WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

«ЛИПИДЫ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, ДИМОРФИЗМЕ И АДАПТАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ ...»

На правах рукописи

МЫСЯКИНА Ирина Сергеевна

ЛИПИДЫ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, ДИМОРФИЗМЕ И

АДАПТАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

03.00.07 микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2009

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии Учреждения

Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского

РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова доктор биологических наук А.Г. Меденцев

Ведущая организация: биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 16 ноября 2009 г. в ______ на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312 Москва, Просп. 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Автореферат разослан ________________________ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета К.б.н. Хижняк Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Липиды грибов, отличающиеся многообразием химической структуры, физических свойств и выполняемых функций, участвуют в поддержании адекватного окружению уровня метаболических процессов, адаптации к изменяющимся условиям среды и в процессах выживания. Роль липидов в жизнедеятельности грибов, морфогенетических процессах и диморфизме, определяется их функционированием как структурных и резервных соединений, факторов адаптации и регуляторных соединений [Nozawa, Kasai, 1978; Rao et al., 1985;

Noverr et al., 2001, 2003, 2004; Klose et al., 2004; Jeennor et al., 2006].

Проявление диморфизма у грибов сопряжено с существенными изменениями биосинтетических и энергетических процессов и структурноморфологических характеристик, что имеет адаптивный характер и направлено на поддержание жизнеспособности организма в изменившихся условиях.

Диморфизм определяет жизненную стратегию грибов путем образования клеток альтернативных морфотипов, обеспечивающих рост и выживание культуры в различных (в том числе стрессовых) условиях. У грибов, в том числе, представителей пор. Mucorales, диморфизм представлен двумя морфологическими формами – мицелиальной и дрожжеподобной, наиболее существенные различиякоторых обусловлены структурой и механизмами формирования клеточной стенки, а также характером роста клетки (апикальным или сферическим). Различия в компонентном составе клеточной стенки не являются единственным фактором, определяющим характер морфогенетических процессов и форму клеток. Имеется много работ, посвященных исследованию взаимосвязи липидного обмена с морфогенезом грибов и свидетельствующих о

Список сокращений

ГЛ Гликолипиды ССт Свободные стерины ДАГ Диацилглицерины СЖК Свободные ЖК ЖК Жирные кислоты ТАГ Триацилглицерины ИЦДГ Изоцитратдегидрогеназа ЭС Эфиры стеринов ИЦЛ Изоцитратлиаза 4-ХА 4-хлоранилин КЛ Кардиолипин ФЛ Фосфолипиды МАГ Моноацилглицерины ФК Фосфатидные кислоты МДГ Малатдегидрогеназа ФС Фосфатидилсерины МЭЖК Метиловые эфиры ЖК ФХ Фосфатидилхолины НЛ Нейтральные липиды ФЭА Фосфатидилэтаноламины ОЛ Общие липиды Цер Цереброзиды ПЛ Полярные липиды ЦТК Цикл трикарбоновых кислот важности липидов как структурных и регуляторных компонентов клетки [Gordon et al.





, 1971; Nomura et al., 1972; Ohno et al., 1976; Greenspan, Mackow, 1977;

Brambl et al., 1978; Daum et al., 1979; Ito et al., 1982; Ghannoum et al., 1986; Sanadi et al., 1987; McLain, Dolan, 1997; Calvo et al., 2001; Klose et al., 2004]. Однако анализ литературы не позволяет сделать определенных выводов о корреляции между липидным составом и морфологическими особенностями клеток и свидетельствует о сложном характере связи липидов с морфогенезом.

В последние годы интерес к изучению роли липидов в диморфизме грибов возрос благодаря тому, что этот феномен оказался связан с широким распространением возбудителей микозов животных и человека и патогенов сельскохозяйственных растений. Мицелиальная и дрожжевая формы диморфных грибов, многие из которых являются патогенными, имеют разную вирулентность [Ghannoum et al., 1986; Kobayashi, Cutler, 1998; Ghormade, Deshpande, 2000; Bahn et al., 2003; Andrews et al., 2004; Ruiz-Herrera et al., 2006]. Известно участие в контроле морфологических переходов (мицелийдрожжеподобные клетки) не только мембранных фосфолипидов, но и стеринов, а также регуляторных липидов, не выполняющих структурной функции [Ito et al., 1982; Vanden Bossche et al., 1983; Odds, 1985; Odds et al., 1985; Georgopapadakou et al., 1987; Vanden Bossche, 1990; Hube et al., 2001; Klose et al., 2004]. Имеются сведения, что жирные кислоты также могут участвовать в регуляции морфологических переходов у диморфных грибов, связанных с вирулентностью и отношениями хозяин–паразит [Jensen et al. 1992; Noverr et al., 2001, 2003, 2004].

Мукоровые грибы, являются классической моделью для изучения диморфизма, и хотя в большинстве они не патогенны, отдельные виды в определенных условиях могут вызывать оппортунистические инфекции – мукормикозы разной локализации, при этом патогенной формой гриба является мицелиальная [Josefiak et al. 1958; Baker, 1970; Whiteway et al., 1979; Lehrer, 1980; Prabhu, Patel, 2004; Harada, Lau, 2007]. Очевидно, что в связи с возросшим интересом к исследованию роли липидов в морфогенетических процессах, актуальным является поиск критериев, необходимых для оценки способности грибов к диморфизму.

Грибы широко применяются в различных биотехнологических производствах и экологических биотехнологиях [Кузнецов, Градова, 2006], а представители отдельных видов мукоровых грибов являются перспективными продуцентами комплекса биологически активных соединений липидной природы – каротиноидов и -линоленовой кислоты. Выяснение закономерностей регуляции морфогенетических процессов и диморфизма у мукоровых грибов необходимо для повышения эффективности штаммов-продуцентов и разработки условий, способствующих мелкодисперсному росту при сохранении высоких показателей липогенеза в биотехнологиях получения липидов.

Таким образом, исследования биосинтеза, метаболизма и регуляторных функций липидов у мицелиальных грибов представляют не только теоретический интерес, но и имеют большое значение для современной медицины, ветеринарии и сельского хозяйства, чем определяется актуальность выполненного исследования.

Цель работы – исследовать изменения липидного состава в процессах адаптации к изменениям условий среды и стрессовым воздействиям, определить значимость липидов в морфогенезе и диморфизме грибов и установить биохимические критерии, позволяющие оценивать способность мукоровых грибов к дрожжеподобному росту.

В задачи диссертации входило:

· исследовать изменения состава некоторых классов липидов и жирных кислот мицелиальных грибов при воздействиях стрессовых факторов: полиенового антибиотика нистатина, этанола, а также неоптимальных температур для выявления роли липидов в процессах адаптации к этим неблагоприятным условиям;

· исследовать состав липидов и способность мукоровых грибов к диморфизму в аэробных условиях при воздействии морфогенных агентов - хлорированных анилинов и высокой кислотности среды;

· выявить корреляцию между морфологическими изменениями, возникающими в условиях различных режимов азотного и углеродного питания грибов, их метаболической активностью и липидным составом клеток;

· выявить особенности состава липидов дрожжеподобной и мицелиальной форм мукоровых грибов в различных условиях роста;

· исследовать влияние качества спорангиоспор на развитие и морфогенез мукоровых грибов;

· выявить корреляцию между составом структурных и запасных липидов спорангиоспор мукоровых грибов и типами морфологической дифференцировки (дрожжеподобным или мицелиальным);

· исследовать влияние экзогенных липидов различного состава на морфогенез мукоровых грибов.

Научная новизна. В работе использован оригинальный подход к изучению роли липидов в диморфизме грибов, который является новым направлением в изучении взаимосвязи между составом липидов и типом дифференцировки грибных клеток: в сравнительном аспекте исследованы липиды ряда диморфных и мономорфных представителей пор. Mucorales.

Морфологические транзиции рассматриваются с позиций биохимической адаптации к стрессовым факторам, что позволило сделать вывод о взаимосвязи реализации определенного морфотипа с составом жирных кислот, мембранных фосфолипидов и стеринов. Установлено, что уровень эргостерина и соотношение метилированных и деметилированных стеринов, непосредственно коррелируют с морфогенезом.

Изучено действие ряда морфогенных агентов и мембранотропных соединений на морфогенез грибов и установлено, что феномен диморфизма распространен шире, чем считалось ранее, и свойствен, помимо диморфных, также видам, ранее относимым к мономорфным, которые способны в стрессовых условиях к дрожжеподобному росту. Впервые получена информация о биосинтезе липидов и их участии в контроле диморфизма при действии на грибы хлорированных анилинов как специфических морфогенных агентов.

Получены новые сведения о функциональной активности грибных липидов. Установлено, что такие резервные липиды как ТАГ и ЭС, способны играть защитную роль в стрессовых условиях, а изменения доли полиненасыщенной -линоленовой кислоты, компонента клеточных мембран, могут рассматриваться как сигнал о стрессе.

Впервые определен состав липидов у различных морфотипов Mucor hiemalis, выявлены особенности состава липидов артроспор, отличающие их от морфологически сходных с ними дрожжеподобных клеток. В составе стеринов артроспор идентифицированы новые редкие соединения – 1-дигидродегидронеоэргостерин и дегидронеоэргостерин, продукты трансформации эргостерина, которые могут принимать участие в морфогенетических процессах и служить маркерами различных форм цитодифференцировки гриба.

Получена новая информация о важной роли изменений липидного состава грибов для морфогенетических процессов. Обнаружена взаимосвязь предпочтительного развития определенного морфотипа мукоровых грибов (гифального или дрожжеподобного) с различиями в составе липидов спорангиоспор, использованных в качестве посевного материала; разработаны биохимические критерии оценки способности мукоровых грибов к сферическому (дрожжеподобному) росту.

Практическая значимость.

Для оценки жизнеспособности спорангиоспор мукоровых грибов, используемых в качестве инокулята в биотехнологических производствах, и способности спорангиоспор при прорастании давать начало дрожжеподобному росту предложено использовать следующие показатели, основанные на качественных и количественных характеристиках их липидов:

(1) высокий уровень ненасыщенных жирных кислот (особенно -линоленовой) и (2) уровень ДАГ; (3) повышенное отношение ФЭА/ФХ и (4) метилстерины/десметилстерины; (5) низкий уровень ТАГ, (6) пониженное отношение ФЛ/ГЛ и (7) ЭС/СCт в спорангиоспорах.

На основании результатов анализа липидного состава 40 штаммов грибов пор. Mucorales выявлена перспективность использования штаммов М. hiemalis в качестве продуцентов каротиноидов (3.6–8.2 мг/г липидов) и штаммов М.

circinelloides как продуцентов комплекса липидов с высоким содержанием линоленовой кислоты (до 372.0 мг/л среды) и каротиноидов (до 3 мг/г липидов).

Разработан способ культивирования М. circinelloides var. lusitanicus с высоким выходом липидов и содержанием в них -линоленовой кислоты (до 40% от суммы жирных кислот), защищенный патентом РФ № 1751212. Состав липидов делает их перспективными для использования в медицинской практике, диетическом питании, косметологии.

Оптимизированы условия выделения липидов из биомассы гриба М. circinelloides var. lusitanicus 306D, обеспечивающие максимальный выход целевого продукта и предусматривающие замену токсичных растворителей (хлороформа и метанола) экологически менее вредными системами (этанолом и гексаном).

Предложены режимы безотходной технологии получения липидов из М. circinelloides var. lusitanicus 306D на основе отходов пищевых предприятий (меласса, кукурузный экстракт, подсолнечное масло, белкозин). Остающаяся после извлечения липидов биомасса, содержащая более 40% белка с практически полным набором незаменимых аминокислот (в том числе лизина), может быть использована в качестве кормовой добавки к рациону сельскохозяйственных животных.

Показано, что мукоровые грибы могут применяться для эффективной доочистки промывных вод маслоперерабатывающих предприятий и получения биологически активных липидов, по содержанию -линоленовой кислоты (до 15% от суммы жирных кислот) сходных с растительными маслами (примулы вечерней или ослинника).

Преимуществами предлагаемых технологий получения грибных липидов являются высокая скорость роста продуцентов, высокое содержание полиненасыщеных жирных кислот в липидах, возможность направленно регулировать процессы роста и липогенеза.

Основные защищаемые положения:

· Липиды мицелиальных грибов участвуют в формировании адаптивных реакций к изменениям условий среды и при воздействии различных стрессовых факторов (полиенового антибиотика нистатина, этанола, гипотермии, изменениям соотношения углерода и азота). Адаптация осуществляется путем регулирования липидного состава: качественного и количественного изменения жирных кислот, мембранных липидов и основных резервных ацилсодержащих фракций.

