WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:     | 1 ||

«БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ краткий курс лекций для магистров I курса Направление подготовки 19.04.01 Биотехнология ...»

-- [ Страница 2 ] --

Внимание привлекла новая концепция: у микроорганизмов, особенно это относится к актиномицетам, часть генов в геноме находится в «молчащем» состоянии. Они не экспрессируются, т.е. продукты, кодируемые этими генами, в том числе антибиотики, не синтезируются. Однако под влиянием различных воздействий тот или иной участок «молчащего» генома начинает работать. В результате получают объяснение причины образования различными штаммами одного вида разных антибиотиков, а также образование близких антибиотиков микроорганизмами разных видов. Конечно, это не означает, что любой актиномицет может образовать любые антибиотики. Однако концепция «молчащих» генов заставляет уже на современном молекулярном уровне вернуться к одному из положений, высказанных классиком науки об антибиотиках американским микробиологом 3. Ваксманом. Он утверждал, что, выделив почвенный микроорганизм на искусственных питательных средах и культивируя его в условиях, отличных от природных, нельзя получить представления о полном биосинтетическом потенциале микроорганизма и о перечне образуемых им вторичных метаболитов. Однако моделирование природных условий - исключительно сложная задача. Во-первых, на микроуровне они мало изучены. Во-вторых, их разнообразие должно быть очень велико.

В лабораториях разных стран мира выделены и охарактеризованы десятки тысяч продуцентов антибиотиков. Как правило, продуцентами антибиотиков являются такие почвенные микроорганизмы как плесневые грибы, актиномицеты и спорообразующие бактерии.

Плесневые или «низшие» мицелиальные грибы отличаются от «высших» грибов отсутствием плодового тела. Плесневые грибы широко распространены в почве. Их относят к микроорганизмам эукариотам, имеющим оформленное, окруженное мембраной ядро. Плесневые грибы имеют также субклеточные структуры - митохондрии, где сосредоточены ферменты, катализирующие биоэнергетические процессы. Клеточная стенка грибов состоит из хитина - полимера, содержащего остатки аминосахаров. В целом клетки грибов отличаются сложной организацией и большими размерами по сравнению с бактериальными клетками.

Плесневые грибы – многоклеточные микроорганизмы со сложным циклом развития. Они формируют разные виды мицелия, спороносцы со спорами и другие морфологические образования. Цикл развития грибов 6 - 7 сут. Плесневые грибы образуют сотни разных антибиотиков, однако в медицинской практике применяются лишь отдельные из них. Важнейшая группа антибиотиков, образуемых грибами, - пенициллины и цефалоспорины. Их объединяют под названием беталактамные антибиотики, так как важнейшая часть их молекулы, от которой зависит антимикробная активность, реакционно-способное четырехчленное беталактамное кольцо (циклический амид).

Беталактамное кольцо получило свое название ввиду того, что при его образовании происходит замыкание связи между углеродом карбоксильной группы аминокислоты и азотом аминогруппы, находящейся при бетауглеродном атоме. Беталактамные антибиотики образуются двумя родами плесневых грибов: Penicillium (отсюда - пенициллины) и Cephalosporium (цефалоспорины). В настоящее время предпочитают вместо Cephalosporium использовать название Acremonium. Широко известны два продуцента беталак-тамов: Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum.

У пенициллинов с беталактамной структурой сконденсировано пятичленное кольцо, содержащее серу, а у цефалоспоринов — шестичленное. К грибам относится продуцент еще одного антибиотика, применяемого в медицинской практике. Представитель рода Fusidium. а именно Fusidium coccineum образует антибиотик стероидной структуры — фузидиевую кислоту.





Необходимо отметить еще один ценный лекарственный препарат, образуемый грибами. На рубеже 1970—1980-х гг. из гриба рода Tolypocladium был выделен циклопептид, проявлявший слабую антимикробную активность, поэтому «забракованный» как антибиотик. Однако он оказался высокоэффективным в качестве иммуносупрессора.

