WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |

«The X International Conference “Plant Cell Biology In Vitro and Biotechnology” ABSTRACTS Kazan, October 14-18, 2013 УДК [581.17+663.1](063) The X International ...»

-- [ Страница 5 ] --

Соматический эмбриогенез у растений зависит от большого числа внешних и внутренних факторов. Ранее было показано, что Сa2+-сигнальная система вовлечена в регуляцию соматического эмбриогенеза. Известно, что главными сенсорами Сa2+ в клетках растений являются Сa2+-зависимые протеинкиназы (CDPK). Ранее нами было показано, что при воздействии ингибиторов Сa2+-каналов и CDPK приводит к достоверному снижению количества соматических эмбриоидов в эмбриогенной культуре женьшеня 2с3. И напротив, добавление ионофора Сa2+ А23187 достоверно увеличивает количество соматических эмбрионов, это говорит об участии Сa2+-сигнальной системы в регуляции соматического эмбриогенеза растений. Также ранее было показано, что в эмбриогенной культуре клеток женьшеня 2с3 по сравнению с каллусной культурой женьшеня GV достоверно повышена экспрессия 4 генов CDPK (PgCDPK1с, PgCDPK2b, PgCDPK2d, PgCDPK3b). Также нами была проанализирована экспрессия генов CDPK на отдельных стадиях развития эмбриоидов. На ранних стадиях развития эмбриоидов достоверно увеличивалась экспрессия гена PgCDPK2d. При получении полной последовательности PgCDPK2d с помощью RACE PCR мы отметили, что данный ген имеет нестандартную структуру. В полученной последовательности гена PgCDPK2d отсутствовали последовательности соответствующие автоингибиторному домену и домену EF-руки. Так как гомология киназного домена PgCDPK2d была сверхвысокой с ранее описанными CDPK растений, но в структуре этого гена отсутствовали последовательности, кодирующие функционально значимые участки белка, решено было назвать его PgCDPK2DS.

Далее мы решили проанализировать влияние сверхэкспрессии гена PgCDPK2DS на соматический эмбриогенез в культуре клеток женьшеня P. ginseng. В качестве модельной системы мы использовали полученную в 2010 году эмбриогенную культуру клеток PG и каллусную культуру клеток женьшеня 1с, которая была получена в 1988 году.

Полученные в ходе агробактериальной трансформации PgCDPK2DS-трансгенные клеточные линии эмбриогенной культуры клеток PG теряли способность образовывать эмбриоидные структуры.

В то время как полученная векторная линия эмриогенной культуры клеток PG, несущая только ген устойчивости к канамицину nptII, имела эмбриоиды как и культура PG. Интересно отметить, что на первых этапах культивирования полученная сверхэкспрессирующей ген PgCDPK2DS 1с культура женьшеня имела плотные образования, напоминающие эмбриогенные структуры. Таким образом, впервые показано, что ген PgCDPK2DS вовлечен в регуляцию соматического эмбриогенеза в культуре клеток женьшеня.

Секция 3

INFLUENCE OF EXPRESSION PgCDPK2DS GENE ON THE

EMBRYOGENESIS IN THE GINSENG CELL CULTURES PANAX GINSENG C.A.

MEYER.

Shumakova О.А.,1,2 Kiselev K.V.1 Institute of Biology and Soil Sciences, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences,

Vladivostok, 690022, pr.-t Stoletiya 159, fax: (423) 231-01-93, phone: (914) 715-00-49, e-mail:

shumakova_olga91@mail.ru Far East Federal University, Vladivostok, 690090, str. Suhanova, 8, fax: (423) 243-23-15, phone. (423) 243-32-80 Ginseng Panax ginseng C.A. Meyer is one of the most known medical plants. Several thousands of years the ginseng use in traditional medicine in East Asia where ginseng is known for the adaptogenic properties and the tonic effect. The increased interest to drugs on the basis of a ginseng bring into question possibility of existence of this relic plant in the wild nature and creates a problem of receiving a source of raw materials. To help solve this problem can the biotechnological way of reproduction of a ginseng with microclonal propagation in vitro.





Somatic embryogenesis in plant depends of large number of external and internal factors. Earlier it was shown that Сa2+ signaling system is regulating somatic embryogenesis. It is known that the main sensors of Сa2+ in plant cell are Сa2+-dependent protein kinases (CDPK).

Earlier we showed that inhibitors of calcium channels and CDPK significantly decreased quantity of somatic embryos in embryogenic cell culture of ginseng 2с3. Furthermore, addition of Сa2+ ionofor A23187 significantly increased the quantity of somatic embryos. This fact shows participation of Сa2+ signaling system in regulation somatic embrygenesis in plants.

Earlier we showed that in ginseng embryogenic cell culture 2с3 significantly increased the expression of 4 CDPK genes (PgCDPK1c, PgCDPK2b, PgCDPK2d, PgCDPK3b) in comparison with calli cell culture GV. Also, we analyzed the expression of CDPK genes in the different embryo development stages. At early stages of embryo development the expression of PgCDPK2d gene significantly increased. Then, using RACE PCR we obtained the full sequence of the PgCDPK2d cDNA. We showed that this gene has non-standard structure: in the obtained sequence of PgCDPK2d gene there were no sequences corresponding to the autoinhibitory domain and the EF-hand domains. Because the homology of the kinases domain of PgCDPK2d was high with earlier described plant CDPKs, but in structure of this gene there were no the sequences coding functional sites of protein, we decided to use abbreviation PgCDPK2DS for this gene.

Further we decided to analyze influence of the overexpression of PgCDPK2DS gene on somatic embryogenesis in P. ginseng cell cultures. We used two model systems: the embriogenic cell culture PG which, was obtained in 2010 and ginseng callus culture 1с, which was obtained in 1988. For overexpression PgCDPK2DS gene we used agrobacterial pSAT1 vectors.

By transformation the PG embryogenic cell culture we obtained several PgCDPK2DStransgene cell cultures. Those cultures lost ability to form embryogenic structures. While, obtained control vector cell culture with only nptII gene had embriogenic structures as in cell culture PG. Interesting to note, that at the first month of free Km cultivation in the PgCDPK2DS-transgene cell cultures 1c we detected some cell aggregates reminding embryogenic structures. Thus, for the first time was shown that the PgCDPK2DS gene is involved in regulation somatic embryogenesis in the ginseng cell cultures.

–  –  –

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт кормов им. В.Р. Вильямса Российской академии сельскохозяйственных наук, Моск. обл., г. Лобня, ул.

Научный городок, корп. 1, факс (495) 577-71-07, тел.(495) 577-73-37, e-mail: vniikormov@nm.ru С целью создания трансгенных растений клевера лугового с сохранением морфогенетических и хозяйственно-ценных признаков исходных генотипов была разработана следующая реципиентная система. В качестве исходного растительного материала использовали морфогенные культуры кислотоустойчивых клонов клевера лугового с высокой семенной продуктивностью, полученные методом прямой регенерации из гипокотильных эксплантов. Растения, выращенные из эпикотилей, служили в качестве контрольных для сравнительного изучения морфологических признаков исходных генотипов и полученных из них растений-трансформантов. Генетическую трансформацию проводили с целью повышения устойчивости выбранных клонов к возбудителям корневых гнилей. Использовали обезоруженный штамм Agrobacterium tumefaciens LGV3850, содержащий векторную плазмиду pK22ac (с геном дефензина амаранта), сконструированную во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

В результате были получены растения-трансформанты при отборе на питательной среде с селективным фактором канамицином, образующие in vitro при 50 мг/л канамицина мощную корневую систему. Трансгенная природа была доказана с помощью ПЦР. Было также показано, что растения-трансформанты по морфобиологическим, физиологическим и цитогенетическим признакам не отличались от исходных генотипов и сохраняли признак кислотоустойчивости. У трансгенных растений-регенерантов LGVac2 при контролируемом переопылении между растениями внутри клона получено семенное потомство Т 1.

Завязываемость семян варьировала в среднем от 12,4 до 40,1%. Начат опыт по изучению экспрессии генов канамицинустойчивости и дефензина (по устойчивости к возбудителям болезней) полученного семенного потомства.

Для люцерны используется метод разобщенных доминирующих центров, разработанный нами ранее, при этом культивирование эксплантов (эпикотилей) осуществляется на питательной среде Гамборга с добавлением бензиламинопурина. Стадия каллусогенеза практически отсутствует, образуется морфогенная ткань, то есть мала вероятность возникновения сомаклональной изменчивости. Кроме того, появилась возможность проведения исследований по трансгенозу с таким сложным в плане регенерации in vitro объектом, как люцерна хмелевидная, которая имеет диплоидный набор хромосом и является строгим самоопылителем.

С целью повышения устойчивости к возбудителям корневой гнили созданы трансгенные растения-регенеранты люцерны хмелевидной с геном синтеза дефензина гороха.

Была также проведена генетическая трансформация люцерны изменчивой (кислотоустойчивый сорт Селена) с геном Fe-СОД для повышения устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды. Генетические конструкции, содержащие вышеназванные гены, получены от А.А. Гулевича (ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии). Трансгенная природа растенийтрансформантов обоих видов люцерны доказана с помощью ПЦР-анализа. Изучается семенное потомство.

–  –  –

State Scientific Institution All-Russian Williams Fodder Research Institute (Russian Agricultural Academy), Moscow reg., Lobnya, Nauchniy gorodok Str., tel. (495) 577-73-37, fax (495) 577 71 07, e-mail: vniikormov@nm.ru For maintenance of morphogenetic and agronomic important characteristics of initial genotypes in transgenic red clover plants a special recipient system was development.

Morphogenic cultures of acid tolerant clones with high seed productivity were used as initial plant material. These clones were obtained by straight regeneration from hypocotyls. The plants, regenerated of epicotyls, were used as a control samples for comparative study of morphological traits the starting genotypes and transformed plants. Genetic transformation was carried out for increase the resistance of selected clones to root rots. We have used the disarmed strain of Agrobacterium tumefaciens LGV3850, containing a vector-plasmid pK22ac with gene defensin of amaranth. The plasmid was constructed in Scientific Research Institute of Agricultural Biotechnology.

Putative transgenic plants with potent root system were selected after incubation on 50 mg/l kanamycine-containing medium. The transgenic nature of the red clover plants was confirmed by PCR analysis. It has been shown, that transformed plants had not differences on the morpho-biological, physiological and cytogenetic characteristics in comparison with initial genotypes and have retained the acid tolerance. Seed progeny T1 from transgenic plants LGVac2 was obtained as a result of controlled intraclonal pollination. Seeds formation varied in average from 12,4 to 40,1 percents. Now expression of genes, responsible for tolerance to kanamycin and resistance to infectious (defensin gene) is studied in the seed progeny.

For genetic transformation of alfalfa we use the method of uncoupled dominating centers that we have developed formerly. Gamborg’s B5-based media with benzylaminopurine was used for cultivation of explants material (epicotyls). Because of direct formation of morphogenic tissue from explants, almost without stage of callusogenesis, the somaclonal variability is rare event. Besides, we have now the possibility to carry out the study on transgenesis with Medicago lupulina L. This forage crop is strong self-pollinator, has diploid set of chromosomes and thus it is the difficult object for regeneration in vitro.

In order to improve resistance to root rots the transgenic plants of Medicago lupulina L.

with gene synthesis of pea defensine were created. Genetic transformation of M. varia (variety Selena with high acid tolerance) with gene Fe-COD was performed to increase resistance of alfalfa to environmental stress. Genetic constructs, containing the targeted genes, was obtained from A.A. Gulevich (Scientific Research Institute of Agricultural Biotechnology). Expression of the transgenes in alfalfa plants of both species was confirmed by PCR analysis. At present we study the seed progeny of the transgenic plants.

Секция 4

ОСОБЕННОСТИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА У ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЙ ТАБАКА С КОНСТИТУТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ СИНТЕЗА ЦИТОКИНИНОВ И АУКСИНОВ

Алексеева В.В.1, Мудрик В.А.2, Рукавцова Е.Б.1, Голубчикова Ю.С.3, Ермошин А.А.3 Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, Пущино, 142290, Проспект Науки, 6, факс:(4967) 33-05-27, тел. (4967) 33 09-70, e-mail: lera@fibkh.serpukhov.su ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, 142290, ул. Институтская, д. 2, факс (4967) 33-05-32, тел. (4967) 73-24-48, e-mail: vilen_mudrik@rambler.ru Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, 620002, г. Екатеринбург, ул. Мира, д. 19, тел. (343) 261-66-85; e-mail: ermosh@e1.ru Использование трансгенных растений с экспрессией агробактериальных генов ipt и iaaM, отвечающих за синтез цитокининов и ауксинов, расширяет возможности исследования функциональной роли этих фитогормонов в регуляции физиологических и биохимических процессов, а также в устойчивости растений к стрессовым факторам. Объектом исследования служили трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун с генами ipt (ipt-растения) и iaaM (iaaM-растения) под одинарным и двойным промоторами 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, соответственно. Уровень свободных цитокининов в ipt-растениях возрастал в три раза по сравнению с контролем. Содержание активных ауксинов в iaaM-растениях было в 1.5-2 раза больше, чем в растениях дикого типа. Исследования проводили на полностью развитых молодых листьях табака, выращенных в условиях закрытого грунта на станции искусственного климата «Биотрон».

Показано, что у ipt-растений площадь листьев уменьшилась на 84%, а скорость нет-фотосинтеза (PN) в расчете на хлорофилл при этом снизилась всего на 65%. У iaaM-растений снижение фотосинтеза соответствовало уменьшению площади листьев и составляло 40% от контроля. Во всех вариантах трансгенных растений увеличилась скорость темнового дыхания (36% для ipt-растений и 50% для iaaM-растений в расчете от нет-фотосинтеза против 23% в контроле). Относительная скорость электронного транспорта (ETR) снизилась на 29% (ipt-растения) и на 10% у iaaM-растений по сравнению с диким типом, а нефотохимическое тушение (NPQ), наоборот – увеличилось на 144% (ipt-растения) и на 69% (iaaM-растения). Ингибирование роста корней, вызванное суперсинтезом цитокининов, привело к нарушению водного режима ipt-растений и снижению фотосинтеза в этих растениях. У iaaM-растений это могло быть связано с появлением многочисленных придаточных корней на стеблях.

Известно, что понижение соотношения Fv/Fm обусловлено ингибированием ФСII, что делает этот показатель эффективным средством наблюдения за растениями под действием стресс-факторов.

Влияние увеличения эндогенных фитогормонов в трансгенных растениях табака на их устойчивость к стрессам изучали на примере воздействия света высокой интенсивности на фотосинтез. После обработки растений 30 мин повреждающим светом 6000 мкМоль м-2 с-1 ФАР и последующей 30минутной темновой адаптации, необратимое фотоингибирование у ipt-растений было ниже (45%), чем у контрольных растений (55%), что подтверждает защитное действие цитокининов в стрессовых условиях. У iaaM-растений необратимое фотоингибирование в этих условиях было больше, чем в контроле – 68% против 55%. Это указывает на сильное повреждающее действие эндогенных ауксинов в iaaM-растениях в условиях фотоингибирования и неспособность этих растений к восстановлению после стресса. Аналогичные выводы следуют из оценки коэффициента спада флуоресценции, характеризующего квантовую эффективность фотосинтеза - индекса жизнеспособности (Rfd). Величина Rfd для контрольных растений составляла 3.00 отн. ед. У iaaMрастений значение Rfd было на 47% ниже контрольного. Возможно, это связано с тем, что гиперпродукция ауксинов вызывает повышенное образование активных форм кислорода, оказывающих повреждающее действие на липиды.