· Изменения состава липидов коррелируют с метаболической активностью и морфогенетическими процессами при воздействии морфогенных факторов – высокого содержания глюкозы, закисления среды, хлорированных анилинов, вызывающих реализацию альтернативных программ роста грибов – мицелиального или дрожжеподобного.

· Особенности состава липидов и ЖК у мицелиального и дрожжеподобного морфотипов и артроспор мукоровых грибов, а также соотношения определенных классов липидов могут быть маркерами этих морфотипов.

· Липидные характеристики спорангиоспор мукоровых грибов – уровень ненасыщенных жирных кислот, количества ДАГ, ТАГ, соотношения ФЭА/ФХ, ФЛ/ГЛ, метилстерины/десметилстерины и ЭС/СCт являются показателями жизнеспособности спорангиоспор и потенциальной способности при прорастании давать начало дрожжеподобному росту.

· Экзогенное внесение липидов определенного качественного состава, в т.ч.

экстрагированных из спорангиоспор различного физиологического возраста, на стадии инокуляции позволяет направленно регулировать развитие гриба в виде желаемого морфотипа.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и представлены на конференциях: XVI, XVII, XVIII конференциях молодых ученых МГУ «Проблемы современной биологии» (Москва, 1986-1988), Всероссийской конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов»

(Пущино, 1989), The Tenth International Symposium on Plant Lipids (Held at Jebra, Tunisia, 1992), «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» (Москва, 1994), Всероссийской конференции «Современные достижения биотехнологии»

(Ставрополь, 1996), III Всероссийском научном конгрессе «Человек и лекарство»

(Москва, 1996), 21st International Specialized Symposium on Yeasts “Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)” (Lviv, Ukraine, 2001), I съезде микологов России (Москва, 2002), I, II, III, IV, V Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003-2007), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (Пущино, 2003), Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 2007), II съезде микологов России (Москва, 2008), VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 51 научная работа, в том числе 27 статей в реферируемых научных журналах, 1 обзор, 5 статей в научных сборниках, 17 тезисов докладов на российских и международных конференциях, 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (2 главы), методической части, результатов исследований (5 глав), обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы из 560 наименований (в т.ч. 497 иностранных). Диссертация изложена на 326 страницах и включает 71 таблицу и 39 рисунков.

Работа проводилась при финансовой поддержке Московского комитета по науке и технологиям, ГНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения»

(подпрограмма «Новейшие методы биоинженерии», направление «Биотехнология защиты окружающей среды» (1997 г.), а также субвенций Минпромнауки РФ по проекту «Создание новых биотехнологий получения эссенциальных, эйкозаполиеновых липидов с использованием продуцентов из определенных таксонов микромицетов» (распоряжения № 144-3ф от 21.10.1999 г., № 53-4ф от 28.03.2000 г. и № 04.900.43/093 от 23.04.2002 г.).

Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Н.С. Фунтиковой, а также коллегам, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований были полученные из ВКМ РАН 40 штаммов мукоровых грибов, представители класса Zygomycetes, а также Fusarium solani (Mart.) Sacc. ВКМ F-142, представитель анаморфных грибов класса Hyphomycetes и полученные на его основе олигоконидиальные и поликонидиальный мутанты. Штамм M. circinelloides var. lusitanicus был получен в ИНМИ РАН методом селекционного отбора после УФ-облучения и депонирован в ВКМ РАН под номером F-306D [Фунтикова и соавт., 1990].

В качестве базовой среды для глубинного культивирования мукоровых грибов использовали среду следующего состава (г/л): глюкоза – 30 или 60; мочевина – 1; NaCl – 0.5; MgSO4*7H20 – 0.5; K2HPО4 – 1; дрожжевой экстракт – 0.5; FeSО4*7H2О – 0.01; рН 6.8–7, температура 27-28°С.

Для получения роста в виде дрожжеподобных клеток в глубинной культуре использовали среду следующего состава (г/л): глюкоза - 150; мочевина NH4)2SО4 - 5; MgSО4*7H2О - 1; К2НРО4 - 1; NaCl - 0.5; FeSО4*7H2О - 0.02;

дрожжевой экстракт - 2; рН 6.8, а также вышеуказанную базовую среду с повышенным содержанием глюкозы (200 г/л).

Разделение клеток различных морфотипов. Дрожжеподобные клетки отделяли от среды культивирования фильтрованием и последующим центрифугированием. Артроспоры отделяли от мицелия механически (с помощью стеклянной палочки), отделяли фильтрованием и осаждали центрифугированием.

Спорангиоспоры получали при поверхностном культивировании грибов на пшеничных отрубях (начальная влажность 70%), подсолнечном жмыхе, агаризованном сусле (7°Б) и агаризованной базовой минеральной среде.

Световую (“Carl Zeiss”, Германия) и электронную микроскопию (Jeol JSM-Т300, "Jеоl", Япония) при увеличении 200–2000 и 2.5 тыс. раз соответственно использовали для наблюдения за развитием культур, морфологическими изменениями, подсчета количества спор, сканирования их поверхности. Ультратонкие срезы клеток после контрастирования и окрашивания по Рейнольдсу просматривали в электронном микроскопе JЕМС ("Jеоl", Япония) при увеличении 14 и 20 тыс. раз.

Содержание азота определяли методом Кьельдаля; глюкозы – с использованием реактива Фелинга или по методу Бертрана [Бурштейн, 1963];

золы - сжиганием при температуре 600°С; нуклеиновых кислот – спектрофотометрическим методом [Спирин, 1958]. Поглощение кислорода определяли полярографическим методом на полярографе LPF (Чехия).

Качественный и количественный состав аминокислот в обезжиренной биомассе определяли на аминокислотном анализаторе ЛКБ 4101 (Швеция) после кислотного гидролиза и контроля чистоты гидролизата хроматографическим методом.

Бесклеточные экстракты получали замораживанием мицелия в жидком азоте, разрушением в клеточном дезинтеграторе, удалением (центрифугированием) обломков клеточной стенки, а также пленки липидных гранул, а супернатант использовали для определения активности ферментов и выделения клеточных фракций.

Активность ферментов изоцитратлиазы (ИЦЛ, КФ 4.1.3.1), НАДзависимой изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ, КФ 1.1.1.41) и малатдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.1.37) в бесклеточных экстрактах определяли в соответствии с методами [Methods in Enzymology, 1955; Dixon, Kornberg, 1959; Kornberg, Pricer, 1951; Лозинов и соавт. 1976] спектрофотометрически (Specord UV-VIS, Германия).

Содержание белка в бесклеточных экстрактах определяли методом Лоури [Lowry et. al., 1951].

Клеточные фракции – липидных гранул, смешанной мембранной и митохондриальной фракции и фракции микросом – получали методом дифференциального центрифугирования бесклеточного экстракта [Давидова и соавт., 1986].

Экстракцию липидов проводили по методу Фолча [Folch et. al., 1957] или Блай и Дайера [Bligh, Dyer, 1959]; каротиноидов – с использованием системы растворителей гексан–95%-ный этанол (3 : 2); количество каротиноидов определяли фотоколориметрически (ФЭК-56М, Россия) при длине волны 451 нм [ГФ, 1988].

Отделение полярных липидов от нейтральных осуществляли их осаждением холодным ацетоном с последующим центрифугированием осадка [Kates, 1986] и хроматографической проверкой чистоты разделения.

Стерины выделяли после щелочного гидролиза липидов. Неомыляемую фракцию экстрагировали гексаном с последующей подготовкой для хроматомасс-спектрометрического исследования («Finnigan-3200», США) и ГЖХанализа (хроматограф модели 3700, Россия). Идентификацию стеринов проводили путем сравнения полученных масс-спектров с литературными данными, а также используя эмпирические корреляции между структурными и масс-спектральными особенностями изучаемых соединений [Djerassi, 1978;

Knights, 1967].

Состав классов липидов определяли методом ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия), используя для разделения нейтральных липидов систему гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (80 : 20 : 1), а для разделения полярных – систему хлороформ : метанол : 28%-ный аммиак (65 : 25 : 4). Двумерную хроматографию полярных липидов проводили в системах хлороформ : метанол : 28%-ный аммиак (65 : 25 : 5) в первом направлении и хлороформ : ацетон : метанол : уксусная кислота : вода (6 : 8 : 2 : 2 : 1) во втором. В качестве проявителей использовали 10%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле или серную кислоту.

Идентификацию липидов проводили с использованием качественных реакций с нингидрином (на липиды со свободной аминогруппой), a-нафтолом (на гликолипиды), реактивом Драгендорфа (на холин-содержащие липиды) [Kates, 1986], реактивом Васьковского (на фосфолипиды) [Vaskovsky, Kostetsky, 1968], смесью серной и уксусной кислот в соотношении 1 : 1 (на свободные и этерифицированные стерины) [Kates, 1986], а также путем сравнения с Rf свидетелей. Количественное определение отдельных классов липидов проводили денситометрически на приборе Chromoscan-3 (“Joyce Loeble”, Великобритания) с интегратором.

Метанолиз. Для получения метиловых эфиров жирных кислот липиды подвергали кислотному метанолизу.

Газо-жидкостную хроматографию метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе модели 3700 (Россия).

Степень ненасыщенности липидов выражали количеством двойных связей на 100 молекул жирных кислот [Weete, 1980].

Статистическую обработку данных проводили вычислением среднего квадратичного отклонения и критерия достоверности по Стьюденту (в работе был принят критерий значимости р0.01 и р0.05) [Дружинина, 1973], а также с использованием метода медианы [Ашмарин, Воробьев, 1962]. Повторность - не менее трех независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

–  –  –

Роль липидов в жизнедеятельности грибов, в том числе в морфогенезе, определяется их участием в клеточном метаболизме как структурных и резервных соединений, участников реакций адаптации к неблагоприятным условиям среды, а также как регуляторных соединений. Существенные изменения в составе классов липидов и жирных кислот грибов при воздействии неоптимальных для роста температур и различных стрессовых факторов, антибиотиков и других токсических соединений, позволяют говорить об участии липидов в формировании адаптивных реакций организма.

1.1. Липидообразование в условиях задержки роста мицелиальных грибов полиеновым антибиотиком нистатином Фунгицидное действие полиенового антибиотика нистатина основано на его взаимодействии со стеринами мембран, что приводит к дезорганизации структуры последних, нарушению клеточной проницаемости и ингибированию роста грибов [Левченко и соавт., 1984; Betina, 1985; Theis, Stahl, 2004; Silva et al., 2006]. Исследование влияния нистатина на липидообразование на модели зигомицета Mucor circinelloides var. lusitanicus F-306D и анаморфного гриба Fusarium solani F-142 показало разнообразие адаптивных реакций на его воздействие. При концентрации нистатина в среде, вызывающей ингибирование роста грибов, в составе клеточных липидов увеличивались доля структурных липидов, снижался уровень ТАГ – основной фракции резервных липидов, изменялось отношение ПЛ/ССт и ЭС/ССт (рис.1).

Также в присутствии фунгистатических концентраций антибиотика у мукорового гриба изменялся состав фосфолипидов: синтез ФХ и ФЭА ингибировался на стадии декарбоксилирования ФС (табл. 1). Восстановление роста (с 3 сут), сопровождалось снижением уровня не только ФС, но и КЛ и ГЛ, а также интенсивным накоплением ФХ и ФЭА. Таким образом, увеличение суммарного уровня ФХ и ФЭА во фракции фосфолипидов является одной из реакций адаптации мукорового гриба к воздействию нистатина, что согласуется с данными, полученными на модели S. cerevisiae, о снижении чувствительности клеток к полиеновым антибиотикам в присутствии этих ФЛ [Rao et al., 1985].

На этапе задержки роста (2 сут) в нейтральных липидах M. circinelloides var. lusitanicus F-306D отмечено значительное возрастание уровня -линоленовой кислоты, которое снижалось при восстановлении роста (рис. 2), что свидетельствует о ее функциональности в развитии стрессового ответа и может рассматриваться как сигнал о стрессе. В целом же, состав ЖК мукорового гриба оставался стабильным. У другого гриба, F. solani F-142, в присутствии нистатина, напротив, наблюдалось изменение ЖК-состава: увеличивалась доля короткоцепочечных и насыщенных кислот, а также олеиновой и -линоленовой, при одновременном снижении уровня линолевой кислоты.