Циклопептид, получивший название циклоспорин (точнее циклоспорин G), широко используется при пересадке органов и тканей, а также при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний.

Название «актиномицеты» отражает распространенное ранее неправильное представление об этих микроорганизмах как о лучистых грибах.

Установлено, что актиномицеты стоят гораздо ближе к бактериям, чем к грибам.

Они являются прокариотами. Их геном не заключен в ядро, а представляет кольцевую хромосому, не отделенную от цитоплазмы ядерной мембраной.

Клетки актиномицетов не содержат также и митохондрий. Их клеточная стенка построена из гетерополимера - пептидогликана. Все это сближает актиномицеты с бактериями. Однако актиномицеты в отличие от «истинных» бактерий (эубактерий) являются многоклеточными организмами со сложным циклом развития. Обычно за 5 —6 сут.

актиномицеты образуют спороносны и споры.

Актиномицеты являются продуцентами огромного количества (около 4000) разнообразных антибиотиков.

Актиномицетами образуется большинство антибиотиков, применяемых в медицинской практике. Ряд видов, относящихся к родам Streptomyces и Micromonospora, образуют антибиотики аминогликозидной структуры, к которым принадлежат: стрептомицин, гентамицин, неомицин, канамицин и ряд других антибиотических веществ с широким спектром антибактериального действия, получивших широкое распространение в клинике.

В молекуле аминогликозидов обязательно присутствуют:

• остаток шестичленного аминоциклитола;

• остатки сахаров и/или аминосахаров.

Кроме природных аминогликозидов в медицинской практике в настоящее время используются и полусинтетические аминогликозидные антибиотики, т.е. продукты химической модификации природных аминогликозидов.

Все они близки по спектру антибактериального действия, все всасываются при приеме внутрь, однако некоторыми преимуществами (лучшей переносимостью) обладает тетрациклин. Как видно из их формул, они содержат структуру из четырех циклов и разнятся только по «верхней», но не по «нижней» периферии молекулы.

Верхняя периферия тетрациклиновой молекулы была модифицирована химическим путем, что позволило получить полусинтетические тетраииклины - доксиииклин, миноциклин и метациклин (первый из них длительно циркулирует в крови, второй обладает повышенной антибактериальной активностью).

Широко известны образуемые актиномииетами антибиотики макролидной структуры, содержащие макроциклическое лактонное кольцо и сахара и/или аминосахара. В частности, к ним относится эритромицин А (продуцент Streptomyces erythraeus);

Эти антибиотики хорошо всасываются при приеме внутрь. Они высокоэффективны только против грамположительных бактерий, так как являются антибиотиками узкого спектра действия.

Из актиномицета, первоначально названного Streptomyces mediterranei, а позднее отнесенного к виду Nocardia mediterranea, выделены антибиотики сложной анзамииновой структуры. У них имеется нафталиновое «ядро» и длинная алифатическая цепь, соединенная с ароматической частью эфирной и амидной связями. Наибольшую известность из них получил рифампицин, или рифампин, который является, однако, полусинтетическим антибиотиком.

Рифампицин успешно применяется влечении туберкулеза. Актиномицеты, помимо антибактериальных антибиотиков, образуют также и антибиотики, подавляющие рост грибов и дрожжей, в том числе патогенных. Представители рода Streptomyces, например, Streptomyces nourasei, являются продуцентами противогрибковых антибиотиков, относящихся к полиеновым макролидам. Макроциклическое лактонное кольцо содержит у этих антибиотиков ряд сопряженных двойных связей.

В молекулу полиеновых антибиотиков входят и аминосахара. Полиеновые антибиотики широко известны в медицинской практике. Вследствие их высокой токсичности полиены применяются в основном наружно или перорально.

