WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 ||

«The X International Conference “Plant Cell Biology In Vitro and Biotechnology” ABSTRACTS Kazan, October 14-18, 2013 УДК [581.17+663.1](063) The X International ...»

-- [ Страница 9 ] --

10, факс: +7(282)333-12-78; тел: +7(383) 363-49-27, e-mail: pershina@bionet.nsc.ru Siberian Agricultural Research Institute, SB RAAS, Omsk, e-mail: belan_skg@mail.ru In our studies show that using of method in vitro promotes increase the efficiency of chromosome engineering aimed an increase in genetic diversity of common wheat. Methods in vitro to overcome an embryonic incompatibility in crosses between plants of different species, to reproduce unique genotypes of hybrid origin, to induce somaclonal variation, to accelerate the production of homozygous introgression and recombinant lines are important when developing new genotypes of common wheat carrying alien genetic material and which are of interest for breeding. Using embryo culture, cultivations of young inflorescences and anther culture made it possible to produce new hybrid combinations of common wheat and introduce a genetic material of wild barley H.marinum ssp.gussoneanum in the genome of common wheat, to create a series of alloplasmic introgressive and recombinant lines of common wheat carrying the cytoplasm of barley H.vulgare and H.marinum ssp.gussoneanum, to produce homozygous lines combining alien genes, determining resistance to stress factors and the expression of valuable agronomic traits. Many of these lines have been successfully used in the breeding. As a result of these experimental investigation and breeding the variety of spring common wheat ‘Sigma’ and a number of promising lines with pyramiding genes determined resistance to fungal pathogens were developed.

Секция 6

МОЛЕКУЛЯРНО -ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИНИЙ

РЕГЕНЕРАНТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ

Райзер О.Б., Хапилина О.Н.

Республиканское государственное предприятие Национальный центр биотехнологии, Астана, 010000, ул. Валиханова 13/1, факс: (7172) 21 -46-33, тел. (7172) 20-07-91, e-mail: lbps@biocenter.kz Методы селекции in vitro в сочетании с традиционной селекцией позволяют получать селекционный материал, сочетающий устойчивость к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам среды с высокой продуктивностью и качеством.

ДНК-технологии довольно широко используются для оценки внутривидового разнообразия растений, для идентификации генетической оригинальности сомаклональных вариантов и защиты прав селекционеров. Многие методы ДНК-анализа являются высокоинформативными, хорошо воспроизводятся, надежны при установлении индивидуальных особенностей генотипа. Основной проблемой исследования сомаклональной вариабельности является необходимость разработки методов детекции для выявления значительных генетических различий между регенерантами и оригинальными формами. Идентичность или оригинальность клонов имеет большое значение для коммерческого размножения растений-регенерантов. Маркерные системы на основе ретротранспозонов - IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) и REMAP(Rеtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymophism) были использованы для детекции сомаклональной вариабельности, индуцируемой селективными агентами в культуре тканей. Основной чертой многих ретротранспозонов является их активация под воздействием биоического или абиотического стресса. Многие изученные ретротранспозоны растений повреждаются в процессе культивирования клеток и тканей in vitro, поэтому они могут быть использованы в качестве маркеров для изучения полиморфизма сомаклональной вариабельности растений (Bradley C. Campbell et all, 2012).





Целью исследований являлась идентификация генетической оригинальности 11 линий регенерантов яровой мягкой пшеницы, созданных различными методами селекции in vitro с использованием NaCl, PEG-6000 и культуральных фильтратов патогенных грибов (F. graminearum, A. alternata). Линии регенерантов были получены на основе константной линии 285/94-1.

Эстракция геномной ДНК проводилась с использованием CTAB-метода, в соответствии с протоколом Doyle & Doyle (1987). Для IRAP и REMAP амплификации использовали LTR-праймеры, сконструированные для консервативного региона ретротранспозонов BARE-1, характерного для ячменя (Hordeum vulgare).Условия IRAP- и REMAP- амплификации и электрофоретической детекции продуктов амплификации были в соответствии с Kalendar R. & Schulman AH (1999, 2006). Все реакции проводились дважды. По результатам анализа было амплифицировано достаточно много бендов – 892, из которых 437 были полиморфны. Размеры фрагментов варьировали от 150 до 4000 bp.

Полиморфизм, детектируемый IRAP-методом, составил 53,5%, что гораздо ниже этого показателя при REMAP-анализе -72,5%. Количество фрагментов, детектируемых на 1 праймер, варьировало от 3 до 16. Для дальнейших исследований были выбраны 2 праймера IRAP (Sukkula and Nikita), и 2 комбинации REMAP-праймеров (Sukkula+8081, Sukkula+8082) с наибольшим уровнем полиморфизма. Регенеранты, полученные с использованием культуральных фильтратов, имели более вариабельные спектры амплификации и, соответственно, более высокое значение полиморфизма - 94,7%. Этот показатель у линий, полученных на средах с абиотическими стрессорами, был гораздо ниже и составил 55,4%. Результат амплификации был представлен в виде формулы, характеризующей полиморфизм каждой линий. Каждому праймеру присвоено буквенное кодирование, с соответствующей индексацией локусов. Данные формулы могут быть использованы для разработки молекулярно-генетических паспортов линий и сортов пшеницы.

Секция 6

MOLECULAR -GENETIC IDENTIFICATION OF REGENERANTS

OF SPRING WHEAT USING RETROTRANSPOSONS

Raiser O.B., Нapilina O. N.

Republican State Enterprise National Center for Biotechnology Astana, 010000, st. Valikhanova 13/1, fax: (7172) 21-46-33, tel. (7172) 20-07-91, e-mail: lbps@biocenter.kz The methods of selection in vitro in combination with traditional breeding allow to get plant-breeding material combining resistance to the unfavorable abiotic and biotic factors of the environment with high productivity and quality. DNA technology quite widely used to assess the intraspecific diversity of plants, to identify the genetic originality of somaclonal variants and protection of breeders' rights. Many methods of DNA analysis are highly informative, well-played, and reliable in determining the individual characteristics of the genotype.

A major problem with studies of somaclonal variants is the necessity to develop reliable methods for determining significant genetic differences between regenerants and original forms.

Identity or originality of clones is important for the commercial reproduction of regenerated plants. The retrotransposon-based marker system, inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP), and rеtrotransposon-microsatellite amplified polymophism (REMAP) were used to detect somaclonal variation induced by selective agents in tissue culture. A general feature of many retrotransposons is their activation by biotic and abiotic stress. Many well characterised plant retrotransposons are particularly affected by protoplast isolation or in vitro cell or tissue culture because they can be used as markers for studying polymorphism somaclonal variants plants (Bradley C. Campbell et all, 2012).

The aim of the research was to identify the genetic originality 11 lines of regenerants of spring wheat, created using different methods of selection in vitro with use NaCl, PEG-6000 and cultural filtrate of pathogenic fungi (F. graminearum, A. alternata). These lines obtained based on the constant line of spring wheat N 285/94-1.

DNA extraction was based on the hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) technique, as described by Doyle & Doyle (1987). For IRAP and REMAP amplifications, we used LTR primers designed to the conserved regions of the Hordeum vulgare RTN BARE-1. The PCR reaction mixtures, the conditions of amplification, electrophoresis and detection of the amplified products were the same for IRAP and REMAP, following Kalendar R. & Schulman AH (1999, 2006). All reactions were repeated twice.

The both methods amplified the highest number of bands (892) and 437 of them were polymorphic. Size of amplified fragments varied from 150 to 4000 bp. The IRAP average percentage of polymorphism (53,5%) was quite lower than that of REMAP (72,5%). The number of amplified fragments was varied for each primer and ranged from 3 to 16. Four most informative primers - 2 IRAP (Sukkula and Nikita), and also two combinations of REMAP primers of (Sukkula+8081, Sukkula+8082) whose spectra were maximally saturated with high level of polymorphism were as a result selected. Regenerants which were obtained using the cultural filtrate of pathogenic fungi had the most variable amplification spectrums. The overall level of polymorphism in these lines was 94,7%. This index at the lines which were obtained on media with abiotic stressors was much lower - 55,4%.

The result of amplification was presented as a formula that characterizes polymorphism of every line on the studied IRAP- and REMAP- markers. Each primer was given the letter coding. The amplified loci have been indexed in accordance with the size of the fragments. These formulas can be used for development of molecular-genetic passports of lines and sorts of wheat.

Секция 6

ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕННЫХ ФОРМ ПШЕНИЦЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНОЙ

ТЕХНОЛОГИИ ДЛИТЕЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ

Рахимбаев И.Р., Бишимбаева Н.К., Амирова А.К., Парменова А.К., Шилманова А., Касымхан К., М.К. Карабаев РГП «Институт биологии и биотехнологии растений» МОН РК, г. Алматы, ул. Тимирязева, 45, тел./факс: 8(727)3947562, e-mail:

Из-за важного продовольственного и экспортного значения пшеницы, настороженного отношения общественности к генетически модифицированным объектам использование методов генетической инженерии для улучшения этой культуры в Казахстане ограничено. В связи с этим, одним из основных дополнительных биотехнологических инструментов повышения генетического разнообразия отечественной пщеницы считается изменчивость, накапливаемая клетками в процессе культивирования in vitro и передающаяся полученным из них растениям-регенерантам (Larkin, Scowcroft, 1981; Сидоров, 1990). Нами разработана генотип-независимая клеточная технология длительной регенерации растений, которая позволяет преодолеть различия между сортами и линиями пшеницы в способности к регенерации растений.

Это позволяет многократно получать растения-регенеранты у любых коммерчески важных сортов и перспективных линий по заказу селекционеров. Ранее существующие методы клеточной и генетической инженерии реализовывались с использованием генотипов, обладающих высокой регенерационной способностью, но не всегда коммерчески ценных. В настоящее время данная технология используется нами для изучения изменчивости in vitro. В результате, выявлен широкий спектр генетической изменчивости у сомаклональных линий по количественным признакам (высота растений, длина главного колоса, число зерен в колосе, масса зерен с колоса) и качественным признакам (окраска зерен, размер, окраска и форма колосковых чешуй, остистость).

Необходимо отметить, что характер изменений признаков у изученных нами сомаклонов находится в существенной зависимости от исходного генотипа и значительно различается у разных сортов и гибридов, что согласуется с литературными данными. Так, у сомаклонов с. Отан наблюдалась тенденция к выщеплению короткостебельных и карликовых форм. У сомаклонов с. Целинная-3С, напротив обнаружены высокорослые линии, которые характеризовались скороспелостью. У с. Казахстанская-25 получены сомаклоны с антоциановой окраской ушка. У гибридной линии Г-4 выщепились остистые формы. Общей тенденцией было появление сомаклональных вариантов с крупным и озерненным колосом, с изменением формы окраски зерна, и колосковых чешуй.

На основе разработанной нами клеточной технологии получены скороспелые формы с комплексом хозяйственно-ценных признаков (повышенная продуктивность, устойчивость к полеганию и т.д.) на основе нескольких генотипов яровой пшеницы.

Предварительные экологические испытания в Центральном и Северном Казахстане показали, что скороспелые СЛ сорта Целинная-3С можно отнести к разряду среднераннеспелых и перспективных с точки зрения районирования в этих регионах.

Положительным моментом является сохранение ранее выявленного превышения биологической урожайности у скороспелых форм по сравнению с значениями данного показателя у исходных сортов, и сохранение у сомаклонов высоких показателей качества зерна характерных для «сильных пшениц». В данное время с целью получения новых форм с ценными признаками получены растения-регенеранты двадцати шести коммерчески важных сортов, возделываемых в Казахстане.

Перспектива – использование технологии длительной регенерации в гаплоидии для получения гаметоклональных вариантов с улучшенными признаками.

Секция 6

OBTAINING OF VALUABLE WHEAT FORMS BY THE USE OF LONG-TERM PLANT

REGENERATION CELL TECHNOLOGY

Rakhimbayev I.R., Bishimbayeva N.K., Amirova A.K., Parmenova A.K., Shilmanova A.A., Кasymkhan K., Karabayev M.K.

Republican State Enterprises "Institute of Plant Biology and Biotechnology" Almaty, Timiryazeva street, 45, tel./fax: 8 (727) 3947562, e-mail: gen_jan@mail.ru For the reason of the significance of wheat as important domestic export product as well as because of the awareness of society against the genetically modified objects, implementation of genetic engineering methods for wheat improvement in Kazakhstan is limited. In this regard, the one of the basic biotechnological instruments that allows to increase genetic diversity of domestic wheat is variability, gained by cells in the process of cultivation in vitro and inherited to regenerated plants (Larkin, Scowcroft, 1981; Сидоров, 1990).

We have developed genotype-independent system of plant regeneration during longterm subcultivation that allows to overcome the differences in plant regeneration capabilities between the wheat varieties and lines. This allows to obtain plant-regenerants repeatedly from any commercially valuable cultivars and perspective lines according to the breeders order.

Earlier existent methods of cell and genetic engineering have been fulfilled with the use of genotypes with high regeneration capabilities but not always commercially valuable. Currently, long-term in vitro plant regeneration technology has been successfully used in our research targeted to genetic improvement of wheat. In our research we identified the wide spectrum of genetic variability in somaclonal lines on their quantitative traits (height of plants, length of main ear, quantity of grains in ear, mass of grains per ear) and qualitative traits (colour of seeds, size, colour and form of spicate scales, awnity). It is important to point out, that the changes of traits in studied somaclonal lines are significantly depend from the initial genotype and significantly differs in different varieties and hybrids, that is in accordance to the data suggested in literature. Thus, somaclonal lines of Otan cv. were observed to have a tendency to arising of short stem and carlic forms. In contrast, somaclonal lines of v. Celinnaya-3C were found to have high stem lines characterized by precocity. Somaclonal lines of Kazakhstanskaya-25 cv. were characterized with antocian coloured ear. From hybrid line G4 awned somaclonal forms of have been developed.. The general tendency in all varieties has become the appearance of somaclonal lines with large and high yield grained ear, with changes in grain’s and spicate scale’s shape and colour. On the basis of developed long-term regeneration cell technology we obtained precocious forms with the complex of agriculturally valuable traits (high productivity, resistance to lodging, etc.) on several genotypes of the spring wheat. Preliminary ecological trial in Central and North Kazakhstan revealed that precocious lines of Celinnaya 3 variety can be classified as medium precocious lines with high perspective in terms of zoning in this regions.

The main achievement that was revealed is that previously determined escalation of biological yield and “strong wheat” quality characteristics remains at the same high level in precocious forms in comparison with initial forms during this trial. Now, in order to obtain new forms with valuable traits we obtained regenerated plants of twenty six commercially important cultivars, grown in Kazakhstan.

The use of long-term regeneration technology opens the perspective to be implemented in haploid technology for obtainment of hametoclonal lines with improved traits.

Секция 6

ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ СХЕМ СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К

ФИТОФТОРОЗУ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ГИБРИДОВ КАРТОФЕЛЯ

Сарсекова А.Н., Измагамбетова А.Ж., Нечай Н.Л., Есимсеитова А.К., Какимжанова А.А.

РГП «Национальный центр биотехнологии», (Казахстан, г. Астана) Фитофтороз картофеля, или картофельная гниль, считается самым вредоносным заболеванием этой овощной культуры в большинстве стран мира. В самых сложных случаях недобор урожая может достигать 70%. Болезнь поражает листья и клубни.