Секция 4

FEATURES OF THE PHOTOSYNTHETIC APPARATUS IN TRANSGENIC

TOBACCO PLANTS WITH CONSTITUTIVE EXPRESSION OF BACTERIAL GENES

OF AUXIN AND CYTOKININ SYNTHESIS

Alekseeva V.V.1, Mudrik V.A.2, Rukavtsova E.B.1, Golubchikova Yu.S.3, Ermoshin A.A.3 Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino, 142290, Science Avenue, 6, Fax: (4967) 27-05-33, tel. (4967) 33-09-70, e-mail: lera@fibkh.serpukhov.su Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences, 142290, Pushchino, Institutskaya str., 2, tel. (4967) 73-24-48, fax (4967) 33-05-32, email: vilen_mudrik@rambler.ru Ural Federal University named after First President of Russia B.N. Yeltsin, 620002, Ekaterinburg, ul. Mira, 19, tel. (343) 261-66-85, e-mail: ermosh@e1.ru The use of the transgenic plants with expression of agrobacterial ipt and iaaM genes which are responsible for cytokinin and auxin synthesis, expands possibilities of research of a functional role of these phytohormones in regulation of physiological and biochemical processes, and also in resistance of plants to stressful factors. We studied the transgenic tobacco plants Nicotiana tabacum L.

var. Samsun with ipt gene (ipt-plants) and iaaM gene (iaaM-plants) under single and double promoters of 35S RNA cauliflower mosaic virus, respectively. The level of free cytokinins in iptplants increased three-fold compared to control. The content of active auxins in iaaM-plants was 1.5-2 times higher than in wild-type plants. The study was performed on a fully developed young leaves of tobacco plants grown in greenhouse "Biotron". It is shown that at ipt-plants the leaf area decreased by 84%, and the rate of the photosynthesis (P N), based on the chlorophyll, decreased by only 65%.

In iaaM-plants the photosynthesis reduction corresponded to a decrease in leaf area and was 40% of the control. In all variants of transgenic plants dark respiration rate increased (36% for the ipt-plants and 50% for the iaaM-plants, based on the net-photosynthesis, versus 23% in controls). The relative rate of the electron transport (ETR) decreased by 29% (ipt-plants) and for 10% in iaaM-plants in comparison to wild-type, and non-photochemical quenching (NPQ), on the contrary, increased by 144% (ipt-plants) and for 69% (iaaM-plants). The root growth inhibition caused by cytokinin supersynthesis led to disruption of the water regime in ipt-plants and decrease in the photosynthesis in these plants. In iaaM-plants it could be due to the emergence of numerous additional roots on the stems.

It is known that lowering the ratio Fv/Fm is caused by the inhibition of PSII making this ratio the effective tool of monitoring for plants under the influence of stress factors. Influence of increase of endogenous phytohormones in transgenic tobacco plants on their resistance to stresses studied on the example of impact of high intensity light on the photosynthesis. After 30 min treatment on plants with damaging light 6000 µmol m-2 s-1 PAR and after subsequent 30-minute dark adaptation, the irreversible photoinhibition in ipt-plants was lower (45%), than in control plants (55%), that confirms the protective effect of cytokinins in stressful conditions. In iaaM-plants the irreversible photoinhibition under these conditions was greater, than in the control group - 68% versus 55%. It indicates strong damaging effect of endogenous auxin in iaaM-plants in photoinhibition conditions and inability of these plants to recover after the stress. Similar conclusions follow from the fluorescence decay rate, the coefficient characterizing the quantum efficiency of the photosynthesis vitality index (Rfd). The Rfd value for control plants was 3.00 relative units. In iaaM-plants Rfd value was 47% lower than the control. Probably, this is due to the fact that auxin overproduction causes the increased formation of reactive oxygen species that have a damaging effect on lipids.

Секция 4

LC AND LC-MS/MS STUDIES OF ANTHRAQUINONES IN GENETICALLY

TRANSFORMED HAIRY ROOT CULTURES OF RUBIA TINCTORUM L.

Bnyai P.1, Kursinszki L.1, Kuzovkina I.2, Szke.1 Department of Pharmacognosy, Semmelweis University, Budapest, H-1085, lli str., 26 Timiryazev Insitute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Moscow Rubia tinctorum L. (european madder) is a perennial plant from the Rubiaceae family. It is a source of a natural dye; it produces a variety of anthraquinone pigments in its roots and rhizomes. The main components are di- and trihydroxy-anthraquinones, alizarin and purpurin and their derivatives, ruberythric acid, pseudopurpurin and lucidin-primeveroside. These substances show bactericidal, antifungal and spasmolytic activity and facilitate the loosening of kidney concrements. Some components show mutagenic activity (lucidin), but recent studies indicated that alizarin and purpurin have strong inhibitory effect on the genotoxicity of several carcinogens.

We have investigated the anthraquinone composition of the genetically modified hairy root cultures. Transformed root cultures of R. tinctorum were obtained by their inoculation with Agrobacterium rhizogenes (strain R-1601). After the elimination of bacteria, the hairy roots were cultured on liquid or solid Gamborg B5 and NMS media [1-2].

For determination of anthraquinone glycosides, crude MeOH extracts of Rubia tinctorum hairy roots were purified by SPE (C-8) then investigated by HPLC method (Spectra Physics System, FOCUS scanning UV-VIS detector) on Luna C-8 (Phenomenex) column [4], using a 16:84 (v/v) isocratic mixture of acetonitrile:20 mM ammonium formate (pH 3.00) as eluent. Purified extacts were fractionated by flash chromatography method on FlashSil column (Jones Chromatography), using a step gradient elution (hexane:2-propanol:methanol 100:0:00:0:100). Fractions were screened by TLC and analysed by HPLC, using gradient elution (acetonitrile:0.1% TFA 10:90100:0). Anthraquinone glycosides and aglycones were separated and 1,2-dihydroxy-anthraquinone-6-O--D-xylanopyranosyl--D-glucose (ruberythric acid), 1,3-dihydroxy-2-hydroxymethyl-anthraquinone-6-O--D-xylanopyranosyl--D-glucose (lucidin-primeveroside), 2-carboxyl-1,3-dihydroxy-anthraquinone (munjistin), 1,3-dihydroxy-2methyl-anthraquinone (rubiadin), lucidin-glucoside and alizarin-glucoside were detected via UV spectrum and LC-MS/MS analysis (Agilent Triple Quadropole System), using electrospray ionisation in negative mode.

References:

[1] Gamborg O.K., Miller R.A., Ojima K. (1968) Exptl. Cell Res. 50: 151-158.

[2] Kuzovkina I.N., Mantrova O.V., Al’terman I.E., Yakimov S.A. (1996) Rus. J. of Pl.

Phys. 43 (2): 291-298.

[3] Mantrova O.V., Dunaeva M.V., Kuzovkina I.N., Schneider B., Mller-Uri F. (1999) Rus. J. of Pl. Phys. 46 (2): 248-251.

[4] Bnyai P., Kuzovkina I.N., Kursinszki L., Szke. (2006) Chromatographia 63 S111-S114.

Секция 4

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ ARABIDOPSIS THALIANA С ИНТЕГРИРОВАННЫМ

ГЕНОМ МИКРОБНОЙ ФИТАЗЫ

Валеева Л.Р.1*, Нямсурэн Ч.1*, Шакиров Е.В.2, Шарипова М.Р.1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, тел. (843) 233-78-56, e-mail: lia2107@yandex.ru.

Техасский аграрно-технический университет, г. Колледж-Стейшен, Texac, США * - Равное авторство В настоящее время одной из наиболее острых проблем для сельского хозяйства является недостаток фосфорного питания растений, связанный с тем, что почвенный фосфор в основном представлен труднодоступными для растений органическими соединениями.

Дефицит фосфора неблагоприятно сказывается как на росте, так и на продуктивности культурных растений. Наиболее эффективным представляется решение данной проблемы с помощью современных методов генетической инженерии. Одно из развивающихся направлений – использование генов фитаз - специфических фосфатаз, высвобождающих неорганический фосфат из труднодоступного почвенного соединения мио-инозитол гексакисфосфата (фитата), широко распространенного в почве органического соединения фосфора. Экспрессия трансгенных фитаз в корнях растений с их последующая секрецией в ризосферу является перспективным методом повышения доступности фосфора для роста и жизнедеятельности растений.

Целью данной работы является получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с интегрированными генами фитаз Bacillus ginsengihumi PhyCg и Pantoea agglomerans PaPhyC. Нами была осуществлена трансформация растений Arabidopsis thaliana бактериями Agrobacterium tumefaciens GV3101. В качестве вектора использовались плазмиды pCBK05 с химерными последовательностями ex::phyCg и ex::paphyC, состоящие из гена фитазы и гена сигнальной последовательности экстенсина Ext3, находящихся в одной рамке считывания под контролем специфического для корней A. thaliana промотора Pht1;2, активирующегося в условиях недостатка фосфора. В состав вектора также входил ген устойчивости к селективному гербициду BASTA.

Трансформацию проводили методом макания цветов в суспензию агробактерий. Для получения трансгенных растений первого поколения проводили селекцию семян на среде MS с добавлением селективного гербицида. От каждой индивидуальной линии трансгенных растений первого поколения также были получены семена и проведена их селекция и анализ расщепления, что позволило отобрать линии растений с единичной копией гена. Наличие трансгенной вставки в геноме растений было также подтверждено с помощью ПЦР с использованием праймеров к гену фитазы и последовательности экстенсина.

В дальнейшем полученные нами трансгенные растения будут использованы для сравнения эффективности двух фитаз в обеспечении растений фосфором при росте на фитате как единственном источнике фосфора. Данная работа позволит разработать новые методы использования микробных фитаз для улучшения роста и урожайности сельскохозяйственных растений, выращиваемых на обедненных фосфором почвах.

Работа поддержана грантом ФЦП № 14.A18.21.0849.

Секция 4

GENERATION OF TRANSGENIC ARABIDOPSIS THALIANA PLANTS WITH

INTEGRATED MICROBIAL PHYTASE GENES

Valeeva L.1*, Nyamsuren Ch.1*, Shakirov E.V.2, Sharipova M.R.1 Kazan (Volga River) Federal University, 420008, Kazan, 18, Kremlyovskaya St., tel. (843) 233 78 56, e-mail: lia2107@yandex.ru Texas A&M University, College Station, TX, USA * - Equal authorship One of the major limiting factors in crop production is the deficit of phosphorus bioavailability, which stems from the inability of plants to utilize organic phosphorus compounds from the soil. Phosphorus deficiency severely limits plant growth and productivity throughout the world. An effective way to solve this problem is through integration of microbial phytase genes into the plant genome. Phytases are specific phosphatases hydrolyzing phytate (myo-inositol hexakisphosphate), the main organic phosphorus compound present in the soil.

Expression of transgenic phytases in plant roots and their secretion to the rhizosphere is a promising approach to increase the bioavailability of phosphorus to the plants.

The major goal of this research is to obtain transgenic Arabidopsis thaliana plants that harbor phytase genes PhyCg from Bacillus ginsengihumi and PaPhyC from Pantoea agglomerans. We transformed Arabidopsis thaliana plants by the T-DNA integration method using bacteria Agrobacterium tumefaciens GV3101 and pCBK05 plasmid as the transformation vector. The T-DNA constructs contained Ext3 extensin signal sequences and either PhyCg or PaPhyC cDNAs under the control of Arabidopsis Pht1;2 promoter, which is specifically activated in the root epithelium cells in the conditions of phosphorus starvation. T-DNA constructs also harbored the bar gene, which confers resistance to the herbicide BASTA.

Transformation was carried out by dipping flower buds into the Agrobacterium tumefaciens suspension culture. Selection of transformants was performed on MS agar plates supplemented with BASTA. Transgenic plants that showed resistance to BASTA were transferred to soil to obtain seeds for the next generation of plants. All individual transgenic lines were analyzed for several generations by the BASTA sensitivity assay to identify independent lines with a single T-DNA integration site. The presence of transgenes in the Arabidopsis genome was further verified by PCR using primers to the phytase gene sequences.

Future research will focus on the analysis of relative efficiency of the two microbial phytases in acquiring inorganic phosphorus from phytate when plants are grown in a synthetic medium with phytate as the only source of phosphorus in solution. This work will explore the possibility of utilizing microbial phytases as a new method in applied plant biotechnology to improve plant growth and productivity on marginal soils deficient in inorganic phosphorus.

This project is supported by FCP grant № 14.A18.21.0849.

–  –  –

CОЗДАНИЕ НОВЫХ АССОЦИАТИВНЫХ СИМБИОЗОВ МЕЖДУ РАПСОМ И

РИЗОБИЯМИ, ОБЛАДАЮЩИМИ ФУНГИСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Вершинина З.Р., Благова Д.К., Нигматуллина Л.Р., Оркодашвили А.М., Баймиев А.Х.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, 450054, г. Уфа,

Проспект Октября, д. 71, факс: (347) 235-61-00, тел. (347) 235-60-88, e-mail:

zilyaver@mail.ru С помощью дикого штамма Agrobacterium hizogenes A4, трансформированного плазмидой pCAMBIA 1301-psl, содержащей в области Т-ДНК ген gus с каталазным интроном и полноразмерный ген лектина гороха посевного psl, были получены трансгенные по гену лектина «бородатые корни» на рапсе Brassica napus L. var. napus сорта Ратник. В опытах по трансформации использовали свежую ночную культуру агробактерий, выращенную при 28 °С на шейкере (150 об/мин) в минимальной среде Min A, с добавлением 100 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина.

Перед инокуляцией культуру центрифугировали (3500 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в жидкой среде Min A с добавлением 100 мкM ацетосирингона. Плотность суспензии агробактерий была доведена до 102 КОЭ/мл. В качестве эксплантов в экспериментах по трансформации использовали 1,5-недельные проростки рапса с отрезанной корневой системой, которые обмакивали в суспензию агробактерий на 10 с и помещали в среду MS без антибиотиков для кокультивации. Через 2 суток совместного культивирования (и далее через каждые 2 недели) экспланты переносили на свежую среду того же состава, но с добавлением по 250 мг/л карбенициллина и цефотаксима. Первые «бородатые корни» начинали появляться через две недели после инокуляции агробактериями. Практически 80% всех «бородатых корней», полученных с помощью штамма A. rhizogenes, несущего конструкцию pCAMBIA1305.1-psl, оказались одновременно трансформированными и gus и psl, что подтвердили gus-анализ и ПЦР на наличие и конститутивную экспрессию на уровне мРНК гена лектина. В качестве контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного штамма A. rhizogenes, и корни, полученные на эксплантах без инокуляции. Гистохимический и ПЦР анализы в этих случаях дали отрицательный результат. Композитные растения, состоящие из трансгенного по гену psl корня и нетрансгенной надземной части, и контрольные (без гена psl) композитные растения были пересажены в емкости диаметром 5 см и высотой 10 см со стерильным вермикулитом, смоченным 10% средой Хогланда-Арнона, и выращивались при температуре 25-28 °С (ночная и дневная темепратуры соответственно) и 14-часовом световом дне. Через месяц после пересадки растения были обработаны на ночь 5 мл суспензии (103 КОЭ/мл) R. leguminosarum 116 (флуоресцентной меченный микросимбионт гороха посевного, обладающий фунгистатической активностью по отношению к Fusarium). Численность адгезированных бактерий на трансформированных геном лектина корнях оказалась выше в 20 раз, по сравнению с контролем, что доказывало взаимодействие ризобий с лектином гороха на поверхности трансформированных корней. Опытные и контрольные растения, обработанные ризобиями, пересаживали в почву, содержащую споры гриба F. oxysporum (патоген рапса) и выращивали в течение трех суток. После окрашивания корней растений толуидиновым синим, проводили их микроскопический анализ. В результате проведенных экспериментов было выяснено, что предварительная обработка трансгенных по гену psl корней ризобиями уменьшает количество гиф патогена F. oxysporum в ризосфере рапса. Такой же эффект, но в гораздо меньшей степени, наблюдается на корнях контрольных растений, на которых адсорбция бактерий происходит менее эффективно.

