WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

«The X International Conference “Plant Cell Biology In Vitro and Biotechnology” ABSTRACTS Kazan, October 14-18, 2013 УДК [581.17+663.1](063) The X International ...»

-- [ Страница 6 ] --

Доступность его неорганических форм часто является лимитирующим фактором их роста и развития, особенно на бедных лесных почвах. Изучение метаболизма азота в древесных растениях имеет большое значение как для фундаментальной науки, так и для практического применения. С целью повышения продуктивности лесных пород мы клонировали цитозольную форму гена глутамин синтетазы GS1 из сосны обыкновенной и путем агробактериальной трансформации перенесли его в растения осины (Populus tremula L.) и березы (Betula pubescens Ehrh.). Полученные трансгенные растения были высажены в сосуды с природной почвой и оценивались в течение трех лет в условиях теплицы (2009-2010) и открытой площадки (2011). У осины с геном GS1 наблюдалось увеличение высоты растений до 23%, а объема древесины – до 41% относительно контроля. Среди растений березы было идентифицировано две линии с ослабленным (на 25-31%) и одна линия с усиленным (на 41%) ростом. Объем древесины этих линий был на 26-49% ниже или на 74% выше по сравнению с контролем. Содержание общего азота во флоэме растений осины коррелировало с их высотой. Измерение клеток ксилемы выявило значительное утолщение (до 2,5 раз) клеточной стенки у трансгенных растений осины, но не у березы. Анализ листьев с помощью программы LAMINA не показал существенных различий между трансгенными растениями и контролем по таким параметрам, как площадь листьев, их длина, ширина, горизонтальная или вертикальная симметрия. Для определения возможного влияния трансгенных растений на почвенную экосистему в конце каждого вегетационного сезона мы оценивали активность почвенных ферментов.

Была проанализирована активность ряда ферментов, включенных в циклы углерода, азота, фосфора и серы – дегидрогеназы, нитратредуктазы, щелочной и кислой фосфатаз, арилсульфатазы и др. Различия между трансгенными растениями и контролем были несущественными, за исключением нескольких линий, однако обнаруженные отклонения не воспроизводились в последующие годы. Возможность воздействия растительных остатков на экосистему мы определяли через скорость разложения различных тканей (листьев, стеблей, корней) трансгенных растений. Анализы проводили путем определения эмиссии СО2 и потери массы в условиях различных температур (22, 12 или 2°С) и влажности (80, 50 или 20%). Было обнаружено, что растения с ускоренным ростом отличались и повышенной скоростью разложения древесины.

Секция 4

GROWTH AND BIOSAFETY OF ASPEN AND BIRCH TRANSGENIC PLANTS WITH

MODIFIED NITROGEN METABOLISM

Lebedev V.G.1, Salmova М.А.1, Rosova C.А.2, Larionova А.А.3, Schestibratov К.А.1 Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, 142290,

Moscow Region, Pushchino, Science avenue, 6, tel. / fax +7(4967) 33-09-66, e-mail:

vglebedev@mail.ru Pushchino Lomonosov Moscow State University campus, 142292, Moscow Region, Pushchino, 20A, tel. +7(4967) 73-36-01, fax +7(4967) 73-04-52 Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science RAS, 142290, Moscow Region, Pushchino, tel.+7(4967) 31-81-55, fax +7(4967) 33-05-95 Nitrogen is one of the most essential nutrients for plants. Availability of inorganic nitrogen is often a significant factor limiting plant growth and development especially in poor forest soils. The study of nitrogen metabolism in woody plants is particular significance both for the understanding of fundamental tree biology and for practical applications. To improve productivity of forest trees we cloned the gene of cytosol glutamine synthetase from Scots pine and transferred it into aspen (Populus tremula) and birch (Betula pubescens) plants by agrobacterial transformation. Three-year trial was performed for evaluation of transgenic plants.





Six lines (nontransgenic control and five lines with GS gene) were grown in pots with natural soil under greenhouse (2009-2010) and open air (2011) conditions. Transgenic aspen plants were similar to each other. Its height varied from 91 to 123% and volume of wood varied from 114 to 141% to control plants. Two lines with decreased growth and one line with highly enhanced growth were identified within birch plants. Compared with the control plants, the height were reduced by 25-31% (2b and 2c lines) or increased by 41% (8b line), respectively.

The wood volumes of these lines were 26-49% smaller or 74% greater than control plants. Total nitrogen content in phloem of aspen lines was correlated with its height. To evaluate the impact of glutamine synthetase activity on xylem cell expansion the lengths, diameters and wall thickness of fibers were measured. Fiber parameters were not significantly affected by overexpression of GS1 gene in birch plants. In contrast, fibers of aspen were significantly wider (up to 3.1-fold) in the transgenic lines than in the wild-type controls. Cell wall of fibers was also thicker up to 2.5-fold. Analysis of aspen and birch leaves by LAMINA program showed no differences between plants of leaf-shape parameters such as leaf area, perimeter, length, width, horizontal and vertical symmetry. Enzyme activities in soil for evaluation the potential risk of transgenic trees were analyzed annually at the end of the growing season. Results of analysis did not differ significantly between transgenic and control plants. The possible effect of plant residues on the ecosystem was studied through the decomposition rate of different tissues (leaves, stems, roots) of transgenic plants. The emission of CO2 and the weight loss under different temperature (22, 12, or 2 °C) and humidity (80, 50 or 20%) conditions were analyzed.

We observed correlation between the accelerated growth and increased decomposition of wood.

Секция 4

ТРАНСФОРМАЦИЯ DIGITALIS PURPUREA L. РАЗНЫМИ ШТАММАМИ

AGROBACTERIUM RHIZOGENES ВЫЗЫВАЕТ РАЗЛИЧНЫЕ

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ

Лёшина Л.Г.1, Булко О.В.1, Егоров О.А.2 Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, 02160, г. Киев,

Харьковское шоссе, д. 50, факс: (044) 559-98-00, тел. (044) 559-05-95, e-mail:

llioshina@ukr.net

Химическая компания «СПОЛУКА», Украина, Киев, ул. Мурманская, д. 5, e-mail:

Oleg.Iegorov@gmail.com Нами проведено сравнительное изучение изменений морфологических и биохимических показателей наперстянки пурпурной в результате трансформации двумя штаммами почвенной агробактерии Agrobacterium rhizogenes.

Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea L.) – декоративное и лекарственное растение из семейства Норичниковые (Scrophulariaceae), содержащее множественные гликозиды сердечной группы, ряд стероидных сапонинов, флавоноиды и др.

Многочисленные галеновые препараты, получаемые из листьев наперстянки, являются классическими лекарственными средствами, применяемыми при нарушении деятельности сердца.

Растение было введено нами в культуру in vitro, инициирована каллусная культура и культуры трансгенных корней, полученных в результате трансформации листовых эксплантов двумя штаммами A.rhizogenes - R-1601 и 15834 (любезно предоставленных нам Кузовкиной И.Н., ИФР им. К.А.Тимирязева РАН, Россия).

Частота трансформации штаммом R-1601 составила 85-100%, а штаммом 15834 - от 35 до 45%. Трансгенные корни имели различную морфологию при выращивании как на твердой, так и в жидкой средах. Они отличались по цвету, длине, толщине корешков и количеству корневых волосков.

Трансформация наперстянки штаммом R-1601 инициировала появление светлокоричневых корешков с большим количеством корневых волосков. Штамм 15834 давал образование более тонких, длинных, светло-желтых корней.

При дальнейшем культивировании на безгормональной среде наблюдалось светозависимое спонтанное побегообразование. 60% корней образовывали побеги в результате прямой регенерации. Остальная часть дедифференцировались в желто-коричневый рыхлый каллус, из клеток которого при дальнейшем пассировании на свету также образовывались побеги. Ростки, перенесенные на среду для корнеобразования (МС +0,1 мг/л НУК ) через 30-45 дней развивались в полноценные растения.

Полученные растения-регенеранты отличались от интактных и имели ряд признаков, характерных для Ri-трансформантов, а именно активный рост латеральных корней, сужение листовой пластины, множественное первичное побегообразование. Регенеранты, трансформированные разными штаммами агробактерии (штамм R1601 - регенерант Р1; штаммом 15834 - регенерант Р2), отличались по коэффициенту размножения, который у Р1 составлял 1:1, а у Р2 – 1:3. Интересным фактом, требующим дальнейшего изучения, стало образование на корнях трансформанта Р1 утолщений, расположенных с некоторым интервалом по всей длине корня. Под микроскопом эти образования представляли собой сильно разросшиеся клетки эпиблемы.

Методом ВЭЖХ-МС был проведен количественный анализ спектра биологически активных соединений, содержащихся в кислотных экстрактах культур клеток и растений наперстянки. Результаты показали, что по сравнению с контролем (нетрансформированные растения), количество веществ в котором взято за 100%, в клеточных культурах синтез вторичных метаболитов был меньше на 80-90%. У растений-регенерантов этот показатель зависел от трансформирующего штамма. У Р1-растений он превысил контрольные на 81%, а у Р2 – на 56%.

Производство веществ в различных линиях одного и того же трансформанта практически не отличалось.

Секция 4

TRANSFORMATION OF DIGITALIS PURPUREA L. USING DIFFERENT STRAINS

OF AGROBACTERIUM RHIZOGENES CAUSES VARIOUS PHENOTYPIC AND

BIOCHEMICAL MANIFESTATIONS

Lioshina1 L.G., Bulko1 O.V., Iegorov2 O.A.

Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry NAS of Ukraine, Ukraine, Kiev, Kharkovskoe sh., 50, fax: (044) 559-98-00, tel. (044) 559-05-95, e-mail: llioshina@ukr.net Chemical company “SPOLUKA", Ukraine, Kiev, Murmanskaja str., 5, е-mail: Oleg.Iegorov@gmail.com We conducted a comparative study of changes in the morphological and biochemical parameters of Digitalis purpurea as a result of transformation using two strains of soil Agrobacterium rhizogenes.

Purple foxglove (Digitalis purpurea L., (Scrophulariaceae)) is an ornamental and medicinal plant, which contains multiple glycosides of cardiac group, a number of steroidal saponins, flavonoids, etc. Numerous herbal drugs derived from leaves of D. purpurea are commonly used for patients with cardiac performance abnormalities.

The plant was introduced to the culture in vitro, there were initiated callus culture and hairy roots resulting from transformation of leaf explants using two strains of A.rhizogenes: Rand 15834 (kindly provided by Kuzovkina I.N., Timiryazev Institute of Plant Physiology of RAS).

Frequency of transformation using strain R-1601 was 85-100%, while using strain 15834 - 35-45%. Transgenic roots had different morphologies when grown in either solid or liquid media. They differed in color, length, thickness and number of root hairs. The transformation of D. purpurea using strain R-1601 initiated the appearance of a light-brown roots with big amount of root hairs. Strain 15834 initiated formation of more subtle, long, pale yellow roots.

During further cultivation in the media without hormones it was observed lightdependent spontaneous shoot formation. 60% of the roots formed shoots as a result of direct regeneration. The rest was dedifferentiated into yellow-brown friable callus, and its’ cells after further passaging in the light also formed shoots. The shoots which were transferred to rooting medium (MS +0.1 mg / l NAA) for 30-45 days germinated into full-grown plants.

The resulting regenerated plants were different from the intact ones and had a number of features specific to Ri-transformants, which were the rapid growth of lateral roots, narrowing of the leaf blade, multiple primary shoot formation. Regenerants which were transformed with different agrobacterium strains (strain R1601 - regenerant P1, strain 15834 - regenerant P2) differed in the rate of reproduction, which was 1:1 for P1 and 1:3 for P2. An interesting fact for further study was the formation condense roots of transformant P1 which were located with certain interval along the entire length of the root. In microscope these structures were overgrown cells of epiblema.

Using HPLC-MS a quantitative analysis of a range of biologically active compounds in acidic extracts of plant and cell cultures of D. purpurea was performed. It was shown that compared to control sample (untransformed plant) in which content of investigated compounds was taken as 100% in the cell cultures the synthesis of secondary metabolites was reduced by 80-90%. For the regenerated plants this parameter depended on transforming strain. For P1 it exceeded control by 81%, and for P2 - by 56%. Production of compounds in different lines of the same transformant did not differ.

Секция 4

TISSUE CULTURE TECHNIQUES FOR SUCCESSFUL GENETIC

TRANSFORMATION OF COMMON WHEAT

Miroshnichenko D.N.,1,2 Dolgov S.V.1,2 Botron, Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 142290, Moscow Region, Pushchino, Science Av., 6, tel: (84967) 73-13email: miroshnichenko@fibkh.serpukhov.su All-Russian Agricultural Biotechnology Research Institute, 127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42, Tel: (8499) 976-90-05 Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the world’s most important cereal crops. Since the mid 1990s, genetic engineering of cereals has provided a novel field of opportunities for faster and more directed modification or introduction of agronomically useful traits. For wheat, the prerequisite for genetic manipulation is the establishment of a routine and simple plant regeneration system through tissue culture. Historically, monocots have proven to be less responsive to in vitro regeneration techniques than dicots. Cereal crops are hardly able to regenerate plants from leaf tissue and only immature tissues of a limited age range can be induced to regenerate efficiently. Last decade our research is being directed toward the speeding up the process of identification of transgenic tissue and the reducing the time and the amount of work involved in the production of primary transgenic lines. Various tissue culture factors that influence the DNA delivery and in vitro regeneration of wheat plants have been investigated.

Based on empirical studies through manipulation of culture medium components, such as growth regulators and carbohydrates, the successful biolistic transformation of common wheat is reported. The combined effects of explant type, the stage of embryogenic callus development and the osmotic pre-treatment were studied. Here we review in vitro dual selection system based on the combination of gfp as vital reporter gene and bar gene for transgene recovery and provide a complete protocol that was used to produce over hundred transgenic plants in Russian spring wheat varieties.

–  –  –

СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ МОРКОВИ (DAUCUS CAROTA L.)

ПРОДУЦЕНТОВ ИММУНОГЕННЫХ БЕЛКОВ M. TUBERCULOSIS

Пермякова Н. В., Уварова Е.А., Дейнеко Е.В.

Институт Цитологии и Генетики СО РАН, 630090, г. Новосибирск, Россия, пр. академика Лаврентьева, д. 10, e-mail: puh@bionet.nsc.ru; uvarova@bionet.nsc.ru Создание новых вакцин против туберкулеза является одним из актуальнейших направлений современной биотехнологии и медицины.

В качестве основных антигенов для кандидатной вакцины нами выбраны два секреторных белка M. Tuberculosis CFP10 ESAT6. Данные белки являются ключевыми факторами вирулентности M. Tuberculosis, они индуцируют сильный Т-клеточный иммунный ответ, и вероятно, вовлечены в лизис мембраны клетки хозяина или лизис самой клетки хозяина. В то же время район RD1 генома M.tuberculosis, в котором закодированы эти белки, делетирован у M. bovis БЦЖ и при использовании вакцины БЦЖ иммунный ответ на эти антигены не образуется. Таким образом, эти белки, являются хорошими кандидатами на роль вакцинальных антигенов в бустерной вакцине против туберкулеза.

Последовательности генов cfp10 и esat6 и слитая последовательность esat6-cfp10dIFN были клонированы в экспрессирующем бактериальном векторе и затем в бинарной плазмиде Agrobacterium tumefaciens. Последовательность химерной конструкции esat6cfp10-dIFN состоит из двух отдельных генов esat6 и cfp10 и рекомбинантного -IFN человека в одной рамке трансляции, между которыми нет стоп-кодонов, но присутствует «шарнир» из трех аминокислотных остатков – «gly-ala-gly» для гибкой связи между доменами гибридного белка. С помощью агробактериального переноса эти три рекомбинантные последовательности были перенесены в растения Daucus carota L.