Нередко при пероральном применении их используют вместе с антибактериальными антибиотиками для того, чтобы предотвратить быстрое размножение дрожжей после подавления роста бактерий. Актиномицеты образуют ряд противоопухолевых антибиотиков. Из них свыше десяти нашли применение при лечении некоторых форм рака. Так, Streptomyces verticillius образует антибиотик блеомицин сложного гликопептидного строения. Наиболее важной в настоящее время считается группа антрациклинов.

Аэробные спорообразуюшие грамположительные бактерии (бациллы) относятся к собственно бактериям. Как и все бактерии, они не имеют ядра. Их кольцевая хромосома имеет меньшие размеры, чем у актиномицетов. Их геном соответственно более прост, т.е. содержит меньшее, чем у актиномицетов количество генов, и тем более, у грибов. Бактерии не имеют митохондрий. Их клеточная стенка близка по составу к клеточной стенке актиномицетов и состоит из пептидогликана. Жизненный цикл бактерий значительно короче жизненного цикла грибов и актиномицетов - около полутора суток.

Открыто более тысячи антибиотиков бактериального происхождения. Большинство из них представлены пептидами и циклопептидами.

Позднее из другого вида почвенных споровых бактерий (Bacillus polymyxa) был выделен также нашедший применение в медицинской практике антибиотик полимиксин В

- представитель ряда полимиксинов. в который входят свыше 20 соединений, разнящихся по отдельным аминокислотным остаткам, а также по входящему в их молекулу остатку жирной кислоты. В структуре полимиксина В присутствуют три фрагмента:

циклопептид, линейный трипептид, остаток 6-метил октановой кислоты (непептидная часть молекулы).

В отличие от грамицидина полимиксин В используется не только для местного, но и для внутримышечного введения. В целом антибиотики, образуемые почвенными споровыми бактериями, не столь разнообразны, как антибиотики актиномицетов, и в медицинской практике они играют меньшую роль.

9.2. Механизмы биосинтеза антибиотиков

Три основных обстоятельства определяют особенности биосинтеза, общие для всех антибиотиков:

• антибиотики не относятся к прямым продуктам трансляции или вообще матричного синтеза;

• антибиотики как вторичные вещества образуются из первичных метаболитов;

• биосинтез молекулы любого антибиотика происходит с участием ряда ферментов.

Координация действия ферментов, т.е. обеспечение правильной последовательности ферментативных реакций, обеспечивается разными путями. Один путь, доказанный на примере биосинтеза циклопептидных и некоторых других антибиотиков, связан с тем, что синтез или сборка антибиотической молекулы происходит в мультиферментных комплексах с упорядочение расположенными ферментами. Первичные метаболиты «входят» в мультиферментный комплекс, в котором происходит ряд их превращений.

Из комплекса «выходит» или завершенная молекула антибиотика, или ее крупный фрагмент, например, специфический агликон того или иного антибиотика и т. п. При «сборке» углеродного скелета молекулы антибиотика могут происходить различные реакции: метилирование или деметилирование; карбоксилирование или декарбоксилирование; аминирование или дезаминирование.

Предшественниками беталактамных антибиотиков являются аминокислоты. Началом формирования беталактамной молекулы является синтез так называемого LLDтрипептида из трех L-ами-нокислот - первичных метаболитов - L-аминоадипиновой кислоты, L-цистеина и L-валина.

Затем LLD-трипептид превращается в моноциклический беталактам, т.е. происходит замыкание беталактамного кольца. Следующий этап — появление пятичленного серосодержащего кольца, сконденсированного с беталактамным. Все это означает участие в биосинтезе антибиотика новых ферментов. В случае образования бензилпенициллина необходимо присутствие фенилуксусной кислоты (в активированной форме), в результате чего освобождаются аминоадипиновая кислота и кофермент А.

Во втором случае происходит «экспансия» - расширение пятичленного кольца до шестичленного, что катализируется специфическим ферментом, получившим название «экспандаза». Далее, в результате еще ряда реакций формируется молекула цефалоспорина С.