Разработанный экспериментальный подход, основанный на симуляции процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями, в том числе и обладающими фунгистатической активностью.

Секция 4

ESTABLISHMENT NEW ASSOCIATIVE SYMBIOSIS BETWEEN RAPE AND

RHIZOBIA WITH FUNGISTATIC ACTIVITY

Vershinina Z.R., Blagova D.K., Nigmatullina L.R., Orkodashvili A.M., Baymiev A.Kh.

Institute of biochemistry and genetics of Ufa science centre RAS, Department of Molecular Biology and Plant Physiology, 450054, Russia, Bashkortostan, Ufa, Prospekt Oktyabrya, 71, tel. (347) 235 60-88, fax (347) 235 61-00, e-mail: zilyaver@mail.ru Hairy roots transgenic on lectin gene were obtained in oil seed rape (Brassica napus L.

var. napus cv. Ratnic) with the use of a wild strain of Agrobacterium rhizogenes A4 transformed with pCAMBIA1301 plasmid containing gene gus with the catalase intron and the full size lectin gene from the Pisum sativum (psl) in T-DNA. For the transformation experiments we used 1 day cultures of A. rhizogenes cultivated at 28°С on a shaker (150 rpm) in Min A liquid medium with 100 g/ml rifampicin and 50 g/ml kanamycin. Before inoculation, the cultures of agrobacteria were centrifuged (2054 g for 10 min) and resuspended in Min A liquid medium with 100 M acetosyringone. The density of the bacterial suspension was conditioned to 10 2 CFU/ml. For the hairy root obtainment 1.5 week plants of oil seed rape were used. The cut end of the de-rooted hypocotyls of seedlings were stored for 10 s in the suspension of agrobacteria, and then inserted upright with the cut end into MS agar medium without antibiotics for cocultivation. After 2 days of co-cultivation (thereafter every 2 weeks) the explants were transferred to fresh MS medium with the addition of carbenicillin and cefotaxime (250 g/ml).

First roots were visible within 2 weeks after inoculation. Practically 80% of all hairy roots obtained from the use of the A. rhizogenes A4 strain with pCAMBIA1301-psl were simultaneously transformed by both gus and psl, which was confirmed by the gus-analysis and PCR on the presence and constitutive expression of lectin gene of the level of mRNA. Hairy roots mediated by A. rhizogenes (carrying pCambia1301 without psl) and ordinary roots did not have any gus and psl activity. Composite plants consisting of psl transformed roots and nontransformed shoots and control (without psl) were transferred directly into test tubes which were 5 cm in diameter, 10 cm in height and contained sterilized vermiculite with 10% Hoagland and Arnon medium. Growth conditions were 14-h photoperiod and 28/25°C day/night cycle.

One month after transferring to test tubes, roots under test were inoculated with 5 ml R. leguminosarum 116 suspension (103 CFU/ml) overnight. This bacterium is fluorescently labeled pea rhizobia with fungistatic activity against Fusarium. The number of adhered bacteria onto the roots transformed with lectin gene was 20 fold in comparison with the control; this confirms the interaction of R. leguminosarum with pea lectin at the surface of the transformed roots of oil seed rape. The test and control plants treated with rhizobia ransferred into soil containing spores of F. oxysporum (oil seed rape pathogen) and cultivated for three days. Then we stained roots with toluidine blue and performed microscopic analysis. As a result of these experiments it was found that rhizobia pretreatment of roots transfotmed psl reduces pathogen hyphae in the rhizosphere of oil seed rape. The same effect, but to a much smaller extent, is observed on the roots of the control plants, that are poorly adsorbed by bacteria.

The developed experimental approach, based on the simulation of recognition processes and early symbiotic interactions with legume lectins, may, in perspective, be used for obtaining stable associations of economically valuable nonsymbiotrophic plant species with rhizobia, including bacteria with fungistatic activity.

–  –  –

Филиал федерального бюджетного учреждения науки института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл. г.

Пущино, проспект Науки, д. 6, телефон: (4967)330966, факс: (4967)330527, e-mail:

vidjagina@mail.ru Рост растительной клетки сопровождается растяжением клеточной стенки под действием внутриклеточного давления. Ксилоглюкан является полисахаридом гемицеллюлозы растительной клеточной стенки, который поперечно сшивает прилегающие микрофибриллы целлюлозы, обеспечивая формирование прочного каркаса.

Разделение микрофибрилл при росте клетки растения обеспечивают ферменты, расщепляющие ксилоглюканы и ослабляющие связывание между микрофибриллами.

Ксилоглюканаза – один из таких ферментов, относящийся к группе карбогидраз, который гидролизуя ксилоглюканы разрушает поперечную «сшивку» целлюлозных микрофибрилл, способствуя тем самым растяжению клеточной стенки. Предполагается, что суперэкспрессия ксилоглюканаз может оказывать влияние на рост и развитие растений. Для доказательства этой гипотезы были созданы трансгенные растения осины с конститутивной экспрессией рекомбинантной ксилоглюканазы sp-Xeg из гриба Penicillium canescens. Используя агробактериальный перенос, были получены 25 трансгенных линий растений осины. Конститутивная экспрессия гена sp-Xeg на уровне транскрипции подтверждена методом ОТ-ПЦР.

Анализ свойств трансгенных клонов осины с рекомбинантным геном ксилоглюканазы sp-Xeg из Penicillium canescens показал наличие комплексных модификаций как в составе древесины, так и в фенотипе растений. Биометрический анализ выявил увеличение высоты трансгенных растений по сравнению с контролем.

Увеличение высоты побега на 24,8%, 25% и 26% отмечено для линий PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, соответственно. Также отмечено повышение числа междоузлий у некоторых трансгенных клонов. Анализ морфологии листьев выявил увеличениие длины черешка и сокращение длины главной жилки у трансгенных линий. Отношение длины черешка к длине главной жилки у растений контрольной группы равнялось 0,49, тогда как у трансгенных растений оно варьировало от 0,51 до 0,66. Кроме морфологических изменений растений было впервые показано изменение ризогенеза у растений с рекомбинантным геном ксилоглюканазы. У 10 линий из 25 эффективность укоренения в условиях in vitro превышала контрольное значение. Максимальное значение эффективности укоренения зафиксировано у линии PtXVXeg1a (в 2,5 раза выше контроля). Масса корневой системы 6 клонов из 25 в условиях защищенного грунта была выше контроля на 20%. У 16 из 25 проанализированных клонов отмечено повышение содержания целлюлозы. Наибольшее значение этого показателя у клона PtXIVXeg1c – 426 мг/г, когда как у контроля оно равнялось 348 мг/г.

Анализ экстрактов из листьев тепличных растений показал увеличение активности ксилоглюканазы у клонов:

PtXVXeg1c – на 92 %, PtXVXeg4c – на 51 %, PtXIVXeg1a на 35%, PtXIVXeg1b – на 21%.

Активность фермента у других генотипов была приближена к контрольными значениям.

Полученные данные ксилоглюканазной активности и целлюлозы в целом взаимосвязаны с модификациями фенотипа.

На основании проведенных анализов нами было выделено четыре наиболее перспективных клона: PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b и PtXIVXeg1c.

–  –  –

THE PROPERTIES MODIFICATION OF ASPEN PLANTS BY MEANS OF

OVEREXPRESSION OF THE RECOMBINANT GENE OF XYLOGLUCANAS SP-XEG

Vidyagina E.O., Kovalitskaya Yu.A., Shestibratov K.A.

Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, 142290, Moscow Region. Pushchino, Science аv., 6, tel. (4967) 330966, fax 4967) 330527, e-mail: vidjagina@mail.ru The growth of plant cells is accompanied by elongation of the cell wall by the action of intracellular pressure. Xyloglucan is a polysaccharide of plant cell wall hemicellulose, which joins adjacent cellulose microfibrilles, providing the formation of a solid frame. Separation of microfibrils in the growing plant cells is provided by enzymes that decompose xyloglucans and weaken the links between the microfibrilles. Xyloglucanases are one of these enzymes from the group of carbohydrases which hydrolyzes xyloglucans destroying transverse links of cellulose microfibrils, providing the stretching of the cell wall. It is supposed that xyloglucanases overexpression can effect plant growth and development. To prove this hypothesis transgenic aspen plants with constitutive expression of recombinant xyloglucanase sp-Xeg from the fungus Penicillium canescens were created. The 25 transgenic aspen plants were obtained by usage of agrobacterium transfer. Constitutive expression of the gene sp-Xeg at the transcriptional level was confirmed by RT-PCR.

Analysis of the properties of transgenic aspen clones with recombinant gene xyloglucanase sp-Xeg from Penicillium canescens revealed the presence of complex modifications in the wood, and the phenotype of plants. Biometric analysis revealed an increase in the height of transgenic plants as compared to the control group. Increasing the height of the sprout of 24.8%, 25% and 26% observed for the lines PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, accordingly. Also an increase in the number of internodes in some transgenic clones was observed. The leaf morphology analysis displays an increase in petiole length and shortening of the main vein in the transgenic lines. The ratio of length to the length of the petiole in the main vein of the control group of plants was equal to 0.49, whereas the transgenic plants, it ranged from 0.51 to 0.66. In addition to the morphological changes of plants rhizogenesis change in plants with recombinant gene of xyloglucanase was observed for the first time. In 10 of the 25 lines rooting efficiency in vitro was increased in comparison with the reference value. The maximum value of the rooting efficiency was noted in a fixed line PtXVXeg1a (2.5 times higher than the control). Root system mass of 6 of 25 clones in greenhouse was 20% higher than the control. In 16 of the 25 clones analyzed an increase in cellulose content was revealed. The highest value of this index is in clone PtXIVXeg1c - 426 mg / g, whereas in the control it was equal to 348 mg/g.

Analysis of extracts from the leaves of greenhouse plants showed increased activity of xyloglucanase the clones: PtXVXeg1c - by 92%, PtXVXeg4c - by 51%, PtXIVXeg1a by 35%, PtXIVXeg1b - by 21%. The enzyme activity of other genotypes was close to the reference value. The obtained data of xyloglucanase activity and cellulose are generally correlated with phenotypic modifications.

Based on our analysis, we have identified four of the most promising clones:

PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b and PtXIVXeg1c.

Секция 4

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЯБЛОНИ,

СОДЕРЖАЩИХ ШПИЛЕЧНУЮ КОНСТРУКЦИЮ

КОМПЛИМЕНТАРНУЮ ВТОРОМУ ЭКЗОНУ ГЕНА АСО ЯБЛОНИ

Власова А.А.1,2, Скляр Ю.А., Пушин А.С.2, Тимербаев В.Р.3, Долгов С.В.2,3 Мичуринский государственный аграрный университет, г. Мичуринск, Тамбовская обл., 393760, ул. Интернациональная, д. 101, тел. (475 45) 5-34-71, e-mail: anutik.vlasowa@yandex.ru;

ФГБУН Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Проспект науки, д. 6, тел. (4967) 73-17-79;

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42, тел. (499) 976-90-05 Проведение генетических исследований на яблоне (Malus domestica L.) – трудоемкий и длительный процесс, что связано в первую очередь с продолжительным циклом воспроизведения. Однако, вскоре после первой успешной попытки трансформации яблони, она стала достаточно популярным объектом для исследования регуляции уровня биосинтеза этилена, прежде всего из-за своей экономической значимости и хорошо изученных физиологических аспектов процесса созревания плодов.

Одним из направлений генетической трансформации яблони является модификация процесса созревания плодов с целью увеличения сроков их хранения.

Целью данной работы является определение уровня синтеза этилена в растениях яблони, содержащих шпилечную конструкцию комплиментарную 2-му экзону гена АСО яблони (самокомплементарные фрагменты гена АЦК-оксидазы яблони в различных ориентациях antisense-sense и sense-antisense).

В нашей лаборатории были получены линии с использованием шести векторных конструкций, содержащих самокомплементарные фрагменты генов АЦК-оксидазы: три из них содержали целевой ген под управлением CaMV35S промотора – pARTMdACOsа, pARTMdACOas, pCamMdACOsa; другие три вектора содержали плодоспецифичный промотор полигалактуроназы томата - pART PGMdACOas, pARTPGMdACOsa, pARTPGLeACOas. В экспериментах по генетической трансформации яблони использовали сорт Мелба.

На первом этапе нашей работы был проведен ПЦР-анализ полученных линий. В результате, были подтверждены вставки селективных генов nptII и hpt во всех образцах (всего 62). Наличие смысловой конструкции было подтверждено для 3 из 3 линий растений яблони, полученных с помощью вектора pARTMdACOsa, 9 из 16 линий, трансформированных конструкцией pCamMdACOsa, и 8 из 9 линий, полученных в результате трансформации конструкцией pARTMdACOas. А также для 18 из 20 линий, полученных при помощи pARTPGLeACOas, для 6 из 10 линий - pARTPGMdACOas и 4 из 4 линий, созданных при помощи вектора pARTPGMdACOsa. В растениях, трансформированных векторами pCam, наличие вставки целевых генов было подтверждено не во всех полученных линиях. Это может быть вызвано тем, что смысловой ген в конструкции следует за селективным геном. А также возможно происходит разрыв Т-ДНК при встраивании в растительный геном. На следующем этапе наших исследований планируется проведение оценки уровня экспрессии изоформ гена АСО, измерение уровня синтеза этилена в различных частях растения и оценка его влияния на рост и развитие трансгенных растений.

Секция 4

GENETIC ANALYSIS OF TRANSGENIC APPLE PLANTS

CONTAINING A COMPLIMENTARY HAIRPIN STRUCTURE

TO THE SECOND EXON OF THE APPLE GENE ACO

Vlasova A.A.1,2, Sklyar Y.A., Pushin A.S.2, V.R. Timerbayev V.R.3, Dolgov S.V.2,3 Michurinsky State Agrarian University, Michurinsk, Tambov Region, 393760, International str., 101, tel. (475 45) 5-34-71, e-mail: anutik.vlasowa@yandex.ru;

Federal State Institution of Science Branch of Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290, Prospect of Science, 6, tel. (4967) 73 17-79 All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, 127550, Moscow, Timirjazevskaja str., 42, tel. (499) 976-90-05 Carrying out genetic research on apple (Malus domestica L.) is laborious and long process which is primarily due to the long cycle of reproduction. However, soon after the first successful attempt to transform apple it became quite popular object for research of regulation of the ethylene biosynthesis level, primarily because of its economic importance and wellstudied physiological aspects of ripening process. One of the directions of genetic transformation is modification of apple fruit ripening process in order to increase the retention period.

The aim of this study is to determine the level of ethylene synthesis in apple plants containing the hairpin structure complementary to the second exon of the apple gene ACO (selfcomplementary gene fragments ACC oxidase of apple plants in different orientations of the antisense-sense and sense-antisense).

In our laboratory we were obtained using six lines of vector constructs containing selfcomplementary fragments of ACC oxidase genes, three of them contained the target gene under the control of CaMV35S promoter - pARTMdACOsa, pARTMdACOas, pCamMdACOsa; other three vectors contained the tomato fruit specificity polygalacturonase promoter - pART PGMdACOas, pARTPGMdACOsa, pARTPGLeACOas. Apple variety “Melba” was used in the experiments of the genetic transformation.