Наличие последовательностей целевых генов в геноме моркови было доказано при помощи ПЦР, продукция белка в корнеплодах показана методами Вестерн блот и Дот блот. Содержание слитого белка esat6-cfp10-dIFN в корнеплодах составило 0.056 % от ОРБ.

Иммуногенность рекомбинантных белков оценивали в опытах на мышах. При оральной иммунизации мышей корнеплодами, содержащими антиген rCFP10, впервые было показано, что у животных возникает, как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Также клеточный и гуморальный ответ были обнаружены при оральной иммунизации мышей морковью содержащей антиген rESAT6. Однако белки rESAT6 и rCFP10 в опытах с инъекционным и пероральным введением проявляли токсичность в отношении мононуклеаров перефирической крови. В тоже время рекомбинантный химерный белок rCFP10-ESAT6-dIFN также вызвал клеточный и гуморальный эффект, но было показано, что он не токсичен для организма. Кроме того, химерный белок, повидимому, менее токсичен и для растений, корнеплоды трансгенной моркови несущей химерный ген в среднем имеют большую массу и лучше хранятся, чем корнеплоды растений с индивидуальными генами esat-6 или cfp-10.

Полученный нами рекомбинантный химерный белок rCFP10-ESAT6-dIFN безусловно представляет интерес для дальнейших исследований и проведения доклинических испытаний терапевтической эффективности и безопасности иммунопрофилактического препарата.

Следующим этапом нашей работы являются дополнительные исследования по разработке и совершенствованию генетической конструкции для повышения уровня экспрессии химерного рекомбинантного белка в тканях трансгенных растений. Конечной целью данной работы является разработка новой безопасной и эффективной кандидатной вакцины от туберкулеза, которая могла бы заменить или дополнить вакцину БЦЖ для интактных или привитых штаммом БЦЖ детей, взрослых и животных.

Секция 4

PRODUCTION OF TRANSGENIC CARROT PLANTS (DAUCUS CAROTA L.)

PRODUCERS OF IMMUNOGENIC PROTEINS OF M. TUBERCULOSIS

Permyakova N.V., Uvarova E.A., Deineko E.V.

Institute of Cytology and Genetics SB RAS, 630090, Novosibirsk, Ak. avrentiev av., 10, e-mail: puh@bionet.nsc.ru; uvarova@bionet.nsc.ru The production of new vaccines against tuberculosis is one of the most pressing issues of modern biotechnology and medicine.

The main antigens for candidate vaccine that we chose were two secretory proteins of M. tuberculosis - CFP10 and ESAT6. These proteins are key virulence of M. tuberculosis they induce strong T-cell immune response, and are probably involved in the lysis of the host cell membrane and the cell lysis of the host. At the same time, region RD1 of the M. tuberculosis genome, which encode these proteins is absent in the attenuated M. bovis BCG and the use of BCG vaccine does not form immune response to these antigens. Thus, these proteins are good candidates for the role of vaccine antigens in a booster vaccine against tuberculosis.

Gene sequences of cfp10, esat6 and fusion gene esat6-cfp10-dIFN, were cloned in the bacterial expression vector, and then in the binary plasmid of Agrobacterium tumefaciens. The sequence of chimeric construct esat6-cfp10-dIFN consists of two separate genes esat6 and cfp10 and recombinant human -IFN in the same frame of translation, between genes there is no stop codons, but there is a "hinge" of three amino acids - «gly-ala-gly» for flexible connection between the domains of fusion protein. Stable transgenic carrot (Daucus carota L.) plants were generated using agrobacterial transformation. The presence of sequences of the target genes in the carrot genome was proved by PCR reaction, protein expression in the roots is shown by Western blot and Dot blot analysis. The content of the fusion protein esat6-cfp10-dIFN in the roots was 0.056% of the TSP.

Immunogenicity of recombinant proteins was evaluated in tests on mice. It was shown for the first time that oral immunization of mice with carrots, containing rCFP10 antigen, induces in animals, both cellular and humoral immune response. Cellular and humoral immune responses were also detected in oral immunization of mice with carrots containing antigen rESAT6. However, in experiments with injection and oral administration proteins rESAT6 and rCFP10 showed toxicity to peripheric blood mononuclear cells. At the same time, a recombinant fusion protein rCFP10-ESAT6-dIFN also induces cell-mediated and humoral immunity, but it is not toxic to the organism. In addition, the fusion protein appears to be less toxic for plants, transgenic carrot roots carrying chimeric gene on the average have larger mass and are stored better than the roots of plants with individual genes esat-6 and cfp-10.

Obtained recombinant fusion protein rCFP10-ESAT6-dIFN obviously is of interest for further research and preclinical testing of therapeutic efficacy and safety of immunoprophylactic drug. The next step of our work is further research on the development and improvement of the genetic construction to increase expression level of a chimeric recombinant protein in the transgenic plants tissues. The long-term goal of this work is to provide a flexible, tuberculosis vaccine that is safe and effective for naive or BCG immunized children, adults and animals.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, 450054, г. Уфа, пр.

Октября, д. 71, тел. (347) 235-60-88, факс: (347) 235-61-00, e-mail: postrigan@bk.ru Белки, участвующие в детоксикации тяжелых металлов обнаружены как у про-, так и у эукариот. У растений такими соединениями являются короткие, богатые цистеином пептиды – фитохелатины с общей структурой [-Glu(Cys)]n-Gly, где n = 2-11. Звенья -Glu-Cys связывают ТМ, образуя с ними комплексы. Фитохелатины синтезируются не напрямую через мРНК, а в ходе ферментативных реакций. Псевдофитохелатины со структурой Мet[(Glu(Cys)]nGly, кодируемые синтетическими “псевдофитохелатиновыми” генами, также способны к комплексообразованию с ТМ. Благодаря матричной природе их синтеза представляется перспективным использовать псевдофитохелатины для создания, как растений, так и бактерий, накапливающих ТМ и способных выживать при их высоких концентрациях. При введении в ризобии псевдофитохелатинового гена, в зависимости от локализации образующихся соединений «псевдофитохелатин-кадмий» на поверхности или внутри клетки, прикрепление трансформированных ризобий к корням растений, таким образом, могло увеличить поступление в них кадмия или, наоборот, уменьшить поглощение тяжелого металла выполняя при этом защитную функцию. Нами были получены бактерии, трансформированные генетической конструкцией, содержащей псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид, в составе которого 10 металл-связывающих звеньев [(Glu(Cys)] на основе вектора pTurboGFP-B.

Данной конструкцией методом электропорации трансформировали бактерии. R. leguminosarum

1078. ПЦР-анализ показал наличие псевдофитохелатинового гена в трансформированных бактериях. Затем в ходе эксперимента выращивали трансформированные и контрольные бактерии на среде, содержащей различные концентрации кадмия (0, 100, 200, 300, 400 мкМ/л).

Было показано, что ризобии, несущие псевдофитохелатиновый ген более устойчивы к высоким концентрациям данного тяжелого металла. Они были способны расти на среде с концентрацией кадмия до 400 мкм/л, в отличие от контрольных бактерий, которые практически переставали расти уже на концентрации 200 мкм/л. В ходе дальнейший исследований трансгенных ризобий с помощью атомно-силовой микроскопии нами было обнаружено, что при выращивании на высоких концентрациях кадмия, 300 мкМ, такие бактерии активно экскретируют на поверхность клеточной стенки достаточно крупные гранулы в больших количествах. В контрольных экспериментах без обработки кадмием трансгенных бактерий и при умеренной обработке нетрансгенных (в силу их слабой устойчивости к токсическому действию кадмия) образования таких гранул и чехлов не наблюдалось, поверхности клеточных стенок были чистыми. В связи с этим мы предположили что бактерии, экспрессирующие псевдофитохелатиновый ген образовавшиеся комплексы с кадмием выводят на поверхность клеточных стенок, тем самым защищая себя от токсического воздействия тяжелых металлов.

Это подтверждает и эксперимент по качественному определению кадмия в клеточном дебрисе, после мягкого лизиса трансгенных бактерий, обработанных кадмием. В целом полученные нами данные согласуются с ранее полученными результатами по устойчивости к воздействию тяжелых металлов, в частности кадмия, и накопительным свойствам трансгенных растений табака, экспрессирующих псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид, в составе которого 6 металл-связывающих звеньев [(Glu(Cys)].

–  –  –

Institute of biochemistry and genetics of Ufa science centre RAS, Department of Molecular Biology and Plant Physiology, 450054, Ufa, Prospekt Oktyabrya, 71, tel.: (347) 235-60-88, fax: (347) 235-61-00, e-mail: postrigan@bk.ru Proteins involved in detoxification of heavy metals found in both pro-and eukaryotes. In plants these compounds are short, cysteine-rich peptides - phytochelatins the general structure [-Glu (Cys)] n-Gly, where n = 2-11. Links -Glu-Cys TM linked to form complexes with them.

Phytochelatins synthesized indirectly via mRNA, but during the enzymatic reaction.

Pseudophytochelatins with the structure of Met [(Glu (Cys)] nGly, encoded by the synthetic "psevdofitohelatinovymi" genes are also able to form complexes with TM. Due to the nature of their matrix synthesis is promising to use psevdofitohelatiny to create, both plants and bacteria that accumulate heavy metals and capable survive when their concentrations is high. When the psevdofitohelatinovy gene is introduced in rhizobia depending on the location of the resulting compounds "psevdofitohelatin-cadmium" on the surface or inside the cells attach to the Rhizobium transformant plant roots, thus, may increase the flow in them cadmium, or vice versa, reduce the absorption of heavy metal while performing a protective function. The bacteria transformed with a genetic construct containing psevdofitohelatinovy gene encoding the peptide, which included 10 parts of metal-binding [(Glu (Cys)] based on the vector pTurboGFP-B, we have obtained. This design Bacteria transformed by electroporation. R. leguminosarum 1078.

The presence of psevdofitohelatinovy gene in transformed bacteria showed by PCR analysis.

Then during the experiment and control were grown transformed bacteria in a medium containing various concentrations of cadmium (0, 100, 200, 300, 400 uM) was shown that rhizobia carrying psevdofitohelatinovy gene are more resistant to high concentrations of heavy metal. They were able to grow on a medium at a concentration of cadmium to 400 uM, in contrast to the control bacteria, which are practically stopped growing at a concentration of 200 uM. During further research transgenic rhizobia using atomic force microscopy, we have found that when growing at higher concentrations of cadmium, 300 uM actively excrete such bacteria on the surface of the cell wall are large enough granules in large amounts. In control experiments, no treatment cadmium transgenic bacteria and moderate processing nontransgenic (due to their poor resistance to the toxic effects of cadmium) forming such granules were not observed and covers the surfaces of the cell walls were clean. Therefore we hypothesized that bacteria expressing the gene psevdofitohelatinovy formed complexes with cadmium output on the surface of the cell walls, thus protecting themselves from the toxic effects of heavy metals.

This experiment confirms the qualitative determination of cadmium in the cell pellet, after mild lysis of transgenic bacteria treated with cadmium. Overall, our findings are consistent with previous results on the resistance to Heavy metals, particularly cadmium and accumulating properties of transgenic tobacco plants expressing psevdofitohelatinovy gene encoding the peptide, which included six metal binding units [(Glu (Cys)].

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, д. 35, факс: (499) 977-80-18, тел. (499) 231-83- 02, e-mail: galina_ifr@fromru.com Сравнивали накопление растворимых сахаров и пролина под действием пониженной температуры и солей тяжелых металлов (ТМ) трансгенными растениями рапса, содержащими выделенный из генома растений риса встроенный ген Osmyb4. Белок, кодируемый этим геном, является транскрипционным фактором, отвечающим за различные биохимические изменения, происходящие с растениями во время адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды.

Исследования проводили на трансгенных растениях (ТР) второго поколения, размножаемых вегетативно in vitro. В качестве контролей использовали нетрансформированные растения рапса (НТР) сорта Westar, полученные через регенерацию. Размноженные черенкованием трансгенные и нетрансформированные растения были высажены в сосуды с жидкой средой Хогланда-Снайдерс. При достижении растениями размера 5-6 листьев на растения воздействовали различными стрессовыми факторами: солями ZnSO4 (1 и 3 мМ) или CuSO4 (100 мкМ), а также пониженной температурой +4оС.

Содержание в растениях растворимых сахаров и пролина при действии охлаждения определяли на 5-е сут., а при действии сульфата меди и цинка определения проводили на 7-е сут. Для анализов брали 3-й или 4-й лист сверху. Было показано, что у НТР содержание сахаров и пролина в процессе адаптации нетрансгенных растений к холоду (4°С) через 2 сут. изменялось в значительной степени: количество сахарозы увеличивалось в 8 раз, фруктозы в 10 раз и глюкозы в 20 раз. На 5-е сутки адаптации растений к 4°С количество сахарозы начинало уменьшаться, тогда как содержание моносахаров возрастало. Подругому происходит накопление сахаров у нетрансформированных растений при добавлении солей ТМ. Под воздействием CuSO4 количество сахарозы и фруктозы к 7 суткам увеличивалось на 10-15%, тогда как содержание глюкозы оставалось постоянным. При воздействии ZnSO4 содержание глюкозы и сахарозы снижалось незначительно (на 10-15%), тогда как количество фруктозы уменьшалось, примерно, в 2 раза. ТР, в отличие от растений дикого типа, обнаруживали на холоде менее выраженные изменения в содержании растворимых сахаров. Содержание сахарозы изменялось в 3 раза, фруктозы – в 4 раза и глюкозы – в 5 раз. При действии CuSO4 количество сахарозы и глюкозы уменьшалось примерно в 2 раза, тогда как содержание фруктозы примерно в 2 раза увеличивалось. Накопление пролина подчинялось другим закономерностям. Если на холоде у НТР его накопление было незначительным, составляя на 5 сутки 200% по сравнению с растениями, находившимися при 24оС, то у ТР накопление составило 1000-1200%. При действии на растения ZnSO4 количество пролина увеличивалось в 4 раза с увеличением концентрации соли в растворе до 1 мМ одинаково у НТР и ТР растений. При возрастании концентрации ZnSO4 до 3 мМ количество пролина увеличивалось значительно (в 15-20 раз), со значительным превышением у ТР растений (на 50-70%). Более сильное воздействие оказывало добавление CuSO4. Содержание пролина увеличивалось у НТР в 27 раз, тогда как у ТР наблюдали увеличение в 37 раз, по сравнению с растениями, росшими без воздействия солей ТМ. Таким образом, и воздействие охлаждения и воздействие солей ТМ вызывают у ТР с геном трансфакторного белка похожий эффект – снижается способность аккумулировать растворимые сахара, но интенсивно аккумулируется пролин, который подобно сахарам обладает осморегуляторным и множественным стресс-протекторным действием.

Работа частично поддержана грантами РФФИ 13-08-01323 и 13-04-01001.