Полученные результаты позволяют заключить, что при воздействии нистатина на F. solani поддержание функциональной активности мембран осуществляется, главным образом, путем регуляции состава жирных кислот активностью ЖК-десатураз и элонгаз, а у мукорового гриба – преимущественно стабилизацией уровня стеринов за счет гидролиза эфиров стеринов. Таким образом, мицелиальные грибы обладают различными механизмами модификации липидного состава клеток, способствующими адаптации грибов к возрастающим концентрациям нистатина, – жирнокислотным и стериновым.

Рис. 1. Влияние нистатина на состав липидов мицелиальных грибов Таблица 1. Полярные липиды M. circinelloides var. lusitanicus F-306D (% от суммы) при культивировании гриба на среде с нистатином (2.5 ед./мл)

–  –  –

Нистатин, 20 2,5 ед/мл Сутки Рис. 2. Содержание -линоленовой кислоты в НЛ M. circinelloides var. lusitanicus FD (% от суммы) в процессе культивирования на среде с нистатином (2.5 ед./мл)

1.2. Липиды мицелиальных грибов в адаптации к условиям гипотермии Адаптация исследованных грибов к условиям гипотермии осуществлялась путем регулирования как состава жирных кислот липидов (в основном за счет изменения уровня пальмитиновой, олеиновой и линоленовой кислот), так и состава мембранных липидов при снижении доли ФХ и, соответственно, отношения ФХ/ФЭА, а кроме того, поддержания оптимального, как правило, более низкого, отношения ПЛ/ССт.

На модели F. solani F-142, было показано, что в процессах адаптации к холодовому шоку при снижении температуры роста культуры от оптимальной (25°С) до 19°С задействованы механизмы, регулирующие текучесть мембран путем не только десатурации ацильных цепей, но и их удлинения. В результате значительно возрастали уровень ди- и триненасыщенных кислот, степень ненасыщенности и доля С18-ЖК (рис. 3). Кроме того, адаптивное значение имеет регуляция текучести мембран соотношением полярных липидов и стеринов – в условиях понижения температуры отмечалось снижение отношения ПЛ/ССт.

Исследование липидного состава при культивировании М. circinelloides var. lusitanicus F-306D в различных температурных условиях (при 28 и 20°С показало сходный характер изменений, однако у мукорового гриба в меньшей степени был задействован механизм повышения активности пальмитоилэлонгазы, чем у F. solani F-142, что выражалось в более высоком содержании С-16 ЖК.

Соотношение массивных фосфолипидов у культур М. circinelloides var.

lusitanicus F-306D, выращенных при разных температурах, отличалось в значительной степени: при температуре 28°С отношение ФХ/ФЭА было равно 0.

6, а при 20°С – 0.42. При пониженной температуре (16°С) суммарное содержание ФХ и ФЭА было меньше, чем при 28°С (37 и 54% соответственно), при этом повышалось содержание КЛ, которое достигало 25% от суммы фосфолипидов, тогда как при 28°С оно составляло не более 7%. Определение ЖК состава отдельных фосфолипидов показало, что при температуре культивирования 20°С ФХ содержит больше -линоленовой кислоты, а также меньше стеариновой и олеиновой кислот, чем при 28°С (табл. 2). Известно, что у М. circinelloides субстратом десатурации является ФХ или лизо-ФХ [Jackson et al., 1998]. Для изучаемой культуры было показано, что основными субстратами десатурации являются ФХ и ФЭА, причем десатурация ФХ осуществлялась с большей скоростью, чем десатурация ФЭА [Фунтикова, Зинченко, 1991].

Рис. 3. Изменения в составе мембранных липидов F. solani F-142 при холодовой адаптации

–  –  –

Т, °С С16:0 С16:1 С18:0 С18:1 С18:2 -С18:3

27.0 0.8 25.0 17.0 28 10.5 19.0 26.4 1.0 20.7 18.0 20 4.4 28.0 Таким образом, при адаптации мицелиальных грибов к условиям гипотермии происходят изменения в составе липидов, влияющие на мембраны таким образом, чтобы их физические и функциональные свойства обеспечивали сохранение жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях роста.

1.3. Липиды морфологических мутантов F. solani с различной способностью к конидиеобразованию в условиях роста при воздействии этанола Используя в качестве мутагенного фактора ультрафиолетовое облучение, был получен ряд мутантов, морфологически отличных от исходного штамма, два из которых образовывали складчатые колонии на агаризованных средах (мутанты 3''7 и 15с). Все использованные в работе штаммы F. solani образовывали споры (микроконидии) при выращивании как на агаризованных средах, так и в жидкой среде. Мутант 3''7 характеризовался обильным конидиеобразованием (поликонидиальный; 2.12 106 конидий/см2), тогда как у штамма 15с способность к конидиеобразованию была в значительной мере редуцирована (олигоконидиальный; 1.5 104 конидий/см2) по сравнению с родительским штаммом (2.5 105 конидий/см2). Мицелий мутанта 3''7 при глубинном росте был представлен длинными утолщенными гифами, тогда как мицелий мутанта 15с имел вид "звездочек" с короткими гифами.

Липиды поликонидиального мутанта шт. 3''7 отличались от липидов родительского штамма пониженным содержанием СЖК и ЭС и более высоким уровнем ТАГ (табл. 3). Для олигоконидиального мутанта шт. 15с было характерно высокое содержание мембранных липидов, СЖК и существенно более низкое содержание главной резервной фракции – ТАГ. Присутствие этанола (2%) в среде культивирования не оказывало существенного влияния на состав липидов исходного штамма и поликонидиального мутанта – штаммов с нормальной и повышенной способностью к конидиеобразованию, но вызывало значительные изменения в содержании ТАГ, ССт и СЖК у олигоконидиального мутанта. В целом, пониженная интенсивность спорообразования коррелировала со снижением уровня резервных липидов (ТАГ) и более высоким – СЖК и мембранных липидов (ПЛ и ССт). В присутствии этанола эти особенности были более выражены, чем в контроле, и штамм 15с полностью переставал спорулировать, что свидетельствует о регуляторной роли липидообразования для эффективности конидиогенеза.

–  –  –

Исследование ЖК-состава показало, что при выращивании на контрольной среде с глюкозой полярные липиды поликонидиального штамма содержали больше насыщенных ЖК (32.5%), чем у олигоконидиального (20.6%). В присутствии этанола состав ЖК изменялся в сторону увеличения доли ненасыщенных ЖК, причем наиболее выражены эти изменения были у олигоконидиального штамма. У штаммов 15с и 3''7 в присутствии этанола в среде уровень стеариновой кислоты (С18:0) составлял 4.8 и 1.5%, а уровень линолевой кислоты (С18:2) достигал 60.8 и 48.7% соответственно. Что касается изменений в содержании олеиновой кислоты, то ее уровень в липидах олигоконидиального штамма на среде с этанолом снижался одновременно с возрастанием доли линолеата, а у поликонидиального не изменялся.

Таким образом, установлено, что оба мутанта с различной способностью к конидиеобразованию значительно различались по составу липидов.

Олигоконидиальный синтезировал более ненасыщенные липиды, чем штамм, образующий большое количество конидий. По-видимому, способность к конидиеобразованию является тем признаком, на который следует обращать внимание при отборе штаммов – перспективных продуцентов ненасыщенных липидов. Полученные данные находятся в соответствии с данными литературы.

В присутствии в среде этанола, вызывающего задержку роста и развития микроорганизмов и оказывающего прямое воздействие на физическое состояние мембран (увеличение их ригидности и последующее разнасыщение ЖК [Ingram, 1976; Alexandre et al., 1993, 1994; Laoteng et al., 2008]), наблюдались адаптивные изменения липидного состава, сходные с теми, которые вызываются условиями гипотермии: увеличение степени ненасыщенности и укорочение длины ацильных цепей [Cabeca-Silva et al., 1985]. Эти изменения, позволяющие преодолеть стрессовое воздействие этанола на мембраны и способствующие возобновлению роста грибов, были более выражены у штамма со сниженной способностью к конидиеобразованию, что свидетельствует о компенсаторной функции липидов в адаптации к воздействию этанола, а также о корреляции липогенеза с морфогенетическими процессами.

1.4. Особенности метаболической активности и состава липидов M. circinelloides var. lusitanicus F-306D при изменениях режима азотного питания Исчерпание питательных веществ при культивировании мицелиальных грибов является естественным стрессовым фактором, затрагивающим все клеточные процессы, в том числе, липогенез. Cоотношение углерода и азота в среде имеет большое значение для накопления липидов у мицелиальных грибов:

при истощении источника азота в среде в процессе периодического культивирования биосинтез белка и нуклеиновых кислот прекращается, а избыток углерода продолжает метаболизироваться в липиды. В этих условиях изменяется метаболическая активность, что сопровождается изменениями в синтезе липидов.

Режим азотного питания гриба M. circinelloides var. lusitanicus F-306D при однократном внесении источника азота в питательную среду при посеве или его дробном внесении в режиме с подпиткой (рис. 4) оказывал влияние на синтез линоленовой кислоты, накопление липидов (рис. 5) и морфогенез (рис. 6).

Рис. 4. Соотношение C/N в питательной среде при разном режиме азотного питания M. circinelloides var. lusitanicus F-306D: 1- однократное внесение; 2 – дробное внесение.

Рис. 5. Накопление липидов и -линоленовой кислоты (ГЛК) грибом M. circinelloides var. lusitanicus F-306D при однократном (1) и дробном (2) внесении источника азота (2.0 г/л).

–  –  –

При выращивании М. circinelloides var. lusitanicus F-306D в режиме нарастающего дефицита источника азота, наблюдались деформации мицелия и образование артроспор, культура выглядела морфологически более старой по сравнению с культурой того же возраста, выращенной при подпитке источником азота (рис.

6). Морфологические различия коррелировали с изменениями в углеродном обмене – поддержанием более высокой активности ферментов глиоксилатного цикла (изоцитратлиазы), чем ферментов ЦТК (НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы; табл. 4), а также пониженным содержанием -линоленовой кислоты (рис. 5) и суммарного содержания ФХ + ФЭА (рис. 7), которые являются основными субстратами десатурации у этого гриба [Фунтикова, Зинченко, 1991]. Эти показатели являются маркерами снижения метаболической активности культуры при нарастающем дефиците источника азота. Известно, что повышение активности функционирования глиоксилатного цикла у грибов связывают с процессами цитодифференцировки и конидиеобразования [Righelato et al., 1963; Aon et al., 1997; Khunyoshyeng et al., 2002], наступающими при неблагоприятных условиях.

–  –  –

Рис. 7. Содержание массивных фосфолипидов (ФХ+ФЭА, % от суммы ПЛ) в мицелии при разном режиме азотного питания M. circinelloides var. lusitanicus F-306D (содержание источника азота – 2 г/л): 1 – однократное добавление источника азота;

2 – культивирование в режиме с подпиткой.

В условиях культивирования с подпиткой источником азота, исключающих азотное голодание, имеет место активное функционирование ферментов ЦТК (табл. 4), которое обеспечивает поступление строительного материала, коферментов и энергии для биохимических синтезов, поддержание повышенного уровня массивных ФЛ (рис. 7), обусловливающих высокую функциональную активность мембран и образование ненасыщенных жирных кислот, в особенности, -линоленовой, содержание которой достигало 35% в сумме ЖК (рис. 5).

С целью выявления роли липидов и входящих в их состав жирных кислот в поддержании функциональности мембранного аппарата в условиях стресса, вызванного азотным голоданием или резкими колебаниями С/N в процессе культивирования, были исследованы липиды субклеточных фракций M. circinelloides var. lusitanicus F-306D – суммарных мембран, микросом и липидных гранул.

Обнаружение в мембранной фракции в варианте с подпиткой источником азота значительного количества ТАГ (10% от суммы липидов) с высоким содержанием -линоленовой кислоты (32.5%), а также ЭС (25.5% от суммы липидов) свидетельствует о синтезе этих липидов в мембранах ЭПР, а также предполагает выполнение ими функции, отличной от запасной. Можно предположить, что ТАГ и ЭС наряду с резервной, могут выполнять и протекторную функцию. Гипотезы о защитной роли ТАГ и ЭС от действия мембраноактивных липидов также высказывались ранее в ряде работ [Bayley, Parks, 1975; Dodds, 1995; Lerner, Kuknis, 1996].