In the first step of our work PCR analysis of the lines was performed. As a result, inserts of selective nptII and hpt genes were confirmed in all samples (a total of 62 sampels). The stable integration of the gene cassettes into the genome of plants was confirmed for 3 of 3 apple lines obtained with the vector pARTMdACOsa, for 9 of 16 lines transformed by the vector pCamMdACOsa, for 8 of 9 lines obtained by the construct pARTMdACOas and for 18 of 20 lines obtained by pARTPGLeACOas, for 6 of 10 lines - pARTPGMdACOas and for 4 of 4 lines developed using the vector pARTPGMdACOsa. In plants transformed by the vectors pCam the integration of the target gene was not confirmed in all the lines obtained. It may be due to the fact that the target gene in the vector follows the selective gene. And probably there is a rupture of T-DNA by inserting into the plant genome. In the next step of our research assessment of the level of expression of the gene isoforms ACO, measurement of ethylene synthesis level in different parts of the plant and assessment of its influence on the growth and development of transgenic plants are planned.

–  –  –

Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии НАН Беларуси (ГНУ ИГиЦ НАНБ), 220072, г. Минск, ул. Академическая, д. 27, тел. (37517) 263-53-26, факс (37517) 284-19-17, e-mail: E.Voronkova@igc.bas-net.by Определение стабильности наследования трансгенной вставки при размножении ГМ-растений является одним из основных этапов оценки их селекционной ценности и биобезопасности. Для картофеля, как вегетативно-размножаемой культуры, изучение этого вопроса важно с точки зрения выяснения сохранения вставки в клубневом потомстве трансгенных клонов, а также определения ее копийности и возможности передачи в селекционный материал путем гибридизации. Целью настоящей работы было изучение наследования целевого гена cry3aM кристаллического инсектицидного белка (Bt-токсина) от Bacillus thuringiensis и репортерного гена licB лихеназы от Clostridium theromocellum при вегетативном и семенном размножении у четырех устойчивых к колорадскому жуку трансгенных клонов картофеля сорта Скарб.

Трансгенные растения были получены в лаборатории молекулярной генетики ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси [Исаенко и др., 2007]. О стабильности наследования трансгенной вставки судили по результатам ПЦР-анализа с использованием специально подобранных специфических праймеров к крупным фрагментам ДНК изучаемых генов, не имеющих аналогов в интактных растениях картофеля. Для детекции целевого гена это был фрагмент размером 675 п.н., а для выявления репортерного гена - 453 п.н. Для оценки вегетативного потомства изучали ДНК от четырех произвольно выбранных растений, выросших из клубней, взятых от каждого из трансгенных клонов (пятая клубневая репродукция). При изучении наследуемости трансгенной вставки в половом потомстве учитывали данные ПЦР анализа ДНК 50 сеянцев, полученных от каждого из трансгенных клонов при принудительном самоопылении.

В результате проведенных исследований выявлена высокая стабильность наследования целевого гена cry3aM синтеза Bt-токсина как при вегетативном, так и при половом размножении трансгенных клонов. Соответствующий фрагмент ДНК этого гена был обнаружен у всех проанализированных растений клубневых репродукций трансгенных клонов. При анализе их самоопыленного потомства только у одного из четырех клонов имело место расщепление, показавшее отсутствие специфического фрагмента у трех из 50 сеянцев. Характер расщепления в потомстве этого клона и отсутствие расщепления у трех других клонов указывают на наличие у них, как минимум, двух копий целевого гена.

В отличие от целевого гена, наследование ПЦР-фрагмента, характерного для репортерного гена, как в вегетативном, так и в половом потомстве трансгенных клонов было нестабильным.

Соответствующий фрагмент был выявлен в вегетативном потомстве двух клонов, в одном был представлен частично (у трех из четырех растений) и в одном отсутствовал полностью. В половом потомстве двух трансгенных клонов ПЦР-маркер полностью отсутствовал. Характер расщепления в потомстве двух других трансгенных клонов (соответствует 3:1) свидетельствует о присутствии у них лишь одной копии репортерного гена. Таким образом, встраивание этого гена, по-видимому, происходило с нарушениями, что привело к его утрате в отдельных копиях вставки и нестабильности его наследования при вегетативном и семенном размножении. Отсутствие стабильной наследуемости данного гена является фактором неопределенности, что нежелательно с точки зрения биобезопасности.

–  –  –

INHERITANCE STABILITI OF TRANSGENE INSERTIONS IN VEGETATIVELI AND

GENERATIVELY PROPAGATED CLONES OF TRANSGENE POTATO WITH

COLORADO BEETL RESISTANCE

Voronkova E.V., Luksha V.I., Poliukchovich Yu.V., Svitoch O.V., Yermishin A.P., Kartel N.A.

State scientific organization Institute of Genetic and Cytology of Belorussian National Academy of Science (SSO IGC NAS of Belarus), Minsk, Akademicheskaja st., 27, tel. (37517) 263-53-26, fаx (37517) 284-19-17, e-mail: E.Voronkova@igc.bas-net.by Inheritance stability study of transgene insertion in progenies of transgene plants are the most important step of transgenic plants biosafety management. For potato inheritance of transgenic insertion analysis in sexual progenies is important in viewpoint 1) of insertion quantity clarification via hybridization analysis (by test of transgenes segregation in hybrids populations) and 2) definition of transgenic insertion transfer capacity by hybridization to new cultivars. Even importance for potato us a vegetative propagated plant have stable inheritance of transgene insertion in tuber propagated clones. In connection with foreside in frame of biosafety test the stability of transgenes inheritance analysis in vegetative and generative progenies of four transgenic clones of potato with transgenic construction including two new genes have been carried out. The construction have included specificpurpose gen cry3aM from Bacillus thuringiensis of crystalline Bt-toxin protein CryIIIA synthesis with insecticide activity against coleopteran and reporter gen licB from Clostridium theromocellum of fermentative protein synthesis. All four transgenic clones were obtained in Institute of Genetic and Cytology of NAS of Belarus [Isaenko et al., 2007].

The stability of transgenic insertion inheritance via consequence of PCR-analysis with specific primers has been concluded. The primers were specially designed to reveal appropriate transgene in plants and don’t have alignments with nontransgene potato sequence. The large-size fragments with 675 b.p for cry3aM and 453 b.p. for licB were detected. The estimation in vegetative propagated transgenic potato has been realized by DNA-analysis of four randomly picked up plants from tubers of every transgenic clone.

The scrutiny of insertion inheritance in sexual progenies has been realized via PCR-analysis of DNA of 50 seedlings was obtained from every transgene clone by compulsory self-pollination.

The test has revealed high inheritance stability of specific-purpose gen cry3aM of Bt-protein synthesis us in vegetative so on in sexual propagated progenies of all four transgenic potato clones. The segregation of the specific fragment only in one clone progenies-population was detected with fragmentlack in three seedlings against 47 with fragment-presence. The segregation absence in three others populations us well segregation peculiarity of these population is evidence of at least two insertions of specific-purpose gens in all tested transgenic clones.

In contrast to specific-purpose gen, the instability of inheritance of specific PCR-fragment typical to reporter licB-gen was detected in vegetative and sexual propagated progenies of transgenic clones. The PCR-fragment presented in vegetative progenies of two clones, in progenies of one clone it partially attended (in three from four tuber-plantlets) and in one absented absolutely. In sexual propagated progenies specific PCR-fragment entirely absented in the cause of two transgenic clones. The segregation in progenies two others give evidence of presence reporter gene in parental transgene clones only in one copy and when in use integration this gene in transformants there were some genetic abnormalities that lead to instability of gene inheritance in progenies us well gene expression disturbance in transgene clones oneself.

Absence of inheritance stability and gene expression of reporter licB-gen is the factor of uncertainty. That is undesirable in point of view of biosafety in transgenic activity us well the presence in transgenic construction extra nonspecific-purpose gen. Substitution for reporter gene designed for revealing of cry-genes expressing activity may be ELISA-test using special kits for specific Bt-proteins quantity assay.

–  –  –

ЭКСПРЕССИЯ ГИРУДИНА В РАСТЕНИЯХ РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.)

Гиляшова Н.В., Таранов А.И., Фирсов А.П., Митюшкина Т.Ю., Долгов С.В.

Филиал федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, г. Пущино, проспект Науки, д. 6, тел. +7(4967)731719, факс: +7(4967)330527, e-mail: natashita-bios@yandex.ru Растительные системы синтеза белков в последнее время активно используются наряду с микробными культурами и дорогостоящими культурами клеток млекопитающих.

Представители семейства Рясковых (Lemnaceae) и Ряска малая (Lemna minor L.) в частности рассматриваются, как перспективные объекты для использования в биотехнологии и биофарминге. Этому способствует ряд таких преимуществ, как преобладание вегетативного размножения, высокая скорость роста (время удвоение биомассы – от 36 часов) и высокое содержание белка (достигает 45%).

Целью данного исследования является проведение генетической трансформации Ряски малой вектором, содержащим ген гирудина. Гирудин – высокоспецифический прямой ингибитор тромбина, синтезируемый в слюнных железах медицинской пиявки (Hirudo medicinalis). В настоящее время препараты гирудина используются при лечении широкого спектра заболеваний, таких как: антикоагулянтная терапия при тромбозах, профилактика и лечение тромбозов после хирургических вмешательств и переломов и др.

На данный момент существует два источника получения гирудина – природный из слюнных желез пиявки и рекомбинантный из дрожжей. Оба этих способа дорогостоящие, кроме того, гирудин, синтезированный в дрожжах, обладает лишь 20–30% активности от природного. Это связано с недостаточной точностью процессинга молекул гирудина в дрожжах.

Преимуществами синтеза гирудина в растениях являются низкая стоимость конечного продукта, а также наличие в растениях биохимических систем, необходимых для формирования корректной вторичной структуры гирудина. Ранее был получен растительный экспрессионный вектор PBI121, содержащий последовательность гена гирудина. К N-концу в трансляционном слиянии был добавлен сигнальный пептид амилазы риса. Кодонный состав кодирующей ДНК был оптимизирован для экспрессии в ряске.

Вектор был перенесен в штамм Agrobacterium tumefaciens CBE21, который был использован для трансформации каллусных тканей Ряски малой. В настоящее время получены листецы-регенеранты от нескольких линий трансформированного каллуса. В дальнейшем планируется завершение процесса селекции и проведение молекулярногенетического анализа полученных клонов.

–  –  –

EXPRESSION OF HIRUDIN IN DUCKWEED LEMNA MINOR L.

Gilyashova N.V., Taranov A.I., Firsov A.P., Mitiouchkina T.U., Dolgov S.V.

Branch of Shemyakin and Ovchinnikov institute of bioorganic chemystry RAS, 142290, Pushchino, Science str., 6, tel. +7(4967)731719, fax +7(4967)330527, e-mail: natashitabios@yandex.ru At the present time plant-based protein production systems are widely used along with microbial and expensive mammalian cell culture systems. Members of the Lemnaceae, including Lemna minor L., are considered as promising subjects for application in biotechnology and biofarming. A number of advantages promotes it, such as prevalence of vegetative propagation, high growth rate (biomass doubling time is about 36 hours) and sizeable protein content (amounts to 45%).

The aim of present research is conducting genetic transformation of Lemna minor L.

with the vector, which contains hirudin gene. Hirudin is high specific direct thrombin inhibitor synthesized in the peripharyngeal glands of the medicinal leech (Hirudo medicinalis). At present hirudin preparations use in a therapy a wide range of deseases, including anticoagulant therapy at thrombosis, prevention and therapy at thrombosis after surgical traetments and fractures.

Curently two hirudin sources exist, namely, native from peripharyngeal glands of the medicinal leech and recombinant from yeast. Both methods are very expensive, in addition recombinant hirudin possesses just 20-30% activity in comparison with native protein. Deficient processing accuracy of protein in yeast is the case of it.

Advantages of synthesis hirudin in plants are low cost of final product, as well as availability in plants biochemical system required for generation correct secondary structure of hirudin. Previously plant expression vector PBI121 that contains hirudin gene was obtained and

-amilase signal peptide was added in translation fusion to N-end. Codon usage of coding DNA was optimized for expression in duckweed.

Vector was transferred into the strain Agrobacterium tumefaciens CBE21, which had been used for transformation of callus duckweed. At present time regenerated fronds had been obtained from several transformed callus lines. Completion of selection process and conducting molecular-genetic analysis obtained lines are planed later on.

–  –  –

AGROBACTERIUM-ОПОСРЕДОВАННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ АПИКАЛЬНОЙ

МЕРИСТЕМЫ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Гончарук А.Н., Бавол А.В., Дубровная О.В.

Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, 03022, г. Киев, ул. Васильковская, д. 31/17; e-mail: dubrovny@ ukr.net Генетическая трансформация растений с использованием Agrobacterium tumefaciens характеризуется относительно высокой эффективностью, перенесением определенного дискретного сегмента ДНК, низкой частотой встраивания копий ДНК. Ожидается, что Agrobacterium будет использоваться в качестве надежного и эффективного вектора для доставки хозяйственно ценных генов в геном пшеницы. Использование этого метода осложнено тем, что для его результативного использования существующие методики требуют усовершенствования и адаптации для работы с конкретным растительным объектом. Кроме того, отдельные трудности связаны с тем, что клетки мягкой пшеницы слабо подвержены воздействию A. tumefaciens. Поэтому разработка эффективной методики трансформации пшеницы при помощи A. tumefaciens является актуальной проблемой.

Одним из основных факторов, определяющих эффективность Agrobacterium-опосредованной трансформации растений является выбор соответствующего экспланта. Использование в качестве эксплантов базальной части проростков пшеницы, содержащую апикальную меристему, имеет определенные преимущества по сравнению с традиционными типами эксплантов, такими как незрелые зародыши и эмбриогенный каллус. Во-первых, при использовании апикальной меристемы исключается необходимость индукции каллуса, и как следствие, не возникает эффект сомаклональной изменчивости. Полученные трансгенные растения характеризуются нормальным развитием и полностью соответствуют исходному сорту. Этот метод позволяет использовать для трансформации широкий перечень сортов, в том числе и те, у которых усложнен процесс индукции и дифференциации каллуса. Во-вторых, данный тип экспланта характеризуется удобством использования, поскольку получение эксплантов не ограничено сезонами года и их подготовка к проведению трансформации проходит в короткий промежуток времени.

В эксперименте использовался современный высокопродуктивный сорт пшеницы Подолянка, селекции ИФРГ НАН Украины. Семена стерилизовали 2%-ным раствором гипохлорита натрия и трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Когда колеоптиле достигал длины 2-4 см, его отрезали стерильным скальпелем под углом 45о к его продольной оси. Для трансформации на срез наносили 2-4 мкл ресуспендированной А. tumefaciens. Использовали штамм GV 2260 с плазмидой pCB002, которая содержит гены GUS – ген фермента -глюкуронидазы и nptII – ген неомицинфосфотрансферазы II E.coli. После тансформации около 70% проростков выжили.

Трансформированные растения были пассированы в стерильные чашки Петри. После того как растения окрепли они были адаптированы к условиям in vivo и пересажены в горшочки. Когда у растений было 3-7 листьев, была проведена инсуффляция сеянцев раствором, который содержал 100 мг/л канамицина. После обработки антибиотиком 11,5% растений выжило, они нормально развивались и дали семена. Наследование устойчивости к канамицину определяли по всхожести полученных семян в присутствии антибиотика. - 200 мг/л. Всхожесть семян полученных с растений Т1 составляла около 70%. При этом всхожесть контрольных семян не превышала 10%, что свидетельствует о приобретении трансформантами устойчивости к канамицину. В дальнейшем трансгенную природу полученных растений подтверждено методом ПЦР.

Полученные данные свидетельствуют о том, что инокулирование базальной части проростков пшеницы A. tumefaciens, штаммом GV 2260 с плазмидой pCB002 является надежным и высокоэффективным методом получения канамицин-устойчивых растений.