–  –  –

Federal State Institution of Science Institute of Plant Physiology K.A. Timirjazev Academy of Sciences, 127276, Moscow, Botanicheskaya str., 35, fax: (499) 977-80-18, tel. (499) 231e-mail: galina_ifr@fromru.com The accumulation of soluble sugars and proline under the influence of low temperatures and heavy metals (TM) was evaluated in transgenic rape (Brassica napus L.) plants transformed by rice Osmyb4 gene. The protein encoded by this gene is a transcription factor that is responsible for a variety of biochemical changes that occur in plants during adaptation to adverse environmental conditions. Investigations were carried out on vegetatively propagated in vitro transgenic plants (TP) of the second generation. As a control, non-transformed rape plants (NTP) variety Westar obtained through regeneration in vitro. Propagated by cuttings, TP and NTP were planted in containers filled with a Hoagland-Snyder solution. When the plants have developed 5-6 leaves on accession, the various stress factors such as salts ZnSO 4 (1 and 3 mM) and CuSO4 (100 M) salts and low temperature (+4C) were applied to plants. The content of soluble sugars and proline in plants under the action of cooling was determined on the 5-th day, and under the action of copper sulfate and zinc sulfate the assays were performed on the 7-th day. For assays the 3-rd or 4-th leaf from top were picked out. It was shown that the content of sugars and proline in NTP during adaptation to cold (4°C) after 2 days varied largely: the sucrose content has increased by 8 times, 10 times the fructose content – by 10 times, and the glucose content - by 20 times. On the 5-th day of plant adaptation to 4°C, the amount of sucrose began to decrease, while the content of monosaccharides increased. An accumulation of sugars in NTP has occurred by another way at heavy metal salts supplying. Under the influence of CuSO4 the content of sucrose and fructose is increased to 7 days to 10-15%, while the glucose content remains constant. When exposed to ZnSO4 the content of glucose and sucrose is decreased significantly (by 10-15%), whereas the fructose content is reduced approximately 2fold. TP in contrast to wild type plants have showed less pronounced alterations in the content of soluble sugars in cold conditions. Sucrose content changed by 3 times, fructose – by 4 times and glucose – by 5 times. The action of CuSO4 caused the decrease of the sucrose and glucose content about two fold, whereas the fructose content has increased about 2 times. The accumulation of proline was changed by another way. If in NTP the accumulation of proline was negligible in cold conditions, amounting to 5 days of 200% compared with plants that were growing at 24°C, whereas its accumulation in TP was reached 1000-1200%. The action of ZnSO4 on plants caused the increasing of proline content by 4-fold in the salt concentration in solution equal to 1 mM in transgenic and non-transgenic plants. When concentration of ZnSO4 has increased to 3 mM the content of proline increased considerably (15-20 times) with a large excess in transgenic plants (50-70%). More severe influence was caused by the addition of CuSO4. Proline content has increased in NTP by 27 times, while the proline content in transgenic plants has enlarged by 37 times in compare with plants growing without heavy metal salts affecting. Thus, the cooling effect and the effect of heavy metal salts cause the similar effect in plants transformed by trans-factor gene - reduced ability to accumulate soluble sugars but intensively accumulated proline which like sugars has osmoregulatory and multiple stressprotective effects.

This work was partially supported by grants RFBR 13-08-01323 and 13-04-01001.

Секция 4

ПОВЫШЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ГЕНОМ

СТИЛЬБЕНСИНТАЗЫ К ФИТОПАТОГЕНАМ

Рукавцова Е.Б.1, Захарченко Н.С.1, Алексеева В.В.1, Лазарева Н.В.2, Бурьянов Я.И.1 Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 142290, г. Пущино, проспект Науки, д. 6; факс: (4967)330527, тел.: (4967)330970, e-mail: ruk@fibkh.serpukhov.su Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, 620002, Екатеринбург, ул. Мира, д 19, тел. (343) 375-44-44;

e-mail: ThuVaeRLo@yandex.ru Целью исследований было получение трансгенных растений с геном стильбенсинтазы винограда. Такие растения могут служить источником фитоалексина резвератрола, что перспективно для сельскохозяйственной биотехнологии и фармакологии. Резвератрол обладает противоопухолевым действием, а также положительно влияет на сердечно-сосудистую и нервную системы человека и проявляет гепатопротекторные свойства. Кроме того, синтез резвератрола в клетках растений может придавать им устойчивость к ряду фитопатогенов.

Нами получены и проанализированы растения табака Nicotiana tabacum L. с геном стильбенсинтазы vinst1 винограда Vitis vinifera (GenBank AB046375.1). Этот ген встраивали в вектор для трансформации растений pSS под контроль сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS.

Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали штаммы агробактерий Agrobacterium tumefaciens CBE21 и А281(pTiBo542). Эти агробактерии использовали для трансформации листовых эксплантов растений и инфильтрации семян. Показано наличие гена vinst1 в ДНК нескольких линий трансгенных растений табака. Проведено тестирование полученных растений на устойчивость к фитопатогенам. Показана устойчивость листьев отдельных линий растений к ряду фитопатогенных бактерий и грибов. Планируется получение безмаркерных растений с геном стильбенсинтазы и их отбор с помощью новых разрабатываемых нами биотестов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований (гранты №11-08-00413 и 12-08-00131).

Секция 4

THE INCREASED RESISTANCE OF TRANSGENIC PLANTS WITH STILBENE

SYNTHASE GENE TO PHYTOPATHOGENS

Rukavtsova E.B.1, Zakharchenko N.S.1, Alekseeva V.V.1, Lazareva N.V.2, Buryanov Ya.I.1 Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 142290, Pushchino, Science Avenue, 6, tel. (4967) 33-09-70, fax: (4967) 27e-mail: ruk@fibkh.serpukhov.su Ural Federal University named after First President of Russia B.N. Yeltsin, 620002, Ekaterinburg, Mira str., 19, tel. (343) 375-44-44; e-mail: ThuVaeRLo@yandex.ru The aim of research was obtaining of transgenic plants with grape stilbene synthase gene. Such plants can be a source of phythoalexin resveratrol that is promising for agricultural biotechnology and pharmacology. Resveratrol possesses antitumour effect, and also positively influences on human cardiovascular and nervous systems and shows hepatoprotective properties. Furthermore, the synthesis of resveratrol in plant cells can give them resistance to several plant pathogens.

We obtained and analyzed tobacco plants Nicotiana tabacum L. with stilbene synthase gene vinst1 from grape Vitis vinifera (GenBank AB046375.1). This gene was inserted into plant transformation vector pSS under control of strong constitutive promoter of 35S RNA of cauliflower mosaic virus CaMV 35SS. Agrobacterium tumefaciens CBE21 и А281(pTiBo542) strains were transformed with obtained plasmids. These agrobacteria were used to transform plant leaf explants and for infiltration of seeds. The vinst1 gene presence in DNA of several lines of transgenic tobacco plants was shown. Resistance of leaves of certain lines of plants to a number of phytopathogenic bacteria and fungi was shown. The obtaining of marker-free plants with stilbene synthase gene and their selection by means of new bioassays developed by us is planned.

The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research, project №11and 12-08-00131.

<

Секция 4

РАПС С ТРАНСГЕНОМ DESC ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCOCCUS VULCANUS:

ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ЛИСТЬЕВ

Сахно Л.А.1, Сливец М.С.1,3, Остапчук А.Н.2, Король Н.A.2, Шелудько Ю.В.1, Голденкова-Павлова И.В.4 Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Д 03680, г.

Киев, МСП, ул. академика Заболотного, д. 148, тел. /фaкс (044) 526-71-04, е-mail:

sakhno@icbge.org.ua Институт микробиологии и вирусологии им. Заболотного НАН Украины, Д 03680, г.

Киев, МСП, ул. академика Заболотного, д. 154, тел. (044) 526-11-79, фaкс (044) 526-23-79 Национальный технический университет Украины «Киевский Политехнический Институт», 03056, г. Киев, пр. Победы, д. 37, тeл. (044) 236-69-13, фaкс (044) 236-59-32 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, тeл. (499) 135-62-13, фaкс (499) 132-89-62 Одним из механизмов адаптации растений к стрессам (холоду, фитопатогенным грибам) является увеличение степени ненасыщенности остатков жирных кислот в липидах клеточных мембран. С использованием биотехнологических подходов благодаря введению гетерологичных десатураз различного происхождения к настоящему времени получен ряд растений с повышенным количеством моно- и полиненасыщенных жирных кислот в составе мембранных липидов, что приводило как к повышению устойчивости к пониженным температурам, так и к меньшему повреждению фитопатогенными микроорганизмами.

Ранее нами были созданы растения рапса с трансгеном desС Synechococcus vulcanus. Ген 9 десатуразы цианобактерии был слит в одной рамке считывания с репортерным геном термостабильной лихеназы (licBM3) Clostridium thermocellum.

Наличие последовательности гена licBM3 в составе гибридного продукта позволило качественно (с помощью чашечного теста) и количественно (фотометрически) оценить экспрессию слитого с ним гена десатуразы.

Целью данной работы было изучение состава жирных кислот листьев этих растений для последующей оценки устойчивости к изменениям температурных режимов выращивания.

В ходе экспериментов анализировали размноженные черенкованием в асептических условиях контрольные (Bn18, сорт Обрий) и экспрессирующие ген desС линии рапса (18а, 18в – первичные трансформанты; Bn18а/6, Bn18в/25 – растения первого поколения, полученные в результате самоопыления). Растения выращивались в условиях термальной комнаты (16/8 фотопериод, +23°С) в течение четырех недель в пробирках Sigma 25150 мм (Sigmawave™) c 15мл агаризованной безгормональной среды MС.

В результате анализа газо-хроматографических данных было выявлено, что экспрессия DesC цианобактерии Synechococcus vulcanus не изменяла качественный состав жирных кислот листьев рапса. Показано, что введение гена 9–ацил-липидной десатуразы в ядерный геном растений рапса приводило к уменьшению содержания насыщенных (С16:0) и увеличению количества триеновых (С16:3 и С18:3) жирных кислот, увеличению содержания липидов (до 48%) и индекса ненасыщенности (до 0,07%) в листьях некоторых трансгенных растений (18b и 18а/6). Увеличение индекса ненасыщенности коррелировало с изменениями в содержании липидов у анализируемых растений. Отмеченные линии рапса могут быть более устойчивыми к холодовому повреждению в сравнении с контрольными.

Работа выполнялась при поддержке гранта Национальной Академии Наук Украины № 0110U006062.

Секция 4

CANOLA WITH CYANOBACTERIUM

SYNECHOCOCCUS VULCANUS DESC TRANSGENE:

LEAF FATTY ACID COMPOSITION

Sakhno L.O.1, Slyvets M.S. 1,3, Ostapchuk A.M.2, Korol N.A.2, Sheludko Y.V.1, GoldenkovaPavlova I.V.4 Institute of Cell Biology and Genetic Engineering NAS of Ukraine, 03680, Kyiv, DSP-22, Zabolotnogo str., 148, tel. / fax: (044) 526-71-04, е-mail: sakhno@icbge.org.ua Zabolotny Institute of Microbiology and Virology NAS of Ukraine, 03680, Kyiv, DSP-22, Zabolotnogo str., 154, tel. (044)526-11-79, fax (044) 526-23-79 National Technical University of Ukraine “Kyiv Polytechnic Institute”, 03056, Kyiv, Prospect Peremogy, 37, tel (044) 236-69-13, fax 236-59-32 Vavilov Institute of General Genetics RAS, 119991, Moskow, Gubkina str., 3, tel. (499) 135fax (499) 132-89-62 One of the adaptation mechanisms of plants to stresses (chilling or phytopathogenic fungi) is the increase in the unsaturation of fatty acid residues in lipids of cellular membranes.

The application of biotechnological approaches allowed for obtaining of plants with the increased content of mono- and polyunsaturated fatty acids in the membrane lipids. The introduction of heterologous desaturases of various origins led to comparable results both in increase of cold tolerance as well as in less damage by the phytopathogenic microorganisms.

Earlier we created canola plants carrying Synechococcus vulcanus desС transgene. This gene was fused with the reporter gene licBM3 (thermostable lichenase) of Clostridium thermocellum in one reading frame. The determination of licBM3 gene product activity as a part of the hybrid protein allowed for qualitative (by using lichenase plate test) and quantitative (photometric) evaluation of the expression of the desaturase gene, fused with it.

This work was aimed at investigation of leaf fatty acid composition of desC transgenic canola for further testing of transgenic lines for resistance to temperature regime changes.

During experiments control (Bn18, cv Obreey) and desС expressing canola lines (primary transformants 18а, 18в and plants of first generation Bn18а/6, Bn18в/25) propagated by cutting under aseptic conditions were analysed. Plants were grown during four weeks in termal room (16/8 photoperiod, +23°С) in Sigma 25150 мм (Sigmawave™) tubes containing 15 ml agar solidified MS medium without hormones.

Gas-chromatographic data revealed that cyanobacterium Synechococcus vulcanus DesC expression did not lead to qualitative changes in canola leaf fatty acid composition. It was shown that introduction of 9–acyl-lipid desaturase gene into canola nuclear genome resulted in decrease in saturated (С16:0) and increase in trienoic (С16:3 and С18:3) fatty acid content, in increase in the lipid content (up 48%) and in the unsaturation index (up 0.07%) in leaves of some transgenic plants (18b and 18а/6). Increase in the unsaturation index was correlated with changes in the lipid content in analysed plants. The described transgenic lines might be more resistant to chilling damage in comparison with control ones.

The work was supported with the grant of National Academy of Science of Ukraine №0110U006062.

–  –  –

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42, тел. (499) 977-09-47, факс (499) 977-09-47, e-mail: greenpro2007@rambler.ru Для отработки методики использовали как полученные нами ранее трансгенные по FeSOD1, так и контрольные растения томата. Ген, внедренный в трансгенные растения, был снабжен сигнальной последовательностью, которая перенаправляла цитоплазматическую Fe-зависимую супероксиддисмутазу в пластиды. Предпосылкой для данной работы послужило обнаружение нами значительных ультраструктурных изменений митохондрий в трансгенных линиях как в контроле, так и при действии разных типов засоления. Для более достоверной интерпретации результатов нам необходимо понимание, связаны ли отмеченные нами изменения структуры с активацией или с подавлением дыхания, так как данные литературы в этом вопросе неоднозначны. Для оценки интенсивности дыхания трансгенные укорененные регенеранты томата линий № 8 и № 19 поколений Т0, Т1 и Т2, а также Т0-трансгеннных линий № 4, № 6 (не давшие семян при самоопылении), экспрессирующих ген Fe-SOD1, помещали в пробирки с агаризованной средой, составленной по прописи МС, с добавлением хлорида и сульфата натрия, оказывающих осмотическое давление, соответствующее 400 кПа. Контрольные регенеранты культивировали на питательной среде МС как в присутствии хлорида или сульфата натрия, так и без их добавления. Каждый вариант опыта включал по 10 растений. Повторность трехкратная. При этом учитывалось, что в исследовании использовались регенеранты одинаковые по габитусу и размеру. Интенсивность дыхания определяли как отношение количества мкг СО2/в час к сухому весу (г). Для измерения дыхания в маленьких объемах была модифицирована и апробирована система измерения в небольших вегетационных сосудах in vitro.

Установлено, что все изученные трансгенные линии были более устойчивы к воздействию сульфата натрия, однако отличались по чувствительности к хлориду натрия в сравнении с контрольными, нетрансгенными растениями, кроме того по этому показателю отмечено наличие аналогичных реакций между исходными трансгенными линиями и растениями поколения Т1 и Т2. Также, можно утверждать, что существенные отличия в ультраструктуре митохондрий различных линий имеют существенную корреляцию с измерениями темнового дыхания произведенного данным методом. После проведения корреляционных исследований с другими методами исследования дыхания метод может быть полезным для первичной оценки трансгенных растений на устойчивость к абиотическим факторам in vitro, так как при достаточном обеспечении стерильности и совпадении параметров размера растений возможно применение его без уничтожения растений.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-31508 мол_а.

–  –  –

STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF TRANSGENIC

TOMATO PLANTS EXPRESSING THE Fe-DEPENDENT SUPEROXIDE DISMUTASE

Serenko E.K., Akanov E.N., Chebotareva I.B., Kurenina L.V., Guleviсh A.A., Baranovа E.N.