Кроме того, в условиях периодического резкого снижения уровня С/N (в варианте с подпиткой) увеличение уровня -линоленовой кислоты может рассматриваться как сигнал об изменениях в среде. Об этом свидетельствует обнаруженное нами наиболее высокое содержание -линоленовой кислоты в составе ПЛ и СЖК липидных гранул, а также в ТАГ мембранных структур (41.7,

31.4 и 32.5% от суммы ЖК, соответственно). Мы полагаем, что избыток высоконенасыщенной -линоленовой кислоты, которая является мембранотропным соединением, может связываться путем образования ТАГ и ЭС и выводиться из сферы активного метаболизма, а также в виде СЖК локализоваться в липидных гранулах, что минимизирует дезорганизующее воздействие этой кислоты на структуру липидного бислоя клеточных мембран.

Таким образом, медленное монотонное повышение уровня C/N при исчерпании источника азота в среде («стресс голодания») вызывает снижение метаболической активности и содержания мембранных ФЛ, а также индуцирует морфологическую дифференцировку культуры (образование артроспор и деформацию гиф). При резких снижениях отношения С/N в среде за счет моментного внесения источника азота в режиме с подпиткой культура также испытывает стресс («стресс новой среды»). Это вызывает возрастание суммарного уровня -линоленовой кислоты и при мобилизации многих ферментных систем способствует поддержанию повышенного уровня метаболической активности и нормальной морфологии мицелия, свойственной молодой культуре. Таким образом, повышение уровня -линоленовой кислоты можно рассматривать как сигнал об изменениях в среде, в том числе, неблагоприятных для роста или стрессовых условиях.

Глава 2. Воздействие морфогенных факторов на состав липидов и метаболические процессы у мукоровых грибов

2.1. Метаболическая активность и состав липидов M. circinelloides var. lusitanicus в связи с диморфизмом при высоком содержании глюкозы в среде Одним из основных факторов, вызывающих изменение морфологии грибов, является глюкоза. При использовании базовой среды с концентрацией глюкозы 6% М. circinelloides var. lusitanicus 306D рос в виде мицелия, а в тех же условиях аэробного культивирования, но в среде с высокой концентрацией глюкозы (20%) гриб также реализовывал способность к дрожжеподобному росту: в культуре присутствовали одновременно дрожжеподобные клетки и мицелий.

Использование среды с высоким содержанием глюкозы (20%) позволило оценить различия в метаболической активности и липидном составе клеток альтернативных форм роста, развивающихся в одинаковых условиях.

Сравнительный анализ метаболических особенностей и состава липидов клеток с различной морфологией показал, что дрожжеподобные клетки содержали больше ПЛ, в том числе ГЛ (следовательно, липиды имели низкое отношение ФЛ/ГЛ), больше СЖК и эфиров стеринов; при этом доля основных резервных липидов – ТАГ, была на 30% ниже, чем в мицелии (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительный состав липидов мицелия и дрожжеподобных клеток M. circinelloides var. lusitanicus 306D на среде с концентрацией глюкозы 20%.

–  –  –

В дрожжеподобных клетках наблюдалось низкое содержание линоленовой кислоты и высокое – олеиновой и пальмитолеиновой кислот (рис. 9), активность НАД-зависимой ИЦДГ была более чем вдвое ниже, а ИЦЛ – вдвое выше, чем в мицелии (табл. 5).

При высокой концентрации глюкозы (20%) дыхательная активность снижалась на 1/3, скорость потребления кислорода грибной культурой в середине и конце фазы логарифмического роста составляла, соответственно, 275 и 130 мг О2 / л · ч · г биомассы, тогда как аналогичные показатели в среде с 6% глюкозы составляли 378 и 194 мг О2 / л · ч · г биомассы.

Рис. 9. Состав жирных кислот липидов мицелия и дрожжеподобных клеток M. circinelloides var. lusitanicus 306D на среде с высокой концентрацией глюкозы (20%) Таким образом, при культивировании M. circinelloides var. lusitanicus 306D в среде с изначально высоким содержанием глюкозы, регистрируются быстрое исчерпание источника азота, низкая дыхательная активность, изменение метаболической активности организма, что сопровождается морфологическими изменениями, связанными с экспрессией генов хитинсинтаз и их активностью, и переключением характера клеточного роста с мицелиального на дрожжеподобный. Снижение скорости метаболических процессов коррелирует с изменениями в составе липидов дрожжеподобных клеток, в которых снижается содержание ФЛ, ТАГ и ненасыщенных жирных кислот, в том числе, линоленовой, по сравнению с составом липидов мицелия.

2.2. Особенности морфогенеза и состава липидов мукоровых грибов в неблагоприятных условиях Не только дисбаланс источников питания, но и другие стрессовые факторы внешней среды – высокая кислотность среды и воздействие хлорированных анилинов, также вызывали изменения морфологии мукоровых грибов.

2.2.1. Влияние кислотности среды Защелачивание среды (рН 9.5) не вызывало изменения гифальной морфологии гриба на дрожжеподобную, тогда как инокуляция спорангиоспор в закисленную среду (рН 3) способствовала появлению дрожжеподобных клеток.

Культивирование в среде с низкими значениями рН было неблагоприятно для синтеза полиненасыщенных жирных кислот как в дрожжеподобных клетках, так и в мицелии, содержание насыщенных ЖК (в т.ч. пальмитиновой) было максимальным. Эти изменения были особенно выражены в дрожжеподобных клетках, в которых, по сравнению с мицелиальными, отмечено низкое значение суммарной доли линолевой и -линоленовой кислот (табл. 6). Жирнокислотный состав липидов, свидетельствующий о снижении активности ферментов элонгации и десатурации жирных кислот в условиях с низкими значениями рН, может оказывать влияние на активность мембранно-связанных ферментов и коррелирует с морфологическими изменениями. При анализе липидного состава клеточных фракций было обнаружено, что снижение степени ненасыщенности касается в большей степени липидов клеточной стенки и цитоплазматической мембраны по сравнению с мембранами внутриклеточных структур. Доля насыщенных жирных кислот в составе липидов клеточной стенки достигала 53%, цитоплазматической мембраны – 64%, внутриклеточных мембран – 50%.

–  –  –

Таким образом, под воздействием высокой кислотности среды, неблагоприятной для прорастания спорангоспор М. circinelloides var. lusitanicus по мицелиальному типу, происходило переключение на дрожжеподобный рост, что коррелировало со снижением синтеза полиненасыщенных жирных кислот в липидах, низким содержанием ФЛ, стеринов, ТАГ и низким соотношением ФЛ/ГЛ. При снятии неблагоприятного воздействия высокой кислотности среды часть дрожжеподобных клеток популяции ревертировала к росту в форме мицелия, что сопровождалось активизацией синтеза полиненасыщенных жирных кислот (линолевой и -линоленовой), стеринов и ФЛ (в том числе ФХ, ФЭА и КЛ). Состав мембранных липидов дрожжеподобных клеток, не ревертировавших к мицелиальному росту после снятия стрессового воздействия высокой кислотности среды, практически не изменялся, а в составе их нейтральных липидов происходила мобилизация резервного пула ТАГ.

Полученные данные находятся в соответствии с данными литературы о том, что уровень рН регулирует многие физиологические процессы, влияющие на морфологию Aspergillus nidulans [Cuadros et al., 2001], на проявление диморфизма у Fusarium bulbigenus [Меденцев и соавт., 1992] и Candida albicans [Saporitoirwin et al., 1992].

Показано, что ионный градиент может играть важную роль в установлении клеточной полярности и развитии поляризованного роста:

величина внутриклеточного щелочного градиента рН строго коррелировала со скоростью удлинения гиф грибов [Robson et al., 1996]. Различия в составе липидов двух морфологических форм в смешанной культуре мукорового гриба в условиях изменения рН свидетельствуют о высокой адаптационной функциональности липидов и их участии в морфогенезе.

2.2.2. Морфогенез и липидообразование мукоровых грибов в присутствии хлоранилинов В литературе практически отсутствуют сведения о влиянии хлоранилинов (ХА) на мицелиальные грибы. Имеются отдельные сообщения о том, что 4-ХА вызывает необратимую инактивацию пероксидазы у Coprinus cinereus [Chang et al., 1999], а также о том, что в присутствии 3,4-ДХА индуцируется образование свободных радикалов, приводящее к окислительному стрессу и перекисному окислению липидов у пресноводных рыб (Carassius auratus) [Li et al., 2002, 2003]. Действие ХА связывают с неспецифическим повреждением структуры и функций мембран, ингибированием транспорта электронов [Argese et al., 2001].

Хлорированные анилины ранее не рассматривались как факторы, влияющие на морфогенез грибов. Использование ХА в качестве морфогенного фактора позволило получить приоритетные данные о реализации диморфного роста мукоровых грибов как реакции на присутствие токсичных соединений.

В работе использовали штаммы двух видов, имеющих, по литературным данным, различную способность к диморфному росту - М. circinelloides (4 шт.) и M. hiemalis (2 шт.). Ранее считалось, что представители некоторых видов рода Мисоr, к числу которых относится М. hiemalis, не способны к диморфизму [Orlowski, 1991]. 4-ХА в диапазоне концентраций 100-160 мкг/мл инициировал фрагментацию мицелия трех штаммов вида М. circinelloides на артроспоры, а также обусловливал рост в форме дрожжеподобных клеток при прорастании как спорангиоспор, так и артроспор. Интерес представили результаты, показавшие, что грибы, принадлежащие к виду М. hiemalis, в присутствии 4-ХА (150 мкг/мл) так же способны к росту в виде дрожжеподобных клеток, как и представители М. circinelloides (рис. 10).

Исследование состава липидов мукоровых грибов, развивающихся в условиях стресса, вызванного присутствием 4-ХА в среде, показало существенное угнетение синтеза ненасыщенных (олеиновой и -линоленовой) и накопление насыщенных жирных кислот. В наибольшей степени этот эффект проявлялся у дрожжеподобных клеток М. circinelloides var. lusitanicus 306D, в липидах которых доля насыщенных жирных кислот составляла до 66%, и в липидах артроспор М. hiemalis F-1156 – до 71%, что свидетельствует о корреляции между процессами десатурации жирных кислот и морфогенезом в присутствии 4-ХА.

Рис. 10. М. hiemalis F-1431 в среде с 150 мкг/мл 4-ХА (1760, фазовый контраст): а – дрожжеподобные клетки, образующиеся при прорастании спорангиоспор; б – монополярно прорастающие гифы из спорангиоспор; в – мультиполярно прорастающие гифы из спорангиоспор; г – нормальный несептированный мицелий; д – образование артроспор; е – цепочки артроспор и дрожжеподобные клетки В мицелии и дрожжеподобных клетках исследованных штаммов мукоровых грибов, растущих в среде с 4-ХА, преобладающими фракциями среди полярных липидов были ФЭА и ФХ, а также ГЛ (рис. 11). Однако, в целом, соотношение ФЛ/ГЛ в дрожжеподобных клетках было значительно ниже, чем в мицелиальных (соответственно, 2.0 и 3.1). Липиды дрожжеподобных клеток отличались от липидов мицелия более высоким относительным содержанием ДАГ, СЖК, свободных стеринов (деметилированных и метилированных), а также более низким – резервных липидов (ТАГ и ЭС).

Таким образом, 4-ХА, оказывая влияние на мембраны, вызывал изменения в содержании ненасыщенных ЖК, ФЛ, стеринов, а также резервных липидов, что коррелировало с индукцией дрожжеподобного роста.

Рис. 11. Состав липидов мицелия и дрожжеподобных клеток культуры М. circinelloides var. circinelloides F-546, растущей в присутствии 4-ХА (50 мкг/мл).

Необходимость высокого уровня ненасыщенных жирных кислот для индукции поляризованного роста, в значительной степени ингибированного в присутствии 4-ХА, была доказана при добавлении в среду роста экзогенных ненасыщенных липидов. Внесение ТАГ из подсолнечного масла с преимущественным содержанием линолевой кислоты (77%) вызвало переход роста М. circinelloides var. lusitanicus 306D от дрожжеподобной формы к мицелиальной. Таким образом, липиды с высоким содержанием полиненасыщенных ЖК оказывают регуляторное влияние на морфогенетические процессы грибов. Ненасыщенные ЖК необходимы для морфологического перехода дрожжеподобного роста в гифальный и оказывают адаптивное действие при стрессе, вызванном токсикантами.