Главная опасность заболевания заключается в огромной скорости ее развития. Как и в предыдущие годы, проявление фитофтороза отмечалось практически во всех регионах Республики Казахстан, как на производственных посадках, так и в частном секторе.

Фитофтороз картофеля распространен во всех областях страны, где возделывают картофель. Оно вызывается грибом Phitophtora investans. В связи с этим, исследования были направлены на изучение возможности создания форм картофеля, устойчивых к данному заболеванию.

Целью исследований являлось оптимизация метода селективного отбора устойчивых к фитофторозу форм картофеля с использованием биотехнологических методов. Схема эксперимента состояла в индукции каллусогенеза гибридов картофеля и последующего отбора, устойчивых каллусных линий на средах Мурасиге и Скуга с культуральным фильтратом (КФ) гриба P. investans, который использовали в качестве селективного фактора. Также для получения устойчивых каллусных линий картофеля использовали двойной слой питательной среды. Первый слой среды состоял из овсяной среды с растущим на нем штаммом гриба P. infestans, второй слой состоял из питательной среды МС.

В качестве объектов исследований служили 21 гибридов картофеля казахстанской селекции. С помощью методов вычленения и культивирования апикальных меристем были получены пробирочные стерильные растения гибридов, которые использовали в качестве эксплантов для дальнейших работ.

В результате исследований подобраны питательные среды для индукции каллусов гибридов картофеля. Использовали восемь вариантов сред с различным соотношением гормонов, витаминов, антиоксидантов. На всех питательных средах наблюдали формирование каллусной ткани, но наиболее оптимальной для быстрого роста морфогенных структур была среда с содержанием фитогормонов 2-4 Д - 1 мг/л и БАП мг/л.

Проведена оптимизация схем клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу для получения устойчивых каллусных линий картофеля, для этого пассировали полученные первичные каллусы на селективные среды с КФ - 5, 10, 20, 30 и 50%.

Процент образования устойчивых каллусных линий в среднем по шести неустойчивым к фитофторозу гибридам картофеля варьировал от 6,25% до 85,7%. Высокий процент роста устойчивых каллусных линий к КФ гриба Phytophthora infestans выявлено на среде МС+5% КФ, что составило 85,7%.

Низкий процент формирования устойчивых каллусов наблюдали при использовании концентрации 50% КФ – 6,25%, 30% КФ – 20,9%. Оптимальными концентрациями для клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу являются 10%, 20%, 30% КФ. Для получения растений-регенерантов гибридов картофеля, с селективных сред с КФ гриба Ph. infestans каллусные линии были пассированы на питательную среду МС для регенерации. В настоящее время полученные пробирочные растения-регенеранты гибридов картофеля с селективных сред микроклонально размножаются и будут высажены в пленочную теплицу.

Использование местных штаммов гриба Phytophthora infestans позволит получить ценные формы картофеля, устойчивые к фитофторозу для Казахстана, которые будут идентифицированы и паспортизированы с помощью молекулярно-генетического анализа.

Секция 6

SELECTION OF THE OPTIMAL SELECTION SCHEME FOR RESISTANCE TO

LATE BLIGHT IN POTATO

Sarsekovа A.N., Izmagambetova A., Nechay N.L., Esimseitova A.K., Kakimzhanova A.A.

–  –  –

Potatoes late blight, or potato rot, is one the most harmful disease of this crop in majority of the world countries. In severe cases, loss of potato crop due to late blight can be up to 70%. The disease affects leaves and tubers. The main danger of the disease is the tremendous speed of its dissemination. For years, manifestation of late blight disease has been noted in almost all regions of the Republic of Kazakhstan, both in the industrial crop production and in the private farmers fields.

Potato late blight is prevalent in all areas of the country where the potato is cultivated.

It is caused by a fungus Phitophtora investans. Therefore, much effort has focused on the development of potato forms resistant to the disease.

Aim of this study was to optimize the selection of the forms of potato resistant to the late blight using biotechnological methods. The experimental scheme implied induction of callus formation from tissues of potato hybrids and subsequent selection of resistant calluses on medium (Murashige and Skoog, MS) containing additions of the culture filtrate (CF) of P.

investans, the latter being a phytotoxic selective factor. Also, for sustainable potato callus lines we used a double layered medium. The first layer was the oatmeal medium with a growing P.

infestans, the second layer was MS medium.

We studied 21 potato hybrids of Kazakhstan selection. Using the methods of isolation and culturing of the apical meristems we obtained sterile test tube plants, which were used for explants for further work.

As a result, the nutrient medium to induce potatoes callus generation was chosen. We used eight variants of media with different compositions of plant hormones, vitamins and antioxidants. All culture media were tested for the effectiveness of the callus formation, the selected medium optimal for rapid growth of morphogenic structures contained phytohormones

- 2,4 D- 1 mg/l, BAP - 0.5 mg/l.

Protocols for cell selection of callus lines for resistance to late blight were optimized, for this purpose the primary calluses were passaged on selective medium with 5, 10, 20, 30 and 50% of CF.

Percentage of callus formation for the six potato lines susceptible to late blight varied from 6.25% to 85.7%. High percentage of stable growth of callus lines was found on MS medium +5% CF, which resulted in 85.7% efficiency of formation of calluses resistant to P.

investans.

Low percentage of formation of resistant calluses was observed using a concentration of CF 50% (6.25% efficiency of callus formation) and 30% of CF (20.9% efficiency). Optimal concentrations of CF for cell selection are 10%, 20%, 30%. The regenerated plants of potato hybrids were obtained on the MS medium for regeneration with addition of CF. Currently, the obtained test-tube plants of potato hybrids are subjected to selective breeding and micropropagation and further will be planted in the greenhouse.

The use of local strains of the fungus P. infestans will allow selection of valuable forms of potato resistant to late blight in Kazakhstan, the forms will be identified and certified by molecular genetic analysis.

–  –  –

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ СОЗДАНИИ

ПЛАНТАЦИЙ С КОРОТКИМ ЦИКЛОМ РОТАЦИИ

Сергеев Р.В., Новиков П.С., Большакова Е.Е., Шургин А.И.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Поволжский государственный технологический университет», 424000, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола, пл.

Ленина, дом 3., факс:

(836) 268-78-80, тел (836) 268-78-80, e-mail: rsergeyev@yahoo.com Выращивание ценных генотипов Populus tremula L. – один из путей повышения продуктивности лесных насаждений. Осина формирует высокопродуктивные древостои в 2 -2,5 раза быстрее деревьев хвойных пород. Качественная древесина P. tremula имеет большой спрос в различных отраслях деревообрабатывающей и деревоперерабатывающей промышленности 1. Существуют формы триплоидной осины, устойчивые к болезням и вредителям. Кроме того, такие деревья характеризуются полнодревесностью стволов и высокой продуктивностью 2.

В связи с этим, выращивание триплоидной осины, является очень перспективным и необходимым направлением, особенно в свете все возрастающей потребности общества в качественной древесине 1. С целью оптимизации гормонального состава среды для культивирования триплоидной осины, осуществлялся подбор оптимальных концентраций ауксинов и цитокининов. Изучалось влияние регуляторов роста на динамику развития регенерантов, коэффициент размножения и ризогенез. Экспланты P. tremula культивировали на питательной среде MS, различающейся по содержанию регуляторов роста.

В эксперименте было заложено 48 вариантов сред с различным содержанием фитогормонов ИМК, ИУК, БАП и Кин.

Через 5 недель культивирования была проведена оценка влияния ИМК, ИУК, БАП и Кин на мультипликацию побегов и ризогенез в культуре ткани Populus tremula L.

Обобщив полученные данные, можно сказать, что для интенсивной пролиферации побегов Populus tremula в культуре in vitro необходимо использовать питательную среду MS дополненную 0,1 мл/л ИМК и 0,1 или 0,5 мл/л БАП. Для интенсивного ризогенеза Populus tremula в культуре in vitro необходимо использовать питательную среду MS, дополненную 0,3 мл/л ИМК.

Литература

1. Газизуллин А.Х., Чернов В.И., Гарипов Н.Р., Исмагилов Р.И. Формы осины в лесах республики Татарстан // Аграрная Россия – М., 2009 – спец. выпуск – С. 19-20.

2. Петрова Г.А. Использование методов биотехнологии для получения здорового посадочного материала осины (populus tremula l.) в условиях республики Татарстан:

Автореф. дис.... канд. с.-х. наук. - М., 2011. – 25 с.

Секция 6

СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ

СИСТЕМЫ ДЛЯ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ

Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия, 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 10, тел.:

+7(383) 363-49-80, e-mail: sidorch@bionet.nsc.ru Суспензионные культуры генетически модифицированных клеток растений привлекают внимание исследователей как перспективные системы для продукции фармацевтических белков. В сравнении с целым растением клеточные культуры имеют значительное преимущество, поскольку дают возможность стандартизовать их по ростовым характеристикам, размерам и типам клеток. Культивирование в строго контролируемых условиях позволяет поддерживать стабильную скорость накопления продукта. В связи с этим создание клеточных линий с высоким биосинтетическим потенциалом и возможностью культивирования в биореакторах является весьма актуальной задачей.

В настоящей работе проводилось введение в культуру тканей различных видов двудольных растений, индукция и отбор каллусов по способности к максимальной пролиферации, введение каллусных культур в суспензию, оценка ростовых параметров суспензии, генетическая трансформация клеточных культур с использованием созданного вектора и оценка уровня экспрессии гетерологичного гена на примере репортерного гена gfp. В качестве исходного материала использовали 12 сортов и форм культурных растений, принадлежащих к 7 видам (Glyicine max, Glycine soja, Medicago varia, Lupinus angustifolius, Amaranthus hypohondriacus, Nicotiana tabacum, Daucus carota), отобранные по уровню накопления общего белка in vivo. Для введения в культуру in vitro в качестве эксплантов использовали котиледоны, гипокотили, эпикотили, семядольные узлы, семядоли, листья, стеблевые диски, черешки и зрелые зародыши. Индукцию и отбор активно пролиферирующих каллусных культур проводили с использованием двух базовых сред (Мурашиге и Скуга, а также среду Гамборга) с 19 вариантами фитогормонов.

Согласно оценке ростовых характеристик каллусных линий, индуцированных из различных типов эксплантов, были отобраны линии табака, амаранта и моркови, характеризовавшиеся максимально высокой скоростью пролиферации. Каллусные линии данных видов были переведены в суспензионные культуры. Полученные суспензионные культуры изучали по следующим параметрам: ростовой индекс, плотность суспензии и жизнеспособность клеток. Установлено, что при одинаковой с прочими культурами жизнеспособности клеток, наибольшим ростовым индексом характеризовалась суспензионная культура амаранта, биомасса которой на 15-й день культивирования увеличивалась в 10 раз по отношению к исходной массе клеток. Биомасса клеточных культур моркови и табака в эти же сроки увеличивалась в 6 и 7 раз, соответственно.

Показано, что содержание общего растворимого белка в клетках амаранта составляло 1,010±0,071 мг/г сырой массы, что втрое превышало его содержание в клетках моркови и табака (0,310±0,025мг/г и 0,3596±0,042 мг/г, соответственно). Анализ накопления гетерологичного белка GFP после проведения агробактериальной трансформации клеточных линий моркови, табака и амаранта выявил аналогичную закономерность. Наибольшим накоплением GFP-белка характеризовались суспензионная культура клеток амаранта, 1,145±0,0047 мг/г сырой массы.

В клетках суспензии моркови и табака накопление GFP-белка достигало лишь 0,412±0,004мг/г и 0,6513±0,0024мг/г сырой массы, соответственно. На основании сравнительного анализа трех отобранных видов растений установлено, что клеточная суспензия амаранта существенно превосходит клеточные суспензии табака и моркови по ростовым характеристикам, а также способности накапливать общий и гетерологичный белок, и может быть рассмотрена как кандидат для создания на ее основе линии-биопродуцента.

Секция 6

SUSPENSION CULTURES OF PLANT CELLS AS PERSPECTIVE SYSTEMS FOR

PRODUCTION OF HETEROLOGOUS PROTEINS

Sidorchuk Yu.V., Zagorskaya A.A., Deineko E.V.

The Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 630090, Novosibirsk, Lavrentyev av., 10, tel.: +7(383) 363-49-80, e-mail: sidorch@bionet.nsc.ru Suspension cultures of genetically modified plant cells are very attractive to the researches as perspective systems for farmaceutical proteins production. In comparison with the whole plant the suspension cultures have significant advantage. They can be standardized by growing parameters, cell types and sizes. Strictly controlled conditions allow to maintain a stable accumulation rate of the product. Thereby production of the cell lines with the high biosynthetic capacity and suitable for bioreactors is highly actual problem.

In this work 12 varieties and forms of different crops (Glyicine max, Glycine soja, Medicago varia, Lupinus angustifolius, Amaranthus hypohondriacus, Nicotiana tabacum, Daucus carota) selected by total protein accumulation in vivo were used as initial materials for in vitro culture induction. Cotyledons, hypocotyls, epicotyls, cotyledonary nodes, leaves, stem disks, petioles and mature embryos were used as explants. MS and B-5 media supplied by 19 variants of phytohormones were used for induction and selection of actively proliferating calluses.

Callus lines induced from different explants were estimated according their growth characteristics and the lines of tobacco, amaranth and carrot characterized by maximal proliferation value were selected. Suspension cultures were developed on the basis of these lines. Such parameters as growth index, suspension density and cell vitality were explored in obtained suspensions. Moreover qualitative composition of cell populations were described in suspension cultures by differential interference contrast (DIC) microscopy.

It is ascertained that for the same with the other cultures cell viability, amaranth suspension culture was characterized by the highest grow index. Its biomass increased 10-fold in relation to initial mass of the cell at day 15 of cultivation. The biomass of carrot and tobacco cell cultures increased in 6 and 7 times respectively for the same period.

It is shown that the content of total soluble proteins in amaranth cells was 1,010±0,071 mg/g of fresh weight that was three times more than the same parameter at carrot and tobacco cells (0,310±0,025 mg/g and 0,3596±0,042 mg/g respectively). The same pattern of accumulation of recombinant GFP protein was detected in carrot, tobacco and amaranth transgenic cell lines developed by agrobacterium-mediated transformation. Suspension cell culture of amaranth were characterized by the highest level of GFP accumulation (1,145±0,0047 mg/g of fresh weight). Accumulation of the GFP protein in suspension cell culture of carrot and tobacco reached the level of 0,412±0,004 mg/g and 0,6513±0,0024 mg/g of fresh weight respectively.

Based on a comparative analysis of three selected plant species it is established that the cell suspension of amaranth exceeds the cell suspensions of carrot and tobacco by grow characteristics and accumulation of total and heterologous proteins. Thus, the cell suspension of amaranth can be considered as candidate for developing bioproducer line.