All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Agricultural Sciences, Moscow, Timiryasevskaya str, 42, fax: (499)977-09-47, tel. (499)977-09-47, e-mail: greenpro2007@rambler.ru For processing techniques were used as our earlier transgenic FeSOD1, and control tomato plants. The design used in the preparation of transgenic plants was supplied with a signal sequence that targets the cytoplasmic Fe-dependent superoxide dismutase into the plastids. The prerequisite for this work was the founding of significant ultrastructural changes of mitochondria in transgenic lines in the control and under the influence of different types of salinity. For a more accurate interpretation of the results, we need to understand, we are connected to the marked change in the structure with the activation or inhibition of respiration, since the literature on this issue is mixed. To estimate the rate of respiration, transgenic tomato lines rooted regenerated number 8 and number 19 generations T0, T1 and T2, and T0-transgenic line number 4, № 6 (have not given seed in self-pollination), expressing the gene Fe-SOD1, was placed in a test tube with agar, prepared according to the recipe MS supplemented with sodium chloride and sulfate providing an osmotic pressure corresponding to 400 kPa.

Control regenerants were cultured on MS medium in the presence of sodium chloride or sulphate, with or without their addition. Each variant of the experiment consisted of 10 plants. When taken into account that the study used the same regenerated by habit and size. The respiration rate is defined as the ratio of CO2 g / hour to the dry weight (g). To measure breathing in small volumes have been modified and approved measurement system in small pots in vitro.

Found that all transgenic lines were studied more resistant to sodium sulfate, but differed in their sensitivity to sodium chloride in comparison with control, non-transgenic plants, in addition to the presence of this indicator noted analogous reactions between source lines and transgenic plants, T1 and T2 generation. Also, it can be argued that the significant differences in the ultrastructure of mitochondria of different lines have a significant correlation with measurements of dark respiration produced by this method. After correlation studies with other methods of investigation breathing method can be useful for initial evaluation of transgenic plants tolerance to abiotic factors in vitro, as a sufficient coincidence ensuring sterility and size parameters it is possible to use plant without killing the plants.

This work was supported by RFBR grant number 12-04-31508 mol_a.

Секция 4

КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ДЛЯ

ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕНОВ В МЕРИСТЕМАХ РАСТЕНИЙ

Сидорчук Ю.В.1, Герасименко И.М.2, Казанцев А.А.2, Шелудько Ю.В.2, Дейнеко Е.В.1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, д. 10, тел.:

(383) 363-49-80, e-mail: sidorch@bionet.nsc.ru Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Украина, 03680, г. Киев, ул. Заболотного, д. 148, тел. / факс: +7(380) 44 526-7104, e-mail: ysheludko@ukr.net Методы генетической инженерии и экспериментального трансгеноза позволяют значительно ускорить процесс создания растений с новыми полезными признаками, например, более устойчивых к неблагоприятным факторам окружающей среды, что особенно актуально в условиях быстрых климатических изменений. Однако использование для экспрессии чужеродных генов конститутивных промоторов не всегда отвечает задачам эксперимента, особенно когда продукт имеет физиологическую активность. Применение промоторов, обеспечивающих тканеспецифическую экспрессию трансгенов, позволяет накапливать чужеродные белки преимущественно в целевых тканях-мишенях, что снижает риск неблагоприятного воздействия этих белков на растение, человека и окружающую среду.

Поскольку развивающиеся цветы и другие меристематические зоны растений часто являются тканями-мишенями при действии стрессовых факторов (в частности, низких температур), представляется целесообразной экспрессия в этих тканях трансгенов, повышающих устойчивость к неблагоприятному воздействию. Для проведения тканеспецифической экспрессии трансгенов в цветочных и вегетативных меристемах растений были созданы генетические конструкции, несущие целевой ген под контролем промоторов apetala3 и prs4A Arabidopsis thaliana. Ген apеtala3 экспрессируется в цветочных меристемах и кодирует фактор транскрипции группы В, регулирующий развитие цветка. Ген prs4A, кодирующий одну из субъединиц протеасомы, экспрессируется преимущественно в апикальных меристемах корня и стебля.

Промотор гена apetala3 (длиной 641 п.н. от точки старта транскрипции) и промотор и 5'-НТР гена prs4A (длиной 1667 п.н. от стартового кодона) были амплифицированы из геномной ДНК A. thaliana и включены в векторные конструкции для Agrobacterium-опосредованной трансформации растений на основе pBIN19 для контроля экспрессии гена -глюкуронидазы (GUS). С помощью полученных генетических конструкций, введенных в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101, была проведена трансформация табака (Nicotiana tabacum линия SR1). Гистохимическое определение активности -глюкуронидазы в первичных трансформантах подтвердило экспрессию трансгена преимущественно в меристематических зонах растений.

Созданные генетические конструкции предусматривают возможность замены репортерного гена на другие последовательности. Это позволит использовать их для создания растений, которые экспрессируют рекомбинантные белки, участвующие в защите от стрессов, преимущественно в меристемах.

Работа выполняется при поддержке гранта НАНУ УкрИНТЭИ № 0110U006061 и УкрИНТЭИ № 0110U006062.

Секция 4

CLONING AND CHARACTERIZATION OF REGULATORY ELEMENTS FOR

SPECIFIC TRANSGENE EXPRESSION IN PLANT MERISTEMS

Sidorchuk Y.1, Gerasymenko I.2, Kazantsev A.2, Sheludko Y.2, Deineko E.V.1 The Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 630090, Novosibirsk, Lavrentyev av., 10, tel.: +7(383) 363-49-80, e-mail: sidorch@bionet.nsc.ru Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of The National Academy of Sciences of Ukraine, 03680, Kyiv, Acad. Zabolotnoho St., 148, tel. / fax: +7(380) 44 526-7104, e-mail: ysheludko@ukr.net Methods of genetic engineering and experimental transgenesis promote the production of plants with new useful traits for example resistance to unfavorable environmental aspects that is especially actual in the conditions of fast climatic changes. However the application of constitutive promoters for foreign gene expression sometimes is not suitable especially when the expression product has a physiological activity. The usage of tissue-specific promoters for transgenesis permits accumulating of foreign proteins mainly in target tissues and reduces risk of adverse effects of these proteins on plants, humans and environment.

So far as the developing flower buds and other plant meristems are the target tissues for stresses, for instance low temperature, therefore expression of transgenes improving resistance to adverse effects in these tissues is very reasonable. Two genetic constructs with the gene of interest regulated by apetala3 and prs4A promoters of Arabidopsis thaliana were produced for specific transgene expression in floral and vegetative meristems.

The apetala3 gene encoding transcription factor of B group controls flower development and its expression is detected in floral meristems. The prs4A gene encodes one of the proteasome subunit and its expression is mainly detected in apical meristems of root and stem.

The apetala3 gene promoter (641 bp region up-stream of the transcription start point) and the prs4A gene promoter (1667 bp region up-stream of the start codon) were amplified from genomic DNA of A. thaliana and cloned into pBIN19-based vector to provide tissue-specific gus-gene expression. Produced genetic constructs were used for transformation of tobacco plants (Nicotiana tabacum, line SR1) by GV3101 strain of Agrobacterium tumefaciens.

Histochemical detection of -glucuronidase in the primary transformants confirms the transgene expression mainly in plant meristems.

Developed genetic constructs provide for replacement of the reporter gus-gene by other sequences. That allows us to use them for production of transgenic plants expressing recombinant stress protection proteins in the meristems.

The work was supported by the grants of NASU (UkrISTEI № 0110U006061 and № 0110U006062).

Секция 4

КУЛЬТУРА ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ КАК АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ КИСЛОТ ИЗ FAGOPYRUM ESCULENTUM

MOENCH

Ситар О.1,2, Габр А.М.2,3, Таран Н.1, Сметанская И.1 Кафедра физиологии и экологии растений, Киевский национальный университет Тараса Шевченка, 01601, Украина, г. Киев, Владимирская ул., д. 64, e-mail: tarantul@univ.kiev.ua Кафедра методов пищевой биотехнологии, Институт пищевой технологии и пищевой химии, Берлинский технический университет, 14195, Германия, Берлин, ул. КьонигинЛуизе, д. 22, e-mail: iryna.m.smetanska@tu-berlin.de Кафедра биотехнологии растений, Национальный опытный центр, Египет, г. Каир, e-mail: a_m_gabr2@yahoo.com Исследована возможность получения культуры трансформированных корней из различных источников эксплантов (корни, листья и стебли) из гречихи обыкновенной Fagopyrum esculentum Moench. Молекулярный анализ ПЦР подтвердил факт внедрения гена rol B в трансформированных корнях в растениях гречихи, передаваемого в трансгенные корни R-плазмидой Agrobacterium rhizogenes. Выбор оптимальных источников эксплантов в культуре трансформированных корней является важным фактором для улучшения содержания вторичных метаболитов для продукции в условиях in vitro. При культивировании в жидкой среде трансформированые корни показали стабильный рост и накопление большого количества биомассы. Кроме того, культура трансформированных корней производит фенольные кислоты и характеризуется повышенным содержанием общей фракции фенолов. В исследуемых культурах было идентифицировано высокое содержание хлорогеновой, p-гiдроксибензойной, р-анисовой и кофейной кислот. Культура трансформированных корней является ценным альтернативным средством получения данных фенольных кислот из F. esculentum.

–  –  –

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ PLEUROTUS OSTREATUS КАК ОДИН ИЗ

МЕТОДОВ СОХРАНЕНИЯ И ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ЕЁ ГЕНОФОНДА

Смирнова Ю.В., Лавлинский А.В., Попов В.Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет", 394006, г. Воронеж, Университетская площадь, д. 1, тел. 8(473)2–208–876, факс 8(473) 2–208–755, e-mail: Petka7@yandex.ru В настоящее время довольно ограничены сведения о биологии культуры макромицетов in vitro. Также о возможности сохранения генофонда различных видов ксилотрофных базидиомицетов в качестве мицелиальных культур. В тоже время ксилотрофные базидиомицеты заняли одно из ведущих мест в качестве объектов биотехнологии.

В процессе интродукции макромицетов происходит селекция по наиболее важным адаптивным признакам в новых условиях их существования. Для ускорения процесса их адаптации используется метод агробактериальной трансформации. В последнее десятилетие было выявлено, что помимо растительных объектов, трансформации подвергаются и мицелиальные грибы.

Метод АТМТ (Agrobacterium tumefaciens-ediated transformation) – промежуточная агробактериальная трансформация имеет некоторые преимущества перед другими методами трансформации: 1) - техническая простота проводимых операций; 2) - высокая частота трансформации (от 50 до 75%).

Объектами исследования являлись:

– штамм вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus Черный принц;

– для трансформации использовался штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 с геном резистентности к канамицину (предоставлен Центром “Биоинженерия” РАН, г. Москва).

– антибиотики – канамицин, гентамицин, ивермектин.

В качестве подготовительного этапа по трансформации Pleurotus ostreatus был проведен опыт по совместному культивированию мобилизованных клеток агробактерий и мицелиальных клеток вешенки на стадии её экспоненциального роста (5-суточная культура). В ходе эксперимента было выявлено, что культура агробактерий не проявляет патогенеза в отношении мицелиальной культуры на всех стадиях развития гриба.

Для выявления антагонистического характера воздействия минимальных концентраций антибиотика на мицелиальную культуру, нами были протестированы разные концентрации (25, 50, 100, 150 мкг/мл) трёх антибиотиков – канамицина, гентамицина и ивермектина. В дальнейшем была подобрана минимальная концентрация антибиотика ивермектина с ингибирующим действием, которая составила 50 мкг/мл.

Для морфологического наблюдения за процессом совместного культивирования мицелия вешенки и агробактерий на субмикроскопическом уровне, нами применялся метод сканирующей электронной микроскопии. Изучаемый процесс наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6380 (Япония), с применением методики вакуумного напыления золотом. Изучались морфологические особенности поверхности культуры мицелия вешенки обыкновенной в контроле и опыте (совместно с культурой агробактерий). В контрольном варианте на гифах мицелия вешенки наблюдали большое количество анаморф и бластоконидий, что свидетельствует о его активном развитии. Также мы наблюдали преимущественное расположение агробакетриальных клеток на концах гиф молодого мицелия.

Таким образом, нами было выявлено, что для более успешного проведения агробактериальной трансформации предпочтительнее использовать монокультуру мицелия вешенки обыкновенной – отдельно расположенные гифы молодого мицелия.

–  –  –

Federal State Institution of Higher Professional Education "Voronezh State University", 394006, Voronezh, University Square, 1, fax 8(473) 2-208–755, tel. 8(473)2–208–876, e-mail: Petka7@yandex.ru At present, information on the biology of macromycetes culture in vitro are limited. In particular of various types of xylotrophic basidiomycetes as mycelial cultures. At the same time xylotrophic basidiomycetes have occupied a leading position as objects of biotechnology.

In the process of introduction of macromycetes selection is the most important adaptive features in the new conditions of their existence. To speed up the process of adaptation the method of Agrobacterium-mediated transformation is used. In the last decades, it was revealed that besides plant objects filamentous fungi are subjected to transformation.

ATMT method (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation) – is an intermediate one, which has some advantages over other methods of transformation: 1) - the technical simplicity of operations, 2) - a high frequency of transformation (50 to 75%).

The objects of the research were:

- strain of oyster mushroom Pleurotus ostreatus (the Black Prince);

- the strain Agrobacterium tumefaciens (GV3101) is used for transformation with the help of canamycin resistance gene (provided by the Centre "Bioengineering", Russian Academy of Sciences, Moscow);

- antibiotics - kanamycin, gentamycin, ivermectin.

As a preliminary step the transformation of Pleurotus ostreatus experiment was carried out by co-culturing cells mobilized by agrobacteria and oyster mushroom mycelium cells at the stage of exponential growth (5 day culture). During the experiment, it was found that the culture of agrobacteria does not show pathogenesis of the mycelial culture at all stages of development of the fungus.

To detect antagonistic affects of minimum concentrations of antibiotic on mycelial culture, we have tested various concentrations (25, 50, 100, 150 g/ml) of antibiotics kanamycin, gentamicin and ivermectin. Futher minimum of antibiotic concentration ivermectin (50 g/ml) was chosen.

For morphological observation of the process of co-culture cultivation of oyster mushroom mycelium and agrobacteria on submicroscopic level, we used the method of scanning electron microscopy. The process understudy was abserved using scanning electron microscope JSM-6380 (Japan), by using the method of vacuum gold deposition.

The morphological peculiarities of the surface of mycelium Pleurotus ostreatus under control and in the experiment (together with culture of agrobacterium) were studied. A lot of anamorphае and blastokonidies were found on hyphae of oyster mycelium, which indicates to its active development.

Also, the preferential location of agrobacteria cells at the hyphae ends of young mycelium was abserved.

Thus, it was revealed that for more preferable process of agrobacterial transformation it is much better to use the monoculture of mycelium Pleurotus ostreatus, separately disposed hyphae of young mycelium.

Секция 4

ЭКСПРЕССИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ:

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ

Тюрин А.А.,1,2 Бердичевец И.Н.1, Мустафаев О.1, Никифорова Х.Р.1, Фадеев В.С.,1 Голденкова-Павлова И.В.1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 35;

тел. (499) 231-83-15, факс (499) 977-80-18, e-mail: irengold58@gmail.com Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, г. Москва, e-mail: alexjofar@gmail.com Создание экспериментальных моделей трансгенных растений для функциональной геномики, как и успех в создании новых форм растений с заданными свойствами или использовании их в качестве продуцентов, зависят от эффективности работы перенесенных генов. Эффективность экспрессии генов регулируется на разных уровнях:

транскрипции, трансляции, и стабильности белкового продукта переносимого гена.

