhstan, Almaty, 050013, Satpayev str, 22, E-mail: bak_anapiyayev@mail.ru Institute of Plant Biology and Biotechnology, Almaty, 050013, Timiryazev str., 45 The problem of cultural plants resistance to adverse environmental factors, alongside with Earth population growth, is recognized as a global problem. Scientists have faced the important problem of new cultivars accelerated breeding of the basic food cultures which are steady to abiotic and biotic environmental factors.

Modern developments of androgenesis which is one of the haploid biotechnology directions and the basis of it is the method of isolated anthers and microspores culture, allow to create the constant homozygous double haploid lines from plant hybrid populations during 1-2 years while a traditional breeding method of stable lines reception demands about 8-10 years.

Wheat genotypes monitoring on rust diseases resistance was carried out in Southern Kazakhstan conditions in natural and infectious nursery. Races Puccinia graminis, Puccinia striiformis, Puccinia recondita were used as an infecting agent. Intensity of rust defeat was taken into account on Peterson et al scale visually on all plants of the plot. The following genotypes have shown a high stability to rust diseases: Triticum kihara, Triticum diccocum, Triticum thimofeevi, Almaly, Naz, Taza and others. The selected steady genotypes have been used for crossing and breeding of perspective inter-cultivar and inter-species remote hybrids.

More than 120 hybrid combinations were created. Received hybrids were genetically stabilized by haploid biotechnology method on the basis of isolated anthers and microspores culture in vitro. The structures of nutrient mediums on Blaydes and №6 basis were modified through activated coal and amylodextrine addition. In the following experiments series rust- disease steady and rust-disease susceptible parental forms, bred hybrid forms and new haploid lines were analyzed at DNA level using molecular markers method. As a result of the SSR-analysis and isogenic lines on the Thatcher basis it was established that rust-disease steady genotypes and lines have Lr 24 gene. In a final stage new perspective dihaploid lines were tested on stability to rust diseases in natural and artificial conditions in two areas of Southern Kazakhstan (Almaty and Zhambyl). Among investigated dihaploid lines the numbers DHL 1057, DHL 1050, DHL 1045 and DHL 1027 were allocated. They appeared rust-diseases steady and are characterized with high productivity and grain quality.

On the basis of the carried out researches and use of haploid biotechnology for the first time in Kazakhstan a new high productive cultivar of common wheat "Nureke" which is zoned in Almaty and Zhambyl areas of Southern Kazakhstan.

–  –  –

КРАХМАЛЫ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АМИЛОЗЫ И АМИЛОПЕКТИНА

КАК КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ ЯЧМЕНЯ

В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO

Белинская Е. В., Тымчук С. М., Деребизова О. Ю.

Институт растениеводства им. В. Я. Юрьева Национальной академии аграрных наук Украины, Харьков, 61060, проспект Московский, 142, факс: +380 (057) 779-84-17, тел. +380 (057) 392-13-43, email: bilinska@ukr.net Гаплоидные технологии, которые основаны на индукции спорофитного развития микроспор в культуре пыльников in vitro, позволяют существенно ускорить процесс создания гомозиготных линий. Однако целесообразность применения этих технологий в селекции зависит от возможности обеспечить массовый характер образования морфогенных структур и регенерации растений, в связи с чем, актуальной задачей современной биотехнологии является поиск методических приемов повышения регенерационного потенциала пыльниковой культуры при максимальном нивелировании генотипической зависимости гаплопродукционного процесса. Исходя из этого, целью исследований была оценка эффективности стимуляции эмбриоидогенеза и регенерации в культуре пыльников in vitro ячменя ярового путём замены агар-агара в питательной среде кукурузными крахмалами.

Материалом для исследований служили три модельных генотипа с контрастной способностью к андрогенезу in vitro и пять гибридных популяций F 3. Базовая индукционная среда NMSмод.2 (контроль) и среда для регенерации растений содержали 0,8 % агар-агара „Difco” (США).

В опытных вариантах в состав среды в качестве гелеобразователя были включены кукурузные крахмалы, выделенные из зерна линий-носителей мутантных генов структуры эндосперма ae, wx, su1 и su2.

При изучении гелеобразующих свойств этих крахмалов было установлено, что высокоамилозные кукурузные крахмалы из зерна линий-носителей генов ae и su2 (содержание амилозы соответственно 65 % и 35 %) в концентрации 6,5 % образуют гели, плотность которых достаточна для инокуляции эксплантов. Крахмалы su1 (содержание амилозы 35 %) и wx (содержание амилопектина более 90 %) оказались непригодными для использования в качестве гелеобразователей питательных сред.

Анализ результатов культивирования пыльников in vitro свидетельствует о том, что у линии андрогенного происхождения ДГ00-126, обладающей высокой способностью к андрогенезу in vitro, на среде с ае-крахмалом (Патент 34859 Украина) частота регенерации нормально пигментированных растений составила 52,5 %, в то время, как в контроле этот показатель был на уровне 31,3 %.