–  –  –

Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, 03022, Ukraine, Kyiv, Vasilkovskaya str., 31/17; e-mail: dubrovny@ukr.net Genetic transformation of plants by using Agrobacterium tumefaciens is characterized by a relatively high efficiency, transferring certain discrete segments of DNA and a low frequency insertion of DNA copies. It is expected that Agrobacterium will be used as a reliable and efficient metod for the delivery of significant genes in the wheat genome. This method is complicated by the fact that for a particular plant object the existing methods should be improved and adapted for its effective use. Certain difficulties arise from the fact that the cells of wheat poorly exposed to A. tumefaciens. Therefore the development of effective methods of wheat transformation by A. tumefaciens is an actual problem.

One of the main factors witch determine the efficiency of Agrobacterium-mediated plant transformation is a kind of explant. The basal part of wheat seedlings, that include the apical meristem, has certain advantages comparing with traditional types of explants such as immature embryos and embryogenic callus. Using of the apical meristem eliminate the need for callus induction and occur to the absence of somaclonal variation subsequently.

The result transgenic plants are characterized by normal development and fully conformed to original cultivar. This method can be used to transform a wide range of varieties, including those that have problems with process of induction and differentiation of callus. This type of explant allows to work all the year round and preparations for the transformation take a short period of time.

For the experiment was taken modern high-yielding cultivar of wheat Podolyanka, which was derived in Institute of Plant Physiology and Genetics NAS of Ukraine. Seeds were sterilized with 2% sodium hypochlorite solution and washed three times with sterile distilled water. When coleoptiles reached 2-4 cm in length, it was cut at an angle of 45 degrees. For the transformation we applied resuspended A. tumefaciens to basal part of wheat seedlings. The strain GV 2260 with plasmid pCB002, which contains GUS - gene of the enzyme glucuronidase and nptII - gene neomycin phosphotransferase II of E. coli. After tansformation survived about 70% of seedlings. The transformed plants were passaged into sterile Petri dishes.

Large plants have been adapted in vivo and planted into pots. Plants with 3-7 leaves were sprayed by kanamycin solution (100 mg/l). There are 11,5% of plants were survived, increased and gave seeds. Obtained seeds were immersed to kanamycin solution (200 mg/l). Germination in such environment indicates inheritance of kanamycin resistance genes, it was about 70%.

Germination of check sample seeds (without transformation) was approximately 10%. The nature of the transgenic plants was confirmed by PCR.

The results indicate that inoculation of wheat seedlings by A. tumefaciens strain GV 2260 with plasmid pCB002 is a effective method for obtaining of the transformation plants.

Секция 4

СОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ГЕН codА ИЗ

ARTHROBACTER GLOBIFORMIS ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИ В ЯДЕРНЫЙ И

ПЛАСТИДНЫЙ ГЕНОМ ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ

Гулевич А.А.1, Кунакова Е.А.2, Данилова С.А.2, Баранова Е.Н.1, Ралдугина Г.Н.2 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии, Москва, Тимирязевская, д. 42, тел. (499)977-09-47, факс: (499)977-09-47, e-mail: a_gulevich@mail.ru Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, Ботаническая ул., д. 35, тел. (499)231-83-44, факс (495)977-80-18, e-mail: galina ifr@fromru.com Для оценки эффективности двух альтернативных стратегий адресной экспрессии и защитных функций бактериального гена, кодирующего ключевой фермент синтеза не характерного для растений семейства Solanaceae осмопротектанта глицин-бетаина – холиноксидазу произведен дизайн двух генно-инженерные конструкций.

Первая – на основе стандартного экспрессионного вектора pBI, применяемого в агробактериальной трансформации растений. Т-область содержит целевой ген codA из почвенной бактерии Arthrobacter globiformis, кодирующий фермент холиноксидазу под контролем CaMV35S конститутивного вирусного промотора и NOS-терминатора. В данной конструкции ген codA будет трансляционно слит с сигнальной последовательностью из гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы томата, которая кодирует транзитный пептид, направляющей белковый продукт в хлоропласт. Кроме того, в Т-области находится придающий устойчивость к антибиотику канамицину маркерный ген nptII под контролем NOS-промотора и NOS-терминатора.

Данный вектор предназначен для трансформации ядер в растительных клетках.

Вторая конструкция на основе плазмиды pKMS8 (предоставленная P.Maliga, США) предназначена для трансформации пластид в растительных клетках. Эта конструкция содержит целевой ген codA под контролем хлоропластных промотора и терминатора, а также придающий устойчивость к антибиотику спектиномицину маркерный ген aadA под контролем хлоропластного гибридного Prrn/clpP промотора и терминатора большой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (rbcL).

В дальнейшем планируется проведение агробактериальной трансформация табака сорта Petit Havana и трансформация хлоропластов в клетках табака посредством биолистического метода.

Работа поддержана грантом РФФИ 13-08-01323-а.

Секция 4

CREATION OF EXPRESSION CASSETTES CONTAINING THE BACTERIAL GENE

codA OF ARTHROBACTER GLOBIFORMIS FOR INTEGRATION INTO THE

NUCLEAR AND PLASTID GENOME OF DICOTYLEDONOUS PLANTS

Gulevich A.A. 1, Kunakova E.A.2, Danilova S.A.2, Baranova E.N.1., Raldugina G.N.2 All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Moscow, Timiryasevskaya str., 42, tel. (499)977-09-47, fax (499)977-09-47, e-mail: a_gulevich@mail.ru K.A. Timiryasev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Science, Botanicheskaya str., 35, tel. (499)231-83-44, fax: (495) 977-80-18, e-mail: galina ifr@fromru.com To evaluate the efficiency of two alternative strategies of the targeted expression and the protective functions of the bacterial gene the design of two genetic constructs was performed.

The gene of interest encodes the choline oxidase, that a key enzyme in the synthesis of osmoprotectant glycine betaine is that is not characteristic for plants of Solanaceae.

First construct - based on a standard expression vector pBI, used in Agrobacteriummediated plant transformation. T-region contains a target gene codA from the soil bacterium Arthrobacter globiformis under control of the viral constitutive CaMV35S promoter and NOSterminator. In this cassette a codA gene is translationally fused to the signal sequence of the small subunit ribulose bisphosphate carboxylase gene of tomato which encodes a transit peptide targeting the protein product to the chloroplast. In addition, the T-region harbours also the resistance to antibiotic kanamycin that is conditioned by marker gene nptII under control of NOS-promoter and NOS-terminator. The vector is intended for transformation of plant cells nuclei.

The second construct based on pKMS8 plasmid (provided P.Maliga, USA) is intended for plastid transformation in plant cells. This vector comprises a target gene codA under the control of chloroplast promoter and terminator, and contains also aadA marker gene conferring the resistance to the antibiotic spectinomycin under the control of chloroplast hybrid Prrn/clpP promoter and terminator from the large subunit of ribulose bisphosphate carboxylase gene (rbcL).

In the future we plan to perform Agrobacterium-mediated transformation of tobacco variety Petit Havana and chloroplast transformation in tobacco cells by the biolistic method.

This work was supported by RFBR grant 13-08-01323-a.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН; 127276, г. Москва ул. Ботаническая, д. 35, тел.: (495) 2318334, факс: (495) 9778018, e-mail: svdan@yandex.ru Развитие генетической инженерии растений позволяет изменять геном растений за счет переноса в них «полезных» генов чтобы получать растения нового поколения.

Особое место в трансгенной инженерии растений занимают транспластные растения.

Хлоропласты, имеют собственный геном и являются обязательным компонентом растительной клетки. Технология экспрессии генов хлоропластов основывается на способности этих клеточных органелл эффективно синтезировать и накапливать белки.

Эта технология позволяет получать различные белки в больших количествах при меньших затратах, что чрезвычайно важно для коммерческого использования. Кроме того, генетическая информация передается от пластид главным образом по материнской линии, что практически исключает перенос при помощи пыльцы любых генов, введенных в хлоропласты. Поэтому, использование таких растений приносит наименьший вред окружающей среде, и они являются экологически более безопасными.

Хлоропласты имеют собственный генетический аппарат и белоксинтезирующую систему и способны делиться внутри клетки. В отличие от линейных молекул ДНК в хромосомах ядра, хлоропластная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу.

Ее размеры варьируют у разных видов растений большей частью в интервале от 130 до 160 тыс. пар оснований. Наиболее широко используемый метод введения ДНК в хлоропластный геном растительной клетки это бомбардировка микрочастицами, или биобаллистика. В нашей работе используется пушка Biolistic PDS-1000/He фирмы Bio-RAD (USA). Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов. Однако, у нас к настоящему времени эффективная технология трансформации пластид отработанна на растениях табака. Техника получения геномных и трансплатомных трансформированных растений значительно различается. Отличие касается не только применяемых векторов, методов трансформации, но и отбора стабильных трансформантов.

Большие перспективы пластидной трансформации растений побуждают к поискам новых методических подходов и расширению круга объектов для трансформации хлоропластов. Трансплантомные растения перспективны как для фундаментальной науки, так и для коммерческой биотехнологии.

Работа частично поддержана грантом РФФИ 13-08-01323/13

–  –  –

Federal State Institution of Science KA Timirjazev Institute of Plant Physiology, 127276,

Moscow, Botanicheskaya str., 35, tel.: (495) 2318334, fax: (495) 9778018, e-mail:

svdan@yandex.ru The development of plant genetic engineering allows to modify the genome of plants by transfer of "useful" genes to produce plants of new generation. A transplastomic plants attract a particular attention in plant genetic transformation. The plastids (chloroplasts) have their own genome and are an obligatory compartment of the plant cell. Technology of transgene expression in chloroplasts is based on the ability of these organelles to effectively synthesize and accumulate proteins. This technology permits to receive a variety of proteins in large quantities at a lower cost, which is extremely important for commercial use. [1] In addition, the genetic information is transferred from the plastid mainly through the maternal line, which virtually eliminates the transfer of pollen by any genes introduced into chloroplasts. Therefore, the use of such plants brings less injury to the environment, and they are environmentally safer.

Chloroplasts have their own genetic machinery and protein synthesis system and are able to divide within the cell. Unlike linear DNA molecules in nuclear chromosomes the chloroplast DNA is a closed circular molecule. Its size varies for different plant species predominantly in the range of from 130 to 160 thousands base pairs. The most widely used method of introducing DNA into the chloroplast genome of a plant cell is a microprojectile bombardment, or bio-ballistics. In our experiments, we use the gun Biolistic PDS-1000/He of Bio-RAD (USA). Microprojectile bombardment method allows transforming many different species of plants. However, to date, an effective technology for transforming plastids was performed on tobacco plants. Technique for obtaining genomic and transplatomic transformed plants varies considerably. The difference does not consist in used vectors and methods of transformation only, but in the selection of stable transformants.

Great prospects of plastid transformation of plants prompt to the search for new methodological approaches and the expanding of the range of facilities for chloroplast transformation. Transplantomic plants are promising for both fundamental science and practical biotechnology.

This work was partially supported by the RFBR 13-08-01323/13.

Секция 4

ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ СПЛАЙСИРОВАННЫХ ФОРМ ГЕНА

VACDPK3A НА РОСТ И МОРФОЛОГИЮ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ВИНОГРАДА

АМУРСКОГО VITIS AMURENSIS RUPR.

Дубровина А.С.,1 Шумакова О.А.1,2, Христенко В.С1,2, Киселев К.В.1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, Владивосток, 690022, пр. Столетия Владивостоку, 159, факс: (423) 231-01-93, (423) 231-07-18, e-mail: dubrovina@biosoil.ru Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, 690090, ул. Октябрьская, 27, факс: (423) 2432315, (423) 2457687 Недавние исследования показали, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК растений – это намного более распространенное и важное явление, чем считалось ранее.

Установлено, что ~42-61% интрон-содержащих генов арабидопсиса подвергаются альтернативному сплайсингу, что во многих случаях вносит значительный вклад в способность растений своевременно отвечать на различные стрессовые условия или сигналы к развитию. В литературе не представлена информация о распространенности альтернативного сплайсинга для генов протеинкиназ растений, а также том, как альтернативный сплайсинг регулирует активность и функции этих ферментов.

В настоящем исследовании нами были детектированы необычные последовательности мРНК транскриптов гена Ca2+-зависимой протеинкиназы VaCDPK3а в каллусных культурах клеток и растениях винограда амурского Vitis amurensis Rupr. В последовательностях этих транскриптов отсутствовали общирные участки киназного, автоингибторного и/или Ca2+-связывающего доменов. С помощью ОТ-ПЦР и секвенирования нами были получены и проанализированы полные белок-кодирующие последовательности необычных транскриптов VaCDPK3а. В полученных последовательностях отсутствовали общирные участки, вследствии чего в большинстве случаев изменялась рамка считывания и появлялись преждевременные стоп-кодоны. При выведении аминокислотных последовательностей оказалось, что соответсвующие белки содержат только N-терминальный вариабельный домен и часть киназного домена (VaCDPK3aSF1), только вариабельный домен и полную N-терминальный последовательность киназного домена (VaCDPK3aSF2), или содержат все домены, кроме автоингибиторного (VaCDPK3aSF3). Мы предположили, что обнаруженные необычные транскрипты гена CDPK3a из V. amurensis подвергались альтернативному сплайсингу, либо другим необычным посттранскрипционным модификациям.

Для изучения функциональной роли и свойств коротких белков VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 нами была поставлена задача получить каллусные культуры V. amurensis, сверхэкспрессирующие полные последовательности кДНК транскриптов VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3. Последовательности кДНК были перенесены в бинарные вектора для агробактериальной трансформации под контроль двойного CaMV35S промотра. Проведено семь попыток агробактериальной трансформации. В течение первых двух месяцев селекции в присутствии селективного маркера наблюдался активный рост трансгенных клеточных агрегатов, однако на второй месяц культивирования наблюдалось резкое ингибирование пролиферации трансгенных клеток, что впоследствии приводило к гибели клеток. Только после семи повторов трансформации нами были получены трансгенные клеточные линии, сверхэкспрессирующие целевые последовательности. Полученные линии активно аккумулировали биомассу и представляли собой рыхлую активно растущую гомогенную каллусную ткань, не проявляющую тенденции к дифференциации. В настоящее время нами проводится изучение устойчивости полученных трансгенных клеточных линий к абиотическому стрессу, а также определение содержания биологически активных веществ полифенольной природы.

Секция 4

THE EFFECT OF VACDPK3A SPLICE VARIANT OVEREXPRESSION ON THE

GROWTH AND MORPHOLOGY OF VITIS AMURENSIS CELL CULTURES.

Dubrovina A.S.,1 Shumakova О.А.1,2, Khristenko V.S1,2, Kiselev K.V.1 Institute of Biology and Soil Science, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok, 690022, Stoletiya str., 159, fax: (423) 231-01-93, (423) 231-07-18, email: dubrovina@biosoil.ru

Far Eastern Federal University, Vladivostok, 690090, Oktyabrskaya str., 27, факс:

(423) 2432315, (423) 2457687.

Recent genome-wide studies have demonstrated that alternative splicing in plants is far more prevalent and important than previously thought and contributes to the high transcriptome and proteome complexity. It has been shown that ~42-61% of intron-containing genes in Arabidopsis are alternatively spliced. It becomes clear that alternative splicing contributes to plant responsiveness to various stress and developmental signals. While it is well established that alternative splicing significantly impacts on the expression of protein kinases in mammals and changes their functions, little is known how alternative splicing regulates activities and functions of plant protein kinases, which are known to be the key regulators of plant signal transduction.

In the present study, we detected unusual mRNA transcripts of the Ca2+-dependent protein kinase gene VaCDPK3a in callus cultures and vines of Vitis amurensis Rupr. The VaCDPK3a transcripts lacked extensive sequences in the kinase, autoinhibitory, and/or Ca 2+binding domains. Using RT-PCR and DNA sequencing, we obtained and analyzed full-length protein-coding cDNA sequences of the unusual VaCDPK3a transcripts. The deletions have led to frameshifts and incorporation of in-frame premature stop-codons in most cases. The deduced amino acid sequences of the VaCDPK3a transcript variants contained only the N-terminal variable domain and a part of the kinase domain (VaCDPK3aSF1); the N-terminal variable domain and the full-length kinase domain (VaCDPK3aSF2); or all domains, except for the autoinhibitory domain (VaCDPK3aSF3). We proposed that the unusual VaCDPK3a transcripts resulted from an unusual posttranscriptional mRNA processing resembling alternative splicing.