Несмотря на бурное развитие генной инженерии растений доступных и охарактеризованных растительных регуляторных элементов невелико, поэтому поиск регуляторных элементов, а также генетических детерминант, важных для оптимальной экспрессии переносимого гена в растениях является актуальным направлением исследований.

Нами предложен новый подход для конструирования экспериментальных моделей с целью дальнейшего создания трансгенных растений, как для фундаментальных исследований, так и перспективных для биотехнологии. Этот подход основан на поиске, анализе, конструировании и апробировании генетических детерминант, которые обуславливали бы не только эффективную, но и оптимальную экспрессию целевых генов в растениях, а также стабильность их белковых продуктов. Для поиска и анализа генетических детерминант, важных для оптимальной экспрессии переносимого гена в растениях, нами создана база данных FlowGene, которая имеет программное обеспечение, позволяющее формировать произвольные выборки нуклеотидных последовательностей генов с целью их дальнейшего анализа по различным параметрам.

Экспериментальная верификация функциональной значимости генетических детерминант, потенциально влияющих на уровень экспрессии гетерологичных генов, показала, что оптимальное окружение инициирующего кодона, размер и состав 5’нетранслируемой области, а также кодоновый состав гетерологичного гена вносят значимый вклад в оптимизацию уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях.

Предложенный подход был успешно апробирован в растительных системах с использованием репортерного и целевых генов, таких как: ген gox и goxmod, кодирующие бактериальную глюкозооксидазу; ген CYP11A1, продукт которого кодирует митохондриальный цитохром Р450SСС; ген inf-2, кодирующий интерферон-альфа2А; ген epo и epoM, кодирующий эритропоэтин.

Полученные результаты продемонстрировали, что такой подход позволяет разработать оптимальные системы экспрессии гетерологичных генов в растениях и создать оптимальные экспериментальные модели трансгенных растений, перспективные для фундаментальных исследований и биотехнологии.

Секция 4

HETEROLOGOUS GENE EXPRESSION IN PLANT SYSTEMS: NEW

OPPORTUNITIES

Turin А.А., 1,2 Berdichevats I.N. 1, Mustafaev О. 1, Nikiforova Ch.R. 1, Fadeev V.S.,1 Goldenkova-Pavlova I.V. 1 Timiryazev Institute of Plant Physiology RAS, 127276, Moscow, Botanicheskaya str., 35;

fax (499) 977-80-18, tel. (499) 231-83-15, e-mail: irengold58@gmail.com Russian State Agrarian University – MTAA named after K.A. Timiryazev, Moscow, e-mail: alexjofar@gmail.com Creation of transgenic plants as models for functional genomics, as well as success in creating new forms of plants with desired properties or use them as producers depend on the

efficiency of the transferred genes. Efficiency of gene expression is regulated at different levels:

transcription, translation, and stability of the protein product of the gene. Despite the rapid development of plant genetic engineering and characterized available plant regulatory elements is small, so the search of regulatory elements, as well as genetic determinant important for optimal expression of the transferred gene in plants is the actual area of research.

Нами предложен новый подход для конструирования экспериментальных моделей с целью дальнейшего создания трансгенных растений, как для фундаментальных исследований, так и перспективных для биотехнологии. Этот подход основан на поиске, анализе, конструировании и апробировании генетических детерминант, которые обуславливали бы не только эффективную, но и оптимальную экспрессию целевых генов в растениях, а также стабильность их белковых продуктов. Для поиска и анализа генетических детерминант, важных для оптимальной экспрессии переносимого гена в растениях, нами создана база данных FlowGene, которая имеет программное обеспечение, позволяющее формировать произвольные выборки нуклеотидных последовательностей генов с целью их дальнейшего анализа по различным параметрам.

We have proposed a new approach for the design of experimental models to further the generation of transgenic plants, both for basic research and looking to biotechnology. This approach is based on the search, analysis, design and testing of genetic determinants that cause not only effective, but also the optimal expression of target genes in plants, as well as the stability of their protein products. To search for and analysis of genetic determinants that are important for optimal expression of the transferred gene in plants, we have created a database FlowGene, which has software to generate random sample of nucleotide sequences of the genes for the purpose of further analysis of the various options.

Experimental verification of the functional significance of the genetic determinants potentially influencing the level of expression of heterologous genes, showed that the optimal ATG codon environment, size and composition of the 5'-untranslated region and a heterologous gene codon composition contribute significantly to the optimization of the expression level of heterologous genes in plants.

The proposed approach has been successfully tested in plant systems using a reporter and target genes, such as gene gox and goxmod, encoding bacterial glucoseoxidase; gene CYP11A1, which encodes a product mitochondrial cytochrome Р450SСС, inf-2 gene encoding IFN-alpha2A; epo and epoM gene, encoding erythropoietin.

The results showed that this approach allows the development of optimal systems of heterologous gene expression in plants and create the optimal experimental models of transgenic plants promising for basic research and biotechnology.

Секция 4

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СОРГО IN PLANTA

И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

С ИЗМЕНЕННЫМ СОСТАВОМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ

Эльконин Л.А.1, Итальянская Ю.В.1, Баранкова И.В.1, Носова О.Н.1, Ракитин А.Л.2, Равин Н.В.2 Государственное научное учреждение Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии, 410010, г. Саратов, ул. Тулайкова, д. 7, факс (845) 264-76-88, тел. (845) 264-83-38, e-mail: lelkonin@gmail.com Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, д. 7, корп.1, факс (499) 135-05-71, тел. (499) 783-32-64, e-mail: nravin@biengi.ac.ru Одним из наиболее перспективных направлений использования генной инженерии является создание трансгенных растений с измененным составом запасных белков эндосперма. Для решения этих задач активно используются технологии РНК-интерференции, позволяющие строго специфическим образом «выключать» экспрессию отдельных генов. За последние годы эти технологии стали активно использоваться не только у двудольных растений, но и у злаков, составляющих основу питания человека и кормовой базы животноводства. Особую актуальность эти исследования приобретают для сорго – высокоурожайной засухоустойчивой культуры, существенным недостатком которой является сниженная, по сравнению с другими злаками, перевариваемостью запасных белков и крахмала. Однако высокоэффективная генетическая трансформация у сорго является серьезной проблемой. Основными препятствиями являются низкая частота регенерации трансгенных растений и интенсивный сайленсинг трансгенов.

Нами в течение ряда лет разрабатывались различные подходы для агробактериальной трансформации растений зернового сорго, основанные на использовании методов культуры in vitro, или инокуляции цветущих изолированных метелок в условиях in planta. С использованием штамма A. tumefaciens AGL0/p35SGIB, несущего в составе Т-ДНК маркерный ген bar, у линий Желтозерное 10 (Ж10) и КВВ-45 были получены трансгенные растения. При этом частота незрелых зародышей, продуцировавших каллусы, из которых были регенерированы ПЦР-положительные растения, составляла 6.6-9.1%. Важнейшими факторами, повышающими частоту регенерации трансгенных растений, являются условия выращивания актобактериальной суспензии перед инокуляцией, а также приемы, усиливающие эмбриогенные потенции культивируемых тканей: культивирование зародышей на разработанной нами ранее питательной среде M11, модификация условий сокультивирования, удаление селективного агента (глюфосината аммония) из среды для регенерации.

У линии КВВ-114, не способной к формированию эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей, трансгенные растения, несущие ген bar, были получены с помощью агробактериальной трансформации цветущих метелок. Частота трансгенных растений в потомстве каждой из инокулированных метелок составляла 1%. ПЦР-анализ показал, что введенные трансгены наследовались в самоопыленном потомстве в течение 2 поколений. Экспрессия трансгенов в генотипах Ж10 и КВВ-45 носила, как правило, рецессивный характер; у КВВ-114 наблюдался сайленсинг.

Разработанные методы были использованы нами для получения трансгенных растений сорго, несущих генетическую конструкцию, способную к индукции РНК-сайленсинга гена гаммакафирина. Этот белок, располагающийся по периферии белковых телец клеток эндосперма, отличается устойчивостью к протеолитическому расщеплению и снижает питательную ценность зерна сорго. У линии Ж10 получены трансгенные растения, несущие эту конструкцию. У одного из растений в поколении Т1 обнаружены зерновки с измененным спектром запасных белков и структурой эндосперма, в котором происходила редукция стекловидного слоя, замещавшегося мучнистым, характеризующимся более высокой перевариваемостью белков и крахмала.

Работа поддержана РФФИ, гранты 10-04-00475, 13-04-01404.

Секция 4

AGROBACTERIUM-MEDIATED GENETIC TRANSFORMATION OF SORGHUM IN

IN PLANTA AND IN VITRO CONDITIONS AND OBTAINING OF TRANSGENIC

PLANTS WITH MODIFIED COMPOSITION OF SEED STORAGE PROTEINS

Elkonin L.A.1, Italianskaya J.V.1, Barankova I.V.1, Nosova O.N.1, Rakitin A.L.2, Ravin N.V.2 Agricultural Research Institute for South-East Region, Russian Academy of Agricultural Sciences, 410010, Saratov, Tulaikov str., 7, fax (845) 264-76-88, tel. (845) 264-83-38, e-mail: lelkonin@gmail.com Centre "Bioengineering", RAS, Russia, 117312, Moscow, Prospekt 60-Letiya Oktyabrya, 7/1, tel. (499) 783-32-64, fax (499) 135-05-71, e-mail: nravin@biengi.ac.ru Development of transgenic plants with modified content of seed storage proteins is one of the most important applications of genetic engineering. To solve these problems RNA interference technology is widely used. This technology allows strictly specific down-regulation of expression of individual genes. With the development of genetic transformation methods, it is efficiently used not only for dicotyledonous species but also for cereals that are the basic source of mankind nutrition and livestock forage. These investigations are especially important for sorghum, a unique drought-tolerant highly-productive crop species, significant drawback of which is relatively low, in comparison with other cereals, digestibility of starch and storage proteins. However, highthroughput genetic transformation of sorghum is a major problem. The main obstacles are the low frequency of transgenic plant regeneration and intense silencing of transgenes.

For several years we have developed a variety of approaches for Agrobacterium-mediated genetic transformation of grain sorghum based on the in vitro culture methods, and on the inoculation of flowering panicles in in planta conditions. Using the A. tumefaciens strain AGL0/p35SGIB with the bar gene under the nos-promoter in the T-DNA region, we have obtained transgenic plants in the grain sorghum lines Zheltozyornoe-10 (Zh10) and KVV-45. The frequency of immature embryos that produced calluses, from which PCR-positive plants were regenerated, was 6.6-9.1% that exceeds reported frequencies for Agrobacterium-mediated genetic transformation for sorghum in in vitro culture. The most important factors affecting regeneration of transgenic plants were conditions of growing of agrobacterial suspension before inoculation, and techniques increasing embryogenic potentials of cultured tissues, such as cultivation of immature embryos on the M11 medium, modification of cocultivation conditions, omitting selective agent (ammonium glufosinate) from the regeneration medium. Immature embryos of KVV-114 did not produce embryogenic callus, and in this line transgenic plants were obtained by inoculation of flowering panicles. In the progeny of each inoculated panicle the frequency of fertile PCR-positive transgenic plants survived BASTA application was approx. 1%. PCR analysis confirmed inheritance of the transgene (bar) for two generations. In the Zh10 and KVV-45, as a rule, recessive mode of transgene expression was observed; in KVV-114 silencing was found.

The elaborated methods of Agrobacterium-mediated genetic transformation have been used for the obtaining of transgenic sorghum plants carrying the genetic construct capable of inducing RNA silencing of the gamma-kafirin gene. This protein located on the periphery of the protein bodies of endosperm cells, is characterized by high resistance to proteolytic digestion and reduces the nutritional value of sorghum grain. In the line Zh10, the transgenic plants carrying this genetic construct were obtained. In one of plants studied from T1 generation, the kernels with modified endosperm structure and storage protein composition were found. Total protein electrophoretic spectrum in these kernels differed significantly from original line: the bands corresponding to gamma-kafirin and, possibly, kafirin dimers were absent; while a few new bands appeared. In these kernels, peripheral vitreous layer was absent or was significantly reduced and replaced by the floury endosperm that is known to be characterized by higher level of protein and starch digestibility.

This work was funded partly by the Russian Foundation for Basic Researches, grants 10-04-00475, 13Секция 5

–  –  –

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, г. Москва, И-276, ул. Ботаническая, д. 35, e-mail: 1balekin_a@zelnet.ru, 2cryostyle@rambler.ru В настоящее время генетическое разнообразие растений постоянно снижается из-за антропогенного влияния. Поэтому важно сохранять коллекции различных видов и сортов растений для будущего. Известно, что криосохранение семян, пыльцы, изолированных тканей и клеток растений является наиболее экономически эффективным способом длительного хранения растительного материала. Это возможно потому, что при криогенных температурах, ниже -132°C вода переходит в стекловидное состояние и обменные процессы в живых клетках останавливаются. Мы полагаем, что устойчивый к криогенному замораживанию растительный материал земляники (частично дегидратированные образцы пыльцы, семян и апексов, изолированных из растений, культивированных in vitro) можно сохранять при криогенных температурах без снижения его жизнеспособности. Для того, чтобы проверить это предположение, мы протестировали фертильность пыльцы, всхожесть семян и жизнеспособность апикальных меристем после криосохранения. Семена земляники (Fragaria vesca L., сорт Rujana) мы сохраняли при комнатной температуре и в жидком азоте. Всхожесть семян анализировали через месяц проращивания в теплице. После криосохранения 85% семян дали всходы.

Этот показатель существенно не отличался от всхожести семян, которые хранили при комнатной температуре. Хорошо известно, что селекционных целей часто используют пыльцу, которую хранят в холодильнике (0-10 °C). Однако при таких условиях хранения пыльцевые зерна быстро теряют фертильность. Для того чтобы проверить можно ли пыльцу земляники использовать после криосохранения мы оценили её устойчивость к криогенному замораживанию и хранению в жидком азоте. Цветки земляники (F. x ananassa Duch., cv. Clatter Star ) собрали в открытом грунте. Пыльцу извлекали из пыльников и 4 часа подсушивали на полосках фильтровальной бумаги над силикагелем.

Затем полоски с пыльцой помещали в криоампулы и погружали в жидкий азот. После криосохранения образцы пыльцы оттаивали при комнатной температуре. Фертильность пыльцы оценивали после опыления цветков земляники с редуцированными пыльниками (F. x ananassa Duch., cv. Mieze Schindler ). В нашем эксперименте все опыленные цветки дали плоды с жизнеспособными семенами. Таким образом, показано, что пыльца земляники после хранения в жидком азоте оставалась фертильной.

Кроме того, мы замораживали в жидком азоте дегидратированные апексы земляники (F. x ananassa Duch., cv. Clatter Star ) и использовали для этого метод, разработанный в Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева. (Патент № 2302107, RF). Для криосохранения растения выращивали in vitro в течение 2-4 недель (20-25 °С, 16-ч день, освещённость: 5-8 клк), а затем переносили в холодную камеру (4-10 °С, 4-х часовой день, освещённость: 1 клк) для адаптации. Через месяц из этих растений выделяли апексы (1-2 мм) и помещали их на модифицированную среду МС, дополненную 0,8 М сахарозы. Спустя два дня, апексы переносили на фильтровальную бумагу и 4 часа подсушивали в потоке воздуха ламинар-бокса. Криоампулы с апексами погружали в жидкий азот на срок не менее часа. Затем апексы оттаивали и помещали на агаризованную среду, дополненную 2% сахарозы, 1% глюкозы и 0,5 мг/л 6-бензиламинопурином. После криосохранения оказалось, что некоторые криоампулы заполнены жидким азотом. Однако, все апексы из криоампул, как заполненных, так и не заполненных азотом, восстановили свой рост (18-20 °С, 16-ч день, освещённость 1 клк). Растения после образования листьев и корней высаживали в теплицу, а затем в открытый грунт, где они цвели и плодоносили. Таким образом, нами показано, что для криосохранения растительного материала земляники можно использовать методы, не требующие программируемых замораживателей.