Высокие показатели гаплопродукции были получены и при замене агар-агара su2-крахмалом. В частности, у линии ДГ00-126 выход зеленых растений увеличился с 25,6 % до 53,4 %. У сорта Феникс, которому присуща низкая способность к андрогенезу in vitro, было достигнуто возрастание частоты регенерации с 0,6 % до 15,8 %. Апробация инновационной разработки – замены агар-агара su2-крахмалом (Патент 42192 Украина) на гибридном селекционном материале подтвердила ее эффективность. Так, при использовании среды с крахмалом отмечено увеличение среднего количества морфогенных пыльников с (19,6 ± 0,9) % до (27,0 ± 0,9) % и средней частоты регенерации растений с (5,9 ± 0,5) % до (14,8 ± 0,7) %.

Таким образом, в результате изучения структурно-механических свойств гелей, полученных из зерновых крахмалов кукурузы с различным содержанием амилозы и амилопектина, отобраны препараты мутантных по генам структуры эндосперма форм ae и su2. Впервые дана характеристика морфогенетического эффекта этих крахмалов в культуре пыльников in vitro ячменя ярового. Наличие мутаций ортологичных генов структуры эндосперма у других видов растений позволяет сделать предположение о возможности выявления новых перспективных гелеобразователей питательных сред для культивирования растительных и микробиологических объектов.

–  –  –

STARCHES POSSESSING DIFFERENT CONTENT OF AMILOSE AND

AMILOPECTINE AS CONPONENTS OF NUTRIENT MEDIUM FOR BARLEY

HAPLOID PRODUCTION IN ANTHER CULTURE IN VITRO

Belinskaya E.V., Tymchuk S.V., Derebizova O. Y.

Yurjev Plant Production Institute of National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, 142 Moskovsky av., Kharkiv, 61060, Ukraine, fax: +38 (572) 779-84-17, phone: +380 (057) 392-13-43, e-mail: bilinska@ukr.net Haploid production technologies based on the induction of microspore sporophytic development in anther culture in vitro allow substantially accelerate a homozygous line creation.

However the expediency of application of these techniques in plant breeding depends on the possibility to ensure a mass character of morphogenetic structure induction and plant regeneration.

Consequently a search for the new approaches to increase anther culture regeneration potential together with the maximum reduction of haploid production genotypic dependence is considered to be an actual task of a modern biotechnology.

The aim of this investigation was to evaluate the efficiency of embryo production and plant regeneration promotion in spring barley anther culture in vitro via agar substitution in the inductive medium for corn starches with the different amylose content.

Three model genotypes with a contrast androgenetic capacity and five F3 hybrid populations were used as an initial material. Both the inductive medium NMSmod.2 (control variant) and the regeneration medium were containing 0.8 % agar “Difco” (USA). Corn starches obtained from the seeds of lines which were the carries of endosperm structure mutations ae, wx, su1 и su2 were added to the experimental variants of a medium.

Investigation on a gelling capacity has shown that corn starches with a high amylose content obtained from the seeds of lines which were the carries of genes ae and su2 (amylose content – 65 % and 35 % respectively) formed gels with the density sufficient for explant inoculation. The starches of su1 type (35 % amylose content) and wx type (more than 90 % amylopectin content) were appeared to be unsuitable for use as gelling components of nutrient media.

Analysis of the obtained data concerning anther cultivation in vitro has shown that a green plant regeneration frequency in a high responsive line DH00-126 which has androgenetic origin was 52.5 % on the medium containing ae-starch (Patent 34859 Ukraine) while in the control variant this trait was at a level of 31.3 % (LSD05=7.1). High values of haploid production traits were also obtained when agar was substituted for su2-starch. Particularly green plant yield has increased from 25.6 % to 53.4 % (LSD05=6.6) in line DH00-126. In this experiment it has been reached an increasing of a green plant regeneration frequency from 0.6 % to 15.8 % in spring barley cultivar Fenix possessing a low androgenetic capacity.

Test of the agar substitution for su2-starch as innovative elaboration (Patent 42192 Ukraine) in a breeding material has proved its efficiency. In particular it has been noted an arising of a morphogenic anther mean number from (19.6 ± 0.9) % to (14.8 ± 0.7) %. The mean frequency of plant regeneration has also increased from (5.9 ± 0.6) % to (14.8 ± 0.7) %.

Thus preparations of corn starches obtained from genotypes which were ae and su2 endosperm structure mutant forms have been selected on the base of the study on structural and mechanical properties of the gels made of starches with a different amylose and amylopectin content.

At the first time a morphogenetic effect of these starches in spring barley anther culture in vitro has been characterized. The existence of orthological endosperm structure gene mutations in other plant species allows make a supposition about the possibility to reveal new perspective gelling agents of nutrient media for cultivation of plant and microbiological objects.

–  –  –

РГП «Институт биологии и биотехнологии растений» МОН РК, г. Алматы, ул. Тимирязева, 45, тел./факс: 8(727)3947562, e-mail: gen_jan@mail.ru Принципиально важным моментом в изучении процесса соматического эмбриогенеза является изучение самых ранних его этапов. При этом важно выяснить не только сигналы и индукторы этого процесса, но и механизмы, заставляющие дифференцированную клетку in vitro переключаться на другой путь развития (Бутенко, 1999). Длительно культивируемые рыхлые эмбриогенные каллусы являются удобными модельными системами для изучения этих вопросов, так как они имеют одноклеточное происхождение эмбриоидов и являются отзывчивыми к регуляции морфогенеза при помощи фитогормонов и трофических факторов.