Вышеперечисленные реакции биосинтеза демонстрируются как пример, чтобы еще раз подчеркнуть основополагающий тезис: молекула любого антибиотика синтезируется с обязательным участием ряда (5-10 и более) ферментов.

На основании анализа структурных формул аминогликозидов — стрептомицина и гентамииинов и других можно предположить, что их предшественником является глюкоза.

Действительно, как показали многочисленные исследования, из глюкозы синтезируются не только остатки сахаров в молекулах аминогликозидов, но и их аминоциклитольный фрагмент. Два других фрагмента молекулы стрептомицина - пентоза (стрептоза) и L-глюкозамин так же образуются из глюкозы за счет ряда ферментативных реакций. Наконец, сборка молекулы стрептомицина из трех компонентов - стрептидина, стрептозы и L-глюкозамина (замыкание между ними гликозидных связей) требует специфических ферментов. В биосинтезе стрептомицина и большинства других аминогликозидных антибиотиков участвуют не менее 20 ферментов.

Описывая ферментативные реакции биосинтеза тетрациклиновой структуры, обычно проводят аналогию с биосинтезом первичных метаболитов - жирных кислот, из остатков ацетатных или пропионатных единиц по принципу «голова к хвосту», когда формируется связь между углеродом карбоксильной группы и углеродом метильной группы (или метиленовой группы) следующей единицы. В этих ферментативных реакциях участвует кофермент А.

Существуют и принципиальные отличия между синтезом жирных кислот и антибиотиков - вторичных метаболитов. При биосинтезе антибиотиков не происходит восстановления карбонильных групп после реакции конденсации или такое восстановление происходит до образования гидроксильной группы или двойных связей. При полном восстановлении образуются ароматические структуры; при неполном - макроциклические лактоны. Таким образом, имеется определенная связь между «биогенезом»

таких соединений, как тетрациклины и антибиотики-макролиды. Скелет молекулы тетрациклинов строится из одной малонамидной единицы и восьми малонатных.

Основа структуры лактонного макроциклического кольца эритромицина образуется как результат ферментативной полимеризации одной единицы пропионата и шести единиц метилмалоната. Сахара эритромицина происходят из глюкозы за счет ряда ферментативных превращений. В биосинтезе участвуют ферменты сборки молекулы из макроциклического лактона и сахаров.

Методы генной инженерии с успехом используются при создании продуцентов рекомбинантных белков, так как белки - прямые продукты трансляции. В целом остается справедливым правило: один ген - один белок, т.е. один «структурный» ген определяет структуру (последовательность аминокислот) одного белка.

Антибиотики не являются прямыми продуктами трансляции в отличие от ферментов биосинтеза антибиотиков. Количество таких ферментов достигает нескольких десятков. Таким образом, в биосинтезе молекулы антибиотика принимают участие десятки «структурных» генов.

9.3. Биотехнология антибиотиков

Фактически ни один продуцент, выделенный из почвы или другого природного источника, непосредственно в производстве использован быть не может. Природный штамм образует лишь незначительные количества антибиотиков. Обработкой мутагенами и многоступенчатым отбором (селекцией) активных вариантов обычно удается повысить активность штамма, так как количество образуемого им антибиотика увеличивается в тысячи и даже десятки тысяч раз. Например, у продуцента пенициллина в результате десятков лет селекционной работы во многих лабораториях разных стран мира активность повысилась от десятков микрограммов до десятых долей грамма антибиотика в миллилитре среды.

У промышленных мутантных штаммов (рабочий термин «суперпродуценты») антибиотик, образуемый в огромном количестве, не должен влиять: на собственный биосинтез; жизнедеятельность своего продуцента.

Как известно, избыточное образование метаболита ведет к прекращению его биосинтеза по принципу обратной связи. В случае суперпродуцентов механизм обратной связи исключен.