Глава 3. Особенности состава липидов артроспор, почкующихся клеток и мицелия M.

hiemalis F-1156 Полиморфизм покоящихся форм рассматривают как приспособительный механизм, позволяющий грибам (как и другим микроорганизмам) выживать в неблагоприятных условиях, наступление которых является причиной споруляции. Мукоровые грибы при глубинном культивировании не образуют спорангиоспор, поэтому в условиях, когда размножение спорангиоспорами невозможно, особое значение приобретает способность грибов образовывать артроспоры – округлые клетки, собранные в четкообразные цепочки на концах гиф. Артроспоры являются бесполыми пропагативными структурами и представляют собой отдельную стадию в жизненном цикле многих видов грибов. Их рассматривают как структуры, необходимые для создания отдельных единиц роста и как покоящиеся клетки. Высказывалось мнение о принадлежности артроспор (оидий) мукоровых грибов к дрожжеподобным клеткам [Милько, 1974]. Однако мы разделяем другую точку зрения, согласно которой к истинным дрожжеподобным относятся только почкующиеся клетки [Bartnicki-Garcia, 1968].

Инокуляция жидкой питательной среды с глюкозой спорангиоспорами, полученными в условиях интенсивного спорогенеза (длительное культивирование на пшеничных отрубях при понижающейся влажности), вызывала на выросшем из них мицелии ускоренное образование артроспор, которые при прорастании давали начало дрожжеподобным почкующимся клеткам.

В липидах артроспор, в отличие от липидов почкующихся дрожжеподобных клеток, содержалось меньше насыщенных и больше мононенасыщенных кислот, при примерно одинаковом уровне полиеновых.

Артроспоры отличались от дрожжеподобных почкующихся клеток повышенным содержанием запасных липидов, а именно ТАГ и ЭС, и более низким – СЖК и мембранных липидов (табл. 8), а также метилированных стеринов. Такие различия липидного состава клеток со сферической морфологией свидетельствуют о том, что, несмотря на морфологическое сходство, эти клетки выполняют в цикле развития гриба разные функции.

Жирнокислотный состав липидов артроспор по сравнению с мицелием отличался более высоким уровнем пальмитиновой кислоты и более низким – линолевой, что приводило к снижению степени ненасыщенности липидов в покоящихся клетках. Кроме того, в артроспорах было повышено содержание ПЛ, СЖК и, особенно, ЭС, что характерно для покоящихся структур, а в полярных липидах содержалось больше ГЛ, ФС и меньше ФК и ФЭА, чем в мицелии (рис. 12). Эти особенности состава липидов маркируют артроспоры как стадию покоя в онтогенезе гриба, а также свидетельствуют о снижении активности метаболических процессов в этих клетках.

–  –  –

Стерины M. hiemalis F-1156 представлены эргостерином (главный стерин), а также его предшественниками, в том числе метилированными. Большинство из 11 идентифицированных стеринов часто встречаются у мицелиальных грибов и дрожжей. Однако впервые у M. hiemalis F-1156 были обнаружены два необычных стерина, ранее не отмеченных у грибов – 1-дигидро-дегидронеоэргостерин и дегидронеоэргостерин. Эти стерины встречаются крайне редко и имеют в своей структуре сложную систему сопряженных двойных связей в ядре (рис. 13).

Поскольку уровень 1-дигидро-дегидронеоэргостерина и дегидронеоэргостерина в артроспорах был выше, чем в мицелии, не исключено, что эти продукты трансформации эргостерина могут участвовать в процессах морфогенеза у M. hiemalis.

Рис. 13. Структура необычных стеринов, обнаруженных у M. hiemalis F-1156:

а – дегидронеоэргостерин; б – 1-дигидро-дегидронеоэргостерин Впервые проведен сравнительный анализ стеринов в клетках M. hiemalis разных морфотипов. В артроспорах по сравнению с мицелием выявлено сниженное содержание эргостерина (55.9 и 78.0% соответственно), а также более высокое – минорных десметилстеринов (дегидронеоэргостерина, 1-дигидродегидронеоэргостерина, 5-дигидроэргостерина, 7-дигидроэргостерина и эпистерина) – 20 и 10.5% соответственно. Кроме того, в артроспорах отмечено повышенное содержание метилированных стеринов – 4-метил-фекостерина, 24метилен-4,14-диметил-холест-5-енола и, особенно, эбурикола и 4,4-диметилфекостерина, последний из которых считается продуктом деградации предшественников эргостерина. Доля 4,14-диметилстеринов в сумме общих стеринов артроспор достигала 13.82% по сравнению с 8.84% в мицелии.

Соотношение метилированных и деметилированных стеринов в мицелии составляло 1 : 9, а в артроспорах, сформированных на этом же мицелии – 1 : 4.

Повышенный уровень 14-метилстеринов в артроспорах M. hiemalis F-1156, особенно эбурикола и 24-метилен-4,14-диметилхолестерина, свидетельствует о более низкой активности С-14-деметилазы по сравнению с ее активностью в мицелии. Совместно с повышенным уровнем пальмитиновой и пониженным – линолевой кислоты это отражает увеличение вязкости мембран, отмеченное в ряде работ [Vanden Bossche, 1990; Gooday, Schofield, 1995].

Таким образом, проведенные исследования показали, что артроспоры имеют не только функциональные, но и физиологические особенности, отличающие их от других морфологических структур гриба: от мицелия, на котором они формируются, а также, несмотря на морфологическое сходство, от вегетативных дрожжеподобных почкующихся клеток. Сравнительный анализ состава липидов мицелия, дрожжеподобных клеток и артроспор на модели гриба M. hiemalis F-1156 выявил особенности, характерные для клеток каждого типа.

Глава 4. Липиды и стерины спорангиоспор в связи с различной способностью мукоровых грибов к диморфизму В процессе наших исследований по влиянию стрессовых факторов среды (присутствие хлоранилинов, истощение источников питания и др.

) на морфогенетические процессы грибов было установлено, что ранее считавшиеся мономорфными представители вида M. hiemalis также способны к дрожжеподобному росту, реализующемуся при прорастании артроспор, но не спорангиоспор. Вызвать дрожжеподобный рост у грибов этого вида было сложнее, чем у представителей М. circinelloides, по-видимому, из-за более высокой устойчивости их спорангиоспор к стрессовым воздействиям. Возможно, и для других представителей мукоровых грибов, считающихся мономорфными, недостаточно четко определен круг условий, в которых индуцируется рост альтернативного морфотипа.

Анализ изменений в липидном составе спорангиоспор на моделях мукоровых грибов с различной способностью к поляризованному росту – у диморфного М. circinelloides, мономорфного M. ramannianus и вида M. hiemalis, у которого, как показано выше, дрожжеподобный рост возможен в определенных условиях – позволил выявить корреляцию между составом липидов спор и особенностями морфогенеза при их прорастании.

4.1. Структура, жизнеспособность и липидный состав спорангиоспор M. circinelloides var. lusitanicus в условиях длительного культивирования спорогенной культуры Твердофазное культивирование гриба на пшеничных отрубях (и других зерновых отходах) позволяло создавать условия пониженной влажности, что способствовало усиленному спорогенезу и образовыванию спорангиоспор, способных прорастать как в виде мицелия, так и дрожжеподобных клеток.

Исследования показали, что в этих условиях интенсивного спорогенеза происходило существенное изменение состава грибных липидов, что не способствовало формированию качественных спорангиоспор с высокой жизнеспособностью. При этом способность к прорастанию и развитию гриба в виде альтернативных морфотипов зависели от возраста спорангиоспор.

Споры 4-суточной культуры прорастали исключительно с образованием мицелия. Процент прорастания 7-суточных спор снижался незначительно, при инокуляции в жидкую среду с глюкозой наблюдались рост деформированного мицелия, а также появление дрожжеподобных клеток при снижении накопления биомассы.

Споры 14-суточной культуры теряли всхожесть на 27%, большая часть жизнеспособных спор прорастала в виде дрожжеподобных клеток, а развивающийся мицелий был деформирован, вакуолизирован, наблюдалось нарушение апикального роста гиф. Увеличение возраста спорогенной культуры до 20 сут приводило к потере всхожести у 98% образуемых спор, а 25-суточные споры полностью теряли способность к прорастанию. Портретные характеристики спорангиоспор, дающих начало мицелию, и спор, потерявших всхожесть, приведены на рис. 14 (сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия).

(г)

–  –  –

Рис. 14. Спорангиоспоры M. circinelloides var. lusitanicus 306D разного возраста Спорангиоспоры 6-суточной культуры, растущей на отрубях (а), способные к прорастанию в виде гиф, и споры 30-суточной культуры на агаризованном сусле (в), также не утратившие жизнеспособность, имеют больший объем и более ровную поверхность, чем споры 30-суточной культуры на пшеничных отрубях (б), на поверхности которых видны глубокие инвагинации. Ультратонкие срезы молодых спорангиоспор 5-суточной культуры демонстрируют плотную зернистую текстуру цитоплазмы с хорошо различимыми митохондриями, ядром, липидными и полифосфатными гранулами и цитоплазматической мембраной, плотно прилегающей к клеточной стенке (г).

Спорангиоспоры 25-суточной культуры обезвожены, часто плазмолизированы, с мембранными инвагинациями, уменьшенным количеством крист в митохондриях, деформациями клеточной стенки, наличием конденсированного электронно-плотного и электронно-прозрачного материала (д).

В условиях увеличивающейся дегидратации при длительном твердофазном культивировании в клетках накапливаются различные протекторные соединения, в частности, глицерин, который может образовываться из глицеролипидов (в том числе из ТАГ), что коррелирует со снижением доли ТАГ в общих липидах в процессе старения культуры. У диморфного гриба М. circinelloides var. lusitanicus 306D отмечена корреляция между составом липидов спорангиоспор, их жизнеспособностью и индукцией дрожжеподобного роста. Дрожжеподобный рост у М. circinelloides var. lusitanicus наблюдался уже при небольшом снижении в липидах спорангиоспор доли ТАГ и увеличении доли ДАГ (табл. 9). В процессе длительного культивирования в липидах спорангиоспор уменьшалось содержание ТАГ, ЭС и основных фосфолипидов (ФХ, ФЭА, ФС). Отношение ФЭА/ФХ повышалось от 0.39 до 0.94, а отношение ФЛ/ГЛ снижалось с 1.6 до 0.5 (табл. 10), что свидетельствовало о критических изменениях структурной организации и функциональности мембран и коррелировало с падением жизнеспособности спорангиоспор. Отмечено повышение уровня СЖК, ДАГ, а также свободных стеринов, половина которых, однако, приходилась на метилированные производные. Известно, что метилстерины не способны полноценно выполнять структурные функции, для обеспечения которых необходимо высокое содержание в мембранах эргостерина – главного десметилстерина грибов [Vanden Bossche, 1990; Vanden Bossche et al., 1993;

Gooday, Schofield, 1995]. Об исчерпании в старых спорангиоспорах резервного пула эргостерина, заключенного в ЭС, свидетельствовало снижение соотношения ЭС/ССт с 1.26 до 0.3. Спорангиоспоры с таким составом липидов полностью теряли жизнеспособность.

–  –  –

38.7 9.4 7.6 29.8 11.5 2.5 0.4 1.6 42.0 8.2 6.0 28.3 13.0 2.7 0.3 1.4 68.7 1.1 12.1 8.1 7.7 3.9 0.9 0.5 Из полученных данных следует, что снижение жизнеспособности спорангиоспор и изменение характера роста гриба при их прорастании в значительной степени связаны с изменением их липидного состава. Это подтверждается тем фактом, что добавление экзогенных липидов влияло на стратегию развития культур, вырастающих из старых спорангиоспор. Добавка ТАГ способствовала нормальному развитию культур из спор с дефицитом внутриклеточных липидов.

Добавление вместе с инокулятом (споры молодой 4-суточной культуры) липидов зерновых отходов (пшеничные отруби, подсолнечный жмых) с высоким содержанием СЖК (олеиновой и линолевой) к концу 1 сут культивирования приводило к развитию деформированного мицелия; внесение липидов, выделенных из молодых спор (4 сут) вызывало формирование артроспор на концах гиф образующегося мицелия, а внесение липидов, экстрагированных из старых спорангиоспор (20 сут) с высоким содержанием ДАГ, СЖК, ФК, ГЛ и метилированных стеринов, сопровождалось появлением дрожжеподобных клеток (рис. 15). Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что липиды грибов являются не только источником углерода и энергии или компонентами клеточных мембран, но и участвуют в регуляции процессов цитодифференцировки, сопряженных с морфогенетическими изменениями.