Методами световой и электронной микроскопии проведено исследование влияния фитогормонов на состав клеточных популяций длительно культивируемых рыхлых эмбриогенных (РЭ) каллусов пшеницы и ячменя в сравнении с неэмбриогенными тканями различной морфологии (рыхлые и плотные). В результате, нами выявлены особенности эмбриогенных каллусов, резко отличающие их от неэмбриогенных тканей: наличие клеток с признаками программированной клеточной смерти (ПКС), накопление густой сети полисахаридов в межклеточном пространстве, обособление сферических эмбриогеннокомпетентных клеток, имеющих каллозную оболочкy. Показано, что возрастание пропорции клеток с признаками ПКС в РЭ тканях под действием 2,4-Д сопровождается усилением накопления экстрацеллюлярных полисахаридов (ЭПС), стимуляцией роста и эмбриогенного потенциала каллусов. Методами цитохимии и гистохимии обнаружено, что клетки с признаками ПКС в процессе гибели секретируют внеклеточные вещества полисахаридной природы. При помощи биотестов in vivo и in vitro установлено, что отдельные фракции секретируемых ЭПС обладают антиауксиновой активностью, т.е. ингибируют рост клеток растяжением, стимулируемый 2,4-Д; повышают устойчивость растений к стрессам; приводят к обособлению клеток каллуса при помощи каллозной оболочки и перепрограммированию их на эмбриоидогенный путь развития; стимулируют рост каллусных тканей.

На основании проведенных исследований разработана концепция о цитофизиологических закономерностях, лежащих в основе индукции и длительного поддержания тотипотентности в культуре тканей зерновых злаков. Предложена гипотетическая схема, демонстрирующая цикличность процессов инициации и дезинтеграции соматических эмбриоидов (СЭ) в длительно тотипотентных эмбриогенных каллусах. Согласно этой схеме последовательность событий, запускаемых фитогормоном 2,4-Д, представляется следующей.

Высокие концентрации 2,4-Д (5,0-7,0 мг/л) оказывают стрессовое действие на клетки каллусных тканей, блокируя процесс дифференциации 2-х, 3-х, 4-х клеточных проэмбрио и вызывая их дезинтеграцию и гибель клеток. При этом эмбриоиды распадаются на клетки с признаками ПКС и одиночные эмбриогенно-компетентные клетки, вновь вступающие на путь эмбриоидогенеза. Инициированные проэмбрио также могут вновь диссоциировать по пути ПКС с образованием эмбриогенных клеток. Таким образом в ходе многократного субкультивирования каллусов поддерживается их эмбриогенный потенциал. При снижении концентрации 2,4-Д до 1,0 мг/л стрессовое действие фитогормона снижается, гибели клеток не происходит, и СЭ имеют возможность к нормальному развитию и дифференциации вплоть до формирования целого растения. В целом, нами показана важная роль ПКС и секретируемых в ходе гибели клеток полисахаридов в переключении клеток каллусов на эмбриоидогенный путь развития, в поддержании пула эмбриогенно компетентных клеток при субкультивировании, в регуляции формы и размеров клеток, а также процессов дифференциации СЭ и роста каллусных тканей.

–  –  –

Republican State Enterprise "Institute of Plant Biology and Biotechnology" Almaty, Timiryazevastreet, 45, tel./fax: 8 (727) 3947562, e-mail: gen_jan@mail.ru The key moment in the investigation of somatic embryogenesis process is study of its very early stages. It is crucial to clarify not only the signals and inductors of this process, but also the mechamisms that force differentiated cell in vitro to switch over to other developemental pathway (Butenko, 1999). Because the long-term cultivated friable embyogenic (FE) calli have a single cell origin of embyoids and appeared to be a very responsive to morphogenesis regulations by phytohormones and trophic factors, they have become a very useful model systems for investigation of these issues. Effect of phytohormones on the composition of cell populations of wheat and barley long-term FE calli, compared to friable and compact non-embyogenic tissues, have been investigated in this work by the methods of light and electrone microscopy. As a result, we found the distinct features of embyogenic tissues in comparison non-embyogenic: the presence of cells with signs of programmed cell death (PCD), accumulation of dense net polysaccharides in the intercellular space, separation of spherical embyogenic competent cells covered by callose envelope. It has been shown, that the increase of the proportion of cells with signs of PCD in FE tissues under the effect of 2,4-D is accompanied by enhanced accumulation of extracellular polysaccharides (EPS) as well as by the stimulation of calli’s growth and embyogenic potential. As it has been determined by cytochemical and hystochemical methods, cells with signs of PCD secrete polysaccharide extracellular substances during the course of death. Bioassays in vitro and in vivo revealed that fractions of secreted EPS have antiauxin activity, i.e. they inhibit the growth if cells by elongation, stimulated by 2,4 D;

increase the stress tolerance of plants; cause separation of callus cells by means of callose envelope and their reprogramming into the embyoidogenic developemt pathway; stimulate the growth of callus tissues.

On the basis of fulfilled research, we developed the concept of cytophysiological regularities underlying the induction and long-term maintanance of totipotency in cereals tissue culture. We suggest hypothetical scheme, that demonstrates the cycle of initiation and desintegration processes of somatic embyoids in the long-term totipotent embyogenic calli.