Работа выполнена при поддержке проекта фундаментальных исследований Российской Академии Наук:

"Живая природа".

Секция 5

–  –  –

Timiriazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Science, 127276, Moscow,

Botanicheskaya str., 35, tel. (499) 977-93-63, fax. (499) 977-80-18, e-mail:

balekin_a@zelnet.ru, 2cryostyle@rambler.ru In our time, plant diversity decrease due to anthropogenic impact constantly. Therefore it is important preserve a collections of different species and varieties of plants for the future. It is known, that cryopreservation of seeds, pollen, isolated tissues and cells is the most cost-effective way to longterm storage of plant material. This is possible because, that at cryogenic temperatures (below -132 °C) water transform to glass state and the metabolic processes in living cells are terminated. We were expected that cryoresistance plant material of strawberry (partially dehydrated specimens of pollen, seeds and of apices, isolated from in vitro plantlets) may be stored at liquid nitrogen temperatures without decrease of viability. In order to verify of this opinion, we tested the pollen fertility, seed germination and viability of meristem apices after they cryopreservation.

Seed of strawberry (Fragaria vesca L., var. Rujana) were stored in room temperature and in liquid nitrogen. Their germination was analyzed after one month’s sprouting in greenhouse. After cryopreservation, 85% of the seeds sprouted. This rate was not significantly different from the germination of seeds which were stored in room.

Well-know that pollen of different crops, which use for plant breeding, often, is kept in the refrigerator (0-10 °C). However, under these conditions, storing pollen grains quickly lose viability. In order to test the possibility of using strawberry pollen after cryopreservation, we investigated its resistance to cryogenic freezing and storage in liquid nitrogen. The flowers of strawberry (F. x ananassa Duch., cv. Clatter Star) harvested on plantations. Pollen isolated from anther and dried on filter paper strips over silica gel 4 hour. Dehydrated pollen is placed in cryoampoules and immersed in liquid nitrogen. After cryopreservation pollen specimens were thawed at room temperature. Pollen fertility was determined by pollination of strawberry flowers with reduced anthers F. x ananassa Duch., cv. Mieze Schindler). As a result, all pollinated flowers were given fruit with viable seeds. It is shown that pollen strawberries after storage in liquid nitrogen remained fertile.

In addition, we carried experiments to freeze of dehydrated apices of strawberry (F. x ananassa Duch., cv. Clatter Star) in liquid nitrogen and for this, we used the method developed at Timiriazev Institute of Plant Physiology (Patent № 2302107, RF). For cryopreservation plants were cultured in vitro 2-4 weeks ( 20-25 °C, 16-hr day, 5-8 klx brightness ), then transferred to a cold room (4-10 °C, 4-hr day, 1 klx brightness) for adaptation. A month later apices (1-2 mm) of these plants was isolated and placed on modified MS medium supplemented with 0.8 M sucrose. After two days, apices transferred onto filter paper and dried during 4 hours under air flow of laminar-box. Cryotubes with dehydrated apices immersed in liquid nitrogen for a period of not less than one hour. After cryopreservation apices were thawed and placed on agar medium with 2% sucrose, 1% glucose and

0.5 mg/l 6-benzylaminopurine. After cryopreservation some cryotubes contained the liquid nitrogen, in addition to apices. We observed that growth of 100% apices, which taken out from cryotubes with liquid nitrogen and without it, was recovered (18-20 °C, 16-hr day in 1 klx). Plants after the formation leaves and roots were cultivation ex vitro in the greenhouse. Adapted plants were transferred to field conditions, where they formed flowers and fruits. Thereby our experimental data showed that for freezing in liquid nitrogen of strawberry plant material may be use cryopreservation methods that do not require programmed freezers.

Work was supported by Project of Fundamental Researches of the Russian Academy of Sciences: “Living Nature”.

–  –  –

Центр биотехнологии Таджикского национального университета, 734025, Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, д. 25, тел. (992-37) 221-79-11, e-mail: bobojankh_7@bk.ru Одной из основных отраслей агропромышленного комплекса Республики Таджикистанявляются садоводство и виноградарство, которые играют достаточно важную роль в обеспечении населения продовольствием, увеличении экспортного потенциала страны и создании постоянных рабочих мест для населения. В стране возделываются самые разнообразные сорта винограда, среди них также можно встретитьсорта, представленныенесколькими кустами на коллекционных виноградниках или одним-двумя на приусадебных участках у виноградарей любителей, часть из них находится на грани исчезновения.

Недостаток посадочного материала является одной из главной причин медленного внедрения сортов в производство. Низкокачественный и зараженный патогенами посадочный материал как правило становится источником распространения опасных болезней и вредителей.

Метод микроклонального размножения in vitro наиболее эффективный путь ускоренного получения посадочного материала ценных сортов винограда. В то же время, способность растений к размножению в условиях in vitro зависит от индивидуальных особенностей сорта. Выявление оптимальных условий роста и развития растений в культуре in vitro позволяет реализовать высокие коэффициенты размножения, получить адаптированные к условиям in vivo растения-регенеранты, снизить материальные затраты на химические реактивы, гормоны, питательные среды.

Данный метод нашел широкое применение в мире, в то же время разработанные технологии не являются универсальными для всех групп сортов и видов растений.

Имеющиеся в литературе сведения противоречивы, не выявлены общие закономерности развития близких групп и видов.

В Таджикистане метод культуры изолированных тканей винограда до последнего времени не применялся. Исследования, проводимые в центре биотехнологии, направлены на выявление оптимальных условий и состава питательных сред для оздоровления и выращивания регенерантов с целью получения оздоровленного посадочного материала. С этой целью сформирована рабочая коллекция разнообразныхсортообразцов винограда, собранная из различных регионов Таджикистана. Результаты исследований внесут вклад в решении задач Целевой Государственной программы развития садоводства и виноградарства, выращивания саженцев плодов и винограда в Республике Таджикистан.

–  –  –

Center of Biotechnology of the Tajik National University, 734025, Tajikistan, Dushanbe, Rudaki Str., 17, tel. (992-37) 221-79-11, e-mail: bobojankh_7@bk.ru One of the mainsectors of agriculture of the Republic of Tajikistan are the horticulture and viticulture, which play a fairly important role in the provision of food, increase the export potential of the country and the creation of permanent jobs for the population. The country has cultivated a wide variety of grape. Some of the varieties of the grape can be found only on farmers’ vineyards or home gardens. Most of them are critically endangered.

The lack of planting material is one of the main reasons of the slow implementation of varieties inproduction. Low quality and infected planting material with pathogens usually becomes the source of the spread of dangerous diseases and pests.

In vitro method is the most effective way of obtaining the seedlings of grape varieties.

At the same time, the ability of plants to reproduce in condition of in vitro depends on the individual species. Revealing the optimal conditions of growth and development of plants in method in vitro allows high rates of reproduction, gets plants adapted to the in vivo conditions and reduces costs for chemicals, hormones, and growth media.

While developed technology is not universal for all groups of varieties and species this method is widely used in the world. Available research datais contradictory. There are no identified common patterns of development and related groups of species.

The method of tissue culture on grapes has not been applied in Tajikistan until recently.

Studies conducted in the Center of Biotechnology aimed to identify the optimal conditions of growth media for the recovery and growth of plants to produce improved planting material. For this purpose has been formed a collection of various grape variety samples collected from different regions of Tajikistan. The research results will contribute on solving the problems of state programs for the development of horticulture andviticulture, growing seedlings of fruitand grapes in Tajikistan.

–  –  –

НПЦ биотехнологии «Фитогенетика», Россия, г. Тула, тел. (4872) 41216, факс (4872) 413116, e-mail: pbfitogenetika.ru, Изучали влияние света различного спектрального состава, на рост и развитие растений жимолости при микроразмножении in vitro.

Испытывали различные источники освещения: люминесцентные лампы белого свечения ЛБ–40 (контроль); люминесцентные лампы ЛФ 40-5 (преобладание синего света); люминесцентные лампы ЛФ 40-4 (преобладание красного света).

Опыты проводили на сортах жимолости съедобной: Волшебница, Волхова, Мальвина, Амфора, Альтаир.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что микрорастения практически всех испытанных сортов жимолости развивались более интенсивно при освещении светом с преобладанием в спектре синих лучей. При таком освещении у микропобегов жимолости в отличие от красного и белого света развивались более длинные корни. Исключение составляли только микрорастения сорта Мальвина, у которых развитие корневой системы не зависело от спектрального состава света.

–  –  –

ДЛИТЕЛЬНОЕ БЕСПЕРЕСАДОЧНОЕ ХРАНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ

ОСИНЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Видягина Е.О., Филиппов М.В., Шестибратов К.А.

Филиал федерального бюджетного учреждения науки института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл. г.

Пущино, проспект Науки, д. 6, тел. (4967) 330966, факс (4967) 330527, email: vidjagina@mail.ru Осина (Populus tremula) и её гибриды широко используется в биотехнологии как модель для изучения различных аспектов генетики лесных древесных растений. Это связано с рядом причин: относительно небольшой размер генома и возможность его эффективной трансформации, быстрый рост, простота клонального микроразмножения и выращивания in vitro. Однако длительное культивирование в условиях in vitro может привести к появлению сомоклональных изменений растений, а также требует больших расходов по сохранению в условиях in vitro в фазе активного роста. В настоящее время длительное беспересадочное депонирование in vitro культур и создание банка генотипов рассматривается как способ сохранения растений, обладающих ценными свойствами. В этой связи нами были разработаны две методики сохранения in vitro культур с использованием таких приемов как депонирование при положительных температурах (+4 оС) и криоконсервация (-190 оС). Основополагающим принципом для разработанных методик длительного хранения микропобегов in vitro является снижение содержания воды в тканях растения. Обе методики были апробированы на 63 различных генотипах осины и подходят для хранения растений с рекомбинантными генами и ценных нетрансформированных генотипов.

В основе хранения при низких положительных температурах лежит изменение состава сахаров в питательной среде: вместе с легко метаболизируемой сахарозой добавляются такие осмолитики как сорбитол и маннитол. Кроме изменения состава питательной среды использовался короткий световой период – 8ч день/16ч ночь. Подобный метод депонирования позволяет хранить растения без пересадок сроком до года. Выживаемость микропобегов у всех 63 генотипов трансформированных и нетрансформированных линий осины после года депонирования достигала 99%.

Криоконсервация в жидком азоте позволяет увеличить время хранения до нескольких лет.

Однако известно, что криоконсервация органов растений является трудоёмким процессом и процент выживания очень низок. При замерзании клеток образующиеся кристаллы воды из вакуолей нарушают целостность клеточной стенки, что приводит к гибели клеток. Разработанная нами методика опирается на использование меристемной ткани почек с низким содержанием воды, что позволяет увеличить выживаемость растительных клеток и обеспечивает быстрое восстановление культуры. Также нами использовались среды с осмолпротекторами, такими как DMSO, глицерол, ПЭГ и сахара. Замораживанию подвергались пазушные почки, обезвоженные раствором, включающим 2 М глицерола и 0,4 М сазарозы. Почки переносились в среду для замораживания с 30% глицеролом, 15% DMSO и 15% ПЭГ. Использовалась шоковая заморозка – непосредственное погружение в жидкий азот. Размораживание культуры обеспечивалось быстрым нагреванием до 45 оС, отмывкой от осмопротекторов, переносом эксплантов на среды для регенерации и восстановления. Выживание эксплантов всех генотипов после года криоконсервации было достаточно высоким и достигало 53%. Статистически значимых отличий в выживаемости у трансгенных и нетрансгенных клонов обнаружено не было.

Таким образом, разработанные нами методики хранения являются достаточно эффективными для успешного депонирования различных генотипов осины. В дальнейшем нами планируется разработать технологии для длительного беспересадочного хранения других видов растений.

Секция 5

–  –  –

Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, 142290 Moscow Region, Pushchino, Avenue of Science, 6, tel. (4967) 330966, fax (4967) 330527, e-mail: vidjagina@mail.ru Aspen (Populus tremula) and its hybrids are widely used in biotechnology as a model of studying of various aspects of forest trees genetics. This is due to several reasons: the relatively small size of the genome and the possibility of its effective transformation, rapid growth, ease of cultivation and clonal microreproduction in vitro. However, prolonged cultivation in vitro may cause somaclonal changes in plants, and is expensive to preserve them in vitro in a phase of active growth. Currently, long-term deposit of cultures in vitro without repotting and the creation of a bank of genotypes considered as a way to save the plants with valuable properties.

Due to this information, we have developed two methods of preservation cultures in vitro using such techniques as deposit at positive temperatures (+4 °C) and cryopreservation (-190 °C). The fundamental principle of the developed techniques for long-term storage of microshoots in vitro is the water content reduction in the plant tissue. Both methods were tested on 63 different genotypes of aspen and they fit for storing plants with recombinant genes and valuable untransformed genotypes.

The base of storage at low temperatures is change in the composition of sugars of nutrient medium: easily metabolizable sucrose and such osmolitic agents as sorbitol and mannitol are added. In addition to changing the composition of the nutrient medium short light period - 8h day/16h night was used. Such method of deposit allows storing the plants up to one year. Microshoots survival level in all 63 genotypes of transformed and non-transformed lines of aspen after a year of deposit reached 99%.

Cryopreservation in liquid nitrogen allows increasing the storage time up to several years. However, we know that the cryopreservation of plant is labor-intensive process and the level of survival is very low. The crystals of ice from the water of vacuoles damage the cell wall, which leads to the cell death. We have developed a technique based on the use of buds’ meristem tissue with low water content, which allows increasing the survival rate of plant cells and provides fast culture recovery. Also, we used the medium with osmoprotectors such as DMSO, glycerol, PEG, and sugar. Axillary buds were frozen, dehydrated by the solution which includes 2 M of glycerol and 0,4 M of sucrose. The buds were transferred into the medium for freezing containing 30% glycerol, 15% DMSO and 15% PEG. The shock freezing was used – the direct immersion into liquid nitrogen. Defrosting of culture was provided by rapid heating up to 45 °C, washing off the osmoprotectors, transfer of explants on medium for regeneration and recovery. The survival level of the explants of all genotypes after a year of cryopreservation was high enough and reached 53%. Statistically significant difference in survival rate of transgenic and non-transgenic clones were not found.

Thus, we have developed techniques that are quite effective for successful storage of different genotypes of aspen. In the future we plan to develop technologies for long-term storage of other species of plants without repotting.

–  –  –

СОХРАНЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ

ХАРАКТЕРИСТИК В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЛЮЦЕРНЫ ПОСЛЕ КРИОХРАНЕНИЯ

В ТЕЧЕНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ВРЕМЕНИ.