Полученные результаты дополняют данные литературы, согласно которым модифицированные жирные кислоты и родственные им липиды играют важную роль в половом и бесполом развитии грибов [Nukina et al., 1981; Батраков и соавт., 1993; Kolattukudy et al., 1995; Goodrich-Tanrikulu et al., 1998; Calvo et al., 1999, 2001; Wilson et al., 2004], а также являются сигнальными молекулами в отношениях хозяин–патоген и индуцируют патогенную фазу развития многих видов диморфных грибов [Macko, 1981; Podila et al., 1993; Klose et al., 2004;

Noverr et al., 2001, 2003, 2004; Noverr, Huffnagle, 2004].

Рис. 15. Гигантские дрожжеподобные клетки, образующиеся на 2 сут после добавления липидов, экстрагированных из спорангиоспор старой культуры.

4.2. Липиды спорангиоспор M. hiemalis F-1156 в условиях длительного культивирования спорогенной культуры Спорангиоспоры M. hiemalis в зависимости от их возраста, определяемого временем культивирования на зерновых отходах, также характеризовались снижением всхожести (особенно при старении культуры после 10-14 сут) и различались составом липидов и стеринов, а также способностью к дрожжеподобному росту при их прорастании.

В составе общей липидной фракции спор по мере их созревания были отмечены увеличение доли ГЛ, в том числе, сфинголипидов (цереброзидов), и снижение доли глицеролипидов, в том числе, ТАГ – основного резерва для окислительного метаболизма. Уменьшение отношения ФЛ/ГЛ (с 8.5 до 1.9), отмеченное в спорангиоспорах старой культуры (20 сут) по сравнению с этими же показателями спорангиоспор более молодых культур (3, 7, 10 сут), отражает изменения структурной организации и функциональности мембран, а снижение отношения ЭС/ССт с 1.7 до 1.0 – мобилизацию резервного пула стеринов и ЖК.

Потеря жизнеспособности старых спорангиоспор сопровождалась повышением уровня -линоленовой кислоты с 20 до 28.5%. В процессе развития спорогенной культуры M. hiemalis соотношение ФЭА/ФХ в спорангиоспорах снижалось с 0.9 до 0.4 (на 10 сут) за счет накопления пула основного фосфолипида – ФХ, а затем опять увеличивалось до 0.9 (на 20 сут) за счет его мобилизации. Таким образом, спорангиоспоры старой культуры имели одинаковые показатели уровней массивных фосфолипидов с молодыми спорангиоспорами, но, несмотря на это, были не способны прорастать исключительно в виде мицелия, а давали начало дрожжеподобному росту. Мы полагаем, что одним из факторов, способных оказывать влияние на характер роста гриба, могут быть изменения в составе стеринов спорангиоспор, а именно снижение уровня эргостерина.

Основным стерином спорангиоспор M. hiemalis был эргостерин, доля которого в сумме стеринов с увеличением продолжительности культивирования спорогенного мицелия уменьшалась с 95% на 7 сут до 51.4% на 20-е (табл. 11). Эти изменения сопровождались увеличением доли минорных промежуточных продуктов биосинтеза эргостерина – деметилированных (фекостерина и эпистерина) и метилированных (24-метилен-4a-метилхолест-8ен-3b-ола, эбурикола и 4,4-диметилфекостерина). Изменения в стериновом обмене совокупно со снижением уровня основного фосфолипида митохондриальных мембран – КЛ, способны оказывать влияние на структурную организацию мембран, для нормального функционирования которых необходимо наличие именно 4,14-десметилстеринов [Nеs et al., 1978, 1993; Weete et al., 1983, Weete, 1989; Debieu et al., 1998].

В спорангиоспорах гриба M. hiemalis, способных прорастать в форме мицелия (7-10 сут), отношение метилированных стеринов к деметилированным составляло 1 : 39 (или не превышало 1 : 17), а в спорах, дающих начало дрожжеподобному росту (20 сут) – 2 : 3. Кроме того, соотношение этерифицированных и свободных стеринов (ЭС/ССт) в старых спорах снижалось, что свидетельствует об исчерпании пула доступного резерва ЭС.

Спорангиоспоры со столь выраженными изменениями в липидном составе в значительной степени (на 70%) теряли способность к прорастанию, а жизнеспособные спорангиоспоры, но с истощенным в процессе длительного культивирования липидным пулом и низким содержанием эргостерина, давали начало как мицелиальному, так и дрожжеподобному росту.

–  –  –

Таким образом, различия в составе стеринов, жирных кислот и отдельных классов липидов в молодых и старых спорангиоспорах M. hiemalis коррелировали с изменением степени их жизнеспособности и способностью давать начало дрожжеподобным клеткам, а также образовывать артроспоры на выросшем мицелии, что свидетельствует о взаимосвязи процессов липидообразования и морфогенеза у грибов.

4.3. Липиды спорангиоспор M. ramannianus F-530 в условиях длительного культивирования спорогенной культуры В отличие от спорангиоспор M. hiemalis F-1156 и M. circinelloides var.

lusitanicus 306D, спорангиоспоры мономорфного вида M. ramannianus F-530 при прорастании не образовывали дрожжеподобных клеток независимо от возраста спор (длительности культивирования спорогенного мицелия), хотя при прорастании старых спор отмечалось появление утолщенных деформированных гиф. Споры имели стабильный состав липидов; основными резервными липидами были ТАГ. С увеличением времени культивирования (7-20 сут) значительному изменению подвергалось, главным образом, содержание СЖК, снижение уровня которых (с 13.8 до 5.2%) сопровождалось увеличением доли ПЛ (с 15.6 до 21%) и ЭС (с 4.6 до 9%). Уровень свободных стеринов и ТАГ (14.5и 38.2-45.4% соответственно) был высоким и значительно не изменялся в спорах разного возраста. Соотношение ЭС/CСт было низким и относительно стабильным (0.3-0.6), что отличало споры мономорфного вида M. ramannianus Fот диморфных M. hiemalis F-1156 и M. circinelloides var. lusitanicus 306D, в составе липидов которых уровень ЭС изначально был более высоким, а снижение содержания запасных липидов (ТАГ и ЭС) коррелировало со снижением жизнеспособности спор и индукцией дрожжеподобного роста.

Главным стерином M. ramannianus F-530 был эргостерин (64.1%), а среди его предшественников основную долю (19%) составлял фекостерин – первый из деметилированных производных, который по некоторым данным [Kelly et al., 1994] может частично выполнять функции эргостерина.

Кроме того, липиды спорангиоспор M. ramannianus F-530, в отличие от липидов M. hiemalis F-1156 и M. circinelloides var. lusitanicus 306D, имели невысокое содержание g-линоленовой кислоты (5-9%), ДАГ (4.3-7%), стабильное соотношение ФЛ/ГЛ (2.1-2.8), а также низкий уровень метилированных предшественников эргостерина (не более 3.8%), что коррелировало со способностью этого мономорфного вида расти исключительно в виде мицелия.

И тем не менее, увеличение содержания g-линоленовой кислоты в 20-суточных спорах (13.2%) сопровождалось развитием из них деформированного мицелия.

Анализ жирнокислотного состава липидов спорангиоспор на моделях представителей трех видов мукоровых грибов (табл. 12) позволил выявить корреляцию между повышенным содержанием в спорангиоспорах линоленовой кислоты и способностью вида к диморфизму: только у видов M. hiemalis F-1156 и M. circinelloides var. lusitanicus 306D, в спорах которых уровень этой кислоты был изначально высок (20-30% от суммы ЖК), отмечалась способность к образованию дрожжеподобных клеток. Кроме того, эти два вида характеризовались высоким уровнем ДАГ и ФК, которые также оказывают влияние на морфогенез, так как известно, что эти продукты деструкции фосфолипидов являются сигнальными молекулами и мессенджерами диморфного роста [Gadd, 1995; Rudge et al., 1998].

–  –  –

0.4 ФЭА/ФХ 0.4 0.9 0.9 1.9 2.8 ФЛ/ГЛ 2 0.5

–  –  –

4.3 ДАГ 5% 19.4 5.4 45.0 ТАГ 20% 16.4 18.9

-С18:3 10% 17.9 28.5 13.0

–  –  –

В литературе имеется информация о том, что высокое содержание десметилстеринов, в том числе эргостерина, способствует поддержанию структуры и нормальному функционированию мембран и коррелирует с ростом грибов в виде мицелия [Vanden Bossche, 1990]. У мономорфного M. ramannianus F-530 в спорах 20-суточной культуры уровень метилированных предшественников эргостерина, в том числе С-14 метилированных тритерпена эбурикола и 24-метилен-4,14-диметилхолестерина, был очень низок (2%), особенно в сравнении со спорами культуры M. hiemalis F-1156 того же возраста, где их уровень достигал 13%. Отношение метилированных стеринов к деметилированным у M. ramannianus F-530 составляло 1 : 25 (для сравнения, у M. hiemalis F-1156 в спорах старой 20-суточной культуры – 2 : 3, а у M. circinelloides var. lusitanicus 306D – 1 : 1). На основании результатов анализа состава стеринов, можно заключить, что способность спорангиоспор мукоровых грибов прорастать в виде мицелия определяется не столько уровнем собственно эргостерина, сколько низким уровнем его метилированных предшественников.

Бесполые споры грибов, предназначенные не для длительного переживания, а для быстрого распространения вида, находятся в состоянии неглубокого покоя. Удаленные с поверхности мицелия, они могут храниться без потери качества (всхожести) длительное время [Agosin et al., 1997; Dantigny et al., 2007]. Как показали результаты проведенных исследований, в оставленных на мицелии спорах происходят метаболические процессы, затрагивающие липидный обмен, что приводит к существенному ухудшению качества спорангиоспор. Таким образом, исследования на моделях мукоровых грибов с различной способностью к диморфному росту – M. hiemalis, М. circinelloides var.

lusitanicus и M. ramannianus, показали, что состав их липидов в значительной степени определяет качество спорангиоспор и играет существенную роль при реализации разных стратегий клеточного роста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование было посвящено изучению изменений липидного состава и функциональности липидов в формировании адаптивных реакций, морфогенезе и диморфизме грибов и выявлению биохимических критериев, позволяющих оценивать способность мукоровых грибов к дрожжеподобному росту.

В последние годы интерес к изучению диморфизма грибов возрос в связи с установленным участием липидов в морфологических переходах и широким распространением возбудителей микозов животных и человека и патогенов сельскохозяйственных растений.

Так как явление диморфизма у грибов, имеет адаптивный характер и способствует поддержанию их активного роста в изменившихся условиях среды, реализация различных жизненных стратегий грибов и формирование стрессового ответа на неблагоприятные внешние воздействия должно базироваться на общих метаболических реакциях, в том числе, на изменениях липидного компонента клеток.

Полученные результаты выявили существенные изменения в составе классов липидов и жирных кислот исследуемых грибов, связанные с формированием адаптивной реакции организма на воздействие неблагоприятных для роста температур и различных стрессовых факторов – исчерпание источников питания, влияние рН среды, этанола, высокой концентрации глюкозы, антибиотиков (нистатина) и других токсических соединений, в частности, хлорированных анилинов. Изменения липидного состава имеют компенсаторный характер и позволяют преодолеть стрессовое воздействие, способствуя возобновлению роста грибов в изменившихся условиях. Впервые получена информация об участии липидов в контроле феномена диморфизма при действии на грибы токсикантов – хлорированных анилинов, которые по вызываемому ими эффекту могут быть отнесены к специфическим морфогенным агентам.

В связи с возросшим интересом к исследованию роли липидов в морфогенетических процессах, актуальным является поиск характеристик, необходимых для оценки потенциальной способности грибов к диморфизму.

Результаты исследований липидного состава покоящихся клеток – спорангиоспор – у нескольких видов мукоровых грибов с различной способностью к диморфизму, обнаружили различия в содержании отдельных классов липидов и их соотношениях, что позволило сделать заключение о регуляторной роли липидов в морфогенетических процессах и возможности их использования для оценки способности к диморфизму. Впервые обнаружены изменения в составе стеринов, жирных кислот и отдельных классов липидов, выявленные в спорангиоспорах разного возраста, которые отражают степень их жизнеспособности и определяют программу включения альтернативных форм роста – мицелиальной или в виде дрожжеподобных клеток. Показано, что повышенное содержание в спорангиоспорах ДАГ, СЖК, ФК, ГЛ, метилированных стеринов при низком уровне ТАГ способствуют образованию дрожжеподобных клеток; высокий уровень -линоленовой кислоты, ЭС, метилированных предшественников эргостерина и низкий уровень ТАГ характерны для смешанного роста деформированного мицелия, на котором формируются артроспоры, и мультиполярно почкующихся дрожжеподобных клеток; для мицелиального – высокий уровень десметилстеринов и ТАГ.