According to this scheme, the sequence of events, caused by 2,4-D, as the following. High concentrations of 2,4-D (5,0-7,0 mg/l) effect on callus cells as strong stress factors, blocking differentiation processes of two-, three- and four- celled proembryos, causing their desintegration. During this process embryoids are destructed onto the cells with signs of PCD and single competent cells, that again enter the path of embryoidogenesis. Initiated proembryos also a capable to dissociate through the PCD process with the formation of spherical competent cells. By this way embyogenic potential of calli is constantly maintained during multiple subcultivations. The decrease of 2,4-D concentration up to 1,0 mg/l diminishes stressful influence of phytohormone, and cell death does not occur. Somatic embyoids are able in this case to normal developement and differentiation with the formation of the whole plant. On the whole, we have shown the important role of PCD and polysaccharides secreted during cell death in the switching over of callus cells to the embyoidogenic developmenthal pathway, in the maintenance of embyogenic competent cells’ pool, in the regulation of cells' shape and size as well as in the regulation of embyoid’s differentiation and callus tissues’ growth.

Секция 2

ПРЕОДОЛЕНИЕ ГЕНОТИПИЧЕСКОЙ ЗАВИСИМОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ

РАСТЕНИЙ IN VITRO У ЗЕРНОВЫХ ЗЛАКОВ

Бишимбаева Н.К., Амирова А.К., Карабаев М.К., Рахимбаев И.Р.

РГП «Институт биологии и биотехнологии растений» МОН РК, г. Алматы, ул.

Тимирязева, 45, тел./факс: 8(727)3947562, e-mail: gen_jan@mail.ru Основными препятствиями, лимитирующими разработку клеточных технологий для зерновых злаков являются высокая зависимость регенерационной способности in vitro от генотипа и потеря ее при длительном субкультивировании. Последнее связано с морфологической гетерогенностью и нестабильностью морфологии каллусных тканей злаков. Несмотря на то, что во многих исследованиях разработаны пути активации соматического эмбриогенеза и регенерации растений, до сих пор не выработаны общие методологические подходы к регуляции морфогенеза у in vitro у зерновых злаков.

Вследствие этого, для каждого вида и даже сорта условия регенерации долгое время приходилось подбирать эмпирически.

Нами проведен цикл исследований по изучению морфологической гетерогенности и метаморфоза в ходе многократного субкультивирвоания каллусных тканей пшеницы и ячменя.

Проведена классификация каллусных тканей на морфотипы, изучено их гистологическое строение, метаморфоз и способность к регенерации при многократном субкультивировании на питательных средах различного состава.

В результате, выявлены универсальные для различных генотипов и стабильные при субкультивировании типы каллусов, клетки которых обладают свойством морфогенетической пластичности или полипотентности; изменяя состав питательной среды, из них можно индуцировать различные типы морфогенеза, в том числе, соматический эмбриогенез. Это позволяет, в свете современных представлений, провести аналогию между клетками универсального стабильного типа каллуса и стволовыми клетками.

На этой основе нами разработан подход к решению важной проблемы в области биотехнологии растений - преодолению генотипической зависимости процесса длительной регенерации растений in vitro, заключающийся в отборе универсальных для различных генотипов меристематически активных каллусов, которые под действием 2,4-Д и стресса могут проявлять одну и ту же морфогенетическую реакцию у разных генотипов – подвергаться метаморфозу с образованием эмбриогенных тканей, потенциально способных к длительному сохранению способности к регенерации растений. При этом, различия в морфогенетических реакциях in vitro между генотипами нивелируются. Выяснены процессы клеточной дифференцировки, происходящие в ходе метаморфоза: под действием стресса происходят ингибирование клеточных делений, разрыв межклеточных связей, гибель клеток по пути программированной клеточной смерти (ПКС), усиленная секреция внеклеточных веществ, обособление и перепрограммирование клеток на путь эмбриоидогенеза. После удаления стресса происходит активация клеточных делений, активная пролиферация эмбриогенных клеточных комплексов, инициация и дифференциация эмбриоидов из перепрограммированных компетентных клеток вплоть до регенерации целых растений.

В результате этих фундаментальных исследований нами разработана генотип-независимая технология длительной регенерации растений в культуре тканей пшеницы и ячменя, которая в настоящее время успешно используется для улучшения коммерчески важных сортов Казахстана.

–  –  –

Republican State Enterprises "Institute of Plant Biology and Biotechnology" Almaty, Timiryazeva street, 45, tel./fax: 8 (727) 3947562, e-mail: gen_jan@mail.ru The high genotype dependence of regeneration capability in vitro and the loss of regeneration capability during long-term subcultivation are the main obstacles that limit the development of cell technologies for cereals. This is due to morphological heterogeneity and instability of callus tissue’s morphology in cereals. Despite the development of somatic embryogenesis and plant regeneration activation pathways in various research works, there are no sufficient common methodological approaches of morphogenesis in vitro has been developed in cereals. Consequently, there was the need to select regeneration conditions empirically for each variety and even for an every cultivar.

We have conducted research on morphological heterogeneity and metamorphosis during multiple subcultivations of wheat and barley callus tissues. We classified callus tissues on morphotypes with the investigation of their histological structure, methamorphosis and capability to regeneration during long-term subcultivation on mediums with various composition.

In the result, we identified universal for various genotypes and stable during subcultivation callus type, which contain morphogenetically plastic or polypotent cells; changes in media composition could lead to the induction of different types of morphogenesis from these cells, including somatic embryogenesis. Considering recent understandings, this allows to assume analogy between the cells of universal stable callus type and stem cells.