Жизнедеятельность суперпродуцентов сохраняется в результате разных причин:

максимум концентрации антибиотика достигается, когда рост культуры либо завершается, либо практически уже завершен; антибиотик синтезируется в местах клетки, отделенных от мест локализации жизненно важных метаболических процессов;

после выхода антибиотика из мицелия в среду вновь в мицелий он не проникает, т.е.

транспорт антибиотика через оболочку продуцента имеет одностороннее направление.

Однако свойство образовывать избыточные количества антибиотиков нестойко, оно легко теряется полностью или частично, поэтому промышленные продуценты хранят в особых условиях, периодически проверяя их активность. При необходимости их рассевают на отдельные колонии, из которых затем отбираются наиболее активные.

При разработке биотехнологии антибиотиков учитываются общие свойства продуцентов, а также, что каждый антибиотик является конечным продуктом длинной цепи специфических ферментативных реакций.

Продуценты большинства антибиотиков, в том числе важнейших для медицинской практики, являются аэробами или (реже) факультативными анаэробами. В связи с этим в первые годы после получения пенициллина, грамицидина С и некоторых других веществ их продуценты выращивали на поверхности жидкой питательной среды в стационарных условиях в микробиологических матрацах или колбах, помещаемых в термостат или термостатные комнаты. Культура продуцента росла только на поверхности среды. Этот способ был трудоемок, не экономичен и не позволял нарабатывать антибиотик в больших количествах. Очень скоро поверхностная ферментация была заменена на глубинную. Через питательную среду пропускали воздух и среду непрерывно перемешивали. Это позволило использовать для роста продуцента весь объем среды.

Только глубинная ферментация создала возможность современного биотехнологического производства с выпуском конечного продукта в большом количестве.

Кривые накопления биомассы продуцента и антибиотика в культуральной жидкости, а также и в мицелии продуцента, не совпадают во времени. Вторая кривая значительно запаздывает.

Это относится к продуцентам всех важнейших антибиотиков: грибам, актиноминетам, споровым бактериям. Первая фаза развития культуры продуцента во время ферментационного процесса была названа «трофофаза» - фаза сбалансированного роста.

Вторая - «идиофаза» или фаза несбалансированного роста. В течение трофофазы антибиотик в культуратьной жидкости не обнаруживается или обнаруживается в незначительных количествах. Во время идиофазы прирост биомассы замедляется. Наступает быстрое накопление антибиотика в культуральной жидкости. В трофофазе источники углерода и азота в среде быстро потребляются, и количество их в среде уменьшается. В идиофазе их потребление замедляется, а в конце идиофазы происходит частичный лизис густой культуры мицелия.

Одновременно в культуре можно обнаружить и некоторое количество новых нитей молодого мицелия, который находится уже в условиях среды, обедненной питательными веществами, и участвует в биосинтезе антибиотика.

Таким образом, интенсивному биосинтезу антибиотика способствует значительное уменьшение в среде источников углерода и азота, особенно легко усваиваемых. Происходит дерепрессия ферментов синтеза антибиотика. Однако выращивание продуцентов с самого начала ферментации на обедненных средах нецелесообразно, так как незначительное накопление биомассы в течение трофофазы ведет в конечном счете и к незначительному накоплению антибиотика малым количеством клеток продуцента.

Для высокопродуктивной ферментации необходимо соблюдать определенные условия. Продуценты антибиотиков выращивают на разных средах как относительно простого состава, так и сложного. Последние получили название комплексных сред. В них могут входить соевая или хлопковая мука, кукурузный экстракт и другие природные многокомпонентные источники питательных веществ. Также в среды вносят индивидуальные органические соединения и минеральные соли. Для каждого штаммапродуцента состав оптимальной для биосинтеза антибиотика среды подбирается отдельно. Это относится даже к штаммам одного вида, продуцирующим один и тот же антибиотик. Существуют и некоторые общие закономерности, учитываемые при работе с большинством продуцентов.