Секция 6

ШТАММЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ – МОДЕЛЬ ИННОВАЦИОННЫХ

ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЙ

Слепян Л.И., Каухова И.Е., Кириллова Н.В., Громова О.Н., Н.С. Пивоварова.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт- Петербургская государственная химико- фармацевтическая академия Минздрава РФ, Санкт- Петербург, 197376, ул. проф. Попова, 14, факс: (812) 234-60-44, тел. (812) 234-90-34, e- mail: larisa.slepyan@pharminnotech.com В1963-1965гг в Санкт - Петербургской государственной химико фармацевтической академии (СПХФА) был создан банк штаммов ценных и редких лекарственных растений не произрастающих, или имеющих ограниченный ареал в России. Это: женьшень Panax ginseng C.F. Mey, панакс пятилистный Panax quinquefolius L., японский женьшень P.japonicus L., тропическое растение раувольфия Rauwolfia serpentina Benth. источник аймалина и других ценных алкалоидов. В дальнейшем в культуре in vitro были получены штаммы полисциаса папоротниколистного Polyscias filicifolia (Moore ex Fournier) Bailey и штамм юкки великолепной Yucca gloriosa L., как источник стероидных гликозидов. В настоящее время в банке клеточных культур СПХФА находится 17 штаммов ценных лекарственных растений, среди которых есть три селективных штамма, содержащих микроэлемент германий, как индуктор гаммаинтерферона одного из первых защитных иммуномодуляторов при любых инфекциях.

В СПХФА впервые из биомассы селективного с Ge штамма женьшеня был получен препарат ПАНАКСЕЛ и проведены его доклинические и клинические испытания, которые подтвердили, что ПАНАКСЕЛ помимо свойств, характерных для корня женьшеня, обладал высокой иммуномодулирующей, противораковой и гепатопротекторной активностью. Учитывая особенности технологии и свойства шрота из биомассы этого штамма, был разработан растительный энтеросорбент ПАНАСОРБ, способный выводить из организма не только радиоактивный стронций, но также свинец и ртуть.

Особый интерес представляет “красный” женьшень, обладающий большей биологической активностью особенно в профилактике онкологических заболеваний. В СПХФА получены препараты из “красной’ биомассы женьшеня, американского женьшеня и других штаммов и показана их высокая биологическая активность. Препараты из “ красной “ биомассы, обладая большей биодоступностью, действовали в 1000 раз меньших дозах по сравнению с препаратами из исходного штамма и оказывали высокий антиметастатический эффект.

Штаммы культур клеток растений являются прекрасной моделью биосистемы, на которой можно моделировать новые технологии и получать клетки, которых нет в природе. Так, впервые были получены клетки женьшеня, которые содержали одновременно и биологически активные вещества березы, солодки, календулы и исландского мха. Показано, что в клетках биомассы женьшеня и других штаммов содержится один из активных антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутаза (СОД), которую ранее получали только из животного сырья. Сегодня в лаборатории разрабатываются новые технологии культивирования штаммов и новые методы экстракции биологически активных веществ (БАВ) с помощью СВЧ и УЗ также с учетом безопасной экологии и безотходной технологии.

Проводятся исследования по конструированию новых медицинских конструкций и лекарственных форм:

трасплантатов, трансдермальных пленок, жевательных конфет, биогелей и шовного материала, как средств доставки лекарственных препаратов с пролонгированным спектром действия. Штаммы растительных клеток как модель биосистемы, используются для исследований влияния на них магнитных полей, а также для оценки экологической и медицинской безопасности в случаях применения различных наноматериалов, в частности, углеродных нанотрубок -.наночастиц от 50 - 150 нм. Таким образом, банк клеток лекарственных растений это прекрасная модель живой биологической системы, которая может служить базой для инноваций в фитобиотехнологии.

Секция 6

–  –  –

The Saint-Petersburg State Chemical- Pharmaceutical Academy, 197376 Saint–Petersburg, Popova street, 14. E- maill. larisa.slepyan@pharminnotech.com In 1963-1965years in the St. Petersburg Chemical-Pharmaceutical Academy different strains of rare and valuable plant species that do not grow or have a limited geographical range in our country such as: Panax ginseng C.A. Mey., P. quinquefolius L. and P.

japonicus L. and tropical Rauwolfia serpentina Benth. known as a source of ajmaline and other valuable alkaloids. Sabsequently strains of another tropical plants Polyscias filicifolia ( Moore ex Founier) Baily and Yucca gloriosaL.were obtained in vitro. At present time there are 17 strains of valuable medicinal plants in the cell bank. These strains are being used as a biological model for receiving new medicinal substanes.

There are three selective lines, containing minor nutrient element Ge, the inducer of endogenic gamma interferon that is one of the first immunomodulators in case of any infective disease. From the biomass of the selective Panax strain with Ge a new medicinal remedy Panaxel was obtained. Pre-clinical and clinical studies have proved that Panaxel possesses not only those activities that are specific for Radix Ginseng but also exerts high immunomodulating, anticancerogenic and hepatoprotective actions also. Taking into account the spesifics of the the technology and the characterictics of the biomass meal a new plant enterosorbent Panasorbwas prepared. It is able to excrete from human bodies not only radioactive Sr, but also Pb and Hg.

The “red” of Ginseng’s biomass is of particular interest and has a high biological activity especially in the prevention on oncological diseases. Same medical products from these “red biomass “and other stains of Araliaceae were obtained and their biological activity was proved. The bioactivity these medical products having in 1000 times lower doses and showed high anti-metastatic effect.

The plant cell strains appear as a good biological model, in which one can imitate new technologies and obtain those cells that are not present in nature. Thus, there were derived Panax cells, producing biologically active substances of birch, liquirice, marigold and lceland moss simultaneously. It was shown that strain of Ginseng and other strains produce one of active antioxidative enzymes – superoxide dismutase (SOD), which had been formerly obtained only from animal raw materials.

Nowadays in SPCPA laboratory we develop new technologies of cultivating and new extraction methods using super – high frequencies and ultra sound, taking into account environmental safety and non-waste technology. We carry out investigations on the development of new medical devices and drag forms such as: transplantats, biodissolved films, chewing sweets, biogel and sutural materials as drag delivery systems with prolonged release.

The plant cell strains as a model of biological system are used for environmental effects of a permanent magnetic field on cells and medicinal security evaluation in cases of application of different nanomaterials, in particular cardon nanotubes- nanoparticleswith dimensions of 50-150 nm.

To summarize, the banc of medical plant cells is a good model of living system forming the basis of innovations phytobiotechnology.

–  –  –

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии, п/о Стрелецкое 302502, Орел, факс: (4862) 403130, тел. (4862) 403224, e-mail: alniksobolev@rambler.ru Горох принадлежит к числу мезофитов и сравнительно легко переносит избыток влаги, но резко снижает урожайность в условиях ее недостатка. Целенаправленная селекция гороха на засухоустойчивость ограничена отсутствием доноров засухоустойчивости, сложностью совмещения в сорте высокой продуктивности и засухоустойчивости. Существующие методы отбора засухоустойчивых вариантов в большинстве случаев позволяют осуществлять только тестирование генотипов.

Цель исследований заключалась в получении нового селекционного материала гороха, устойчивого к засухе с использованием селекции in vitro. Материалом для проведения исследований служили каллусы разного возраста пассирования in vitro 7 генотипов гороха, представленные различными морфотипами. В качестве селективного фактора использовали ПЭГ-6000.

Установлено, что длительно пассируемые ткани более чувствительны к осмотическому стрессу. Прирост молодой (120-135 суток in vitro) культуры тканей на селективной среде с ПЭГ варьировал от 5,1 до 82,4% от контроля, в длительно культивируемой культуре каллусов данный показатель был в пределах 4,9-30,9%. Тем не менее ранжирование генотипов, по осмоустойчивости, проведенное в культуре молодого каллуса, сохранялось и при длительном пассировании. Регенерацию растений гороха проводили на средах без селективного фактора. Установлено, что длительно культивируемые (1500 – 1900 суток in vitro) каллусы отселектированные на средах с ПЭГ резко снижают способность к регенерации побегов. При этом у всех исследованных сортов и линий не наблюдалось угнетения недефференцированного роста каллусных тканей, формировались меристематические очаги с многочисленными зачаточными почками, часто образовавшиеся микропобеги так и оставались в зачаточном состоянии, не развиваясь дальше. Большая часть полученных из каллусных клонов побегов имела нормальную морфологию, однако встречались побеги с высоким уровнем витрификации.

Не установлена взаимосвязь между индукцией побегообразования в каллусах гороха и морфотипом исследуемых генотипов. Установлена зависимость морфогенеза от исходного генотипа и селективной нагрузки.

Выявлено преимущество регенерантных линий гороха, отселектированных на осмоустойчивость в каллусной культуре по ряду физиологических показателей характеризующих засухоустойчивость.

На стадии бутонизации у абсолютного большинства регенерантных линий общее содержание воды (ОСВ) в тканях растений, позволяющее опосредованно оценить работу корневой системы, было выше, чем у исходных генотипов. По способности удерживать воду срезанными растениями в процессе завядания (6 часов) большинство линий также превосходили исходные генотипы. Установлено, что между критериями засухоустойчивости (общим содержанием воды в тканях и потерями воды в процессе завядания) существует довольно тесная положительная корреляция (r=0,65).

В результате проведенных исследований выделены перспективные линии, совмещающие повышенную засухоустойчивость и урожайность, одна из которых как сорт Смолянка передана на Государственное сортоиспытание.

–  –  –

All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, p/b Streletskoye, 302502, Orel, fax:

(4862)403130, phone. (4862)403224, e-mail: alniksobolev@rambler.ru Pea belongs to mesophits and has resistance to wet excess but sharply decreases yield under water deficiency. Pea breeding for drought resistance is limited by absence of donors and difficulty to combine high yield with resistance to drought. Existing methods of selection allow to test genotypes only.

The aim of research was focused on obtaining of new breeding material resistant to drought with use of selection in vitro. The initial materials were calli of 7 genotypes cultivated in vitro for different time. PEG-6000 was used as a selective factor.

It was established that long term cultivated calli were more sensitive to osmotic stress.

Increase of young callus mass (120-135 days in vitro) on selective medium with PEG was 5.1as compare to control. This trait in long term culture was varied from 4.9 to 30.9%.

Regeneration of pea plants was conducted on media without selective factor. It was determined that calli cultivated in the presence of PEG for long term (1500 – 1900 days in vitro) had decreased ability to shoot regeneration. Among all studied varieties and lines proliferation of tissues, formation of meristematic sites with numerous buds were not depressed. But small shoots often did not development until mature stage. Majority of shoots had normal morphology but part of them was with high level of vitrification. A relation between regeneration and morphotype of plants was not observed. But dependence of morphogenesis from genotype and selective factor was determined.

Preference of plant lines selected in presence of PEG on physiological traits of resistance to drought was revealed. On the stage of bud formation total water content in tissues of regenerated plant was higher than in initial genotypes. A large part of regenerated lines had preference on ability to retain water in cut plants. Positive correlation (r=+0.65) between total water content and waste of water in cut plants was determined.

As a result high yielding perspective pea lines with resistance to drought were obtained.

One line named as variety Smolyanka was submitted to the State testing.

–  –  –

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Алтайский государственный университет, Барнаул, 656049, пр. Ленина, 61 тел.: (3852)36-86-39, e-mail: werasolo@mail.ru Сирень как исключительно декоративный кустарник находит широкое применение в озеленении и ландшафтной архитектуре. Высокая востребованность культуры требует большого количества посадочного материала. Современные сорта плохо размножаются вегетативно. Для целей размножения применяют биотехнологические методы, разработанные на основе изучения регенерационной способности сирени в культуре in vitro.

Целью работы – изучить регенерационный потенциал сортов Syringa vulgaris L.

на этапе собственно микроразмножения.

Объектами исследований являлись 2 сорта (Сенсация, Огни Донбасса) и 1 форма сирени обыкновенной из коллекции НИИСС Россельхозакадемии. Экспериментальные работы с использованием метода культуры тканей и гистологический анализ проводили по общепринятым методикам.

В процессе исследований было изучено влияние разных концентраций БАП, способа культивирования, основанного на чередования сред с относительно низким и высоким содержанием БАП, а также содержание НУК и негормональных стимуляторов роста на регенерационную способность S. vulgaris в культуре ткани. Показаны изменения коэффициента размножения и высоты побегов в зависимости от состава питательных сред, проведены анатомо-морфологические исследования образцов. По результатам экспериментов были отобраны эффективные среды и схемы культивирования S. vulgaris, которые позволяют максимально использовать регенерационный потенциал растений на этапе собственно размножения без снижения качества регенерантов.

–  –  –

Altay state university, Barnaul, 656049, p. Lenina, 61 tel.: (3852) 36-86-39, e-mail: werasolo@mail.ru Lilac is an ornamental shrub that is widely used in gardening and landscaping. The high demand of culture requires a large amount of planting material. Modern varieties propagate poorly vegetatively. For the purposes of breeding are applied biotechnological techniques that are developed through the study of the regenerative capacity of lilac in culture in vitro.

The aim of the work is to study the regeneration potential of the varieties of Syrnga vulgaris L. at the stage of actually micropropagation.

The objects of the investigations were two grades (Sensation, Lights of Donbass) and one form of the common lilac collection of the Siberian Horticultural Research Institute (SHRI).

Experimental work with the method of tissue culture and histologic analyzes were performed by standard methods.

During the study, we studied the effect of different concentrations of BAP, cultivation method, based on the alternation of media with low and high BAP and NAA content and nonhormonal growth promoters on the regenerative capacity of S. vulgaris in tissue culture. We demonstrated the changes of the multiplication of shoots and their elongation depending on the composition of the culture media, conducted anatomical and morphological studies of samples.

According to the results of experiments were selected effective media and cultivation schemes S. vulgaris, that maximize the regeneration potential of plants at the stage of actual reproduction without compromising the quality of regenerates.

–  –  –

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Российской академии сельскохозяйственных наук, факс: (4862)403130, тел.: (4862)403751, e-mail: galina@vniizbk.ru Известны 7 видов рода Lens Mill., культурным из которых является чечевица тарелочная L. culinaris Medik., остальные виды дикорастущие. В процессе селекции местные популяции чечевицы заменяются улучшенными сортами, вследствие чего происходит сужение генетического разнообразия культурного вида. Дикорастущие сородичи чечевицы, обладая рядом полезных признаков, в частности устойчивостью ко многим грибным болезням, могут стать источником дополнительной изменчивости для культурной чечевицы.

Среди возможных комбинаций скрещивания в роде Lens нами получены межвидовые гибриды чечевицы L. culinaris с видами L. orientalis (Boiss) Schmalh. (ILWL

7) и L. tomentosus Ladizinsky (ILWL 90, ILWL 120).

В комбинации L. culinaris х L. orientalis гибридные семена получены в результате обычных скрещиваний. Для преодоления покоя семян использовался метод проращивания семян F1 на питательной среде MS, содержащей индолил-3-масляную кислоту (ИМК) в концентрации 1 мг/мл. Метод проращивания семян in vitro повышал их выживаемость, соответственно повышался выход гибридных растений. В результате последовательного многократного индивидуального отбора в течение нескольких поколений в гибридных популяциях L. culinaris х L. orientalis были сформированы рекомбинантные по признакам окраски цветка, семенной кожуры, семядолей, селекционные линии чечевицы. Высокий уровень рекомбинаций был показан RAPD анализом.