On this basis we developed an approach to solve an important problem in the area of plant biotechnology – overcoming genotype dependence of long-term regeneration process in vitro. This approach means the selection of meristematically active calli universal for different genotypes, that under the impact of 2,4-D and stress can display the same morphogenetic reaction for all genotypes– undergoing the methamorphosis with generation of embryogenic tissues potentially capable to maintain long-term regeneration capacity. At the same time, differences in morphogenetic reactions in vitro between the genotypes are eliminated. Processes of cells differentiation during methamorphosis have been revealed in this work: stress causes inhibition of cell division, disruption of intercellular connections, death of cells by means of programmed cell death, increased secretion of extracellular substances, isolation and reprogramming of competent cells on the pathway of embryoidogenesis. After the stress elimination we observed activation of cell divisions, active proliferation of embryogenic cell complexes, initiation and differentiation of embyoids from reprogrammed competent cells up to the regeneration of the whole plants.

As a result of this fundamental research, genotype-independent long-term regeneration technology in cereal tissue culture have been developed and is successfully being used for the improvement of commercially valuable varieties of Kazakhstan.

Секция 2

ИЗУЧЕНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОБЕГОВ ИЗ КАЛЛУСА

ПЕРСИКА

Вагапова Т.И.1,2, Сидорова Т.Н.2, Долгов С.В.1,2 Пущинский государственный естественно-научный институт; Пущино, Московская область, 142290, проспект Науки, дом 3, тел. (4967) 73-25-38, e-mail: tatya38@yandex.ru Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино,

Московская область, 142290, проспект Науки, дом 6, тел. (4967) 73-17-79, e-mail:

sidorovat@rambler.ru Персик (Prunus persica L. Batsch) – одна из самых ценных плодовых культур.

Плоды персиков потребляются в свежем виде и используются в производстве сухофруктов, консервов, джемов, сиропов, соков. В настоящее время наблюдается снижение урожайности персика, так как данная культура в значительной степени подвержена влиянию различного рода неблагоприятных факторов (подмерзание, грибные и вирусные заболевания). Повышение урожайности персика за счет повышения устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам, в том числе и к наиболее опасному патогену косточковых плодовых культур – вирусу оспы сливы (Plum Pox Virus, PPV), способствовало бы увеличению производства плодов. Применение традиционных методов селекции для получения сортов, устойчивых к вирусам, является низкоэффективным, поскольку отсутствуют природные доноры устойчивости. Из наиболее приемлемых выходов из данной ситуации является использование современных методов генной инженерии, которые дают возможность значительно ускорить процессы создания устойчивых высокопродуктивных сортов персика. Более того в настоящее время с помощью методов генной инженерии можно получать генетически модифицированные растения, которые не содержат нежелательные чужеродные последовательности ДНК (например, гены селективных и репортерных маркеров).

Получение морфогенного каллуса и последующая регенерация растений являются важными и неотъемлемыми этапами при создании трансгенных сортов косточковых культур. Однако отсутствие надежных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей коммерческих сортов персика, является главным препятствием при создании трансгенных растений персика.

Целью нашей работы являлся подбор состава питательных сред и длительности культивирования, позволяющие индуцировать образование морфогенного каллуса на растениях-донорах каллуса и последующую регенерацию побегов из каллусов двух подвоев персика «Bailey», «Nemaguard». Индукцию каллусообразования осуществляли на питательных средах MS и LР с добавлением 6-БАП и ИМК в три этапа. Образовавшийся каллус помещали на среду регенерации, содержащую минеральные соли MS и регуляторы роста (6-БАП-2 мг/л и НУК-1 мг/л). Регенерацию из каллусов наблюдали три месяца.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что минеральный состав среды оказывает существенное влияние на индукцию образования морфогенного каллуса и адвентивную регенерацию. Культивирование растений-доноров на среде MS приводит к образованию морфогенного каллуса, способного регенерировать побеги с большей частотой. Для более эффективной регенерации предпочтительней культивирование растений-доноров на среде индукции в течение двух – трех месяцев.

Секция 2

RESEARCH OF ADVENTITIOUS SHOOTS FORMATION FROM CALLUS OF

PEACH Vagapova T.I.1,2, Sidorova T.N.2, Dolgov S.V.1,2 Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290, Prospect of Science, 3, tel. (4967) 73-25-38, e-mail: tatya38@yandex.ru Federal State Institution of Science Branch of Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290, Prospect of Science, 6, tel. (4967) 73-17-79, e-mail: sidorovat@rambler.ru Peach (Prunus persica L. Batsch) is one of the most valuable fruits. Peach fruits are consumed fresh and used in the production of dried fruit, canned goods, jam and juice. There is currently decrease of the yield of peach, as the peach is heavily influenced by various unfavorable factors (freezing, fungal and viral diseases). Rise of the peach yields by increasing peach resistance to biotic and abiotic stress factors including the most dangerous pathogens of stone fruit trees - Plum Pox Virus (PPV) would promote increase the production of fruits.

Application of conventional breeding for improvement of the cultivars which will be resistant to various unfavorable factors is low effective as there are not natural resistance donors. The most acceptable way of the solution of this problem is application of modern genetic methods that enable significantly accelerate the development of resistant high-yield varieties of the peach.