In order to investigate the functions and properties of the short VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2, and VaCDPK3aSF3 proteins, we aimed to establish callus cultures of V.

amurensis overexpressing full-length cDNA sequences of the putative VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2, and VaCDPK3aSF3 transcripts. The cDNA sequences have been transferred to a binary vector under the control of the double CaMV35S promoter for the following Agrobacterium-mediated transformation of V. amurensis. Seven transformation experiments have been conducted. Unexpectedly, selection of the transformed V. amurensis calli for two months after transformation in the presence of the selective marker resulted in an abrupt growth inhibition and cell death. Only after seven transformation experiments we were capable to establish transgenic cell cultures overexressing the unusual VaCDPK3a transcript variants. The transformed calli actively accumulated cell biomass and exhibited friable homogenous phenotype without signs of cell differentiation. At present, we are analyzing abiotic stress tolerance of the transformed calli and the content of bioactive phenolic compounds in the calli.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 10, тел.

(383)363-49-26, факс (383)333-12-78, e-mail:

zagorska@bionet.nsc.ru Основной эндогенный ауксин – индол-3-уксусная кислота (ИУК) принимает участие практически во всех процессах роста и развития растений и относится к ключевым растительным гормонам. Однако биохимические пути биосинтеза ИУК и соответственно гены, контролирующие эти процессы, до сих пор изучены слабо. На сегодняшний день ничего не известно о генах, обеспечивающих биосинтез ауксина у такого важного модельного объекта, как табак (Nicotiana tabacum L.). Данную работу проводили в рамках изучения проблем функционирования трансгенов и собственных генов, затронутых инсерцией, с использованием двух линий N. tabacum: линии SR1 в качестве контроля и полученной на ее основе трансгенной линии IF4/11 с лонгостильным фенотипом. Известно, что изменение морфологии цветка может быть связано с нарушениями в соотношении фитогормонов, с их инактивацией, а также с нарушением их транспорта. В связи с этим представляло интерес провести анализ содержания ИУК в тканях цветков в процессе его формирования. Данный анализ выявил более низкое по сравнению с контролем содержание ауксина в цветках трансгенной линии с лонгостильным фенотипом на всех стадиях развития за исключением завершающей стадии ХII. Формирование лонгостильного фенотипа происходило на стадиях развития с VIII по XII. Необходимо отметить, что именно на этих этапах наблюдалось возрастание содержания ИУК в тканях цветков растений линии IF4/11. В контрольной же линии SR1 динамика ИУК характеризовалась снижением концентрации, начиная со стадии I и до стадии XII.

Молекулярный механизм, регулирующий биосинтез ИУК у N. tabacum остается неизвестным. Поэтому мы предприняли попытку обнаружить гены, ортологичные FZYгенам томатов. Для выявления генов NtFZY-семейства использовали ПЦР-анализ экстрактов ДНК, выделенных из тканей цветков линий IF4/11 и SR1. С применением набора праймеров, комплементарных последовательностям генов ToFZY мультигенного семейства томатов, в геноме N. tabacum обнаружены четыре неизвестные ранее гена.

Обнаруженные нами NtFZY1–NtFZY4 гены являются первыми выявленными генами табака, принимающими участие в триптаминовом пути биосинтеза ауксина и кодирующими флавин-монооксигеназаподобные белки, функционирующие на начальных стадиях триптофанзависимого пути биосинтеза ауксина. Выявление данных генов у табака является перспективным с точки зрения расширения возможностей детального изучения триптаминового пути биосинтеза ИУК у растений.

Дальнейшее развитие работы предполагает сравнительное изучение уровня экспрессии NtFZY-генов у табака в линии SR1 и трансгенной линии IF4/11 с мутантным фенотипом методом ПЦР в реальном времени.

–  –  –

Federal State Institution of Science Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk, Lavrentiev av., 10, tel. (383) 363-49fax (383) 333-12-78, e-mail: zagorska@bionet.nsc.ru The key plant endogenous hormone indole-3-acetic acid (IAA) is involved in almost all processes of plant growth and development. However biochemical pathways of the IAA biosynthesis and genes controlling these processes are still poorly understood. Nothing is known about the genes that ensure auxin biosynthesis in such an important model system, as tobacco (Nicotiana tabacum L.). This work was carried out within the studying of functioning of own plant genes and transgenes affected by the insertion using two lines of N. tabacum: line SR1 as control and transgenic line IF4/11 with longostily phenotype obtained on its basis. It is well known that modifying the flower morphology may be due to abnormalities in the ratio phytohormones, their inactivation, as well as disturbance of their transport. In this regard, it was of interest to analyze the IAA content in flower’s tissues during the formation of the flower.

This analysis revealed a lower auxin content in the flowers of the transgenic line with longostily phenotype at all developmental stages with the exception of the final stage XII as compared with the control line SR1. Formation of longostily phenotype occurred at the developmental stages from VIII to XII. It should be noted that it is during these phases observed increasing of the IAA content in flowers tissues of line IF4/11. Dynamics of IAA concentration in the control line SR1 in the course of flower formation was characterized by a decrease from the stage I to stage XII.

The molecular mechanism that regulates the IAA biosynthesis in N. tabacum is still unknown. Therefore, we attempted to detect tobacco genes orthologous to FZY-genes of tomatoes. For this purpose we used PCR analysis of DNA extracts isolated from tissue of flowers of lines IF4/11 and SR1. Using a set of primers complementary to gene sequences of ToFZY-multigene family of tomato four previously unknown genes were found.

Discovered NtFZY1-NtFZY4-genes are the first identified tobacco genes involved in the tryptamine pathway of auxin biosynthesis and encode flavin monooxygenase-like proteins functioning at the initial stages of the tryptophan biosynthetic pathway of auxin biosynthesis.

The identification of these genes in tobacco is promising in terms of empowering a detailed study of the tryptamine IAA biosynthesis pathway in plants in general.

Further development of this study suggests comparative analysis of expression level of NtFZY-genes in tobacco lines SR1 and transgenic line IF4/11 with longostily phenotype using real-time PCR.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН), 630090, г.

Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д. 10, факс: (383) 333-12-78, тел.: (383) 363-49-80, e-mail: isola@bionet.nsc.ru Неблагоприятные факторы окружающей среды негативно влияют на рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Засуха, низкие температуры и засоленность почв вызывают у растений осмотический стресс. В ответ на осмотический стресс растения накапливают низкомолекулярные органические соединения, получившие названия осмопротектантов или совместимых осмолитов. Аминокислота пролин известный осмолит, играет важную роль в жизнедеятельности растения и как структурный компонент белков и как свободная аминокислота. Накопление пролина наблюдали у видов различной таксономической принадлежности в ответ на абиотический стресс. Модификация экспрессии генов метаболизма пролина с помощью современных методов генной инженерии является одним из перспективных направлений повышения стрессоустойчивости у растений.

Методом агробактериальной трансформации, получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L. сорт Havana Petit SR1) и картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Никулинский), несущие антисмысловой супрессор гена ПДГ (фрагмент гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса, помещенный под управление 35S промотора вируса мозаики цветной капусты). Для получения трансгенных растений были использованы различные типы эксплантов: высечки листа табака и междоузлия картофеля. Уровень пролина у полученных трансгенных линий табака и картофеля в нестрессовых условиях превышал таковой у контрольных в 1.5-2 раза Оценка полученных трансгенных линий картофеля в культуре in vitro на среде, содержащей стрессовые агенты: 180 мМ NaCl и 300 мМ маннитола, показала устойчивость трансгенных линий, по сравнению с контролем, в накоплении биомассы, в высоте растения и длине корней.

Проростки трансгенных линий табака культивированные на средах содержащих повышенные концентрации NaCl (200- 300 мМ) и агара (14 г/л) также проявляли повышенную устойчивость, по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями. В условиях солевого стресса (200 мМ) скорость роста корней проростков трансгенных линий табака была достоверно выше по сравнению с контролем. Дефицит влаги, имитированный повышенным содержанием агара в питательной среде, снижал скорость накопления биомассы проростка у контрольных растений по сравнению с растениями трансгенных линий.

Взрослые растения трансгенных линий табака, выращенные в горшочках с вермакулитно-перлитной смесью характеризовались повышенной устойчивостью к дефициту влаги и низким температурам (-2).

Таким образом, частичная супрессия гена ПДГ привела к увеличению уровня пролина у трансгенных растений табака и картофеля, и сопровождалась повышенной стрессоустойчивостью растений к таким факторам абиотического стресса как, засоление, засуха, пониженные температуры.

Секция 4

–  –  –

The Institute of Cytology and Genetics, The Siberian Branch of The Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk, Lavrentyev ave, 10, tel. +7(383) 363 49 80, fax: (383) 333-12e-mail: isola@bionet.nsc.ru Abiotic environment stress, such as drought, salinity, low temperatures, is a major limitation for plant growth and crop productivity. Accumulation of certain organic solutes (called osmoprotectants) is а common metabolic adaptation means found in different taxa.

Proline accumulates in many plant species in response to environmental stress. It plays a role in cellular osmoregulation and exhibits many protective effects. The induction of proline accumulation in response to environmental stress suggests that overproduction of this one in agriculturally important crop by genetic engineering might increase overall environmental tolerance and enhance productivity.

We obtained transgenic tobacco and potato plants are bearing a fragment of arabidopsis proline dehydrogenase gene (PDH) in antisense orientation. For obtaining transgenic plants in tobacco and potato, different types of explants have been used: leaf explants for tobacco, while interstices in case of potato. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum L. cv. Havana Petit SR1) and potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Nikulinsky) were developed via Agrobacterium mediated transformation. The usage of heterologous antisense suppressor resulted in mild increase in proline content in non-stressed transgenic plants. The higher proline level shown by transgenic plants was associated with better biomass production and growth performance under the stress conditions.

In vitro grown shoots of potato transgenic lines on MS medium supplemented with high concentration of NaCl (180 mM) showed enhanced tolerance to NaCl compared to control untransformed plants. Treatment with NaCl caused reduction in the shoot and root length in both transgenic and control plants. But transgenic potato lines at high salt concentration exhibited a significantly higher shoot and root length as compared with untransformed control plants.

Mannitol (300 mM) under in vitro conditions reduces roots development and biomass production in control untransformed plants unlike transgenic lines.

The seedlings of transgenic tobacco lines cultured on MS medium supplemented with stress agents were resistant to high NaCl concentrations (200–300 mM) and water deficit simulated by increasing agar content in the medium (14 g/L) as compared to the control seedlings of cv. Havana Petit SR1. Mature plants of transgenic lines grown in pots also manifest the higher resistance to water deficit and low temperatures (2° C and –2° C) than the control (untransformed plants).

Thus, the partial PDH suppression leads to proline accumulation in plants and correlate with an increase in nonspecific resistance to different types of abiotic stress, including salinity, water deficit, and low temperatures.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-80, e-mail: kinyaykin@bionet.nsc.ru Клеточные механизмы, обеспечивающие перемещение цитоплазмы и органелл, в том числе и таких крупных как ядро, между мейоцитами у растений при цитомиксисе, все еще остаются невыясненными.

Вероятнее всего, что в этом процессе задействованы элементы цитоскелета, микротрубочки и микрофиламенты.

Так как на основе результатов иммуно-флуоресцентного анализа тубулинового цитоскелета в мейозе растений табака с высоким уровнем цитомиксиса не выявлено каких-либо особенностей его динамики или организации, которые позволили бы связать их с межклеточными перемещениями ядер, логично предположить, что основную роль в миграции ядер при цитомиксисе играет актиновая часть цитоскелета растительной клетки.

В настоящее время для визуализации актинового цитоскелета у растений применяется метод окрашивания родамин–фаллоидином, однако этот метод не позволяет использовать живые растительные клетки.

Для мечения актина в живых растительных клетках предложены другие подходы, основанные на применении гибридных флюоресцентных белков, слитых с актин-связывающими белками. Использование таких гибридных белков дает возможность выявить актиновую составляющую цитоскелета (радиальные и кортикальные пучки актиновых микрофибрилл, веретено деления) в различных типах растительных клеток.

Целью данной работы является сравнительная визуализация актинового цитоскелета в различных типах клеток трансгенных растений Nicotiana tabacum cv Petite Havana линии SR1 с использованием генетических конструкций GFP-ABD2-GFP и Lifeact-GFP. Конструкция GFP-ABD2-GFP включает актин-связывающий домен высоко консервативного белка фимбрина, выделенного из Arabidopsis thaliana и осуществляющего объединение одиночных актиновых микрофибрилл в пучки. Конструкция Lifeact-GFP включает актин-связывающий домен белка Abp140, выделенного из дрожжей.

В лаборатории биоинженерии растений получены трансгенные растения табака с вышеперечисленными типами генетических конструкций. Проведен сравнительный анализ степени визуализации актинового цитоскелета в различных типах клеток (микроспороциты, трихомы, клетки эпидермиса листа, корневые волоски и пыльцевые трубки). Несмотря на то, что во всех типах используемых генетических конструкций в качестве регуляторного элемента был включен конститутивный 35S-промотор, актиновый цитоскелет (радиальный и кортикальный) хорошо визуализовался только в трихомах и клетках эпидермиса листа. В остальных типах клеток (микроспороциты, корневые волоски и пыльцевые трубки) актиновый цитоскелет нами не выявлен. Однако особый интерес для нас представляла визуализация актинового цитоскелета в мейоцитах табака при цитомиксисе.

Для этих целей в конструкциях GFP-ABD2-GFP и Lifeact-GFP планируется замена конститутивного 35Sпромотора на тканеспецифичный. В качестве тканеспецифичных промоторов, экспрессирующихся в мейоцитах, будут использованы pZm13 и pAtDMC1, являющиеся промоторами генов белков микроспорогенеза. Белок Zm13 выявлен среди специфических белков микроспорогенеза у кукурузы. Белок DMC1 является мейоз-специфичным белком рекомбинации и репарации ДНК. Созданные конструкции, включающие тканеспецифичные промоторы, будут использованы для создания трансгенных растений Nicotiana tabacum L cv. Petite Havana SR1 с целью визуализации актинового цитоскелета в мейоцитах табака при цитомиксисе.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 11-04-01192-а.

–  –  –

COMPARATIVE ACTIN CYTOSKELETON VISUALIZATION IN VARIOUS CELL

TYPES OF TRANSGENIC PLANTS NICOTIANA TABACUM L.

Kinajikin V.I., Sidorchuk Yu.V., Deineko E.V.

Institute of cytology and genetics The Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences Russian Federation, 630090, Novosibirsk, Prospekt Lavrentyeva, 10, tel. (383) 363-49-80, e-mail: kinyaykin@bionet.nsc.ru Cellular mechanisms of the cytoplasm and organelles movement, including such big as the nucleus, between meiocytes cytomixis in plants, are still unclaified. Most probably, this process involved elements of the cytoskeleton, microtubules and microfilaments. According to results of immuno-fluorescence analysis, tubulin cytoskeleton doesn’t reveal any features of its dynamics or organization that would link them to the intracellular movement of the nuclei.

Under that logic we assume, that the main role in the migration of the nuclei during cytomixis is played by actin cytoskeleton.

Staining with rhodamine-phalloidin is now used for actin cytoskeleton visualization in plants, but this method is not applicable to live plant cells. For labeling of actin in living plant cells, is proposed another approach based on the use of hybrid fluorescent protein fused to the actin-binding proteins. Using of such fused proteins permits to reveal the actin cytoskeleton components (radial and cortical actin bundles of microfibrils division spindle) in different types of plant cells.