В комбинации L. culinaris х L. tomentosus для получения гибридных растений использовали метод культуры изолированных семяпочек. Гибридные семяпочки в возрасте 7…20 дней после опыления доращивали на питательных средах MS или В5, содержащих 1…2,25 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) в сочетании с индол-3-илуксусной или -нафтилуксусной кислотой (0,2…1 мг/мл). Иногда БАП заменяли зеатином. Развитие зародышей происходило как в направлении прямого эмбриогенеза, чаще на средах с зеатином, так и с формированием многочисленных побегов и почек на средах с БАП. В случае прямого эмбриогенеза проросток извлекали из среды и высаживали в сосуды с почвой. Если формировалась морфогенная ткань, процесс получения гибридных растений занимал более длительное время. Морфогенную ткань периодически пассировали на среды содержащие 0,6 мг/л БАП, отросшие побеги декапитировали и переносили на ризогенные среды с ИМК. Для повышения эффективности ризогенеза использовали метод культивирования побегов в обратной ориентации. В культуре тканей чечевицы in vitro наблюдался феномен цветения и формирования бобов, в том числе и жизнеспособных семян. Из 296 гибридных семяпочек данной комбинации начали развиваться in vitro 27, но получить растения-регенеранты удалось только из 3 семяпочек. Более жизнеспособным оказалось семенное потомство комбинации L. culinaris х L. tomentosus ILWL 120. В процессе отбора лучших по продуктивности и крупности семян растений в ряде поколений были сформированы рекомбинантные селекционные линии.

Урожайность лучших селекционных линий полученных в результате межвидовой гибридизации чечевицы в 2012 году в конкурсном сортоиспытании составила 1,8…2 т/га, что не уступало или превосходило стандартный сорт Рауза с урожайностью 1,9 т/га.

–  –  –

All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, p/b Streletskoye, 302502, Orel, fax:

(4862)403130, phone. (4862)403224, e-mail: galina@vniizbk.ru There are seven known species of the genus Lens Mill. where only L. culinaris Medik. is a cultivated one while others are wild species. In the breeding process local populations of lentil are replaced by advanced varieties, that leads to a narrowing of genetic diversity of cultivated species. Wild relatives of lentil possessing a number of useful traits, in particular resistance to fungi diseases, could be source of additional variability for the cultivated lentil.

Among all possible cross combinations in the genus Lens we obtained interspecific lentil hybrids in crossing L. culinaris with L. orientalis (Boiss) Schmalh. (ILWL 7) and L. tomentosus Ladizinsky (ILWL 90, ILWL 120).

In a combination L. culinaris х L.orientalis hybrid seeds were obtained by means of conventional crossing. In order to overcome seed dormancy F 1 seeds were germinated on a nutrient media MS with 1 mg/l indole-3-butyric acid. In vitro germination increased seed survival and output of hybrid plants. As a result of regular multiple selection within a few generations of hybrid populations L. culinaris х L. orientalis there were developed breeding lines recombinant in flower, seed coat and cotyledon coloring. High level of recombination was demonstrated by RAPD analysis.

In a combination L. culinaris х L. tomentosus ovule rescue technique was used to recover interspecific hybrids. Hybrid ovules of 7 – 20 days after pollination old were cultured on nutrient media, containing mineral salts of MS or В5, 1…2,25 mg/l of 6-benzylaminopurine (BAP) in combination with 0,2…1 mg/l of indole-3-acetic acid or -naphthylacetic acid.

Sometimes BAP was replaced by zeatin. Embryos developed in way of direct embryogenesis as well as in way of multiple shoot formation. In case of direct embryogenesis seedling was taken out from medium and transferred into pot with soil. When morphogenic tissue was formed, period of hybrid recovery took a longer time. Morphogenic tissue was periodically passed to fresh media containing 0,6 mg/l BAP, shoots were detruncated and passed to rooting media containing indole-3-butyric acid. To optimize rooting procedure of lentil shoots a method of soot culture in inverted orientation was applied. Phenomena of flowering and pod setting in vitro was observed. From 296 hybrid ovules being planted 27 explants began to grow and 3 hybrids were recovered. Seed progenies of cross L. culinaris х L. tomentosus ILWL 120 were more viable. As a result of selection of productive large-seeded plants in a few generations there were developed recombinant breeding lines of lentil.

Seed yield of the best recombinant lines in 2012 field trial was at the level of 1,8…2,0 t/ha, whereas yield of standard variety Rausa was 1.9 t/ha.

The reported study was supported by grant of Industry department of Orel region, research project No.12-04-97500.

–  –  –

ВЛИЯНИЕ СМЕНЫ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ДЫХАТЕЛЬНУЮ

АКТИВНОСТЬ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК DIOSCOREA

DELTOIDEA WALL.

Титова М.В. 1, 2, Шумило Н.Ан. 1, Куличенко И.Е. 1, Горшкова Е.Н. 1, Носов А.М. 1, 2 Институт физиологии растений РАН, 127276, Ботаническая 35, Москва Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Воробьевы Горы, 1, корп. 19.

E–mail: titomirez@mail.ru При масштабировании аппаратного выращивания культур клеток до промышленных объемов важной задачей является мониторинг физиологического состояния клеток. В работе проводили оценку возможности использования в качестве подобного экспресстеста анализ активности клеточного дыхательного метаболизма. Кроме того, поскольку кислород является одним из лимитирующих факторов при глубинном выращивании клеток in vitro, представлялось актуальным изучить влияние массообменных характеристик используемых биореакторов на дыхательную активность штаммов.

Исследования проводили на примере штамма-продуцента Dioscorea deltoidea – продуцента фуростаноловых гликозидов, для которого при полупроточном выращивании в барботажных биореакторах (20 л и 630 л) в экспоненциальной фазе роста измеряли общую скорость поглощения кислорода и долю АО в этом процессе, а также содержание фуростаноловых гликозидов. Для каждого аппарата измерения проводили на протяжении 3-4 циклов субкультивирования, начиная со 2-ого цикла от момента инокуляции. Значения коэффициентов массопередачи по кислороду (KLa, ч-1) для биореакторов определяли при режимах перемешивания и аэрации, оптимальных для выращивания штамма.

Полученные результаты показали, что максимальная доля цианидрезистентного дыхания наблюдалась при выращивании в 20 л барботажном биореакторе с точечным аэрирующим устройством (до 60-65 % от общей интенсивности дыхания). Для этого же аппарата были получены минимальные значения KLa (2.0 – 2.4 ч-1), а также был отмечен более низкий уровень содержания фуростаноловых гликозидов (4.2 – 8.0 % к сухой массе клеток).

Минимальная активность АО (в пределах 15-25 %) была отмечена для системы с более интенсивным массообменом по кислороду – 630 л барботажного биореактора с кольцевым аэратором (KLa 7.1 – 8.0 ч-1). Для этого же биореактора отмечали более высокие биосинтетические показатели (7.7 – 13.9 % к сухой массе клеток).

Таким образом, на примере аппаратного культивирования клеток D. deltoidea была показана зависимость активности цианидрезистентного дыхания от условий выращивания, в частности - от массообменных характеристик систем культивирования.

Показана возможность использования этого показателя для мониторинга физиологического состояния культуры при масштабировании процесса выращивания.

Секция 6

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ РОСТА И БИОСИНТЕЗА В СУСПЕНЗИОННОЙ

КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК TAXUS BACCATA ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ В КОЛБАХ И

БИОРЕАКТОРАХ

Титова М.В. 1, 2, Черняк Н.Д. 1, Соловьева Л. 1, Кочкин Д.В. 1, 2, Суханова Е.С. 1,, Спринчану Е.К. 1, Носов А.М. 1, 2 Институт физиологии растений РАН, 127276, Ботаническая 35, Москва Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Воробьевы Горы, 1, корп. 19.

E–mail: titomirez@mail.ru Отсутствие в нашей стране естественного растительного сырья для производства лекарственных препаратов влечет за собой необходимость получения и выращивания соответствующих культур клеток высших растений – продуцентов целевых вторичных метаболитов. Значительный интерес для медицины представляют растения рода Taxus – продуценты таксоидов или таксанов (дитерпеноидов сложного строения), которые являются ценнейшими противоопухолевыми агентами.

В ИФР РАН в 2008-2009 годах был получен ряд культур клеток разных видов Taxus [Глоба, Демидова, 2009], с различными ростовыми и биосинтетическими характеристиками.

В работе была использована суспензионная культура клеток T. baccata (линия 107ПВП) инициированная из каллусных культур клеток T. baccata в 2009 году научными сотрудниками лаборатории физиологии культивируемых клеток ИФР РАН Е.Б. Глобой и Н.Д. Черняк. Культивирование клеточной суспензии проводили в колбах на качалке при стандартных условиях и в барботажном биореакторе (рабочий объем 2 л) в режиме «отъем суспензии-долив среды» Химический анализ сухой клеточной биомассы проводили с применением ВЭЖХ. Для адекватной оценки результатов использовали два хроматографа - «Adgilent» серии 1200 (США) и «Perkin Elmer» серии 200 (США).

В результате проведенных экспериментов были исследованы цитологические и ростовые характеристики суспензионной культуры T.baccata при выращивании в колбах.

Показано, что она обладает удовлетворительными ростовыми характеристиками (максимальное накопление биомассы клеток по сухому весу достигало 8-10 г/л, жизнеспособность - 93-95 %, индекс роста - 3.50). Был проведен скрининг на содержание таксоидов экстрактов биомассы линии 107ПВП. Обнаружено вещество, по хроматографической подвижности соответствующее паклитакселу. Проведенный с использованием диодноматричного детектора анализ спектров поглощения пиков соответствующих соединений подтвердил принадлежность исследуемых веществ к группе таксоидов. При выращивании суспензионной культуры T.baccata в барботажном биореакторе было проведено 5 циклов выращивания в режиме полупротока, общая продолжительность выращивания составила 109 суток. Показано, что при переходе к аппаратному культивированию ухудшение ростовых характеристик не происходит (максимальное накопление биомассы клеток по сухому весу в конце каждого из циклов субкультивирования достигало 12-16 г/л при жизнеспособности на уровне 80-93 %, индекс роста варьировал в пределах 3.50-5.50). В ходе фитохимического анализа экстрактов биомассы клеток T.baccata (линия 107ПВП), выращенной в биореакторе, также обнаружены вещества, по хроматографической подвижности и спектрам поглощения соответствующие баккатину III и паклитакселу.

Секция 6

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИСКУССТВЕННОГО ЗАРАЖЕНИЯ ХРИЗАНТЕМ

CHRYSANTHEMUM VIRUS B (CVB)

Титова С.М.1, Фирсов А.П.1,2, Митюшкина Т. Ю.1,2, Долгов С.В.1,2 ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Россия, 127550, Москва, ул.

Тимирязевская, д. 42, тел. (499) 977 95 13, e-mail: f0t0nchik@mail.ru Филиал Института биоорганической химии РАН, Россия, 142290, Московская обл. г.

Пущино, проспект Науки, д. 6, тел. (4967) 731 779, e-mail: mitiouchkina@rambler.ru Вирус В хризантем относится к роду карлавирусов, получивших свое название от латентного вируса гвоздики (Carnation latent virus). Вирус В хризантем представляет собой палочку диаметром 12 нм и длиной 680 нм. Коэффициент седиментации 168 S.

Содержит одноцепочечную РНК, длиной 7500 нуклеотидов. Вирусную РНК покрывает белок оболочки (31-36 кДа). Проявления симптомов вирусного заболевания различны и зависят от условий выращивания и сорта растения. На листовых пластинках у одних сортов появляются желто-зеленые кольца и пятнистость, некротические пятна, едва видимая мозаика, у других – изменение окраски цветков, деформация листьев и т.д.

Иногда симптомы могут отсутствовать. Согласно литературным данным, CVB передается механической инокуляцией, прививкой или некоторыми видами тлей (Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae, Aulacorthum solani, Coloradoa rufomaculata, Macrosiphoniella sanborni, Rhopalosiphum ruformaculatum) неперсистентным образом.

Целью нашей работы является тестирование устойчивых линий трансгенных хризантем к вирусу В, ранее полученных на станции искусственного климата «Биотрон». Поэтому, на данном этапе наших исследований мы разрабатывали практичный протокол искусственного заражения растений хризантем вирусом В хризантем.

Мы использовали здоровые растения хризантем сорта White Snowdon и инфицированные коммерческие селекционные линии хризантем, любезно предоставленные ГНУ Всероссийским научно-исследовательским институтом цветоводства и субтропических культур РАСХН (ВНИИЦиСК Россельхозакадемии). Были протестированы 2 способа инфицирования растений вирусом В хризантем – механическая инокуляция вируса и прививка. В первом случае, здоровые растения хризантем инфицировали втиранием, растительного сока содержащего CVB, на заранее поврежденную поверхность листовой пластинки, а также производили инфильтрацию препарата вируса в межклеточное пространство при помощи шприца. Во втором случае – инфицированные черенки селекционных линий хризантем прививали на здоровые растения хризантем White Snowdon. Анализировали привой, подвой и непривитый черенок, взятые с каждого растения инокулированной хризантемы. Затем исследуемые растения были проанализированы 2 способами – иммуноферментным и вестерн-блот анализами.

В результате эксперимента, визуальных симптомов проявления вируса не наблюдалось.

ИФА и вестерн-блот анализы не детектировали наличие вируса В хризантем при механической инокуляции, однако метод прививки оказался более эффективным, что было подтверждено как ИФА так и вестерн-блот анализом, то есть, вирус В хризантем присутствовал в исследуемых образцах. Вестерн-блот показал наличие полосы, соответствующей белку оболочки CVB (~37 кДа), которая не наблюдалась в контрольных растениях. В результате наших исследований показано, что метод прививки является более эффективным, чем метод инфильтрации. Таким образом, в дальнейшем планируется проведение искусственного заражения и тестирование трансгенных хризантем с различными конструкциями, содержащими ген белка оболочки вируса В.

Секция 6

DEVELOPMENT OF ARTIFICIAL INFECTION OF CHRYSANTHEMUM VIRUS B

(CVB) IN CHRYSANTHEMUM

Titova S. M.1, Firsov A. P.1,2, Mitiouchkina T. Yu.1,2, Dolgov S.V.1,2 State Scientific Institution All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology,

RAAS, Russia, 127550, Moscow, Timirjazevakaja street, 42, tel. (499) 977 95 13, e-mail:

f0t0nchik@mail.ru Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, Russia, 142290, Moscow Region, Puschino, Prospect of Science, 6, tel.

(4967) 731 779, e-mail:

mitiouchkina@rambler.ru Chrysanthemum virus B belongs to the genus carlavirus has received its name from the Carnation latent virus. Particles of CVB are filamentous, slightly flexuous, 680 nm in length and 12 nm in diameter. The sedimentation coefficient of 168 S. The carlavirus genome is a positivesense, single-strand RNA. The genome of CVB is 7500 nucleotides long. The nucleic acid is encapsulated in a single coat protein of around 31-36 kDa. Chrysanthemums infected with CVB have various symptoms from mild leaf-mottling or vein-clearing to severe mosaic or flowermalformation, but sometimes they show no symptoms. According to published data, CVB is transmitted in a non-persistent manner by several aphid species such as Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae, Aulacorthum solani, Coloradoa rufomaculata, Macrosiphoniella sanborni and Rhopalosiphum ruformaculatum. It could also be transmitted by grafting, and mechanical inoculation.