Moreover nowadays using genetic methods we could receive genetically modified plants which do not contain undesirable alien DNA sequences (e.g., reporter genes and selective markers).

Induction of morphogenic callus and the subsequent regeneration of plants are important and integral steps in development transgenic varieties of stone fruit. However lack of the reliable methods capable to provide rather high frequency of shoot regeneration of from mature tissues of the peach is the main obstacle to development of transgenic peach plants.

The aim of our work was improvement of culture conditions for cultivation of donor plants of peach rootstocks “Nemaguard” and “Bailey” and induction of morphogenic callus.

Callus induction was made on culture media MS and LP with the addition of 6-BAP and IBA for one, two and three months. Formed callus was placed on regeneration medium containing MS mineral salts and growth regulators (BA-2 mg/l, NAA-1 mg/l). Regeneration from callus was observed during three months. The obtained data allowed to make a conclusion that the mineral composition of the medium had a significant effect on the induction of morphogenic callus and adventitious regeneration. The cultivation of donor plants on MS medium resulted in formation of morphogenic callus capable to regenerate shoots with high frequency. The cultivation of donor plants on the induction medium for two or three months was preferred for more efficient regeneration of plants than one month.

–  –  –

Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии НАН Беларуси (ГНУ ИГиЦ НАНБ), Минск, 220072, ул. Академическая, 27, Факс: (37517) 284-19-17, тел. (37517) 263-53-26, e-mail: E.Voronkova@igc.bas-net.by В селекции растений метод культуры пыльников обычно используют для снижения уровня плоидности исходного материала. Однако для культурного картофеля характерно формирование в большом количестве наряду с диплоидными также и тетраплоидных растенийрегенерантов. Эти тетраплоидные регенеранты могут представлять интерес для селекции [Воронкова, 1999; Воронкова и др., 2004]. Гаметоклональная изменчивость растенийрегенератов в культуре in vitro пыльников значительно превосходит изменчивость растенийрегенератов, полученных в культуре соматических клеток (сомаклональную изменчивость), поскольку основным механизмом ее возникновения является не мутационный процесс, а рекомбинация генов в мейозе при образовании мужских половых гамет. Недостатком этого способа селекции картофеля является то, что у большинства сортов картофеля тетраплоидные растения-регенераты, полученные в культуре пыльников, существенно уступают исходному сорту по показателям продуктивности из-за повышения гомозиготности (они являются удвоенными дигаплоидами). Сохранение высокого уровня гетерозиготности андрорегенератов возможно при морфогенезе из нередуцированных пыльцевых зерен FDR (FDR-first division restitution: восстановление плоидности по типу первого деления мейоза, связанное с наличием мутации fs-слияние веретен) или SDR (SDR-second division restitution: восстановления плоидности по типу второго деления мейоза, связанное с наличием мутации pcпреждевременный цитокинез)-типа. Целью настоящего исследования было изучить, каким образом наличие, тип и частота мейотических мутаций в формирующейся пыльце влияют на уровень андрогенетического потенциала сортов картофеля.

Определяли частоту каллюсообразования в культуре пыльников и частоту регенерации побегов из пыльцевого каллюса в культуре пыльников 11 сортов картофеля с разной частотой и типом формирования нередуцированных гамет. Сорта Верас, Нептун, Прамень не формировали нередуцированные гаметы. Сорт Блакит имел низкий уровень (до 5 %) формирования диад FDR-типа, сорта Луговской, Adora, Aula и Anosta имели средний (от 5 до 20%), а сорта Дубрава, Лазурит и Загадка Питера – высокий (от 43,5% у сорта Дубрава до 85,6% у сорта Загадка Питера) уровень этого признака. У сорта Загадка Питера наблюдали формирование 2n-пыльцы преимущественно FDR-типа, у сорта Дубрава – преимущественно SDR-типа. У сорта Лазурит диады обоих типов были представлены примерно в равной пропорции.

В результате проведенных исследований установлено, что частота образования диад и тип мейотических мутаций у растений-доноров пыльников не оказывали существенного влияния на частоту каллюсообразования (она колебалась от 4,35% до 60,7%). С одной стороны, минимальный по опыту выход каллюса в культуре пыльников был отмечен у сорта Прамень, не образующего нередуцированную пыльцу. С другой стороны, низкий уровень каллюсообразования (около 13%) также был у сорта Лазурит, для которого характерна высокая частота мейотических мутаций одновременно нескольких типов. По-видимому, более значимую роль при пыльцевом морфогенезе играет уровень жизнеспособности пыльцы и доля в ней эмбриогенных пыльцевых зерен. Несмотря на то, что более высокая регенерационная активность наблюдалась у сортов, не формирующих нередуцированную пыльцу, или формирующих ее с невысокой частотой, нами не было выявлено четкой зависимости между этими двумя явлениями.