Сравнительное исследование состава липидов в дрожжеподобных клетках и мицелии мукоровых грибов позволило выявить существенные различия между клетками этих морфотипов, основными из которых являются содержание ненасыщенных жирных кислот, массивных фосфолипидов, стеринов, запасных липидов, а также соотношения отдельных классов липидов.

Полученные данные свидетельствуют о корреляции между метаболической активностью, процессами синтеза, обмена липидов и морфогенезом, а также о роли совокупных показателей липидного состава в реализации стратегии роста грибов по дрожжеподобному или мицелиальному типу в зависимости от условий окружающей среды.

Впервые получена информация о взаимозависимости таких морфогенетических процессов как образование и созревание покоящихся форм грибов и проявление программ диморфизма при их прорастании, что на метаболическом уровне реализуется через изменения липидного состава этих форм.

Впервые для Mucor hiemalis – вида, ранее относимого к мономорфным, выявлена способность к диморфизму, получена информация об особенностях состава липидов артроспор, отличающих их от морфологически сходных с ними дрожжеподобных клеток. Впервые в составе стеринов артроспор этого гриба идентифицированы редкие соединения – 1-дигидро-дегидронеоэргостерин и дегидронеоэргостерин, продукты трансформации эргостерина, которые, повидимому, принимают участие в морфогенетических процессах.

Таким образом, комплекс липидных характеристик спорангиоспор может быть использован для оценки способности мицелиальных грибов к диморфизму, в том числе у тех видов, для представителей которых такая способность ранее не была показана. Это существенно расширяет представления о распространенности этого явления и открывает перспективы его контроля в современной медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и биотехнологии.

Мукоровые грибы широко применяются в различных биотехнологических производствах, а представители отдельных видов являются перспективными продуцентами комплекса биологически активных соединений липидной природы – каротиноидов и -линоленовой кислоты, поэтому предпринятые исследования липогенеза 40 штаммов мукоровых грибов позволили выявить круг наиболее активных продуцентов липидов, а исследования по влиянию условий культивирования – определить условия повышения эффективности штаммов-продуцентов и выхода целевых продуктов.

Большую перспективу имеют предложения использования мукоровых грибов при доочистке промывных вод маслоперерабатывающих предприятий с одновременным получением биологически активных липидов.

Проведенные исследования липидов мукоровых грибов и выяснение их роли в явлении диморфизма вносят вклад не только в познание механизмов адаптации грибов, но также в расшифровку биохимических основ морфогенеза.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что адаптация к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсичных агентов (условий гипотермии и режима азотного питания, а также полиенового антибиотика нистатина и этанола) осуществляется c участием липидов путем регулирования состава жирных кислот (десатурацией и элонгацией), мембранных липидов (изменением в содержании стеринов, фосфо- и гликолипидов) и основных резервных ацилсодержащих фракций (ТАГ и ЭС).

2. Полиненасыщенная -линоленовая кислота может выполнять функции не только компонента клеточных мембран, но и сигнального соединения, уровень которого повышается в условиях стресса, а ТАГ и ЭС наряду с резервной могут выполнять и другие функции, в том числе защитную.

3. Феномен диморфизма распространен среди мукоровых грибов шире, чем полагали до последнего времени. Показано, что представители вида М.

hiemalis, ранее относимого к разряду мономорфных, могут в определенных условиях изменять клеточную морфологию с мицелиальной на дрожжеподобную под воздействием специфических агентов (хлорированных анилинов) или неблагоприятных условий (длительное культивирование при понижающейся влажности).

4. Комплексные характеристики липидного состава могут служить маркерами сферического или поляризованного роста мукоровых грибов. Диморфизм, как адаптивная реакция грибов на воздействия неблагоприятных условий среды или токсичных агентов (высокого содержания глюкозы, низкого рН, хлорированных анилинов), сопряжен с изменениями метаболической активности и состава как мембранных, так и резервных липидов.

5. Липиды дрожжеподобных клеток имеют характерные отличия от липидов мицелия: более низкий уровень ненасыщенных жирных кислот, ТАГ, ЭС и соотношения ФЛ/ГЛ, а также более высокий – ПЛ, ДАГ и СЖК.

6. Обнаружены существенные различия в составе липидов артроспор и вегетативных клеток M. hiemalis (мицелиальных и дрожжеподобных), которые маркируют артроспоры как стадию покоя в онтогенезе гриба, а также свидетельствуют о снижении активности в этих клетках метаболических процессов.

7. Впервые у грибов в составе стеринов артроспор выявлены редкие соединения

– 1-дигидро-дегидронеоэргостерина и дегидронеоэргостерина, продукты трансформации эргостерина, которые могут участвовать в процессе морфогенеза. Установлена корреляция между уровнем эргостерина и соотношением метилированных и деметилированных стеринов, и морфогенетическими процессами поляризованного роста.

8. Обнаружена зависимость переключения морфогенетических программ роста мукоровых грибов в виде мицелия или дрожжеподобных клеток, а также ускоренного формирования артроспор от особенностей липидного состава спорангиоспор, использующихся в качестве инокулята и полученных в условиях длительного культивирования спорогенного мицелия.

9. Потенциальную способность мукоровых грибов к дрожжеподобному росту предложено оценивать по качественным и количественным характеристикам липидов их спорангиоспор: уровню -линоленовой кислоты (10% от суммы ЖК); уровню ДАГ (5%) и ТАГ (20%); отношению ФЭА/ФХ (0.4), метилстерины/десметилстерины (1:17), а также ФЛ/ГЛ (2) и ЭС/СCт (1). Эти показатели характерны для спорангиоспор с низкой жизнеспособностью (всхожестью) и указывают на их способность при прорастании давать начало дрожжеподобному росту.

10.Экзогенные липиды определенного состава, внесенные вместе с инокулятом, оказывают регуляторное влияние на морфогенетические процессы, связанные с реализацией альтернативных программ роста грибов – мицелиальной и дрожжеподобной: ТАГ с высоким содержанием полиненасыщенных ЖК индуцируют морфологический переход к гифальной форме, а липиды с повышенным содержанием ДАГ и СЖК, метилированных стеринов и низким уровнем ТАГ и ЭС, вызывают деформации развивающегося мицелия, способствуют образованию артроспор и дрожжеподобных форм. Липиды старых спорангиоспор с низкой всхожестью индуцируют рост почкующихся дрожжеподобных клеток.

Список публикаций автора по материалам диссертации:

Статьи в рецензируемых журналах

1. Мысякина И.С. Изучение фракционного и жирнокислотного состава липидов гриба Fusarium solani и его олигоконидиальных мутантов // Микробиология.

1988. Т. 57. № 3. С. 389–393.

2. Мысякина И.С. Влияние нистатина на липидообразование у Fusarium solani // Микробиология. 1989. Т. 58. № 2. С. 346–347.

3. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Исследование состава липидов гриба Mucor ИНМИ в условиях задержки роста нистатином // Микробиология. 1991. Т. 60. №

4. С. 645–651.

4. Фунтикова Н.С., Катомина А.А., Мысякина И.С. Состав фосфолипидов и степень ненасыщенности липидов гриба Mucor 12M при низких температурах // Микробиология. 1992. Т. 61. № 5. С. 793–797.

5. Торланова Б.О., Конова И.В., Фунтикова Н.С., Бабанова Н.К., Катомина А.А., Мысякина И.С. Влияние условий культивирования мукорового гриба, обработки биомассы, способа экстракции на получение липидов, содержащих -линоленовую кислоту и каротиноиды // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т. 28. № 4. С.

614–622.

6. Конова И.В., Фунтикова Н.С. Труфанова Е.Н., Мысякина И.С. О корреляции содержания азотсодержащих фосфолипидов и полиеновых кислот в клетках мукорового гриба в связи с экзогенным азотом // Микробиология. 1992. Т. 61.

№ 6. С. 1101–1104.

7. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Состав ацилсодержащих липидов клеточных фракций гриба Mucor lusitanicus в условиях различного режима азотного питания // Микробиология. 1994. Т. 63. № 4. С. 624–629.

8. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Диморфизм и состав липидов гриба Mucor lusitanicus // Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. С. 285–286.

9. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Синтез -линоленовой кислоты мукоровыми грибами при использовании экзогенных жирных кислот // Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 90–94.

10. Фунтикова Н.С. Панькина О.И., Мысякина И.С., Конова И.В. Синтез линоленовой кислоты и каротиноидов мукоровыми грибами // Микробиология. 1998.

Т. 67. № 3. С. 345–348.

11. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Поглазова М.Н. Состав жирных кислот и классов липидов в связи с диморфизмом у Mucor lusitanicus в экстремальных условиях // Микробиология. 1998. Т. 67. №. 4. С. 485–491.

12. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Конова И.В. Синтез гамма-линоленовой кислоты мукоровыми грибами при использовании жиросодержащих сточных вод // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 345–348.

13. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Поглазова М.Н. Особенности морфогенеза и состава липидов грибов рода Mucor в присутствии хлоранилинов в погруженной культуре // Микробиология. 1999. Т. 68. № 4. С. 467–472.

14. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Состав липидов дрожжеподобных и мицелиальных клеток гриба Mucor hiemalis, выращенных в присутствии 4-хлоранилина // Микробиология. 2000. Т. 69. № 6. С. 790–795.

15. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Особенности состава липидов артроспор почкующихся клеток и мицелия гриба Mucor hiemalis // Микробиология. 2001. Т. 70. №

4. С. 465–470.

16. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Конова И.В. Синтез биологически активных липидов на средах разного состава // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 6. С. 644–648.

17. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С., Медведев Ф.А. Состав стеринов артроспор и мицелия гриба Mucor hiemalis // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 475– 481.

18. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Изменение состава липидов спорангиоспор Mucor hiemalis в связи с возрастом спорогенной культуры // Микробиология. 2003. Т. 72. № 4. С. 516–520.

19. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Корреляция между липидным составом спорангиоспор, их жизнеспособностью и морфологией клеточного роста гриба Mucor lusitanicus 12M // Микробиология. 2003. Т. 72. № 6. С. 775–779.

20. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Стерины спорангиоспор культуры гриба Mucor hiemalis // Микробиология. 2003. Т. 72. № 6. С. 862–863.

21. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Диморфизм гриба Mucor lusitanicus 12M в зависимости от условий получения спорангиоспор // Микробиология. 2004. Т. 73. №

6. С. 851–853.

22. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Влияние экзогенных липидов на морфологию прорастания спорангиоспор гриба Mucor lusitanicus 12М // Микробиология. 2006. Т. 75. №3. С. 430–432.

23. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Роль стеринов в морфогенетических процессах и диморфизме грибов (Обзор) // Микробиология. 2007. Т. 76. № 1. С. 5–18.

24. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Липиды спорангиоспор мицелиального гриба Mucor ramannianus, неспособного к диморфному росту // Микробиология. 2007.

Т. 76. № 2. С. 179–183.

25. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы, изоцитратлиазы и малатдегидрогеназы у Mucor circinelloides var. lusitanicus ИНМИ в связи с режимом азотного питания // Микробиология. 2008. Т.

77. № 4. С. 453–459.

26. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Особенности метаболических процессов и состав липидов дрожжеподобных клеток и мицелия Mucor circinelloides var.

lusitanicus ИНМИ при высоком содержании глюкозы в среде // Микробиология. 2008.

Т. 77. № 4. С. 460–464.

27. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Влияние условий получения спорангиоспор посевного материала на морфологию и продуктивность гриба Mucor circinelloides var. lusitanicus 12М – продуцента -линоленовой кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 4. С. 446–450.

28. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Особенности метаболической активности и состава липидов при изменениях режима азотного питания Mucor circinelloides var.

lusitanicus – продуцента -линоленовой кислоты // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. № 2. С. 194–195.

Статьи в сборниках

1. Мысякина И.С. Сравнительное изучение липидов гриба Fusarium solani и полученных из него мутантов // В сб.: Проблемы современной биологии. Материалы 16 конференции молодых ученых МГУ. М.: Изд-во МГУ, 1986. Т. 1. С. 91–95. Деп. в ВИНИТИ, № 6642-В86.

2. Мысякина И.С. Жирнокислотный состав липидов гриба Fusarium solani и его морфологических мутантов при росте на глюкозе и этаноле // В сб.: Проблемы современной биологии. Материалы 17 конференции молодых ученых МГУ. М.: Изд-во МГУ, 1987. Т. 1. С. 215–219. Деп. в ВИНИТИ, № 6654-В87.