The aim of our research is to test the stable lines of transgenic chrysanthemums to the virus B in the previously obtained at the station artificial climate "Biotron". Therefore, at this stage of our research, we have developed a practical protocol artificial plant infection by a CVB in chrysanthemums.

We used a variety of healthy plants chrysanthemums ‘White Snowdon’ and infected commercial breeding lines chrysanthemums kindly provided by All-Russian Scientific Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops Agricultural Sciences (RAAS VNIITsiSK).

We tested two methods by a virus infection of chrysanthemum plants - mechanical inoculation of the virus and the grafting. In the first case, chrysanthemums healthy plants infected by rubbing, sap extract containing CVB, to in advance the damaged surface of leaf blade, as well as infiltration of virus preparation produced in the extracellular space by a syringe. In the second case - the infected breeding lines of chrysanthemum cuttings grafted onto healthy chrysanthemum ‘White Snowdon’. Analyzed graft, rootstock and unvaccinated stalk taken from each plant were inoculated with chrysanthemums. Then, the test plants were analyzed in 2 ways - ELISA and Western blot analyzes.

Consequently of the experiment, the visual display the symptoms of the virus were observed.

ELISA and Western blot analysis detected no presence of Chrysanthemum virus B in the mechanical inoculation, but the method is more effective grafting has been confirmed as ELISA and Western blot analysis, i.e., of Chrysanthemum virus B present in the samples. Western blot showed the presence of the band corresponding to the coat protein CVB (~ 37 kDa), which was not observed in control plants. As a result of our studies have shown that grafting method is more efficient than the method of infiltration. Thus, after artificial infection is planned to hold and testing of transgenic chrysanthemums with different constructs containing the virus coat protein gene of B.

–  –  –

ОСОБЕННОСТИ ГАМЕТОКЛОНАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У ГЕНОТИПОВ

МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ГИБРИДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Трубачеева Н.В., Осадчая Т.С., Кравцова Л.А., Першина Л.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, 630090, пр.

Академика Лаврентьева, 10, факс:

+7(282)333-12-78; тел: +7(383) 363-49-27*2117, e-mail: natas@bionet.nsc.ru Культивирование пыльников (широко используемый метод для получения дигаплоидных линий мягкой пшеницы, востребованных для исследований по генетике, функциональной геномике, селекции. Одним из ограничений этого метода является проявление гаметоклональной изменчивости у развивающихся андрогенных растений.

Наиболее распространенное ее проявление – альбинизм, связанный с делециями в хлоропластном геноме. В данной работе были поставлены задачи: 1) изучить возможное проявление гаметоклональной изменчивости при культивировании пыльников мягкой пшеницы гибридного происхождения; 2) изучить характер передачи отдельных генов чужеродного происхождения, определяющих признаки устойчивости растений к грибным патогенам. В работу были включены сорта и линии яровой мягкой пшеницы, полученные в результате интрогрессивной гибридизации и несущие в ядерном геноме хромосомы (или их сегменты) чужеродного происхождения, а также аллоплазматические интрогрессивные линии мягкой пшеницы – носители цитоплазмы отдельных видов ячменя и отдельные хромосомы ржи посевной S.cereale или дикорастущего ячменя H.marinum ssp. gussoneanum. Растения-доноры выращивали в гидропонной теплице.

Пыльники культивировали на среде P-II с модификациями, а эмбрио-подобные структуры

– на среде Гамборга В-5 без фитогормонов или с добавлением ИУК (IAA) и кинетина.

Хлорофилдефектные проростки и зеленые растения изучали с применением следущих методов: цитогенетические (поведение хромосом и анализ числа хромосом), геномной in situ гибридизации (идентификация хромосом и их сегментов чужеродного происхождения), ПЦР-анализ (выявление отдельных генов в ядерном геноме и анализ определенных последовательностей хлоропластной и митохондриальной ДНК у андрогенных растений, полученных при культивировании пыльников аллоплазматических линий). Среди жизнеспособных гаметоклонов с измененным числом хромосом наиболее часто встречались анеуплоиды с 2n=41 и 2n=43. У аллоплазматических генотипов, несущих цитоплазму ячменя и хромосомы ржи, цитогенетическая нестабильность характеризовала не только растения R0, но и их самоопыленные потомки. Так, выявлены растения R1 и R2-поколений с 2n=42 и 2n=43, у которых в митозе наблюдали разрывы хромосом по центромере с последующим образованием телоцентрических хромосом.

Обнаружены гаметоклоны, у которых произошла элиминация пшенично-чужеродных транслокаций или определенных маркерных генов, ответственных за устойчивость к грибным патогенам. Изменений в структуре митохондриальной ДНК, ни у зеленых растений, ни у альбиносов отмечено не было, независимо от цитогенетической стабильности, или цитогенетической изменчивости этих растений.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (No11-04-00806).

–  –  –

GAMETOCLONAL VARIATION IN GERMPLASM OF HYBRID COMMON WHEAT

Trubacheeva N.V., Osadhaya T.S., Kravtsova L.A., Pershina L.A.

Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, 630090, Lavrent’ev av. 10, fax:

+7(282)333-12-78; tel: +7(383) 363-49-27*2117, e-mail: natas@bionet.nsc.ru Anther culture is a wide used method for production of common wheat doubled lines, which are useful for genetics, functional genomics and breeding. One of the restrictions of this method is a gametoclonal variation in androgenic plants. The most common manifestation of it is an albinism determined by deletions in chloroplast genome. The aim of this work were: 1) to study the probable manifestation of gametoclonal variation in anther culture of hybrid common wheat; 2) to study the transmission of some alien genes determined the resistance to fungal pathogens. The plant material were: cultivars and lines of spring common wheat produced by introgressive hybridization, carrying alien chromosomes or their fragments, alloplasmic introgressive lines of common wheat with cytoplasm of barley species and rye or wild barley H.marinum ssp. gussoneanum chromosomes. Donor plants were grown in greenhouse. Anthers were cultivated on P-II medium with modifications, embryo-like structures on Gamborg B-5 medium without phytohormones or with additions of IAA and kinetin. Chlorophyll-defective seedlings and green plants were studied by following methods: cytogenetic (chromosome behavior and number), genomic in situ hybridization (alien chromosomes or their segments detection), PCR (detection of genes in nuclear, chloroplast and mitochondrial genomes in androgenic plants produced by anther culture of alloplasmic lines). Aneuploids 2n=41 and 2n=43 were the most often among viable gametoclones with changed chromosome number. In alloplasmic plants with barley cytoplasm and rye chromosomes cytogenetic instability was observed not only in R0 plants, but also in their self-pollinated progenies. For instance, we have revealed R1 and R2 plants with 2n=42 and 2n=43 in which the chromosome breaks at the centromeres and following telocentric chromosomes formation were observed. The gametoclones with eliminations of wheat-rye translocations or genes responsible for resistance to fungal pathogens were found out. There were no changes of the mitochondrial DNA neither in green plants nor in albinos irrespective of cytogenetic stability or instability of these plants.

The work was supported by RFFR (No11-04-00806).

–  –  –

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПШЕНИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНКМАРКЕРОВ

Турганбаева А.К., Хапилина О.Н., Какимжанова А.А., Тагиманова Д.С., Ергалиева А.Ж.

РГП «Национальный центр биотехнологии», Казахстан, г. Астана, 010000, ул. Валиханова 13/1, факс: (87172) 21-46-33, тел. (87172) 20-07-91, lbps@biocenter.kz В настоящее время для выявления полиморфизма на разных уровнях: формы, линии, растения-регенеранта, сорта, вида, рода широко используют ДНК–маркеры.

Использование ДНК-маркеров в селекционных процессах позволяет быстро и эффективно отбирать нужные генотипы растений. Современный уровень развития молекулярной биологии позволяет использовать различные классы молекулярных маркеров, выявляющие полиморфизм ДНК растений. Каждый тип маркеров позволяет получить представления о типах полиморфизма линий растений-регенерантов. Многие методы ДНК-анализа являются высокоинформатив-ными, хорошо воспроизводятся, надежны при установлении индивидуальных особенностей генотипа. RAPD технологии являются важным инструментом для быстрой идентификации маркеров, связанных с засухоустойчивостью, и весьма эффективна при определении генетического изменения среди генотипов пшеницы. Наибольшее распространение при анализе генома растений приобрел метод RAPD PCR (random amply/led polymorphic DNA polymerase chain reaction), основанный на амплификации геномной ДНК с помощью случайных десятичленных праймеров. Метод RAPD позволяет анализировать индивидуальные растения и отдельные каллусы. RAPD анализ позволяет выявить полиморфизм ДНК у сомаклональных вариантов. Высокая разрешающая способность RAPD метода позволяет обнаружить изменения наследственной информации клеток на разных этапах их культивирования, что может способствовать изучению природы сомаклональной изменчивости.

Целью исследований являлось определение полиморфизма фрагментов ДНК пшеницы с использованием RAPD маркера.

Был проведен RAPD-ПЦР анализ, при этом используя различные генотипы пшеницы с разной степенью адаптационной способностью к стрессовым факторам среды.

Для выявления генетической оригинальности сортов пшеницы были использованы специфичные праймеры для анализа полиморфизма фрагментов ДНК. RAPD ПЦР проводили с различными праймерами (OPA 17, OPD 17, OPN15, OPN 8).

В результате использования метода ПЦР для анализа растений пшеницы были подобраны наиболее подходящие праймеры RAPD (OPA 17, OPD 17, OPN15, OPN 8) для идентификации генетических особенностей сортов пшеницы. Если оценить суммарный спектр ампликонов участков ДНК с использованием различных RAPD праймеров, полученный на ДНК разных сортов и гибридов пшеницы, то можно насчитать от 6 до 14 различных фрагментов длиной от 520 до 4000 п.о. При амплификации с различными праймерами (OPD 17, OPN 15) были выявлены межсортовые отличия.

Таким образом общее количество ампликонов варьировало от 184 до 474 в зависимости от генотипа пшеницы. В спектрах ампликонов всех сортов и гибридов пшеницы, присутствовали фрагменты длиной от 520 до 4000 п.о. Все изученные генотипы различались между собой по рисунку выявленных спектров, только 2 праймера OPA17 и OPN8 оказались не полиморфными. В связи с этим были проанализированы различные генотипы пшеницы с использованием праймеров OPD17 и OPN15. В данном случае общее количество амплифицированных фрагментов по OPD17 составило 460, из которых 14 были полиморфными, в данном случае уровень детектируемого полиморфизма составил 3,04% по сравнению с праймером OPN15 - 2,10% соответственно.

Исходя из результатов ПЦР, проведенного с различными праймерами, можно предположить, что RAPD праймеры OPD17 и OPN15 могут быть использованы для выявления генетического полиморфизма пшеницы.

Секция 6

GENOTYPING OF WHEAT WITH DNA-MARKERS

Turganbayeva A.K., Hapilina O.N., Kakimzhanova A.A., Tagimanova D.S., Ergalieva A.Z.

Republican State Enterprise "National Center for Biotechnology", Kazakhstan, Astana, 010000, st. Valikhanova 13/1, fax: (87172) 21-46-33, tel. (87172) 20-07-91, lbps@biocenter.kz Currently, identification of polymorphism at different levels forms lines regenerated plants, variety, species, genus widely used DNA markers. The use of DNA markers in breeding processes quickly and effectively select the desired genotypes of plants. The present level of development of molecular biology allows the use of different classes of molecular markers that detect polymorphism DNA of plants. Each type of marker can get an idea of the types of polymorphism lines regenerated plants. Many methods of DNA analysis are highformativgovernmental, are well reproduced, reliable in determining the individual characteristics of the genotype. RAPD technology is an important tool for the rapid identification of markers associated with drought resistance, and is very effective in determining the genetic variation among genotypes of wheat. The most widespread in the plant genome analysis technique has gained RAPD PCR (random amply / led polymorphic DNA polymerase chain reaction), based on amplification of genomic DNA using random primers ten-membered. RAPD method allows us to analyze individual plants and some calluses. RAPD analysis reveals DNA polymorphism in somaclonal variants. High resolution of the RAPD method can detect changes in genetic information of cells in different stages of cultivation, which can help you understand the nature of somaclonal variation.

The aim of research was to determine the polymorphism of DNA fragments of wheat using RAPD marker.

Was performed RAPD-PCR analysis, while using different wheat genotypes with varying degrees of adaptation ability to stress factors. To identify the genetic originality wheat-specific primers were used for the analysis of polymorphism of DNA fragments. RAPD PCR was performed with different primers (OPA 17, OPD 17, OPN15, OPN 8).

The use of the PCR method for the analysis of the wheat plants were chosen the most appropriate primers RAPD (OPA 17, OPD 17, OPN15, OPN 8) to identify the genetic characteristics of wheat varieties. If the total rate spectrum of DNA amplicons with different RAPD primers prepared on the DNA of different varieties and hybrids of wheat, it is possible to count from 6 to 14 of different fragments from 520 to 4000 bp. The different amplification primers (OPD 17, OPN 15) were identified intervarietal differences.

Thus, the total number of the amplicons varied from 184 to 474 depending on the genotype of wheat. In the spectra of the amplicons of all varieties and hybrids of wheat, attended fragments ranging in length from 520 to 4000 bp All the studied genotypes differed in pattern identified spectra, only 2 primer OPA17 and OPN8 were not polymorphic. In this regard, different genotypes were analyzed using primers wheat and OPD17 OPN15. In this case, the total number of amplified fragments was 460 OPD17 14 of them were polymorphic in this case the level of the detected polymorphism was 3.04% compared with a primer OPN15 - 2,10% respectively.

Based on the results of PCR performed with different primers, it can be assumed that the RAPD primers and OPD17 OPN15 can be used to identify genetic polymorphisms wheat.

Секция 6

КЛЕТОЧНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЦЕННЫХ

МЕТАБОЛИТОВ В РАСТЕНИЯХ АGASTACHE RUGOSA

Фоменко Т.И., Спиридович Е.В., Мазур Т.В., Юхимук А.Н.

ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси», Минск, 270012, ул. Сурганова 2В, факс (017) 284-14-61, тел.

(017) 284-14-73, e-mail:

fomenko_ti@mail.ru Многоколосник морщинистый Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze – многолетнее лекарственное и декоративное растение из семейства Яснотковые (Lamiaceae). Согласно фитохимической и этноботанической базе данных д-ра Дюка из разных частей многоколосника выделено 71 БАВ, которые обладают широчайшим биологическим действием, от противовоспалительного до противоопухолевого. Agastache rugosa является сильнейшим биостимулятором, соперничающим с женьшенем. В зависимости от содержания регуляторов роста в среде культивирования на листовых и стеблевых эксплантах наблюдали каллусогенез, индукцию и формирование адвентивных почек и побегов, либо ризогенез. Разработаны условия получения прямого и непрямого органогенеза для различных эксплантов в культуре in vitro. Была разработана биотехнологическая система создания и размножения новых форм многоколосника морщинистого с использованием методов клеточной инженерии.

На основе сомаклональной вариабельности получены растения-регенеранты с повышенным синтезом вторичных метаболитов, проведена их идентификация и изучение состава фенольных соединений. Из 36 сомаклонов для биохимического анализа были отобраны растения, которые имели выраженные отличия от родительской формы по морфофизиологическим показателям. Сомаклоны Agastache rugosa проходили адаптационный период при переводе их к условиям ex vitro. В фазе цветения в растенияхрегенерантах оценили суммарное содержание фенольных веществ, флавонолов (класс флавоноидов) и дубильных веществ, а также количество флавоноида акацетина.