Секция 2

–  –  –

Institute of Genetics and Cytology of Belorussian National Academy of Science (SSO IGC NAS of Belarus), Minsk, Akademicheskaja st., 27, Fаx: (37517) 284-19-17, tel. (37517) 263-53-26, e-mail: E.Voronkova@igc.bas-net.by Anther culture technique is usually used in breeding for the purposes of reducing ploidy level of initial material. Nevertheless, it is characteristic for potato that tetraploid regenerants are produced along with diploid ones in anther culture. These tetraploid regenerants may be interesting for breeding [Voronkova 1999; Voronkova et al. 2004]. Gametoclonal variabity of plants regenerated in anther culture well exceeds variability of regenerants produced in somatic tissue culture (somaclonal variability), as far as the main mechanism of its origin is not mutation process, but gene recombination in meiosis during male gamete development. The shortcoming of this breeding technology is that tetraploid plants regenerated in anther culture of majority of potato varieties are inferior in productivity of initial plants because of rise in homozygosity (they are doubled dihaploids). Prevention of high level of heterozygosity in regenerants is possible if they are originated from FDR- or SDR unreduced pollen grains (FDR – first division restitution, it is associated with meiotic mutation fs – fusion of spindles; SDR–second division restitution due to mutation pc – premature cytokinezis). The aim of the present work was to study whether the presence, type and frequency of meiotic mutations in developing pollen have an influence on the level of androgenic ability of potato varieties.

There were determined the frequency of callus formation and plantlet regeneration in anther culture of 11 potato varieties having different type and frequency of unreduced gamete formation. Varieties Veras, Neptun and Pramen did not produce 2n-pollen. The variety Blakit had low level (less than 5%) of FDR-dyad formation, varieties Lugovskoi, Adora, Aula and Anosta had medium (5 to 20%), and varieties Dubrava, Lazurit and Zagadka Pitera – high (from 43.5% in Dubrava to 85.6% in Zagadka Pitera) level of this character. We observed mainly FDR 2n-pollen formation in variety Zagadka Pitera, and predominantly SDR 2n-pollen in variety Dubrava. Dyads of both types (FDR and SDR) were presented in approximately equal frequencies in Lazurit variety.

As the result of the study it has been revealed that frequency of dyad formation and type of meiotic mutation in anther donor plants did not have a significant influence on frequency of callus formation (it varied from 4.4% to 60.7%). On the one hand, minimal in the experiment frequency of callus formation in anther culture was registered in variety Pramen which did not produce unreduced pollen. On the other hand, variety Lazurit which was characterized by high frequency of meiotic mutations of different types had low level of callus formation (about 13%) as well. Probably, the level of pollen viability and proportion of embryogenic grains in pollen play more important role in microspore morphogenesis. We did not reveal clear dependence between regeneration ability of potato varieties and unreduced gamete formation regardless of the fact that varieties, which did not produce 2n-pollen or produced it with low frequency, highlighted, in general, by better plantlet regeneration from callus.

Секция 2

СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МЕГАГАМЕТОФИТОВ И

ЗИГОТИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ PINUS SIBIRICA

Ворошилова Е.В.1, Третьякова И.Н.2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский федеральный университет, 660041 Красноярск, пр-т Свободный 79, Тел. (391) 291-29-42; e-mail: bretill@mail.ru Учреждение российской академии наук Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, 660036 Красноярск, Академгородок 50, стр. 28. Тел. (391)249-46-25; Факс: (391) 243-36e-mail: culture@ksc.krasn.ru Для проведения работ по микроклональному размножению в культуре in vitro использовали зиготические зародыши и мегагаметофиты кедра сибирского, произрастающего на клоновой прививочной плантации Западно-Саянского ОЛХ.

Экспланты вводили в культуру на стадии неразвитого зародыша - кливажа и инициации семядолей (начало июля).

Культивирование проводили на среде 1/2LV с регуляторами роста 2,4-Д (9µМ) и 6БАП (4,5µМ), дополненной сахарозой (30 г/л), глютамином (1 г/л), казеином (0,5 г/л), мезоинозитом (0,1 г/л) и аскорбиновой кислотой (0,3 г/л).

В культуре мегагаметофитов через 7-10сут. культивирования в коррозийной полости вдоль продольной оси наблюдалось образование каллуса. Ядра длинных вакуолизированных клеток, из которых состоял каллус, делились, и формировался четырехядерный ценоцит. Далее образовавшиеся четыре ядра мигрировали к одному из полюсов клетки, где формировались инициальные клетки, которые затем образовывали глобулы эмбриоидов и суспензоры.

В культуре зиготических зародышей на 4-8сут культивирования формирование каллуса происходило в области зародышевого корешка. Через 30сут культивирования каллус нарастал по всей длине гипокотиля. Образовавшийся каллус состоял из вытянутых вакуолизированных эмбриональных трубок, в которых на пролиферационной среде происходило асимметричное деление, с последующим формированием эмбриональных глобул и эмбриональных трубок. В формирующейся эмбрионально-суспензорной массе происходило выделение соматических зародышей.

Таким образом, было показано, что процесс образования соматических зародышей в культуре мегагаметофитов и культуре зиготических зародышей отличается: в культуре мегагаметофитов образование соматических зародышей идет через стадию ценоцита, миграцию ядер к полюсу клетки и формирование инициальных клеток и глобул соматических зародышей; в культуре зиготических зародышей идет удлинение клеток эксплантов и их асимметричное деление, так же, как у зародышей, образующихся естественным путем.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 11-04-00281

Секция 2

SOMATIC EMBRYOGENESIS INDUCTION IN SIBERIAN PINE

MEGAGAMETOPHYTE AND ZYGOTIC EMBRYOS CULTURES

Voroshilova1 E., Tretyakova2 I.