3. Мысякина И.С. Влияние температуры культивирования на фракционный жирнокислотный состав липидов гриба Fusarium solani и его мутантов // В сб.:

Проблемы современной биологии. Материалы 18 конференции молодых ученых МГУ.

М.: Изд-во МГУ, 1988. Т. 3. С. 161–165. Деп. в ВИНИТИ, № 6712-В88.

4. Konova I.V., Funtikova N.S., Karpova N.V., Mysyakina I.S., Pankina O.I.

Physiological regulation of lipogenesis of fungi // Chapter in: Metabolism: structure and utilization of plant lipids / A. Cherif e.a., eds. The Proceedings of the Tenth International Symposium on Plant Lipids, Held at Jebra, Tunisia, April 27 – May 2, 1992. P. 344–347.

5. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Липиды гриба Mucor hiemalis в связи с диморфизмом // «Грибы в природных и антропогенных экосистемах». Сб. Труды Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург, 24-28 апреля 2005 г. Т. 2. С. 37–40.

Тезисы конференций

1. Фунтикова Н.С., Катомина А.А., Мысякина И.С. Характеристика липогенеза гриба Mucor 12M в условиях ингибирования роста низкой температурой // Материалы Всероссийской конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов», Пущино, 12-14 декабря 1989 г. С. 91–92.

2. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Сократова Н.Б., Панькина О.И., Конова И.В. Использование микроскопических грибов в качестве деструкторов загрязнителей органической природы // Тезисы конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду», Москва, май 1994. С. 52.

3. Фунтикова Н.С., Конова И.В., Мысякина И.С., Панькина О.И.

Мицелиальные грибы – источник полиненасыщенных жирных кислот для диетотерапии // Тезисы Всероссийской конференции «Современные достижения биотехнологии», Ставрополь, 1-3 июля 1996 г. С. 164–165.

4. Фунтикова Н.С., Конова И.В., Мысякина И.С., Бабанова Н.К., Кутузова И.С. Микробиологический метод получения липидов, содержащих g-линоленовую кислоту // Материалы III Всероссийского научного конгресса «Человек и лекарство», Москва, 16-20 апреля 1996 г. С. 55.

5. Heidebrecht O., Arzumanian V., Plakunov V., Mysiakina I. Yeast Malassezia spp. is an extremely halotolerant // 21st International Specialized Symposium on Yeasts “Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)”, Lviv, Ukraine, August 2001, Р. 96.

6. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Диморфизм и состав липидов мукоровых грибов // Сб. «Современная микология в России». Тезисы докладов I съезда микологов России. Москва, 11-13 апреля 2002 г. С. 153.

7. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Конова И.В. Продуктивность гриба Mucor lusitanicus ИНМИ – продуцента биологически активных липидов, содержащих гамма-линоленовую кислоту и каротиноиды // Материалы Первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 20-21 февраля 2003 г. «Успехи медицинской микологии» (ред. Ю.В. Сергеев). М.: Национальная академия микологии,

2003. Т. 1. С. 258–259.

8. Конова И.В. Фунтикова Н.С., Галанина Л.А., Мысякина И.С., Сергеева Я.Э. Биотехнологическое использование микроорганизмов как продуцентов фармакологически активных липидных препаратов // Тезисы семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003». Пущино, 24-25 ноября 2003 г. С. 55–56.

9. Фунтикова Н.С., Конова И.В., Мысякина И.С. Комплекс биологически активных липидов «Гаммалин»» // Материалы Второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 24-25 марта 2004 г. «Успехи медицинской микологии» (ред. Ю.В. Сергеев). М.: Национальная академия микологии, 2004. Т. 3. С.

141–142.

10. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Катомина А.А. Получение – линоленовой кислоты с использованием непрерывного культивирования дрожжеподобных клеток гриба Mucor lusitanicus ИНМИ // Материалы Третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 24-25 марта 2005 г.

«Успехи медицинской микологии» (ред. Ю.В. Сергеев). М.: Национальная академия микологии, 2005. Т. 5. С. 233–234.

11. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С., Сократова Н.Б., Конова И.В. Утилизация масел и жиросодержащих отходов мукоровыми грибами // Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Саратов, 14-16 сентября 2005 г. С. 54–55.

12. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Влияние экзогенных липидов на характер роста диморфного гриба Mucor lusitanicus 12М // Материалы Четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 29-31 марта 2006 г.

«Успехи медицинской микологии» (ред. Ю.В. Сергеев). М.: Национальная академия микологии, 2006. Т. 7. С. 23–25.

13. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Комплексное использование биомассы гриба Mucor circinelloides Tiegh. var. lusitanicus ИНМИ – продуцента -линоленовой кислоты // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.

Овчинникова. Пущино, 5-7 декабря 2006 г. М.: Макс-Пресс, 2006. С. 277–279.

14. Фунтикова Н.С., Мысякина И.С. Комплекс биологически активных липидов, полученных с использованием гриба Mucor circinelloides Tiegh. var.

lusitanicus (Bruderl.) Schipper 12M // Материалы Пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 27-29 марта 2007 г. «Успехи медицинской микологии» (ред. Ю.В. Сергеев). М.: Национальная академия микологии. Т. 9. С. 196– 197.

15. Mysyakina I.S., Funtikova N.S. Sporangiospore lipid composition and capacity to dimorphism in Mucor fungi // Abstracts of XV Congress of European Mycologists, 16-21 September 2007, St. Petersburg, Russia – St Petersburg: TREEART LLC, 2007. – 303 p. (P.

174).

16. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Липиды спорангиоспор грибов Mucor ramannianus и Mucor hiemalis в связи со способностью к диморфному росту // Современная микология в России. Материалы Второго Съезда микологов России / Под ред. Дьякова Ю.Т. М.: Национальная академия микологии, 2008. Т. 2. 548 с. (С. 134Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Влияние условий получения спорангиоспор на морфологию и продуктивность мукорового гриба – продуцента линоленовой кислоты // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». 2июня 2008 г., Минск / Минск: Издатель И.П. Логвинов, 2008. Т. 1. С. 163-165.

Патент Фунтикова Н.С., Катомина А.А., Мысякина И.С. Способ получения липидов, содержащих -линоленовую кислоту // Патент РФ № 1751212. А1 СССР / Бюллетень изобретений. 1992. № 28.




Похожие работы:

«Ученые записки Таврического национального университета имени В. И. Вернадского Серия "География". Том 27 (66), № 2. 2014 г. С. 3–15. РАЗДЕЛ 1. ФИЗИЧЕСКАЯ ГЕОГРАФИЯ И ГЕОЭКОЛОГИЯ УДК 620.91:712.253.58 "ЗЕЛЁНАЯ" ЭНЕРГЕТИКА В САДОВО-ПАРКОВЫХ КОМПЛЕКСАХ Багрова Л.А., Змерзлая К.С., Мазинов А.С.-А. Тавриче...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины" ГИДРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕК БАССЕЙНА ДНЕПРА (В ПРЕДЕЛАХ ГОМЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ) Гомель 2008 УДК 574.5 (476.2, 282.2 Днепр) ББК 28.082 (4 БЕИ – 4 Гом, 2 Днепр) Г 464 Авторы: И.Ф. Ра...»

«ФАРОПОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСЕЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА У ДЕТЕЙ С ПСИХОНЕВРОЛОГИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель:...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 78-85. УДК 591.5:598.113.6 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОРОДЯЩЕЙ ЯЩЕРИЦЫ, LACERTA VIVIPARA, ГОСУДАРСТВЕННОГО ЗАПОВЕДНИКА "КОМСОМОЛЬСКИЙ" © 2009 О.Г. Лазарева Ивановский государственный университет, г. Иваново (Россия) herpet.log@mail.ru Поступила...»

«ЕЖЕГОДНЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ И ОБ ОХРАНЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ГОРОДА ФЕДЕРАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ СЕВАСТОПОЛЯ ЗА 2015 ГОД Приложение УТВЕРЖДЕНО Приказом Севприроднадзора от 01.07.2016 № 105 Правительство Севастополя ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ ГОРОДА СЕВАСТОПОЛЯ...»

«Муравьёв А.Г., Мельник А.А.ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ Программа элективного курса для учащихся 9–11 классов ЗАО "Крисмас+" Санкт-Петербург ББК 74.264.4+74.264.5+74.265.7 УДК 373.5+ 372.854+372.857 + 372.853+ 372.857+ 372.862+ 658.382 Экологический практикум: Программа элективн...»

«ЭЛЕКТРОТЕХНИЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ МЕАНДР МР 19.0316.01 ПС V03.04.16 Устройства защиты многофункциональные УЗМ-51МД ТУ 3425-003319288072014 Наличие функции детектирования аварийной электрической дуги Защита от скачков и длительных перенапряжений Встроенная варисторная защита от импульсных скачков сете...»

«Светлова Марина Всеволодовна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ПРИМОРСКИХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 25.00.36 – Геоэкология (Науки о Земле) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руковод...»

«ООО “Вторая лаборатория” ЦИФРОВОЙ МЭМС ДИКТОФОН "СОРОКА-07" Руководство по эксплуатации ЛБМД.423363.017 РЭ Страница 1 Версия от 03.06.2014 ООО “Вторая лаборатория” СОДЕРЖАНИЕ 1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ И ОПИСАНИЕ РАБОТЫ ДИКТОФОНА.3 1.1 Назначение диктофона. 1.2 Основные технические характеристики диктофо...»

«Технология развития критического мышления(ТРКМ) на уроках биологии Учитель биологии Переладова Н.А. Соавторы-разработчики В основу этого подхода к обучению положены труды ученых с мировым именем: Джени Л. Стил Д. Дьюи Кертис С. Мередит Ж.Пиаже Технология (РКМЧП) была Чарльзом Темплом Л.С. Выготского С...»

«Special material. Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 191 УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ О понятии и классификации видов экологическог...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом факультете кафедрой гуманитарных и естес...»

«Самаратрансавто-2000 Транспорт Складской девелопмент VOLVO&RENAULT сервисная станция 03.09.2015, Самара Самаратрансавто-2000 ИСТОРИЯ КОМПАНИИ Фирма ООО "СамараТрансАвто-2000" была основано в 1996 году как транспортно-экспедиторская компания, работающая на международных и вн...»

«Труды Русского энтомологического общества. С.-Петербург, 2013. Т. 84 (2): 107–113. Proceedings of the Russian Entomological Society. St. Petersburg, 2013. Vol. 84 (2): 107–113. Влияние фотопериода на развитие и созревание особей из европейской инвазивной популяции Harmonia axyrid...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 1. – С. 119-126. УДК 591.5:598.113.6 ЖИВОРОДЯЩАЯ ЯЩЕРИЦА, LACERTA VIVIPARA, КАК ИНТЕГРАЦИОННАЯ МОДЕЛЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ © 2009 Д.В. Семенов Институт проблем экологии и эволюции им....»

«База нормативной документации: www.complexdoc.ru МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ ПРИКАЗ 20 июля 2009 г. № 640 Москва Об утверждении и введении в действие руководства по безо...»

«Гандзюра В.П., Гандзюра Л.А., 2008. Подходы к оценке качества вод и состояния экосистем в условиях антропогенной нагрузки //М-лы Междунар. конф. по водной токсикологии и гидроэкологии "Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы. Критерии оценки качества воды"....»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный гуманитарно-педагогический университет...»

«ПРЕДСТАВИТЕЛИ АКЦИОНЕРА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ: ОПЫТ ДТЭК Евгений Круть Менеджер Департамента по корпоративному управлению ДТЭК ДАТА: 03.06.2016, Г. КИЕВ КОНФИДЕНЦИАЛЬНО ВМЕСТО ПРЕДИСЛОВИЯ. "ВЫ НЕ ПОМНИТЕ, КТО ТАКИЕ ЮРИДИЧЕСКИЕ ЛИЦА В НАБЛЮДАТЕЛЬНЫХ СОВЕТАХ, ЭТОГО НЕ БЫЛО!!!" Сноски ЧТ...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижневартовский государственный университет" Факультет экологии и инжиниринга Рабочая программа дисциплины (модуля) Б1.В....»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологи...»

«Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 151 УДК 502.34 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ Влияние эксплуатации опасных производственных объектов на современное состояние экологии в Рос...»

«Планирование энергоэффективных траекторий полета стратосферного дирижабля-челнока многоуровневой транспортной системы МААТ В.Х. Пшихопов, В.А. Крухмалев Экологически безопасная и экономически эффективная транспортировка грузов и пассажиров представляют большой интерес в наше время. Решен...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.