Волкова Л.А., Урманцева В.В., Носов А.М.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва, e-mail: lavolkova@yandex.ru Культивируемые в суспензии клетки могут использоваться в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а также источников для производства ферментов, в том числе пероксидаз. Интерес к изучению и использованию последних не ослабевает, поскольку появление пероксидаз с повышенной стабильностью и отличной субстратной специфичностью, могло бы повысить качество фермент-содержащих наборов и стимулировать разработку новых аналитических методов и промышленных процессов. Клетки суспензионной культуры люцерны, характеризующиеся высокой активностью пероксидазы, были возобновлены после хранения в жидком азоте (-196 °С) 27 лет. Несмотря на низкий уровень выживаемости (18-20%) клетки сохранили способность к делению, жизнеспособность к 16-му циклу роста увеличилась до 80-90% и ростовые показатели по числу клеток, сухой и сырой биомассе, а также уровню активности пероксидазы были близки к исходным (до криохранения). Аналогично исходной, в возобновленной суспензионной культуре наблюдались 2 пика активности пероксидазы. Первый пик с максимальной активностью (3000-3500 ммоль/г сухой массы) приходился на 14 сутки в стационарную фазу роста, а второй – на 26 сутки в фазу деградации. Клетки люцерны после криохранения сохранили высокую чувствительность к осмотическому стрессу, также как и клетки до замораживания. Эта чувствительность выражалась в резком снижении выживаемости до 20%. После процедуры замораживанияоттаивания число выживших клеток было также на уровне 20%, что указывает на действие осмотического стресса в качестве основного повреждения клеток. Наряду с сохранением ряда показателей наблюдали также и изменение некоторых параметров. Так, цитогенетический анализ показал, что в цикле роста на 14-е сутки превалировали клетки с гаплоидным и диплоидным набором хромосом, и только на 21-е сутки увеличилась частота полиплоидных клеток (до 65%). В исходной суспензионной культуре уменьшение диплоидных и увеличение высокоплоидных клеток наблюдали уже на 7-е сутки, а на 12-14-е сутки уровень последних составил 80%. Успех низкотемпературного криоконсервирования зависит от целого ряда факторов: генетических и морфологических особенностей клеток, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротектора, режима охлаждения и условий оттаивания. В наших экспериментах при глубоком замораживании клетки подвергались двухступенчатому режиму охлаждения. Первая ступень включала охлаждение до -5 °С с низкой скоростью (0,5 °С/мин) и последующей инициацией кристаллизации; дальнейшее охлаждение до -70 °С производилось с большей скоростью и после этого ампулы с клетками быстро переносили в жидкий азот.

Защита клеток осуществлялась с помощью 7% диметилсульфоксида (ДМСО). Известно не только криопротекторное свойство ДМСО, а также его антиоксидантное действие в условиях гипотермии. Наряду с действием ДМСО одной из причин возобновления суспензионной культуры люцерны при низком уровне выживаемости может быть высокая активность гваякол-зависимой пероксидазы и альтернативной (цианрезистентной) оксидазы у исходных клеток, у которых наблюдалось резкое повышение активности пероксидазы при действии низкой температуры.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, 127276, ул. Ботаническая, д. 35, тел. (499) 977-93-63, факс (499) 977-80-18, e-mail: cryostyle@rambler.ru Сохранение в полевых и коллекциях in vitro видов и сортов растений, размножаемых вегетативно, требует значительных материальных затрат. С помощью криогенного хранения можно значительно снизить затраты на содержание живых коллекций растений. Устойчивый к замораживанию растительный материал, в том числе размноженный in vitro, сохраняется при криогенных температурах без существенной потери жизнеспособности на протяжении десятилетий. Современные методы криосохранения растительного материала, культивированного in vitro, совмещают в себе последовательно сменяющие друг друга этапы. После культивирования на специальных питательных средах клеток, тканей или побегов растений их адаптируют к низким положительным температурам. Насыщенные сахарами растительные ткани, постепенно освобождают от "свободной" воды, молекулы которой, кристаллизуясь при замораживании, могут разрушать мембраны и вызвать гибель клеток. Для этого непосредственно перед замораживанием образцы дегидратируют либо в гипертонических растворах различных веществ, либо с помощью подсушивания над поглощающими молекулы воды веществами или в осушающем потоке воздуха. Дегидратированные клетки растений успешно восстанавливаются в благоприятных условиях, если остаются жизнеспособными после замораживания, криогенного хранения и регидратации. В Институте физиологии растений Российской академии наук (ИФР РАН) был разработан способ криосохранения (Патент № 2302107, РФ) для дегидратированных апексов земляники, изолированных из растений in vitro. Этот метод позволил сформировать первую в Российской федерации экспериментальную криоколлекцию земляники (49 сортов Fragaria x ananassa Duch., 1 сорт F. vesca L.), предназначенную для долговременного хранения. Однако наши эксперименты показали, что, восстановление растительного материала после жидкого азота может зависеть не только от его криоустойчивости, но и от режима криогенного хранения. Известно, что использование стандартных криогенных контейнеров приводит к неизбежным варьированиям температуры в криопробирках с образцами в ходе многочисленных операций погружения в жидкий азот, и извлечения из него, практикуемых при длительном хранении коллекций образцов. Такие манипуляции c ортодоксальными семенами не снижали их посткриогенной всхожести. Однако эти воздействия приводили к достоверному снижению жизнеспособности дегидратированных апексов земляники, изолированных из растений in vitro, и сокращали количество меристем восстанавливавших свой рост после жидкого азота. Полученные данные мы планируем использовать для оптимизации условий сохранения коллекций растений в криобанке ИФР РАН.

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа» и межгосударственной программой ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» («Развитие национальных коллекций культур клеток растений для развития методов современной селекции и сохранения редких генотипов», Госконтракт №16.М04.12.0003).

Секция 5

CRYOSTORAGE PARTICULARS OF DEHYDRATED APICES ISOLATED FROM

STRAWBERRY (FRAGARIA L.) PLANTLETS CULTIVATED IN VITRO

Vysotskaya O.N.

Timiriazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Science, 127276, Moscow, Botanicheskaya str., 35, tel. (499) 977-93-63, fax (499) 977 80 18, e-mail: cryostyle@rambler.ru Collection preservation in field and in vitro of vegetatively propagated plants requires significant material spending. Using cryogenic storage can significantly reduce the cost of maintaining the living plant collections. For decades at cryogenic temperatures, freeze-resistant plant material preserves viability without significant loss. Modern techniques, which employ for cryopreservation of plant material from in vitro culture, consist of several stages consecutive.

Usually the cells, tissues and shoot apices of plants adapt to low positive temperatures and then dehydrate after cultivation in vitro with using special of nutrient media. After sugar saturation, material gradually exempt from "free" water molecules, which can form crystals destroying cell membranes by freezing. For this purpose, plant specimens partially dehydrate by means of hypertonic solutions of various substances, the water-absorbing materials or by the use of the dry air stream directly before the freezing. Dehydrated plant cells are recovered in favorable conditions successfully if they were remained viable after freezing, of cryogenic storage and rehydration. Timiriazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Science (IPP RAS) possesses of method which was developed for cryopreservation of dehydrated apices from strawberry plants, which were cultured in vitro (Patent № 2302107, RF). This method was used for forming of the first Russian cryocollection of strawberry (49 cvs. Fragaria x ananassa Duch., 1 cv. F. vesca L.), which is intended to long-term experimental storage. However, our experiments have been shown that recovery plant material after liquid nitrogen can depend not only on its cryoresistance but also from the conditions of cryostorage. It is known that the use of standard cryogenic containers does not exclude of unfavorable variation temperature into cryotubes with samples in the course of multiple operations of immersions into liquid nitrogen, and extractions theirs from it. Such manipulations with orthodox seeds did not changed characteristics of their germination. But, in our experiments, these actions led to decrease of the viability of dehydrated apices, which were isolated from plantlets cultured in vitro. We plan to use the obtained data to optimize the conditions for plant collection preservation in the IPP RAS cryobank.

Work was supported by Project of Fundamental Researches of the Russian Academy of

Sciences: “Living Nature” and Eurasian Economic Community interstate target program:

"Innovative Biotechnology" ("The development of the national collections of plant cell cultures for the development of the techniques of modern plant breeding and conservation of rare genotypes", State contract number 16.M04.12.0003).

–  –  –

СОХРАНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

ВЕГЕТАТИВНО РАЗМНОЖАЕМЫХ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

В КОНТРОЛИРУЕМЫХ УСЛОВИЯХ СРЕДЫ В ВИРе

Гавриленко Т.А., Дунаева С.Е., Антонова О.Ю., Швачко Н.А., Шувалова А.Р., Крылова Е.А., Овчинникова А.Б., Пендинен Г.И., Шувалова Л.Е., Черепко М.М., Волкова Н.Н.

Государственное научное учреждение Всероссийский институт растениеводства им. Н.И.

Вавилова Россельхозакадемии (ВИР), 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 42-44, тел. (812) 466-44-04, http://vir.nw.ru/biot/indexe.php, email: t.a.gavrilenko@vir.nw.ru ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова (ВИР) сохраняет одну из крупнейших и старейших в мире коллекцию генетических ресурсов растений (культурные растения и родственные дикие виды), включающую более 320 000 образцов. Основная часть коллекции ВИР представлена видами растений, размножаемых семенами. Для долгосрочного сохранения этих коллекций используются методы низкотемпературного хранения семян. Однако коллекции таких важных сельскохозяйственных культур, как плодовые, ягодные, декоративные, некоторые овощные, картофель, можно стабильно воспроизводить только при вегетативном размножении. Хранение их генофонда в виде семян невозможно, поскольку половое размножение разрушает генетическую структуру сортов, представленных высоко гетерозиготными генотипами. В ВИРе вегетативно размножаемые культуры поддерживают в основном в виде полевых коллекций.

Актуальность проблемы сохранения генофонда вегетативно размножаемых культурных растений постоянно возрастает, что связано с угрозой сокращения их генетического разнообразия в результате воздействия экстремальных абиотических факторов, заболеваний и вредителей.

В докладе приводится обзор современных технологий сохранения генофонда вегетативно размножаемых культурных растений в контролируемых условиях среды - in vitro и криохранения. Эти технологии включают: введение в культуру in vitro различных типов эксплантов, оздоровление растений от вирусных и бактериальных инфекций, микроразмножение, мониторинг фитосанитарного статуса микрорастений, генотипирование, среднесрочное in vitro хранение, криоконсервацию и долгосрочное криохранение.

В докладе особое внимание уделено исследованиям, проводимым в этих направлениях в институте растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР). В ВИРе в условиях in vitro сохраняется коллекция вегетативно размножаемых растений (представителей родов: Solanum, Rubus, Ribes, Lonicera, Fragaria, Allium), включающая около 700 образцов. Проведена успешная криоконсервация 80 местных сортов картофеля.

Тестирование растений на наличие вирусных инфекций проводится с использованием методов ELISA и ОТ-ПЦР. Для оздоровления микрорастений картофеля от вирусных инфекций используется модифицированный метод комплексной химио- и термотерапии.

Местные сорта картофеля и большинство селекционных сортов малины генотипированы с использованием SSR маркеров.

Секция 5

MAINTENANCE OF GENETIC DIVERSITY OF VEGETATIVELY PROPAGATED

PLANT CROPS UNDER CONTROLLED ENVIRONMENT IN VIR

Gavrilenko T.A., Dunaeva S.E., Antonova O.Y., Shvachko N.A., Shuvalova A.R., Krylova E.A., Ovchinnikpva A.B., Pendinen G.I., Cherepko M.M., Shuvalova L.E., Volkova N.N.

N. I. Vavilov All-Russian Research Institute of Plant Industry RAAS, 190000, St. Petersburg, Bolshaja Morskaja str., 42-44, tel. (812) 466-44-04, http://vir.nw.ru/biot/indexe.php, e-mail: t.a.gavrilenko@vir.nw.ru The N.I.Vavilov Institute of Plant Industry (VIR) holds one of the biggest and oldest germplasm collections worldwide. Its collection represents plant genetic resources (diversity of crop species and their wild relatives) encompassing more than 320 000 accessions. Long-term storage of seeds at low temperature is the most convenient, traditional method for plant germplasm conservation. However, this method is not applicable for vegetatively propagated species like fruits, small berry crops, potato.

Most germplasm of the vegetatively propagated crops at VIR is maintained in field collections. However, the collections are endangered by diseases, pests and abiotic stress. To avoid the possible loss of these germplasm collections, new strategies, technologies and information are needed.

Modern technologies of in vitro and cryopreservation provide the opportunity to create safe duplicates conserved under controlled conditions. These technologies include: the establishment of in vitro culture, elimination of viral and bacterial infections, micropropagation, monitoring of phytosanitary status of microplants, genotyping, medium-term in vitro storage, cryoconservation and long-term storage of cryocollections.

Detail information about current stay of in vitro and cryopreservation programs at VIR will be provided. At present, about 700 of clonally propagated stocks (representatives of Solanum, Rubus, Ribes, Lonicera, Fragaria, Allium genera) are stored under in vitro conditions at VIR. About 80 potato landraces are cryopreserved. ELISA and RT-PCR methods are used for testing of viral infections in microplants. Modified method based on chemo- and termotherapy is applied for virus eradication of potato microplants. Potato landraces and raspberry varieties were genotyped using SSR markers.

–  –  –

Государственное научное учреждение Всероссийский институт растениеводства им. Н.И.

Вавилова Россельхозакадемии, 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 42-44, тел. (812) 466-44-05, факс (812) 466-43-61, e-mail: dunaevase@mail.ru Генетические ресурсы вегетативно размножаемых растений в генетических банках сохраняют в полевых и крио коллекциях, предназначенных для длительного хранения, и в in vitro коллекциях, используемых для восстановления, размножения и среднесрочного хранения генотипов.

Каждая из них может служить в качестве дублетной коллекции, повышающей степень надежности сохранения генофонда. In vitro коллекции предназначены для оздоровления растений от патогенов, микроклонального размножения и сохранности генотипов растений в контролируемых условиях среды, для обмена сертифицированным растительным материалом с другими генбанками и для создания криоколлекций.

Наша работа ориентирована на формирование и сохранение в ВИРе in vitro коллекции преимущественно тех представителей рода Rubus L. (Rosaceae Adans.), которые присутствуют в природной флоре на территории России или получены отечественными селекционерами и отсутствуют (или незначительно представлены) в других генетических банках). В мировой флоре видовое разнообразие рода Rubus насчитывает 750 видов, распределенных по 16 подродам.

Наибольшее число видов сосредоточено в подродах Rubus (ежевики) – 132, Idaeobatus (малины) – 117, Malachobatus – (115) (Красовская, 2002). Виды двух первых подродов широко вовлекаются в современную селекцию. На территории России зарегистрировано 6 дикорастущих видов малин (Синькова, 1980) и около 80 видов ежевик (Синькова, 1983). Среди лесных малин самый обширный ареал распространения имеет малина обыкновенная (европейская) R. idaeus L. subsp. idaeus (один из родичей культурной малины). Среди дикорастущих видов ежевик наибольшее видовое разнообразие (46 видов, из них 31 вид – эндемики) отмечено в дикорастущей флоре Кавказа и Закавказья (Неронова, 1973).

Для формирования in vitro коллекции дикорастущих видов малин и ежевик преимущественно был использован растительный материал, собранный в экспедициях ВИР и Ботанического института им. В.Л. Комарова на территории России. Большинство собранных видообразцов малин морфологически описаны, гербаризированы и сохраняются в Гербарии Ботанического института им. В.Л. Комарова (LE). Видообразцы ежевик, собранные на территории Кавказа и Закавказья сотрудниками экспедиций ВИР (1937-1999гг.), поддерживаются в живом виде (22 вида, 32 экотипа) в полевой коллекции Майкопской опытной станции ВИР (Семенова и др., 2007). Этот материал, изученный по многим признакам (Грюнер, 1993, Добренков, 2007), гербаризирован и сохраняется в Гербарии ВИР (WIR).