The aim of this work is the comparative visualization of the actin cytoskeleton in various cell types of transgenic plants Nicotiana tabacum cv Petite Havana line SR1 using genetic constructs GFP-ABD2-GFP and Lifeact-GFP. The design of GFP-ABD2-GFP involves actin-binding domain of highly conserved protein fimbrin, isolated from Arabidopsis thaliana that merge single actin microfibrils in bunches. Lifeact-GFP construction includes actin-binding domain of the Abp140 protein, isolated from yeast.

In the laboratory of plant bioengineering number of transgenic tobacco plants with types of genetic constructs listed above was obtained. A comparative analysis of visualization level of the actin cytoskeleton was performed in various cell types (microsporocytes, trichomes, leaf epidermal cells, root hairs and pollen tubes). Despite the fact that in all types of genetic constructs constitutive 35S-promoter was included as a regulatory element, actin cytoskeleton (radial and cortical) is well visualized only in trichomes and leaf epidermal cells. In other cell types (microsporocytes, root hairs and pollen tubes), the actin cytoskeleton was not detected by us. However, visualization of actin cytoskeleton in tobacco meiocytes during cytomixis is of special interest.

For these purposes, it is planned to replace constitutive 35S-tissue-specific promoter in GFP-ABD2-GFP and Lifeact-GFP constructions. Promoters of microsporogenesis genes pZm13 and pAtDMC1 will be used, as a tissue-specific promoters expressed in meiocytes. Zm13 protein was found among specific microsporogenesis proteins in maize. DMC1 protein is a meiosis-specific protein of recombination and DNA repair. Constructs obtained, including tissue-specific promoters, will be used to create transgenic plants Nicotiana tabacum L cv. Petite Havana SR1 to visualize the actin cytoskeleton in tobacco meiocytes during cytomixis.

The work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant No. 11a).

<

Секция 4

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА Lac ИЗ ГРИБА TRAMETES HIRSUTA В ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЯХ ОСИНЫ

Ковалицкая Ю.А.1,2, Филиппов М.В.1,2, Васина Д.В.2,3, Даянова Л.К.1,2, Логинов Д.С.2,3, Королева О.В.2,3, Шестибратов К.А.1,2 Филиал ФГБУН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, д. 6, тел. / факс: 8(4967) 33-09-66, e-mail: kovalitskaya@inbox.ru Пущинский государственный естесственно-научный институт, 142290, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, д. 3, тел. / факс: (4967) 73-26-77, 73-18-57, 73-27-11.

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, г. Москва, Ленинский пр., д. 33, стр. 2,тел. / факс: (495) 954-5283/(495)-954-2732.

Лигнификация растений – сложный процесс, в регуляции которого участвует множество генов. Если основные гены, управляющие биосинтезом лигнина известны, то о регуляции этого процесса известно очень мало. Считается, что в процессе полимеризации монолигнолов при образовании лигнина участвуют не только ферменты лигазы, редуктазы, дегидрогеназы, но и пероксидазы и лакказы. Однако однозначного мнения, о том, какой из этих ферментов, играет главную роль в лигнификации растений, пока нет.

Известно, что наиболее эффективными деструкторами лигнина являются грибы белой гнили, обладающие уникальным ферментным комплексом, ключевое место в котором отводится лакказам.

Целью данной работы являлось получение трансгенных растений осины, содержащих ген высоко редокс потенциальной лакказы из гриба Trametes hirsuta.

На основе вектора pBI нами была создана конструкция, содержащая ген лакказы из гриба T.

hirsuta под контролем 35S промотора и нопалинсинтетазного терминатора nos. В качестве селективного гена был использован ген устойчивости к канамицину - nptII. Полученный плазмидный вектор pBI-Lac был перенесен в Agrobacterium tumefaciens (штамм CBE21). Для трансформации осины (Populus tremula) использовали междоузлия растений, полученных в условиях in vitro. Селекцию трансгенных тканей проводили на питательных средах с содержанием канамицина 30 мг/л. Из всех полученных линий была выделена геномная ДНК и проанализирована методом ПЦР-анализа на присутствие селективного гена nptII и целевого гена Lac. Чтобы подтвердить отсутствие агробактериальной контаминации в анализируемом растительном материале, ДНК всех линий одновременно анализировалась на наличие агробактериального гена VirB. Проведенный ПЦР-анализ подтвердил трансгенный статус 33 линий из 52 проанализированных.

Исследование активности рекомбинантной лакказы в растительном материале in vitro трансгенных линий осины показало увеличение активности фермента в 4 клонах в 2 раза по сравнению с контролем, в 10 клонах от 50 до 80%, в остальных клонах активность фермента была на уровне контроля или ниже. В растениях с высокими показателями активности лакказы экспрессия рекомбинантного белка подтверждена методом Вестерн-блота. Оценка активности лакказы в листьях тепличных растений показала снижение общей активности фермента по сравнению с показателями in vitro, но в высокопродуктивных клонах эти показатели также были выше контрольных. Измерение высоты растений с повышенной активностью рекомбинантной лаказы показало достоверное снижение высоты по сравнению с контролем, на 40-60%, кроме растений генотипа PtXVIILac24, высота растений которого была сравнима с контрольными показателями. На данный момент растения, трансформированные геном Lac, находятся на стадии вегетации в условиях защищенного грунта. По результатам дальнейшего анализа химического состава древесины можно будет судить о влиянии рекомбинантной лакказы на процесс лигнификации растений. Работа выполнена при поддержке гранта ФЦП №14.B37.21.1915 и стипендии президента РФ 2013-2015.

Секция 4

THE EXPRESSION OF Lac GENE FROM THE FUNGUS TRAMETES HIRSUTA IN

ASPEN TRANSGENIC PLANTS

Kovalitskaya Yu.A.1, 2, Filippov M.V.1,2, Vasina D.V.2,3, Dayanova L.K.1,2, Loginov D.S.2,3, Koroleva O.V.2,3, Shestibratov K.A.1,2 Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, 142290, Moscow region, Pushchino, Science avenue, 6, tel / fax: 8 (4967) 33-09-66, kovalitskaya@inbox.ru Pushchino State Naturally and Research Institute, 142290, Moscow region, Pushchino, Science av., 3. tel / fax: (4967) 73-26-77, 73-18-57, 73-27-11.

Institute of Biochemistry, RAS, 119071, Moscow, Lenin Prospect, 33, building 2, tel / fax: (495) 954-5283 / (495) -954-2732.

Lignification of plants is a complex process, which regulated by many genes. The major of genes controlling the biosynthesis of lignin are known, but the regulation of this process is very little investigated. It is believed that in process of mononolignol polymerization to formation of lignin are involved not only the enzymes ligase, reductase, dehydrogenase, but peroxidase and laccase. Until the present, it is not a clear opinion about which of these enzymes plays a major role in the plant lignification.

It is known that the most effective lignin destructors are white-rot fungi, which have a unique enzyme complex, the key place where play laccase.

The aim of this work was to obtain transgenic aspen containing gene highly redox potential laccase from the fungus Trametes hirsuta.

On the basis of the vector pBI we created construct containing laccase gene from the fungus T. hirsuta under the control of the 35S promoter and nopalinsintetase terminator nos. As the selection gene was used kanamycin resistance gene - nptII. The resulting plasmid vector pBI-Lac was transferred to Agrobacterium tumefaciens (strain CBE21). For the transformation was used internode in vitro plants (Populus tremula). Selection of transgenic tissue was performed on nutrient media containing kanamycin 30 mg / l. Genomic DNA from all transgenic lines was isolated and analyzed by PCR for the presence of nptII selection gene and the target gene Lac. To confirm the absence of Agrobacterium contamination in the analyzed plant material, the DNA of all lines simultaneously analyzed for the presence of agrobacterial gene VirB. PCR analysis confirmed tetransgenic status of the transgenic lines, 33 of the 52 analyzed.

Investigation of the activity of the recombinant laccase in the plant material in vitro transgenic aspens showed increased activity of the enzyme in the four clones in the 2-fold compared with the control, 10 clones from 50 to 80%, in other clones of the enzyme activity was at the level of control or lower. In plants with high levels of activity of laccase expression of recombinant protein was confirmed by Western blot. Evaluation of activity of laccase in the leaves of greenhouse plants showed a decrease in the total activity of the enzyme as compared with in vitro, but in high-clones, these figures were higher than the control.

Measurement of plant height with increased activity of the recombinant Lacase showed significant reduction in height compared to the control, by 40-60%, except for one plant genotype, PtXVIILac24, plant height which was comparable with controls.

At the moment the plants transformed with the gene Lac, are in the process of vegetation in a greenhouse. According to the results of further analysis of the chemical composition of the wood will be judged on the effect of recombinant laccase on lignification process in plants.

This work was supported by grant from the Federal Program № 14.B37.21.1915 and Presidential Scholarship 2013-2015.

Секция 4

AGROBACTERIUM-ОПОСРЕДОВАННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.) IN PLANTA, С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММА LBA4404, НЕСУЩЕГО pBi2E С

ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫМ РНК-СУПРЕССОРОМ ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Комисаренко А.Г., Михальская С.И., Сергеева Л.Е, Тищенко Е.Н.

Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Украина, 03022, г. Киев, ул. Васильковская, д. 31/17, e-mail: oltyko@gmail.com Перспективной методологией повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам является генетическая инженерия, одно из направлений которой связано с манипуляциями генами, контролирующими метаболизм L-пролина (Pro). В частности, представляет интерес ген катаболизма Pro – пролиндегидрогеназа (ProDH). Частичная супрессия этого гена может приводить к увеличению содержания пролина и повышению уровня стресс-устойчивости растений.

При разработке системы методов генетической трансформации подсолнечника внимание исследователей главным образом сконцентрировано на Agrobacteriumопосредованной трансформации как направлении молекулярной биотехнологии, при котором наиболее часто наблюдается стабильная экспрессия трансгенов.

Анализ результатов генетической трансформации ряда видов однодольных и двудольных растений показал, что трудоёмкие и экономически затратные процедуры культивирования in vitro можно заменять, применяя метод Agrobacterium-опосредованной трансформации растений in planta. Особую актуальность это направление имеет для подсолнечника в связи с проблемами, связанными с преждевременным цветением и укоренением побегов in vitro.

При разработке способа Agrobacterium-опосредованной трансформации подсолнечника in planta использовали инбредные линии подсолнечника 96А/3, 16А/3 (селекции Одесского селекционно-генетического Института, УААН), VК-121 (селекции Института масличных культур НААН Украины). Agrobacterium-опосредованную трансформацию проводили штаммом LBA4404, содержащим бинарный вектор pBi2E с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, полученым на основе гена арабидопсиса ProDH1, а также селективный ген неомицинфосфотрансферазы (nptII) E.

coli. Векторная конструкция любезно предоставлена к.б.н. Кочетовым А.В. (Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск).

При оптимизации условий генетической трансформации анализировали эффективность использования различных сред инокуляции, способов нанесения суспензии агробактериальных клеток на рыльце пестика в период опыления и их концентраций. При этом корзинки изолировали до полного созревания семян.

Наличие Т-ДНК оценивали по первому экзону гена ProDH. Показана генотипическая зависимость частоты интеграции трансгена в геном подсолнечника.

Получено семенное поколение трансформированных Т0-растений (Т1 и Т2), которое по морфологическим показателям не отличалось от контроля. Около 80% растений Т2поколения содержали ген интереса.

Трансформанты Т1 испытывали в условиях моделированного водного стресса.

Растения отличались повышенным уровнем устойчивости, на фоне увеличения количества свободного пролина.

–  –  –

AGROBACTERIUM-MEDIATED TRANSFORMATION IN PLANTA OF

SUNFLOWER (HELIANTHUS ANNUUS L.) USING LBA4404 HARBORING pBi2E

WITH DOUBLE SEQUENCES RNA-SUPPRESSOR OF GENE PRODH.

Komisarenko A.G., Mykhalskaya S.I., Sergeeva L.E., Tishchenko E.N.

Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, e-mail: oltyko@gmail.com Genetic engineering is advanced method of the elevation of plant abiotic stress tolerance. One trend is related to procedures with genes connected with L-proline metabolism.

The gene of the L-proline catabolism (proline dehydrogenase, ProDH) is the object of particular interest. This gene part suppression ought to enhance plant proline level and stress tolerance.

Agrobacterium-mediated transformation of sunflower attracts attention due to the fact that demonstrated the maximum frequency of stable expression of transgenes.

The results of the genetic transformation of various monocotyledon and dicotyledons exhibited expensive and complicated components of in vitro cultivation. The premature flowering and rhizogenesis problems of sunflower are the key difficulties of sunflower in vitro culture. In planta sunflower Agrobacterium-mediated transformation challenges these obstacles.

Inbred lines of sunflower 96A/3, 16A/3 (Odessa Institute of Selection and Genetics NAAS) and VK -121 (Institute of Oil Cultures NAAS) were used for Agrobacterium-mediated transformation. The transformation procedure was created by LBA4404 harboring pBi2E with double sequences RNA-suppressor of gene ProDH and gene npt II E.coli. Vector construction kindly was given by Kochetov A.V. (Institute of Cytology and Genetics RAS, Novosibirsk).

The improvement of transformation conditions were estimated via: effectiveness of various inoculation media; concentration of cell suspension, alterations of agrobacterial cell suspension inoculation into pistil stigma during fertilization. The heads were isolated before seed ripening.

The integration of T-DNA were detected using the first exone of arabidopsis ProDH gene. The genotype-dependent frequency of genetic transformed T0-plants were obtained. T1 and T2 plants contained the transgene.

T1- plants were tested under simulating water stress (lethal dose of mannitol). These plants had the higher level of stress resistance which combined with elevation of free proline content.

Секция 4

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАКОПЛЕНИЕ Na+ И K+

ТРАНСГЕННЫМИ РАСТЕНИЯМИ КАРТОФЕЛЯ, НЕСУЩИМИ ГЕН HVNHX2,

НА ФОНЕ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ NACL

Кривошеева А.Б.1, Юрьева Н.О.1, Беляев Д.В.1,2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 35;

тел.: (495) 2318334, факс: (495) 9778018, e-mail: Positive.Melody@mail.ru (Кривошеевой А.Б.) Московский физико-технический институт (государственный университет) Исследование засоления почв приобретает все большее значение в сельском хозяйстве, поскольку засоление негативно влияет на рост и развитие сельскохозяйственных культур, приводя к потере урожая. Устойчивость растений к засолению зависит главным образом от способности регулировать ионный транспорт через мембрану для поддержания оптимального ионного состава в цитозоле и внутриклеточных компартментах, а также для поддержания водного потенциала клеток растений при солевом стрессе.

В настоящей работе изучали влияние экспрессии гена HvNHX2 вакуолярного Na+, K+/H+ антипортера ячменя в трансгенных растениях картофеля на их устойчивость к засолению.

Пять независимых трансгенных линий культивировали в колбах (300мл) со средой, содержащей 150 мМ NaCl в течение трех недель, затем определяли сырую и сухую массу листьев, стеблей и корней, а также содержание K+ и Na+ в этих органах.

Анализ экспериментальных данных показал, что сырая масса листьев и стеблей трансгенных линий не изменились под действием 150 мМ NaCl, в то же время повышенное содержание NaCl существенно снизило эти параметры у контрольных нетрансформированных растений. В случае присутствия в среде 150 мМ NaCl содержание K+ в побегах и корнях всех трансгенных линий существенно увеличилось по сравнению с нетрансформированными растениями, при этом наибольшее накопление K+ наблюдали в стеблях растений. У трех трансгенных линий, выращенных в присутствии соли, отмечали повышенный уровень Na+ по сравнению с контрольными растениями, у двух других линий наблюдался противоположный эффект. При росте на среде с 150 мМ NaCl все трансгенные линии были более обводнены.