Siberian Federal University, 660041 Krasnoyarsk, Svobodny 79, tel. (391) 291-29-42; e-mail:



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |

Похожие работы:

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как и выживаемость, привлекает многих ученых. Однако...»

«Convention on Protection and Use of Transboundary Watercourses and International Lakes SEMINAR ON ENVIRONMENTAL SERVICES AND FINANCING FOR THE PROTECTION AND SUSTAINABLE USE OF ECOSYSTE...»

«ИЛЬИНА ЕЛЕНА ПЕТРОВНА НЕЗАКОННАЯ ДОБЫЧА (ВЫЛОВ) ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ (ПО МАТЕРИАЛАМ КАМЧАТСКОГО КРАЯ) 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание учено...»

«1.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Санжарова Н. И., Молин А. А., Козьмин Г. В., Ко Sanzharova N. I., Moline A. A., Koz’min G. V., Ko бялко В. О. Радиационные агробиотехнологии: byalko V. O. Radiation agricultural biotechnologies: приоритетные направления развития и коммер priority areas for the de...»

«59 Biological Bulletin УДК 591.526:598.113.6 Ю. В. Кармышев1, А. Н. Ярыгин2 РЕПРОДУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ НАСТОЯЩИХ ЯЩЕРИЦ (LACERTIDAE) УКРАИНЫ 1Мелитопольский государственный педагогический университет имени Богдана Хмельницкого 2Институт Зоологии им. И.И. Шмальгазена НАН Украины В работе представлены св...»

«ООО "ИНСТИТУТ РЕСТАВРАЦИИ, ЭКОЛОГИИ и ГРАДОСТРОИТЕЛЬНОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ" Муниципальный заказчик: Комитет архитектуры и градостроительства администрации городского округа "Город Калининград". ДОКУМЕНТАЦИЯ ПО ПЛАНИРОВКЕ ТЕРРИТОРИИ Проект планировки с проектом межевания в его составе террито...»

«ЛАДЫГИН Константин Владимирович ТЕХНОЛОГИЯ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ОЧИСТКИ ОБРАТНООСМОТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ОБЕЗВРЕЖИВАНИИ ФИЛЬТРАТА ПОЛИГОНОВ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ Специальность 03.02.08 – Экология (в химии и нефтехимии) АВТОРЕФЕРАТ дис...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@water.tu-chel.ac.ru (1), diff@irex.urc.ac....»

«2015 Географический вестник 2(33) Экология и природопользование ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ УДК 004.6:581.55 П.Н. Бахарев, В.В. Семенов, Д.Н. Андреев27 ГЕОИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА ДАННЫХ ТЕРРИТОРИИ ЗАПОВЕДНИКА "ВИШЕРСКИЙ" В статье п...»

«8.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ПОЧВОВЕДЕНИЕ SOIL SCIENCE Воропаев В. Н., Астахов Ю. А. Мониторинг содер Voropaev V. N., Astakhov Yu. A. Monitoring of the жания меди в почвах реперных участков. 2 copper content in reference sites of soils. 2 Х...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт наук о Земле Кафедра физической географии и экологии Марьинских Дмитрий Михайлович ДЕШ...»

«Бакшеева Юлия Витальевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫХ СВОЙСТВ СИГНАЛОВ В УЛЬТРАЗВУКОВЫХ СИСТЕМАХ ДИАГНОСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Специальность: 05.13.01 "Системный анализ, управление и обработка информации (в технике и тех...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Капцегайтуйская средняя общеобразовательная школа" Рассмотрено Утверждаю На заседании МС Директор МБОУ "Капцегайтуйская СОШ" Протокол № /Н.А.Волгина/ ""_2016 г. Приказ №_ от ""_2017г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА КУРСА "биология" 9 класса Н...»

«МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ С. В. Зеленцов, Научно-технический кандидат сельскохозяйственных наук бюллетень В. С. Петибская, Всероссийского научно-исследовательского кандидат биологических наук института масличных...»

«АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях 03.02.03.микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата мед...»

«О.А. Белых и др.: Дикоросы как источник биотехнологического сырья для производства УДК 630.2.56.9: 643.0.524 ДИКОРОСЫ КАК ИСТОЧНИК БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И БАДОВ О.А. Белых1, А.Н.Петров2, А.Г.Еникее...»

«5.2013 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ЭКОНОМИКА И ФИНАНСЫ ECONOMY AND FINANCES Сафаров Ш. О. Пути совершенствования цено Safarov Sh. O. Ways to improve the price mecha вого механизма в сельском хозяйстве. 2 nism i...»

«Научный журнал Российского НИИ проблем мелиорации, № 1(13), 2014 г., [158-167] УДК 631.67.03 Л. А. Воеводина (ФГБНУ "РосНИИПМ") НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОЛЕНЫХ ВОД ДЛЯ ОРОШЕНИЯ В статье рассмотрена проблема...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт Кафедра экологии и генетики Кафедра зоологии и эволюционной экологии Кафедра анатомии и физиологии человека и жи...»

«ЭЛЕКТРОННЫЙ УЧЕБНИК ПО ДИСЦИПЛИНЕ "ЭКОЛОГИЯ" Акиньшин А. А., Пащенко И. В., Луценко Е. В. Шлыков К. И., Закурдаев А. В. – студенты, Шамов Ю.А. – к.т.н. доцент Алтайский государственный технический университет (г.Барнаул) Программа является элек...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.