Полученные сомаклоны по содержанию флавонолов превосходят исходную форму (от 3 до 7 раз). Были отобраны для биохимического анализа 5 сомаклонов-гиперпродуцентов фенольных соединений. Использование ВЭЖХ позволяет эффективно разделить и идентифицировать нелетучие и термолабильные компоненты водноспиртовых экстрактов лекарственных растений, которые невозможно идентифицировать другими методами.

Увеличение площади пика акацетина после проведения кислотного гидролиза свидетельствует о присутствии значительного количества гликозилированной формы этого соединения в экстрактах сомаклонов многоколосника морщинистого.

С целью выяснения возможной генетической природы зафиксированной вариабельности биохимических параметров у отобранных сомаклонов по сравнению с исходной формой A. rugosa, было предпринято мультилокусное ДНК-маркирование генотипов с использованием RAPD- и ISSR-техник. После предварительного скрининга 42 праймеров были отобраны три RAPD (OPA–03, OPC–02 и OPP–19) и два ISSR (UBC–827 и UBC–856) праймера, выявляющие наибольший полиморфизм между исследованными сомаклонами.

В результате ПЦР тотальной ДНК многоколосника морщинистого с отобранными произвольными и микросателлитными праймерами, были получены четкие воспроизводимые ампликоны, набор которых для каждого исследуемого сомаклона и исходной формы характеризовался уникальностью, т.е. праймеры обнаруживали полиморфизм между образцами и таким образом позволили дифференцировать все исследованные генотипы. Построена консенсусная дендрограмма генотипов Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze, сгенерированная с использованием UPGMA алгоритма на основе 73 RAPD и 45 ISSR маркеров.

Секция 6

CELLULAR BIOTECHNOLOGIES OF VALUABLE METABOLITES CONTENT

INCREASE IN AGASTACHE RUGOSA PLANTS

Fomenko T.I. Spiridovich E.V. Masur T.V. Yukhimuk A.N.

GNI "The central botanical garden of National academy of Sciences of Belarus", Minsk, 270012, Surganov St. 2B, fax (017) 284-14-61, ph.

(017) 284-14-73, e-mail:

fomenko_ti@mail.ru Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze is a perennial medicinal and ornamental plant from Lamiaceae family. According to the phytochemical and ethnobotanical database of Dr. Duke 71 BAS which possess antiinflammatory and antitumours action were extracted from different parts of Agastache rugosa. Giant-hyssor rugosa is the biostimulator competing to a ginseng. The conditions of direct and not direct оrganogenesis receiving were developed. It was observed callusogenesis, an induction and formation of adventiv shoots and/or roots Depending on the maintenance of certain regulators of growth on leaves and stems. The biotechnological system of creation and reproduction of new forms of Agastache rugosa with use of methods of cellular engineering was developed.

Plants-regenerants with the increased synthesis of secondary metabolites are received on the basis of somaklonal variability and identification and studying of structure of phenolic connections is carried out them. Plants which had the expressed differences from a parental forms on morphophysiological sings were selected for the biochemical analysis from 36 received somaklons. Somaklons Agastache rugosa passed the adaptation period when translating them to ex vitro conditions. In a flowering phase in plants-regenerates estimated the total content of phenolic substances, flavons (a class of flavonoids) and tannins, and also quantity flavonoid acatsetin. All somaklons surpass the original form on the contents of phenolic substances (from 3 to7 times). 5 somaklons hyper producers of phenolic connections were selected for biochemical analysis. The HPLC allows to divide and identify effectively nonvolatile and thermolabile components of alcoholic extracts of herbs which can't be identified other methods. The increase in the area of peak acatsetin after carrying out acid hydrolysis testifies to presence of a significant amount of a glikozilirovanny form of this connection at extracts giant-hyssor somaklons.

Multilokusny DNA marking of genotypes with use of RAPD-and the ISSR technician was undertaken for finding-out of possible genetic nature recorded variability biochemical parameters in selected somaklons. After preliminary screening of 42 primers three RAPD (OPAOPC-02 and OPP-19) and two ISSR (UBC-827 and UBC-856) of the primer revealing the greatest polymorphism between investigated somaklons were selected. As a result of PCR of total DNA of A. rugosa a with selected any and microsatellite primers, were received accurate reproduced аmplicons which set for everyone investigated somaklons and an initial form was characterized by uniqueness, i.e. primers found polymorphism between samples and thus allowed to differentiate all studied genotypes. Agastache rugosa genotypes dendrogram was constructed with the use of UPGMA algorithms on the basis of 73 RAPD and 45 ISSR markers.

–  –  –

Научно-производственный центр биотехнологии «Фитогенетика» - структурное подразделение ОАО «КБП», г.Тула, 300004, ул.Щегловская засека, д.59,тел/ф (4872) 41-31тел.(4872) 41-21-06, e-mail: kbp@fitogenetika.ru Сирень – одна из наиболее востребованных декоративных культур на рынке посадочного материала. Традиционные способы размножения этой культуры – прививка и черенкование. Однако эти приёмы имеют ряд недостатков: низкий процент укоренения черенков, а также приживаемости прививок и необходимость в постоянном удалении поросли. Наиболее рациональным и прогрессивным способом размножения сортовой сирени является клональное микроразмножение.

Известно, что клональное микроразмножение состоит из нескольких этапов: введения в культуру, собственно размножения на искусственных питательных средах, укоренение микрочеренков и адаптация in vivo. По нашим многолетним наблюдениям наиболее узким местом в технологии клонального микроразмножения сирени является этап укоренения микрочеренков. Цель исследований – сравнить эффективность укоренения микрочеренков сирени in vitro и in vivo в условиях теплиц. На этапе укоренения in vitro использовали половинный состав макросолей питательной среды МС с добавлением ауксинов – ИУК 1 мг/л и ИМК 1 мг/л. Длительность укоренения составляла 6 недель. Процент укоренения

– 45%, среднее количество корней на одно растение – 0,8, средняя длина корней – 3,5 см.

Кроме того, корни образовались низкого качества: хрупкие, часто обламывающиеся при высадке растений из сосудов, не имеющие вторичных корней, что значительно усложняет этап адаптации. На этапе укоренения микрочеренков сирени in vivo использовали низкие овощные ящики, наполненные до половины вермикулитом. Перед высадкой микрочеренков вермикулит проливали сначала водопроводной водой, а затем раствором двух ауксинов в концентрации ИУК 1мг/л и ИМК 1 мг/л. После высадки ящики полностью закрывали плёнкой – стрейч для создания 100% влажности в зоне укоренения.

Длительность этапа укоренения составила 6 недель. При этом способе наблюдали 100% укоренение микрочеренков, средняя длина корней составила 11,6 см, среднее количество корней на одно растение – 3,9. Кроме того отмечено высокое качество корней: отсутствие ломкости, наличие вторичных корней.

По результатам исследований способ укоренения микрочеренков сирени в вермикулите оказался предпочтительнее традиционного укоренения на агаризованной среде in vitro. Кроме того, дальнейшая высадка укоренённых в вермикулите черенков в ящики с торфом (этап адаптации) показала 100% приживаемость и хороший рост, в то время, как укоренённые in vitro черенки на этапе адаптации показали приживаемость около 70% и сильное отставание в росте по сравнению с предлагаемой технологией.

–  –  –

“Fitogenetika” scientific and production centre of biotechnology – “KBP” OJSC department, 59, Shcheglovskaya zaseka str., Tula, 300004, phone/fax (4872) 41-31-16, phone (4872) 41-21-06, e-mail: kbp@fitogenetika.ru Lilac is one of the decorative cultures being in the greatest request in the planting material market. Implanting and grafting are traditional ways of its propagation. But such techniques are not exempt from some disadvantages: low percentage of cuttings rooting and survival rate of implants as well as a necessity of constant suckering. A clonal micro-reproduction is the most perspective and rational way of varietal lilac propagation.

A clonal micro-reproduction is known to consist of several phases: introduction into culture, cloning itself on artificial growing media, rooting of micro-cuttings and adaptation in vivo.

According to our long-term observations the phase of micro-cuttings rooting is a technology bottleneck. Our research objective was to compare efficiency of lilac cuttings rooting in vitro and in vivo in a hothouse. A half-mix of macro-sols of MC growing medium with addition of such auxins as ИУК 1 mg/l and ИMК1 mg/l was used at the stage of rooting in vitro. The rooting lasted 6 weeks. The rooting percentage was 45%, average number of roots per plant was 0.8, average length of roots was 3.5 cm. In addition the roots formed were of low quality and fragile, often broke while being transplanted from pots, exempt from secondary roots, that considerably complicates the adaptation stage. Low vegetable boxes half-filled with vermiculite were used at the stage of lilac micro-cuttings rooting in vivo. Before planting of micro-cuttings the vermiculite was watered with tape water followed by two auxin solution: ИУК 1 mg/l and ИMК1 mg/l. After transplanting the boxes were completely covered with stretch film to create 100% humidity in the rooting area. The rooting lasted 6 weeks. With this technology 100% of micro-cuttings rooting was achieved, average length of roots was 11.6 cm, average number of roots per plant was 3.9. In addition the roots formed were of high quality: there was not any fragility, secondary roots were formed.

According to the results of the research the way of lilac micro-cuttings rooting in vermiculite appeared to be more preferable than a traditional rooting in an agarized medium in vitro. In addition the following planting of cuttings rooted in vermiculite into boxes filled with peat (adaptation phase) showed 100% survival rate and good growth, while cuttings rooted in vitro showed about 70% of survival rate at their adaptation phase and also considerable stagnation in comparison with the suggested technology.

Секция 6

БИОХИМИЧЕСКАЯ И ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К

АЛЮМИНИЮ ОТОБРАННЫХ IN VITRO РАСТЕНИЙ ЯЧМЕНЯ

Широких И.Г.1,2, Огородникова С.Ю.2, Баранова Е.Н.3 Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока имени Н.В.Рудницкого Россельхозакадемии, Киров, 610007, ул. Ленина, 166а, факс: (8332) 33-10-25, тел. (8332)33-10-26, e-mail: irgenal@mail.ru Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар, 167982, ул. Коммунистическая, 28, факс/тел.: (8332) 37-02-77, e-mail: ecolab2@gmail.com Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии, Москва, 127550, ул.

Тимирязевская, 42, факс: (499) 977-09-47, тел. (499) 977-16-36, e-mail: greenpro2007@rambler.ru В каллусной культуре ячменя (Hordeum vulgare L.), инициированной сортом 999-93, на кислых селективных средах с алюминием отобраны устойчивые линии. Из двух линий получены растения-регенеранты. Семенное потомство (R3) регенерантных линий R917-01 и R781-04 в модельном опыте подвергли воздействию кислого (рН 4.0) и алюмокислого (рН 4.0+10 мг/л А13+) растворов. Реакцию регенерантов на стресс сравнивали с исходным сортом по накоплению в листьях и корнях малонового диальдегида (МДА), выходу электролитов из корневых тканей, содержанию в листьях пластидных пигментов, антоцианов и аскорбиновой кислоты.

Оценка интенсивности перекисного окисления липидов по накоплению в листьях МДА показала, что обе регенерантные линии характеризовались, в сравнении с исходным сортом, существенно более низкой степенью окислительных повреждений, вызванных повышенной кислотностью и алюминием. В ответ на стресс накопление МДА в листьях регенерантов, в отличие от исходной формы, существенно не увеличивалось. Другие биохимические показатели проростков исходного сорта и полученных от него регенерантных линий изменялись под воздействием ионной токсикации различным образом. По содержанию хлорофиллов R917-01 превосходил на 8-15% исходный генотип, а R781-04, напротив, на 9% уступал ему при стрессе. Оценка степени вызванных алюминием окислительных повреждений по выходу электролитов из клеток корня показала, что у R917-01 экзоосмос не изменялся, тогда как у R781-04 утечка электролитов из корневых тканей в 1,6-1,8 раза была выше контрольного показателя, что указывает на угнетение в условиях стресса барьерной функции мембран у этого генотипа. Содержание аскорбиновой кислоты при стрессе в листьях R917-01 не изменялось, а у R781-04 снизилось на 14-29% по сравнению с контролем. Содержание антоцианов в присутствии алюминия увеличилось в листьях R781-04, и не изменилось у R917-01 и исходного генотипа. Таким образом, R917-01 пострадал при стрессе меньше, чем исходный сорт и линия R781-04.

Исследование структурной организации корней путём микроскопии показало, что у исходного сорта при наложении стресса произошли необратимые изменения, приводящие либо к уплотнению цитоплазмы и ядер, особенно в центральной части корня, либо к плазмолизу и разрушению клеток, особенно в меристематической зоне. На поперечных срезах было установлено повреждение клеток центральной части корня, формирование уплотненной наружной клеточной стенки клеток эпидермиса. В корнях R917-01, на фоне вызванных токсичными ионами изменений структуры, установлена сохранность большей части клеток. Клетки меристемы в этом случае оставались живыми, без существенных повреждений, что также свидетельствует о большей, в сравнении с исходным генотипом, устойчивости к алюминию линии R917-01.

Полученные результаты свидетельствуют, что индуцированная в культуре ткани изменчивость не всегда является адаптивной. Об этом говорит появление регенерантных форм с изменениями устойчивости к стрессовому фактору, как в сторону повышения, так и понижения значений результирующего признака по сравнению с исходным сортом.

Секция 6

BIOCHEMICAL AND CYTOLOGICAL ESTIMATION IN RESISTANT TO

ALUMINUM OF BARLEY PLANTS OBTAINED IN VITRO

Shirokikh I.G.1,2, Ogorodnikova S.Yu.2, Baranova E.N.3 N. V. Rudnitski Zonal North-East Agricultural Research Institute, Russian Academy of agricultural Science, Kirov, 610007, Lenina str., 166 a, fax: (8332) 33-10-25, tel. (8332)33-10-26, e-mail: irgenal@mail.ru Institute of Biology, Komi Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences,

Syktyvkar, 167982, Kommunisticheskaya str., 28, fax/ tel.: (8332) 37-02-77, e-mail:

ecolab2@gmail.com All-Russia research institute of agricultural biotechnology Russian Academy of agricultural science, Moscow, 127550, Timiryasevskaya str., 42, fax: (499) 977-09-47, tel. (499) 977-16-36, e-mail: greenpro2007@rambler.ru Callus lines of barley (Hordeum vulgare L.) initiated by variety 999-93, resistant to aluminum toxicity from which plants regenerated were obtained in acid selective systems with aluminum. Seeded progeny (R3) lines R917-01 and R781-04 in the model experiment were exposed to acidic (pH 4.0) and aluminium (pH 4.0 +10 mg / l A1 3 +) solutions. The reaction to stress of plants regenerated was compared with the initial variety for the ability accumulate malonic dialdehyde (MDA) in the leaves and roots, electrolytes out of the root tissue, content of plastid pigments, anthocyans and ascorbic acid in the leaves.