Это исследование показало, что устойчивость трансгенных растений к засолению не обязательно сопровождается повышенным содержанием Na+. В то же время во всех исследованных линиях, экспрессирующих HvNHX2, было выше накопление K+ по сравнению с нетрансформированными растениями.

Секция 4

GROWTH PARAMETERS AND ACCUMULATION OF Na+ AND K+ IN TRANSGENIC

POTATO PLANTS EXPRESSING THE HVNHX2 GENE UNDER SALT STRESS

Krivosheyeva A. B.1, Yur’eva N. O. 1, Belyaev D. V. 1,2 Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, 127276, Moscow, Botanicheskaya str., 35, e-mail: Positive.Melody@mail.ru (Krivosheyeva A. B.) Moscow Institute of Physics and Technology, 141700, Dolgoprudny Studies on soil salinity are gaining importance in agriculture because salinity has negative effects on growth and development of crops resulting in yield loss. Salinity tolerance of plants depends primarily on the regulation of ions transport across cellular membranes for maintenance of optimal ion composition of cytosol and intracellular compartments, as well as for maintenance of the water potential of plant cells under salt stress.

In the present work salinity tolerance of transgenic potato plants expressing HvNHX2, a vacuolar Na+, K+/H+ antiporter gene from barley, was studied. Five independent transgenic lines were cultured for 3 weeks in flasks (300 ml) with medium containing 150 mM NaCl. The plantlet leaves’, stems’ and roots’ fresh and dry weights and the tissue contents of K + and Na+ were determined.

The plantlet leaves’ and stems’ fresh weights of the transgenic lines were not affected by 150 mM NaCl, while the salt stress significantly reduced these parameters of control wild type plants. When the medium contained 150 mM NaCl, the K+ content of stems and roots of all transgenic lines increased significantly in comparison with control plants and was highest in plantlet stems. Three transgenic lines grown in the presence of salt accumulated elevated levels of Na+ in shoots as compared with control plants, but two lines demonstrated the opposite effect. When grown on medium containing 150 mM NaCl the transgenic lines had higher water content.

This study demonstrated that salt tolerance of transgenic plants was not necessarily accompanied by the increase of their Na+ content, but the plants K+ content was higher than in wildtype plants.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, 450054, Уфа, проспект Октября, д. 71, факс: (347) 2356100, тел. (347) 2356088, e-mail: kuluev@bk.ru.

Получение трансгенных древесных растений с увеличенным размером ствола является одной из актуальных направлений современной лесной биотехнологии. Однако перечень известных генов, которые могут быть применены для этих целей, пока весьма скуден. В связи с этим существует необходимость в поиске новых генов, участвующих в регуляции роста деревьев и получении на их основе трансгенных растений с повышенным или пониженным уровнем экспрессии целевого гена. Из древесных растений одним из первых геном полностью был секвенирован у тополя Populus trichocarpa, что позволяет изучать функции любых его генов путем получения трансгенных растений. В то же время из представителей рода Populus наиболее легко поддающейся агробактериальной трансформации и наименее требовательной к составу регенерационной среды является осина (Populus tremula L.). Исходя из этого, с целью получения трансгенных древесных растений с увеличенными размерами органов, нами на среде WPM (woody plant medium) из весенних побегов была получена культура in vitro осины. Из генома тополя черного (Populus nigra L.) были выделены гены, кодирующие транскрипционные факторы подкласса АР2 (PnANTL1 и PnANTL2) и экспансины (PnEXPA1 и PnEXPA3). Кроме того, из генома тополя черного нами был впервые выделен гомолог гена ARGOS, которому было дано название PnARGOS-like (JQ955606). Целевые гены были амплифицированы при помощи полимераз с редактирующей активностью и клонированы в бинарном векторе pCambia 1301 под контролем 35S промотора. Полученные генно-инженерные конструкции были внедрены в электрокомпетентные клетки Agrobacterium rhizogenes штаммов 15834 и А4. Культуры in vitro осины выращивали на среде WPM с 2% гельритом без добавления фитогормонов. Для проведения агробактериальной трансформации части стеблей осины с удаленными листьями с одной почкой предварительно культивировали двое суток на среде для каллусообразования (среда МS с МЕS и агаром, с добавлением 2 мг/л НУК и 1 мг/л 2-изопентиладенина). Для первого опыта была использована конструкция гена экспансина AtEXPA10 A. thaliana с 35S промотором.

Культуру A. rhizogenes штамма 15834 центрифугировали и ресуспендировали в 3 мл среды MinA, добавляли раствор ацетосирингона до концентрации 50 мкМ и ставили на орбитальный шейкер качаться при 28°С на 1 час. Затем смешивали подготовленные экспланты с агробактериями и добавляли заранее подготовленную суспензию карбида кремния (до 1%). Полученную смесь встряхивали на вортексе и проводили дальнейшую инокуляцию в течение 30-ти минут на чашке со средой MinA. Затем подсушивали экспланты на фильтровальной бумаге и ставили их на совместное культивирование с агробактериями на среде для каллуссобразования. После трех суток экспланты переносили на среду МS с 3% сахарозой, агаром с добавлением 250 мг/л цефотаксима и 250 мг/л карбенициллина и культивировали их в темноте при 25°С в течение 1.5 месяцев. Полученные в ходе эксперимента бородатые корни осины проверяли на наличие экспрессии репортерного гена GUS. Окрашивающиеся в синий цвет корни отбирали и пересаживали на новую среду МS и культивировали их в климатической камеры Binder (Германия) при 25°С. Через 2.5 месяца на культуре бородатых корней спонтанно начали появляться побеги. Гистохимический анализ показал наличие экспрессии в этих побегах репортерного гена GUS. Таким образом, нами при помощи A. rhizogenes были получены трансгенные растения осины, экспрессирующие ген AtEXPA10 A. thaliana. Были также получены бородатые корни осины, сверхэкспрессирующие ген PnARGOS-like Populus nigra L.

–  –  –

Institute of biochemistry and genetics of Ufa scientific centre of RAS, 450054, Ufa, prospekt Oktyabrya, 71, fax (347)2356100, tel. (347)2356088, e-mail: kuluev@bk.ru Creation of transgenic woody plants with the increased size of the trunk is one of the important directions of modern forest biotechnology. But the number of known genes that may be used for these purposes are still very poor. In this regard, there is a need to find new genes involved in the regulation of the growth of trees and their delivery through transgenic plants with an increased or reduced level of expression of the target gene. Of woody plants one of the first genome was completely sequenced in poplar Populus trichocarpa, which allows us to study the function of any of its genes by producing transgenic plants. At the same time, from the genus Populus most easily amenable to Agrobacterium-mediated transformation and the least demanding to the composition of the regeneration medium is aspen (Populus tremula L.).

Therefore, in order to obtain transgenic plants with increased wood size of organs we on WPM from spring shoots was obtained culture in vitro of aspen. From the genome of black poplar (Populus nigra L.) have been isolated genes encoding transcription factors AP2 subfamily (PnANTL1 and PnANTL2) and expansins (PnEXPA1 and PnEXPA3). In addition, the genome of the black poplar we was first isolate homolog of the gene ARGOS, which was given the name PnARGOS-like (JQ955606). Target genes were amplified using the polymerase with proofreading activity and cloned into the binary vector pCambia 1301 under the control of 35S promoter. The obtained genetic engineering constructs were introduced into electrocompetent cells of Agrobacterium rhizogenes of strains A4 and 15834. in vitro cultures of aspen were grown on WPM with 2% gelrite without the addition of phytohormones. For Agrobacteriummediated transformation of aspen a portion of the stems with removed leaves with one kidney pre-cultured for two days on the medium for callusogenesis (МS medium with МЕS, agar, 2 mg/l NAA and 1 mg/l 2iP). For the first experiment was used construction of gene AtEXPA10 of A. thaliana with the 35S promoter. The culture of A. rhizogenes strain 15834 was centrifuged and resuspended in 3 ml of MinA, acetosyringone was added to a solution concentration of 50 mM and placed on an orbital shaker to swing at 28°C for 1 hour. Then mixed explants with Agrobacterium and added to the prepared suspension of silicon carbide (up to 1%). The resulting mixture was vortexed and were further inoculated within 30 minutes on the cup with a medium MinA. Explants were then dried on a filter paper and placed them in the co-cultivation with Agrobacterium in a medium for callusogenesis. After three days the explants are transferred to MS medium with 3% sucrose and agar supplemented with 250 mg/l cefotaxime and 250 mg/l carbenicillin and cultured in the dark at 25°C for 1.5 months. Obtained in the experiment hairy aspen roots examined for expression of the reporter gene GUS. Stained blue were picked and the roots were transplanted to a new MS medium and cultured in a climatic chamber Binder (Germany) at 25°C. After 2.5 months on the culture of hairy roots began to emerge spontaneously shoots. Histochemical analysis revealed expression in these shoots of reporter gene GUS. Thus, using the A. rhizogenes we were obtained transgenic aspens, expressing gene AtEXPA10 of A. thaliana. Were also obtained hairy roots of aspen overexpressing the gene PnARGOS-like of Populus nigra L.

Секция 4

РОСТ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ И БЕРЕЗЫ

С МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТАБОЛИЗМОМ АЗОТА

Лебедев В.Г.1, Салмова М.А.1, Розова Х.А.2, Ларионова А.А.3, Шестибратов К.А.1 Филиал Федерального государственного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, д. 6, тел. / факс (4967) 33-09-66, e-mail: vglebedev@mail.ru Филиал МГУ им. М.В. Ломоносова в г. Пущино, 142292, Московская обл., г. Пущино, мкрн «В», д. 20А, тел. (4967) 73-36-01, факс (4967) 73-04-52 Федеральное государственное учреждение науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, тел. (4967) 31-81-55, факс (4967) 33-05-95 Азот является одним из основных элементов минерального питания растений.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |

Похожие работы:

«АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях 03.02.03.микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Маянский Нико...»

«1.2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Новрузов В. С., Исаева Ф. М. Novruzov V. S., Isaeva F. M. Лишайники — биоиндикаторы атмосферного за Lichens are biological indicators of atmospheric po гря...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 26 (65). 2013. № 4. С. 110-120. УДК 616.12:616.76 ИЗМЕНЕНИЕ МОЗГОВОЙ ГЕМОДИНАМИКИ ПРИ ПАРАВЕРТЕБРАЛЬНОЙ МИОРЕЛАКСАЦИИ У СПОРТСМЕНОВ Маметова О.Б., Савина К.Д. Таврический национальный университет имени В.И. Вернадского, Симферопо...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Международный государственный экологический университет имени А. Д. Сахарова" А. С. Шиляев С. П. Кундас А. С. Стукин ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ УЛЬТРАЗВУКА В МЕДИЦИНЕ И ЭКОЛОГИИ Учебно-методическое пособие Рекомендовано к изданию УМО высших учебных заведений Республики Беларус...»

«Федеральная целевая программа Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки на 1997-2000 годы· экология Под редакцией докт. техн. наук, проф. Г В. Тягунова, докт...»

«ЗАРУБЕЖНЫЙ ОПЫТ УДК 349.6 ББК 67.407 С.Н. ОВЧИННИКОВ Таможенно-правовые средства охраны природы: опыт АСЕАН Рассматриваются экологические аспекты таможенного регулирования в странах АСЕАН: защита ви...»

«Обзор прессы 03.07.2009 Печатные и электронные СМИ Спецпроекты СФ расширил возможности инвестирования пенсионных накоплений 13:01 07/07/2009 МОСКВА, 7 июл РИА Новости. Совет Федерации одобрил во вторник закон, расширяющий возможности инвестирования средств пенсионных накоплений застрахова...»

«Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Кольцово – 2008 Работа выполнена в Федеральном г...»

«Правила оформления статей для публикации в журнале"Владикавказский медико-биологический вестник" К публикации в журнале "ВМБВ" принимаются оригинальные статьи на русском или английском языках, научные обзоры, отчеты (хронику) по к...»

«Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский ИЗБРАННЫЕ ТРУДЫ ИЗ ИСТОРИИ МЕДИЦИНСКОЙ мысли Н. В. Тимофеев-Ресовский Избранные трудь1 Генетика. Эволюция. Биосфера Москва ссМедицина)) 1996 ББК 53.6 28.04 Т41 УДК 612.052.014.482+577.2 Портрет Н.В. Тимофеева-Ресовскоrо работы ху...»

«1 ХИМИЯ. БИОЛОГИЯ. МЕДИЦИНА 1. Актуальные проблемы сохранения биоразнообразия растительного и животЕ0 ного мира Северной Фенноскандии и сопредельных территорий : док. Междунар. А437 конф., Апатиты, 26-28 нояб. 2002...»

«03.06.01 Физика и астрономия Направления № Научное направление Коды по ГРНТИ научноисследовательс 29.35; 29.37; 29.19; Физика кой 29.33; 29.19 деятельности Университет, позиционируя себя на российском и Стратегия научномеждународном научно-образовател...»

«Серия Wind Top AE2282 All-in-One (AIO) PC Модель MS-AC7B/ AC7C Введение Содержание Авторские Права iii Товарные Знаки iii Журнал Изменений iii Модернизация и Гарантия iv Приобретение Сменных Деталей iv Техническая Поддержка iv Особенности продукцииiv Экологическая политика v Информация о Химических веществах v Информация о Батаре...»

«1 Содержание Б.1.Б.1 Иностранный язык..3 Б.1.Б.2 Философия..4 Б1.Б.3 История..5 Б.1.Б.4 Экономическая теория..6 Б.1.Б.5 Менеджмент Б.1.Б.6 Маркетинг..7 Б.1.Б.7Математика.. 8 Б.1.Б.8Информатика..9 Б.1.Б.9Химия..10 Б.1.Б.10Физика..11 Б.1.Б.11 Ботаника..12 Б.1.Б.12 Физиология и биохимия растений....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учрежден...»

«РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ НА ЮГЕ АРЕАЛА В ПОВОЛЖЬЕ Г.В. Епланова Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти eplanova_ievb@mail.ru Живородящая ящерица Zootoca vivipara (Lichtenstein, 1823) – вид с обширным транспалеарктическим ареалом. Она распространена в северной половине Евраз...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт биологии Кафедра зоологии и эволюционной экологии животных Сорокина Н.В. Териология Учебно-методический комплекс. Рабочая программа для студ...»

«Малхасян Артем Витальевич АГРАРНО-ПРАВОВЫЕ ПРОБЛЕМЫ В СФЕРЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ 12.00.06 – Земельное право; природоресурсное право; экологическое право; аграрное право Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель доктор юридических...»

«Бакшеева Юлия Витальевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫХ СВОЙСТВ СИГНАЛОВ В УЛЬТРАЗВУКОВЫХ СИСТЕМАХ ДИАГНОСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Специальность: 05.13.01 "Системный анализ, управление и обработка информации (...»

«Экологическое общество "Зеленое спасение" Республика Казахстан, Алматы, 2008 К Третьему совещанию сторон Орхусской конвенции For the Third Meeting of the Parties to the Aarhus Convention The Ecological Society Green Salvation The Republic of Kazakhstan, Almaty, 2008 ББК 20.1 К 11 Электронные версии публикаций Экологического общества "Зеленое с...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Балашовский институт (филиал) Кафедра биологии и экологии ФИТОИНДИКАЦИЯ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ НА ПРИМЕТЕ Р...»

«Проект Программа работы Фестиваля технологий, экопродукции и услуг для гармоничной жизни "ЭкоСезон-2017" 18 – 20 августа 2017 года с 10-00 до 20-00 г. Омск, выставочный парк на Королева, 20 18 августа 2017 года (пятница) Работа молодежного экологического форума "Экофест "Пикник" 10.00-20.00 Организатор – Министерство по делам...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.