Селекционный материал малины в коллекции in vitro, представлен, в основном, сортами отечественной селекции, большинство из которых сохраняются в полевой коллекции Павловской опытной станции ВИР. Эти сорта были генотипированы с использованием ISSR и SSR маркеров (Lamourex еt al., 2011). Сорта ежевики в коллекции in vitro имеют зарубежное происхождение, поскольку селекция ежевики в России и странах СНГ практически не проводится.

Таким образом, in vitro коллекция представителей рода Rubus в ВИРе включает 182 образца (генотипа). Из них 12 дикорастущих видообразцов малин (включая 35 экотипов европейской лесной малины), 22 дикорастущих видообразца ежевик, 89 сортов малины (из них 64 сорта российской селекции) и 25 сортов ежевики. Сорта ежевики в коллекции in vitro паспортизированны с помощью изоферментных маркеров (Дунаева и др.,2005).

–  –  –

N.I. Vavilov All-Russian Research Institute of Plant Industry RAAS, 190000, St. Petersburg, Bolshaja Morskaja str., 42-44, tel. (812) 466-44-05, fax (812) 466 43 61, e-mail: dunaevase@mail.ru In genebanks the genetic resources of vegetatively propagated plants are preserved in field and cryo collections, aimed for long term storage and in in vitro collections, used for recovery, reproduction and medium-term storage of genotypes. Each of them can serve as a doublet collection, which increases the reliability of the conservation of the gene pool. In vitro collection serves for the eradication of field growing plants from pathogens, micropropagation and conservation plant genotypes under controlled environmental conditions, for the exchange of certified plant material with other genebanks and for the establishment of cryocollections.

Our work is directed on conservation under in vitro condition the representatives of genus Rubus L. (Rosaceae Adans.) which are present in natural flora of Russian Federation.

Genus Rubus is divided into 16 subgenera which include about 750 species (Krassovskaja, 2002), most of them are concentrated in the subgenus Rubus (blackberry, 132 species) and Idaeobatus (raspberry, 117 species). In flora of Russia 6 species of raspberry are noted (Sinjkova, 1980), of which european raspberry R. idaeus L. subsp. idaeus has the vast area of distribution in Russia. Of the 80 species of blackberries found in Russian Federation, 46 species are described in the Caucasus, which is one of the centers of origin of blackberries (Neronova, 1973); 31 species from them are endemics.

For establishing VIR’ in vitro collection of wild species accessions we used mainly plant material collected by expeditions of VIR and the Komarov Botanical Institute. Most of wild species accessions of raspberries were morphologically described; their herbarium samples are stored in the herbarium of the Komarov Botanical Institute (LE). Accessions wild species of blackberries were collected in the Caucasus region during the VIR expeditions (1937-1999).

These samples studied in many aspects (Gruner, 1993; Dobrenkov, 2007) are presented in the herbarium of the VIR (WIR). The living accessions are also maintained in the field collection of the Maikop experimental station of VIR (Semenova et al, 2007).

In vitro collection of raspberry varieties was initiated on the basis of genotyped plants (ISSR and SSR markers, Lamourex et al., 2011) from the field collection of Pavlovsk Experimental Station of VIR. The vast majority of blackberry varieties stored in vitro were developed in the U.S., because blackberries’ breeding is practically absent in Russia. Blackberry varieties in the in vitro collection were genotyped by isozyme markers (Dunaeva et al., 2005).

Thus, in vitro collection of representatives of Rubus genus at VIR includes 182 accessions (genotypes). There are 89 vareities of raspberry and 25 varieties of blackberries and 34 wild species accessions.

–  –  –

ПОДБОР ИНФОРМАТИВНЫХ ПРАЙМЕРОВ К ПОЛИМОРФНЫМ

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ КАРТОФЕЛЯ

Есимсеитова А.К., Шустов А.В., Какимжанова А.А.

РГП «Национальный центр биотехнологии», Казахстан, г. Астана В настоящее время картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных овощных культур, возделываемых практически во всех peгионах Казахстана. Большое значение для современных биотехнологических исследований, а также селекции хозяйственно-ценных культур и семеноводства имеет разработка методов паспортизации сортов растений на основе молекулярных маркеров.

Одна из наиболее информативных ДНК-систем молекулярного маркирования сельскохозяйственных культур являются микросателлитные последовательности ДНК (SSR).

К преимуществу метода микросателлитного анализа можно отнести возможность создания на его основе эффективной универсальной технологии, пригодной для контроля интрогрессии генетического материала при отдаленных скрещиваниях, для различения и идентификации источников, доноров, гибридов и сортов сельскохозяйственных растений.

Целью исследований являлось оптимизация условий амплификации ДНК и подбор, наиболее информативных микросателлитных праймеров для идентификации и паспортизации сортов и гибридов картофеля.

В качестве материала исследовани использовали 34 отечественных и зарубежных сортов картофеля, возделываемых в Казахстане и 17 гибридов. Для идентификации генотипов картофеля применяли 23 SSR-праймеров.

ДНК выделяли из проращенных ростков картофеля с использованием модифицированной методики Edwards (1991). Качество и количество полученных препаратов ДНК определялось спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм на «Nanodrop 1000». Условия ПЦР соответствовали рекомендациям разработчиков праймеров, в ряде случаев условия ПЦР были оптимизированы (Ghislain M. et al., 2009).

Для SSR-анализа полимеразную цепную реакцию проводили в объеме реакционной смеси 30 мкл содержащей: 10х Tag буфер, MgCl2 (25 mM), смесь 4 dNTPs (2 mM), прямой и обратный праймеры (10 pM), Tag ДНК полимераза (2 ед/мкл), ДНК (15 нг/мкл).

В результате исследований подобрали режим амплификации ДНК - предварительная денатурация при 94 0С в течение 5 минут, следующие 30 циклов: денатурация при 94 0С – 30 секунд, отжиг 30 секунд с подобранной температурой в зависимости от праймера, синтез при 72 0С – 30 секунд, конечная элонгация при 72 0С в течение 5 минут. Амплификацию ДНК при использовании SSR маркера проводили в амплификаторе Eppendorf Mastercycler pro.

На следующем этапе выполняли электрофоретическое разделение продуктов амплификации с SSR праймерами в полиакриламидном геле с использованием камеры для вертикального электрофореза с 1хТАЕ-буфером. Готовый гель окрашивали бромистым этидием, фрагменты ДНК анализировали в трансиллюминаторе и фотографировали с использованием компьютерной программы QuantityOne.

Таким образом, для идентификации и паспортизации генотипов картофеля была подобрана температура отжига – 50, 53, 55, 57, 58 и 60°с в зависимости от праймера. Подбор оптимальных условий амплификации ДНК и эффективных SSR-праймеров к полиморфным микросателлитным локусам позволит нам в дальнейшем идентифицировать и различить сорта и гибриды картофеля.

–  –  –

RSE "National Center for Biotechnology", Kazakhstan, Astana Currently, potato is one of the most important agricultural crops cultivated in almost all regions in Kazakhstan. Of great importance for the modern biotechnology research, crops breeding and seed production is the development of methods for certification of plant varieties on the basis of molecular markers.

One of the most informative DNA molecular markers for crop plants are the microsatellite DNA sequences (SSR).

Among the advantages of the method of microsatellite analysis are the ability to develop widely applicable technology utilized to control the introgression of genetic material from distant crosses, to distinguish and identify the sources, donors, hybrids and varieties of plants.

The aim of this study was to optimize the conditions of DNA amplification and selection of the most informative microsatellite primers for the identification and certification of potato varieties and hybrids.

The material for the study was 34 domestic and foreign varieties of potato grown in Kazakhstan and 17 hybrids. To identify potato genotypes we used 23 SSR primers. DNA was extracted from germinated potato sprouts using a modified procedure of Edwards (1991). The quality and quantity of the DNA preparations were determined spectrophotometrically at 260 nm with the Nanodrop 1000. The PCR conditions corresponded to those recommended by the vendors of SSR primers; in some cases PCR conditions were optimized (Ghislain M. et al., 2009).

The SSR-polymerase chain reaction analysis was done in 30 µl reaction mixtures containing: 10xTag buffer, MgCl2 (25 mM), a mixture of four dNTPs (2 mM), forward and reverse primers (10 pM), Tag DNA polymerase (2 un/µl), and a matrix DNA (15 ng/µl).

Preliminary studies allowed selection of the most efficient PCR conditions: pre-denature at 94 °C for 5 min, following 30 cycles of 30 sec at 94 °C (denaturation), 30 sec at annealing temperature selected depending on the primers’ properties and 30 sec at 72 °C, with the final extension at 72 °C for 5 min. DNA amplification for SSR markers was performed in the Eppendorf Mastercycler Pro.

The following step for SSR analysis was electrophoretic separation of the amplification products in the polyacrylamide gels using vertical chamber and 1xTAE electrophoresis buffer system. Gels were stained with ethidium bromide, DNA fragments were analyzed on a transilluminator, photographed and analyzed using the QuantityOne software.

This work resulted in selection of the optimal annealing temperatures (50, 53, 55, 57, 58 or 60 °C) for the set of SSR primers, and development of the protocol for identification and certification of potato genotypes for mentioned varieties. The developed protocol for SSR analysis of the polymorphic microsatellite loci in potato will further enable us to identify and distinguish varieties and hybrids of potato in the Kazakhstan.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, 630090, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, д. 101, тел. (383) 330-41-01, факс (383) 334-44-33, e-mail: zhelez05@mail.ru Селитрянка – это галофитный засухоустойчивый кустарник, произрастающий на солонцеватых грунтах. Благодаря своим биологическим особенностям она перспективна в защитном лесоразведении, может использоваться для укрепления песков, снижения засоленности почв. Представители этого рода произрастают в жестких климатических условиях и их семена обладают высокой степенью покоя. Органический покой связан с анатомическим строением покровов семени и, вероятно, со свойствами зародыша. Биология прорастания семян видов рода Nitraria L. мало изучена. Использование биотехнологических приемов позволяет не только исследовать некоторые аспекты данной проблемы, но также и преодолевать покой в условиях in vitro.

Цель работы заключалась в оптимизации режима проращивания семян Nitraria sibirica Pall.

в условиях культуры ткани. Материалом для исследования служили зрелые семена из четырех популяций Алтайского края, Республики Алтай и провинции Внутренняя Монголия (КНР), находящихся в условиях с разным уровнем засоления почвы. Стерилизацию материала проводили ступенчато при помощи 30% Н2О2. Промытые семена оставляли на сутки при комнатной температуре, затем повторяли стерилизацию. Выход стерильного материала составлял около 75%.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

Похожие работы:

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом факультете кафедрой гуманитарных и естестве...»

«Федеральная целевая программа Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки на 1997-2000 годы· экология Под редакцией докт. техн. наук, проф. Г В. Тягунова,...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 574 496 C1 (51) МПК G08G 1/01 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2014127098/11, 03.07.2014 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Давыдов Юрий Львович (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Шемигон Николай Николаеви...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учр...»

«Изумрудная сеть: инструмент охраны естественной среды обитания в Европе Европа и биологическое разнообразие Во всём мире продолжается сокращение биологического разнообразия. Фрагментация местообитаний, загрязнение, чрезмерная эксплуатация территорий и создание искусственных лан...»

«ОГРАНИЧЕНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ И РЕАБИЛИТАЦИЯ ПРИ НАРУШЕНИЯХ РИТМА СЕРДЦА Санкт Петербург СпецЛит УДК 616 036.8 О 39 Авторы составители: Заболотных Инга Ивановна — доктор медицинских наук; Кантемирова Раиса Кантемировна — кандидат медицинских наук; Ишутина Инна Сергеев на; Старобина Елена Михайловна — доктор педагогически...»

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как и выживаемость, привлекает многих ученых. Однако сами эти понятия в русском языке несут, ск...»

«УДК 612.017.1:616-097 КОЛИКОВА ЮЛИЯ ОЛЕГОВНА АУТОАНТИТЕЛА К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2003 Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета Научный руководитель: Доктор биологических наук, профе...»

«Для экологического номера Journal of Eurasian Research в 2004 г. Экологическое образование в сообществах Евгений Патаракин, Сергей Шустов Ключевые слова: экологическое образование, сетевые сообщества Введение В последне...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижневартовский государственный университет" Кафедра экологии Фонд оценочных средств дисциплин...»

«Министерство культуры Российской Федераци ФГБУК "Государственный историко-архитектурный и этнографический музей-заповедник „Кижи“" Карельский научный центр Российской академии наук Бюллетень экологических исследований на территории музея-заповедника "Кижи" 2013 год Петрозаводск Издательский центр музея-заповедника "Кижи" УДК 502.7 ББК 20....»

«03.06.01 Физика и астрономия Направления № Научное направление Коды по ГРНТИ научноисследовательс 29.35; 29.37; 29.19; Физика кой 29.33; 29.19 деятельности Университет, позиционируя себя на российском и Стратегия научномеждународном научно-образовательном пространстве исследовательс как центр образования, на...»

«Приказ Минздрава России от 15.11.2012 N 927н Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пострадавшим с сочетанными, множественными и изолированными травмами, сопровождающимися шоком (Зарегистрировано в Минюсте России 21.01.2013 N 26634) Документ предоставлен...»

«УДК504.064.36 И. А. ШВЕДЧИКОВА, д-р. техн. наук, проф. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк;9 И. В. НИКИТЧЕНКО, асп. ВНУ им. В. Даля, Северодонецк ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЕ СИСТЕМЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПАРАМЕТРОВ ШАХТНЫХ ВОД Определены основ...»

«ISSN 1994-0351. Интернет-вестник ВолгГАСУ. Сер.: Политематическая. 2014. Вып. 2 (33). www.vestnik.vgasu.ru _ УДК 504.056 И. К. Яжлев МЕХАНИЗМ ГАРАНТИРОВАННОЙ ЛИКВИДАЦИИ НАКОПЛЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО УЩЕРБА ПРИ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ГОРОДСКИХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ТЕРРИТОРИЙ Ра...»

«Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВО О РЫБОЛОВСТВЕ И СОХРАНЕНИИ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ В ВОПРОСАХ И ОТВЕ...»

«Ученые записки Таврического национального университета имени В. И. Вернадского Серия "География". Том 27 (66), № 2. 2014 г. С. 3–15. РАЗДЕЛ 1. ФИЗИЧЕСКАЯ ГЕОГРАФИЯ И ГЕОЭКОЛОГИЯ УДК 620.91:712.253.58 "ЗЕЛЁНАЯ" ЭНЕРГЕТИКА В САДОВО-ПАРКОВЫХ КОМПЛЕКСАХ Б...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологические основы устойчивого водопользования/2 года ОФО; 05.04.06 Экология и Учебный план: природопользование: Ге...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г.ЧЕРНЫ...»

«База нормативной документации: www.complexdoc.ru МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ ПРИКАЗ 20 июля 2009 г. № 640 Моск...»

«ПРЕДСТАВИТЕЛИ АКЦИОНЕРА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ: ОПЫТ ДТЭК Евгений Круть Менеджер Департамента по корпоративному управлению ДТЭК ДАТА: 03.06.2016, Г. КИЕВ КОНФИДЕНЦИАЛЬНО ВМЕСТО ПРЕДИСЛОВИЯ. "ВЫ НЕ ПОМНИТЕ, КТО ТАКИЕ ЮРИДИЧЕСКИЕ ЛИЦА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ, ЭТОГО НЕ БЫЛО!!!" Сноски ЧТО НАМ ГОВОРИТ ЗАКОН? С 01.05.2016 в Украине появился новый...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.