It is shown that lines of barley R917-01 and R781-04 in comparison with the variety 999-93 have lower degree of oxidative damage, which is caused by high acidity and aluminum. Accumulation of MDA in leaves of plants regenerated is not significantly increased as compared with the original form. Other biochemical parameters of seedlings of barley 999-93 and the regenerants were modified by ion intoxication differently. The chlorophyll a and b content in leaves of the regenerants R917-01 was 8-15% higher, and in leaves of regenerants R781-04 was 9% lower in comparison with the initial form. Differences in barrier functions of membranes between the regenerants and the original genotype were judged from the amount of efflux of electrolytes from leaf tissue. It was 1,6-1,8 times greater in lines R781-04 as compared with initial form 999-93. Efflux of electrolytes out the line of R 917-01 under stress has not changed. Ascorbic acid content in leaves of R917-01 under stress did not change, while in the R781-04 it decreased by 14-29% as compared with the control line. The content of anthocyans in presence of aluminum in the leaves of R781-04 increased, and in R917-01 and the original genotype did not change. Thus, R917-01 suffered from the stress less than the initial genotype and line R781-04.

Microscopy study of structural organization of the roots showed that the initial variety in stress had irreversible changes causing either seal or cytoplasm and nuclei, especially in the central part of the root, or to plasmolysis and cells destruction, especially in the meristematic zone. On cross-section damages of cells of the central part of the root were, found as well as forming compacted outer cell wall of the epidermal cells. In the roots of R917-01, in conditions of changes caused by toxic ions structure changes most of the were cells safe in this case.

Meristem cells were alive, with no significant damage, which also indicates its greater resistance to aluminum line R917-01, as compared with the original genotype.

The results suggest that the variation induced in tissue culture is not always adaptive.

This is evidenced by the appearance of modified forms of regenerants differently resistante to stress factors lithe more or less, as compared with the original genotype.

–  –  –

ПОЛУЧЕНИЕ IN VITRO ГЕНОТИПОВ ЯЧМЕНЯ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К

ТОКСИЧНЫМ МЕТАЛЛАМ

Шуплецова О.Н., Широких И.Г.

ГНУ Научно-иследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока Россельхозакадемии, г. Киров, 610007, ул. Ленина, 166 а, тел. (8332) 331026, е-mail: olga.shuplecova@mail.ru Наряду с повышенной кислотностью и высоким содержанием ионов алюминия и марганца, характерными для подзолистых и дерново-подзолистых почв Нечерноземной зоны России, для ряда зональных почв отмечается высокий уровень загрязнения тяжелыми металлами, в частности, кадмием. Ионная токсикация наносит существенный вред культурным растениям, особенно при сокращении объемов известкования почв и, как следствие, повышении подвижности ионов токсичных металлов в почвенном растворе. В настоящее время, несмотря на интенсификацию генно-инженерных работ, селекция пока единственное реальное решение вопроса в создании генотипов растений, способных переносить токсическое действие металлов без снижения урожайности. Для решения поставленной задачи использовали клеточную селекцию, как способ повышения адаптивного потенциала культурных растений.

Целью работы являлась разработка селективных условий для отбора каллусных линий ячменя, устойчивых к токсичным ионам Cd2+, Mn2+ и А13+ с последующим получением растений-регенерантов с измененными свойствами, семенное потомство которых может быть перспективным селекционным материалом.

Изучена генотипическая реакция каллусной ткани 8 сортов ячменя на введение в питательную среду Cd2+ (0-25 мкг/мл) и Mn2+ (0-350 мкг/мл) на этапах пролиферации и органогенеза. Построены дозовые кривые и выявлены оптимальные для отборов концентрации: ионов кадмия 15 - 20 мг/л, марганца — 250 мг/л. Установлено существенное снижение выживаемости каллуса при изменении рН среды от 6,5 до 4,5.

Сравнительное изучение фитотоксического действия кадмия и марганца в сульфатной и хлоридной форме показало большую гибель каллуса ячменя в присутствии хлоридов, чем сульфатов.

Для проведения отборов устойчивых форм были установлены кратность и последовательность введения в селективные среды ионов Сd2+, Mn2+ и А13+ как индивидуально, так и в оптимальных сочетаниях. Показана целесообразность проведения в каллусной культуре ступенчатой селекции на устойчивость к кадмию и жесткой селекции на устойчивость к марганцу и алюминию. Изучение комбинированного действия токсичных металлов позволило установить, что сочетание в питательной среде алюминия (25 мг/л) с марганцем (250 мг/л) снижало выживаемость каллуса в 2,5-3,5 раза по сравнению с выживаемостью на средах с раздельным введением этих ионов, а способность каллуса к морфогенезу утрачивалась полностью. В то же время, добавление к алюминию (25 мг/л) кадмия (20 мг/л) не оказало существенного влияния на выживаемость каллуса и незначительно изменяло частоту морфогенеза и регенерации.

Для практического использования, тем не менее, более пригодны схемы отбора каллусных линий с последовательным введением в селективные среды ионов токсичных металлов, чем одновременное их введение, при котором возможны непредсказуемые кумулятивные эффекты, способные привезти к утрате регенерационной способности каллусной ткани.

В результате клеточной селекции получены каллусные культуры ячменя, устойчивые к ионам Mn2+, Cd2+, а также комплексам ионов Mn2+ и Al3+; Cd2+ и Al3+.

Созданы регенерантные растения, семенное потомство которых передано в дальнейший селекционный процесс для создания сортов ячменя, устойчивых к ионной токсикации без снижения продуктивности.

–  –  –

Along with high acidity and high content of aluminum and manganese ions that are characteristic of podzolic and sod-podzolic soils of Non-Chernozem zone of Russia, for a number of zonal soil has high levels of contamination by heavy metals, in particular cadmium.

Ion intoxication causes significant harm to the crop, especially in reducing the volume of soil liming and, as a consequence, increase the mobility of toxic metal ions in the soil solution.

Currently, despite the intensification of genetic engineering work, selection - so far the only real solution to the problem in the creation of plant genotypes that can carry toxic effects of metals without reducing crop yields. To solve the problem using the cell selection as a way to enhance the adaptive capacity of crops.

The purpose of the work was to develop a selective conditions for the selection of callus barley lines resistant to the toxic ions Cd2 +, Mn2 + and A13 + and then obtaining regenerated plants with altered characteristics, seed progeny of which may be a promising breeding material.

Genotypic response studied callus 8 barley to introduction into the medium Cd 2 + (0-25 µg / ml) and Mn2 + (0-350 µg /ml) on the proliferation stage and organogenesis. Dose curves were constructed and identified for the selection of optimal concentrations: cadmium ions 15 mg / l, of manganese - 250 mg / l. Established significant decrease in survival callus changing the pH from 6.5 to 4.5. A comparative study of the phytotoxic action of cadmium and manganese sulfate and chloride form callus showed greater death of barley in the presence of chlorides, sulfates than.

For the selection of resistant forms were identified multiple and succession carrying in ion selective medium Cd2 +, Mn2 + and A13 +, both individually and in optimal combinations. The expediency of a callus culture stepped selection for resistance to cadmium and through selection

- for resistance to manganese and aluminum. Study of the combined action of toxic metals revealed that the combination of the medium of aluminum (25 mg / l) and manganese (250 mg /

l) reduced the survival callus 2.5-3.5 times in comparison with survival on media separate from the introduction of these ions, and the ability to callus morphogenesis was lost completely. At the same time, the addition of the aluminum (25 mg / l), cadmium (20 mg / l) had no significant effect on the survival of callus and slightly changed the frequency of morphogenesis and regeneration. For practical use, however, a suitable selection scheme callus lines with successive introduction of selective media toxic metal ions than their simultaneous introduction, where possible unpredictable cumulative effects capable of bringing the loss of regenerative capacity of the callus tissue.

As a result of cell selection derived callus cultures of barley resistant to ions Mn 2 +, Cd 2 +, as well as complexes of ions Mn2 + and Al3 +; Cd2 + and Al3 +. Created regenerantnye plant seed progeny are referred to the further selection process for the obtaining of barley sorts that are resistant to ion intoxication, without reducing productivity.

–  –  –

Республиканское унитарное предприятие «Научно-практический центр национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству», Беларусь, Минский район, 223013, п. Самохваловичи, ул. Ковалёва 2а, факс: (+375-17) 506-70-01, тел.: (+375-17) 506-69-98, e-mail: y_galina@tut.by Культурный картофель (Solanum tuberosum L.) имеет один из самых больших генетических пулов, который насчитывает более 200 видов. Прямой перенос генов от диких видов в культурный картофель затруднен барьерами пред- и пост- зиготной несовместимости. Слияние соматических протопластов двух различных геномов с последующей регенерацией растений и отбором гибридов позволяет преодолеть репродуктивные барьеры и расширить гермоплазму, доступную для селекции. При вторичной соматической гибридизации (ВСГ) один из партнеров или оба представлены соматическими гибридами.

Протопласты из мезофилла листа были слиты в присутствии ПЭГ, Ca2+, pH=10. Из значительного количества полученных колоний регенерированы 990 побегов в 7-ми комбинациях ВСГ: 1) P – ЛДГ (S. tuberosum, 2x) + 10D-1 [S. polyadenium + (S. etuberosum S. brevidens)]; 2) S – 10D-1 + S. bulbocastanum; 3) 6D – 429 (S. tuberosum, 2x) + 1D-37-4 [86S. tuberosum S. chacoense) + S. cardiophyllum]; 4) 7D – 1D-37-4 + Л30-1-2 [78563-76 (S.

tuberosum, 4x) + S. caripense]; 5) 8D – 1D-37-4 + S. boliviense; 6) 11D – 10D-1 + S.

boliviense; 7) 12D – Sc4-18 [DL4-18 (ЛДГ + S. bulbocastanum) 88.34/14] + S.

pinnatisectum. Использовано три первичных соматических гибрида: 10D-1 (комб. 1, 2, 6), 1D-37-4 (комб. 3, 4, 5), Л30-1-2 (комб. 4). Первичный соматический гибрид DL4-18 – материнская форма полового гибрида Sc4-18, который является одним из партнеров комбинации ВСГ №7.

Вторичные соматические гибриды комбинаций P (№1), S (№2) and 6D (№3).

идентифицированы по изозимам пероксидазы. Соматический гибрид идентифицирован в ПЦР с SSR-маркерами для 12 из 80 регенерантов комбинации №7. Дополнительно SCAR маркеры Sblb на гермоплазму S. bulbocastanum и COS4 на гермоплазму неклубненоса S.

etuberosum были использованы для подтверждения гибридности в комбинации S.

Определение гибридности регенерантов комбинаций 7D, 11D и 12D в процессе работы.

Цветущие растения описаны для регенерантов всех комбинаций за исключением 11D.

Ягоды от свободного опыления и кроссов собраны на растениях комбинаций 1 (P), 2 (S), 3 (6D), 4 (7D), 5 (8D). Четыре семени, выделенные из двух ягод гибрида Р2-17 в условиях in vitro дали 3 сеянца, два из которых 09P/1-2 и 09P/1-3 успешно скрестили с S. tuberosum, 4х. Вторичный соматический гибрид Р2-17 и его половые потомки 09P/1-2, 09P/1-3 содержат гермоплазму неклубненоса S. etuberosum согласно данным ПЦР со SCAR маркером COS4.

Образцы, устойчивые к Y-вирусу картофеля (YВК), выявлены в популяциях растенийрегенерантов комбинаций P (№1), S (№2), 6D (№3), 8D (№5) в тесте с прививкой на растения томата, инфицированные различными штаммами YВК. Устойчивые к фитофторозу образцы выделены в популяции соматических гибридов комбинации S с мексиканским видом S. bulbocastanum.

–  –  –

Research and Practical Centre of National Academy of Sciences of Belarus for Potato, Fruit and Vegetable Growing, Belarus, Minsk region, 223013, Samokhvalovichi,2a Kovaleva St, fax: (+375-17) 506-70-01, tel.: (+375-17) 506-69-98, e-mail: y_galina@tut.by The cultivated potato Solanum tuberosum has one of the largest gene pools, including more than 200 wild relatives. Gene transfer from these species through conventional breeding is difficult owing to sexual incompatibility or reproductive barriers. Somatic hybridization via protoplast fusion is a possible alternative for gene transfer from these species to cultivated crops.

The technique involves the fusion of protoplasts of the two different genomes followed by regeneration of plantlets and selection of hybrids. It was used for overcome sexual barriers and broadening potato germplasm accessible for breeding. The secondary somatic hybridization involves the fusion of protoplasts of the two partners, one of which or both partners are presented by the somatic hybrids.

The mesophyll leaf protoplasts were fused in presence PEG, Ca2+, pH=10, large numbers of colonies were obtained and 990 shoots were regenerated in 7 combinations of secondary somatic hybridization: 1) P – LDG (S. tuberosum, 2x) + 10D-1 [S. polyadenium + (S.

etuberosum S. brevidens)]; 2) S – 10D-1 + S. bulbocastanum; 3) 6D – 429 (S. tuberosum, 2x) + 1D-37-4 [86-6 (S. tuberosum S. chacoense) + S. cardiophyllum]; 4) 7D – 1D-37-4 + L30-1-2 [78563-76 (S. tuberosum, 4x) + S. caripense]; 5) 8D – 1D-37-4 + S. boliviense; 6) 11D – 10D-1 + S. boliviense; 7) 12D – Sc4-18 [DL4-18 (LDG + S. bulbocastanum) 88.34/14] + S.

pinnatisectum. Three primary somatic hybrids were used: 10D-1 (comb. N1, 2, 6), 1D-37-4 (comb. N3, 4, 5), L30-1-2 (comb. N4). The primary somatic hybrid DL4-18 was female parent of sexual hybrid Sc4-18 – one of the partners of combination N7.

The secondary somatic hybrid plants were identified by their isoenzyme peroxidase patterns in combinations P (comb. N1), S (comb. N2) and 6D (comb. N3). Molecular analysis with SSRmarkers of 12 from 80 regenerated shoots was used for revealing hybrid in combination 7D (comb. N4). Additionally SCAR markers Sblb of S. bulbocastanum germplasm and COS4 nontuberous germplasm S. etuberosum were used for confirmation hybridity of plants which were regenerated in combination S. The determination hybridity of regenerants of fusion combinations 7D, 11D and 12D are in the process.

Bloomed plants were revealed between regenerants of all combinations of secondary somatic hybridization except of 11D. The berries from free pollination and crosses with cultivated potato were collected from plants regenerated in combinations numbers 1 (P), 2 (S), 3 (6D), 4 (7D), 5 (8D). The four seeds were isolated from two berries obtained in free pollination of somatic hybrid P2-17 (comb. N1). Three seeds were germinated in vitro. Two from three obtained seedlings 09P/1-2 and 09P/1-3 were crossed successfully with cultivated potato. The secondary somatic hybrid P2-17 and their sexual progeny 09P/1-2 and 09P/1-3 were positive for SCAR marker COS4 which confirmed the presence in their genomes non-tuberous germplasm S. etuberosum.

The PVY resistant samples were found within populations of regenerants of combinations P (N1), S (N2), 6D (N3), 8D (N5) in the test with grafting on Y-affected tomato plants. Late blight resistant samples were detected within population of somatic hybrids S with species S.

bulbocastanum.

Секция 6

–  –  –

Республиканское унитарное предприятие «Научно-практический центр национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству», Беларусь, Минский район, 223013, п. Самохваловичи, ул. Ковалёва 2а, факс: (+375-17) 506-70-01, тел.: (+375-17) 506-69-98, e-mail: y_galina@tut.by Один из самых больших генетических пулов ценных для сельскохозяйственных культур генов принадлежит культурному картофелю (Solanum tuberosum L.), он насчитывает более 200 видов. Наличие пред- и пост-зиготных барьеров и различие в уровне функциональной плоидности, определяемой балансовым числом эндосперма (EBN) препятствуютт прямому переносу генов из диких видов в S. tuberosum.

Соматическая гибридизация, как альтернативный классической селекции метод, обеспечивает создание предселекционного материала с увеличенной генетической вариабельностью и ценными для селекции признаками от диких видов. Дополнительным преимуществом соматической гибридизации является возможность одновременного переноса ядерных и цитоплазматических генов и сохранения их биоразнообразия.

Критический момент соматической гибридизации – проблема с фертильностью соматических гибридов и их способностью к генерации жизнеспособного потомства в кроссах с культурным картофелем. Генерация полового потомства соматических гибридов имеет самостоятельную ценность независимо от наличия ценных для селекции признаков вследствие увеличения генетического пула доступного селекционеру.

Количество успешных соматических гибридов между S. tuberosum и другими представителями Solanum ограничено 10 видами: S. acaule, S. brevidens, S.

bulbocastanum, S. cardiophyllum, S. circaeifolium, S. commersonii, S. etuberosum, S. nigrum, S.

pinnatisectum and S. tarnii. Как успешные мы рассматриваем соматические гибриды, обладающие желаемым для селекционера признаком, перенесенным от дикого вида, и способные скрещиваться с тетраплоидным картофелем, как правило, в качестве материнской формы.

В наших экспериментах межвидовые соматические гибриды картофеля получены химическим слиянием протопластов мезофилла листа в 16 комбинациях, в том числе 4 – во вторичной соматической гибридизации. Половое потомство получено в 7 комбинациях.

Как правило, необходимо наличие фертильности у одного из партнеров соматической гибридизации. Первые несколько лет вегетативного размножения (от 2 до 6 в зависимости от комбинации) необходимы для стабилизации соматических гибридов, полученных слиянием суспензий протопластов 2-х родителей.

Для успешных соматических гибридов 5-ти комбинаций получено 2 и более половых поколений, в том числе по комбинациям: SB – тетраплоид S. tuberosum 78563-76 + S.

bulbocastanum, 2D – 86-6 (S. tuberosum S. chacoense) + S. etuberosum, 4D – 86-6 + Л49-2 (S. etuberosum S. brevidens) – 4 и более; DL – дигаплоид S. tuberosum ЛДГ + S.

bulbocastanum – 3; F – 78563-76 + S. polyadenium и P – ЛДГ (S. tuberosum, 2x) + 10D-1 [S.

polyadenium + (S. etuberosum S. brevidens)] – 2. Соматические гибриды SB и их половые поколения устойчивы к фитофторозу листьев и клубней и к Y-вирусу картофеля (YВК).

Они содержат ген устойчивости к фитофторозу RB (Rpi-blb1) из S. bulbocastanum.

Соматические гибриды 2D и 4D с неклубненосами и их половые поколения устойчивы к вирусам картофеля Y и L. Они включают гермоплазму неклубненосного вида S.

etuberosum согласно ПЦР со SCAR маркером COS4. Соматические гибриды комбинаций SB, F, DL, 2D, 4D имеют различные сочетания геномов пластид и митохондрий согласно данным ПЦР с маркерами на хлоропластный (NTCP09, ALC_1/ALC_3) и митохондриальный (ALM_1/ALM_3, ALM_4/ALM_5) геномы.

Секция 6

SECONDARY SOMATIC HYBRIDIZATION OF POTATO

Yakovleva G.A., Semanyuk T.V., Dubinich V.L., Rodzkina I.A., Schcurko K.A., Makhanko O.V., Manarkhovich S.V.

Research and Practical Centre of National Academy of Sciences of Belarus for Potato, Fruit and Vegetable Growing, Belarus, Minsk region, 223013, Samokhvalovichi,2a Kovaleva St, fax: (+375-17) 506-70-01, tel.: (+375-17) 506-69-98, e-mail: y_galina@tut.by The cultivated potato Solanum tuberosum has one of the largest gene pools, including more than 200 wild relatives. Gene transfer from these species through conventional breeding is difficult owing to sexual incompatibility or reproductive barriers. Somatic hybridization via protoplast fusion is a possible alternative for gene transfer from these species to cultivated crops.

The technique involves the fusion of protoplasts of the two different genomes followed by regeneration of plantlets and selection of hybrids. It was used for overcome sexual barriers and broadening potato germplasm accessible for breeding. The secondary somatic hybridization involves the fusion of protoplasts of the two partners, one of which or both partners are presented by the somatic hybrids.

The mesophyll leaf protoplasts were fused in presence PEG, Ca2+, pH=10, large numbers of colonies were obtained and 990 shoots were regenerated in 7 combinations of secondary somatic hybridization: 1) P – LDG (S. tuberosum, 2x) + 10D-1 [S. polyadenium + (S.

etuberosum S. brevidens)]; 2) S – 10D-1 + S. bulbocastanum; 3) 6D – 429 (S. tuberosum, 2x) + 1D-37-4 [86-6 (S. tuberosum S. chacoense) + S. cardiophyllum]; 4) 7D – 1D-37-4 + L30-1-2 [78563-76 (S. tuberosum, 4x) + S. caripense]; 5) 8D – 1D-37-4 + S. boliviense; 6) 11D – 10D-1 + S. boliviense; 7) 12D – Sc4-18 [DL4-18 (LDG + S. bulbocastanum) 88.34/14] + S.

pinnatisectum. Three primary somatic hybrids were used: 10D-1 (comb. N1, 2, 6), 1D-37-4 (comb. N3, 4, 5), L30-1-2 (comb. N4). The primary somatic hybrid DL4-18 was female parent of sexual hybrid Sc4-18 – one of the partners of combination N7.

The secondary somatic hybrid plants were identified by their isoenzyme peroxidase patterns in combinations P (comb. N1), S (comb. N2) and 6D (comb. N3). Molecular analysis with SSRmarkers of 12 from 80 regenerated shoots was used for revealing hybrid in combination 7D (comb. N4). Additionally SCAR markers Sblb of S. bulbocastanum germplasm and COS4 nontuberous germplasm S. etuberosum were used for confirmation hybridity of plants which were regenerated in combination S. The determination hybridity of regenerants of fusion combinations 7D, 11D and 12D are in the process.

Bloomed plants were revealed between regenerants of all combinations of secondary somatic hybridization except of 11D. The berries from free pollination and crosses with cultivated potato were collected from plants regenerated in combinations numbers 1 (P), 2 (S), 3 (6D), 4 (7D), 5 (8D). The four seeds were isolated from two berries obtained in free pollination of somatic hybrid P2-17 (comb. N1). Three seeds were germinated in vitro. Two from three obtained seedlings 09P/1-2 and 09P/1-3 were crossed successfully with cultivated potato. The secondary somatic hybrid P2-17 and their sexual progeny 09P/1-2 and 09P/1-3 were positive for SCAR marker COS4 which confirmed the presence in their genomes non-tuberous germplasm S. etuberosum.

The PVY resistant samples were found within populations of regenerants of combinations P (N1), S (N2), 6D (N3), 8D (N5) in the test with grafting on Y-affected tomato plants. Late blight resistant samples were detected within population of somatic hybrids S with species S.

bulbocastanum.

Авторский указатель Bnyai P., Kursinszki L., Kuzovkina I., Szke. 206 Leistner E. 40 Miroshnichenko D.N., Dolgov S.V. 245 Paek K. Y. 41 Park S.Y., Moon H.K., Shin H., Kang K.S., Paek K.Y. 90 Touraev A. 42 А Агафодорова М.Н., Солодкая Л.А., Лапотышкина Л.И., Клименко И.А., Шамустакимова А.О.

Акулов А.Н., Горшков О.В., Румянцева Н.И. 156 Алексеева В.В., Мудрик В.А.2, Рукавцова Е.Б., Голубчикова Ю.С., Ермошин А.А.

Амброс Е.В., Полубоярова Т.В., Новикова Т.И. 91 Амирова А.К., Касымхан К., Бишимбаева Н.К., Рахимбаев И.Р. 56 Анапияев Б.Б., Искакова К.М., Бейскенбек Е.Б., Казкеев Д.Т., Жанбырбаен Е.А.

Антоненко Е.В., Кременевская Е.М., Ермишина Н.М., Лемеш В.А. 93 Б Беккужина С.С., Рахимбаев И. 332 Балекин А.Ю., Высоцкая О.Н. 268 Белинская Е.В., Тымчук С.М., Деребизова О.Ю. 97 Бишимбаева Н.К. 99 Бишимбаева Н.К., Амирова А.К., Карабаев М.К., Рахимбаев И.Р 101 Бишимбаева Н.К., Парменова А.К., Шилманова А.А., Муртазина А.С., Рахимбаев И.Р.

Бободжанова Х.И., Абдулалишоева С.Ф., Ясаулова Ш.К., Бабаева С.Х. 270 Бойкова Н.В., Ткаченко О.В., Евсеева Н.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю.

Бородай В.В., Бальвас К.М., Миголь М.О. 60 В Валиков В.А. 272

–  –  –

Я Яковлева Г.А., Семанюк Т.В., Дубинич В.Л., Родькина И.А., Щурко К.А., Маханько О.В., Монархович С.В.

Яковлева Г.А., Семанюк Т.В., Дубинич В.Л., Родькина И.А., Щурко К.А., Монархович С.В.

Ярмоленко Л.В. 328 С 1988 года поставляет оборудование, расходные материалы и реактивы российских и зарубежных производителей. Наши клиенты - сотрудники лабораторий: биологических, химических, медицинских, контроля качества пищевых и химфарм предприятий, государственные контрольные службы

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 ||

Похожие работы:

«OPENGOST.RU www.OpenGost.ru Портал нормативных документов info@opengost.ru 3.1.2. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ Профилактика дифтерии Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2.1108-02 1. Разработаны: Московским научно-исследовательским институтом...»

«Хайбрахманов Тимур Салаватович КАРТОГРАФИЧЕСКАЯ БАЗА ДАННЫХ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКОЛОГО-ГЕОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ Специальность 25.00.33 – картография Диссертация на соискание ученой степе...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт неразрушающего контроля Направление подготовки 20.03.01 "Техносферная...»

«АНАЛИЗ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ В БЕЛАРУСИ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ПЕРСПЕКТИВ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ* Елена Ракова** Резюме Зависимость от одного поставщика топливно-энергетических ресурсов и превалирование природного газа в топливно-энергетическом балансе делают Беларусь уязвимой с точки зрения энергет...»

«Библиографические ссылки 1. Комплексный доклад о состоянии окружающей природной среды в Челябинской области в 2011 г.: информ. сб. Челябинск, 2012.2. Экологические последствия радиоактивного загрязнения на...»

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как...»

«ISSN 1727-9712 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ГИГИЕНЫ ТРУДА И ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ЕБЕК ГИГИЕНАСЫ ЖНЕ МЕДИЦИНАЛЫ ЭКОЛОГИЯ ГИГИЕНА ТРУДА И МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ № 2 (47), 2015 г. OCCUPATIONAL HYGIENE and MEDICAL ECOLOGY ЕЖЕКВАРТАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРН...»

«ПРЕДСТАВИТЕЛИ АКЦИОНЕРА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ: ОПЫТ ДТЭК Евгений Круть Менеджер Департамента по корпоративному управлению ДТЭК ДАТА: 03.06.2016, Г. КИЕВ КОНФИДЕНЦИАЛЬНО ВМЕСТО ПРЕДИСЛОВИЯ. "ВЫ НЕ ПОМНИТЕ, КТО ТАКИЕ ЮРИДИЧЕСКИЕ ЛИЦА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ, ЭТОГ...»

«3. 2017 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS РАСТЕНИЕВОДСТВО PLANT RAISING Асланов Г. А., Новрузова Г. Х. Aslanov G. A., Novruzova G. H. Влияние удобрений на урожайность хлопчатника 2 Effect of fertilizers on cotton productivity. 2 Ерошенко Л. А., Бекенова Л. В., Кузнецова Н...»

«МБОУ "Анабарская улусная гимназия"ОБСУЖДЕНО СОГЛАСОВАНО УТВЕРЖДАЮ На заседание МО зам директора по УНР директор школы Естественно-математического цикла Герасимова Н.И. Матвеева В.А._ Торокова А.П._ "_"_2015 г "_"_2015г. "_" 2015 г. РАБОЧАЯ УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА (типовая) БИОЛОГИЯ 6-9класс. УМК В....»

«1 Человек – саламандра. Фантастика или реальность? МОУ средняя общеобразовательная школа №27 Плахотин Кирилл, 9а класс, МОУ СОШ № 27 Руководитель: Суховеенко Раиса Егоровна, учитель биологии МОУ СОШ № 27 Содержание Введение......................................................... 1 Глава 1. Аналитиче...»

«2011 БЕЛКИ ПЕПТИДЫ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Научный совет по биоорганической химии Учреждения Российской академии наук: Институт биологии Карельского научного центра РАН Институт биоорганической химии им. ак...»

«Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Кольцово – 2008 Работа выполнен...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2011. – Т. 20, № 2. – С. 31-43. УДК 598.1(091)(470.53) ОБ ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ГЕРПЕТОФАУНЫ ПЕРМСКОГО КРАЯ 2011 А.Г. Бакиев, Н.А. Четанов* Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти (Россия)...»

«МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ С. В. Зеленцов, Научно-технический кандидат сельскохозяйственных наук бюллетень В. С. Петибская, Всероссийского научно-исследовательского кандидат биологических наук и...»

«Образование и наука. 2014. № 2 (111) ЗДОРОВЬЕСБЕРЕЖЕНИЕ УДК 37.037.1+796.01:316 И. В. Манжелей СРЕДОВЫЙ ПОДХОД К ФИЗИЧЕСКОМУ ВОСПИТАНИЮ СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ Аннотация. В статье обсуждается проблема физического воспитания россиян, которая о...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@water.tu-chel.ac.ru (1), diff@irex.urc.ac.ru (2,3) Южно-Уральский государств...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно исследовательский инст...»

«УДК 612.017.1:616-097 КОЛИКОВА ЮЛИЯ ОЛЕГОВНА АУТОАНТИТЕЛА К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2003 Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета Научный руководите...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Капцегайтуйская средняя общеобразовательная школа" Рассмотрено Утверждаю На заседании МС Директор МБОУ "Капцегайтуйская СОШ" Протокол № /Н.А.Волгина/ ""_2016 г. Приказ №_ от ""_2017г. РАБОЧАЯ ПРОГРА...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на...»

«ЭЛЕКТРОННЫЙ УЧЕБНИК ПО ДИСЦИПЛИНЕ "ЭКОЛОГИЯ" Акиньшин А. А., Пащенко И. В., Луценко Е. В. Шлыков К. И., Закурдаев А. В. – студенты, Шамов Ю.А. – к.т.н. доцент Алтайский государственный технический университет (г.Барнаул) Программа является электронным учебным пособием к изучению дисциплины по экологии. Основной литературой при соз...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.