Углеродкатаболитная регуляция является одним из механизмов, воздействующих на биосинтез вторичных метаболитов. Известно, что глюкоза - лучший источник углерода и энергии для любых организмов. Однако быстрый катаболизм глюкозы резко снижает биосинтез антибиотиков. Показано, что глюкоза ослабляет биосинтез беталактамов, аминогликозидов и многих других антибиотиков, образуемых разными продуцентами.

Относительно биосинтеза антибиотиков отметим, что глюкоза, фруктоза, сахароза и галактоза - сильные репрессоры этого процесса. Необходимо подчеркнуть, что продукты катаболизма глюкозы подавляют не активность ферментов биосинтеза антибиотиков, а сам синтез этих ферментов. Медленно утилизирующиеся полисахариды (крахмал и др.) более благоприятны для биосинтеза антибиотиков. Не является репрессором биосинтеза и лактоза, которая также медленно утилизируется: при ее гидролизе освобождающаяся глюкоза репрессирует бетагалактозидазу и, в результате, гидролиз лактозы (появление в среде глюкозы) замедляется.

Высокое содержание в среде фосфора (в виде неорганических фосфатных солей) неблагоприятно для биосинтеза большинства антибиотиков. Общая причина этого обогащение клетки макроэргическими фосфорными соединениями (прежде всего АТФ), что повышает скорость роста мицелия. Накапливается много биомассы, но относительно мало антибиотика. Например, высокоактивные штаммы продуцентов тетрациклиновых антибиотиков содержат в мицелии меньше АТФ и растут медленнее, чем исходные низкоактивные продуценты тетрациклинов. Неблагоприятное действие фосфора на биосинтез беталактамных антибиотиков объясняется на биохимическом уровне следующим механизмом: образование LLD-трипептида - ключевого соединения, с которого начинается синтез пенициллинов и цефалоспоринов, ингибируется глюкозо-6фосфатом. Взаимодействие легкоокисляемого сахара и фосфата оказывает отрицательный эффект на биосинтез. Однако все вышеизложенное не означает, что фосфор может быть полностью исключен из среды. Биосинтез антибиотиков снижается при его избыточном количестве, поэтому для каждого штамма-продуцента подбирается оптимальное содержание фосфора в среде.

Аммоний и другие легкоутилизируемые источники азота подобно легкоокисляемым углеводам усиливают рост продуцентов беталактамных, полиеновых антибиотиков (эритромицина, рифамицинов и др.), но отрицательно влияют на их биосинтез. Соевая и хлопковая мука, БВК (белково-витаминный концентрат) медленно расщепляются в процессе ферментации, т.е. из них медленно высвобождаются аминокислоты и ионы аммония, поэтому их используют в качестве компонентов питательных сред, что позволяет получать высокий выход антибиотиков. Механизм отрицательного действия легкоусвояемых источников азота на биосинтез антибиотиков не ясен. Есть данные, что у продуцентов беталактамов он связан с уровнем глутаминсинтетазы в мицелии. Известно, что глутамин является донором аминогрупп для ряда аминокислот, а сами аминокислоты, в свою очередь, являются предшественниками беталактамных антибиотиков. Вероятно, что у разных продуцентов механизм этого действия на биосинтез различен. В любом случае неблагоприятное действие легкоусвояемых источников азота на биосинтез обязательно учитывается при подборе сред, а также осуществляется контроль количества таких соединений.

Некоторые первичные метаболиты являются прямыми предшественниками антибиотиков, например, валин включается в трипептид, из которого формируются беталактамные структуры. При избытке валина и высокой концентрации его в мицелии происходит подавление валином собственного биосинтеза по принципу обратной связи. Находясь в избытке, он подавляет активность ацетогидроксисинтетазы — первого фермента своего биосинтетического пути. Однако в результате снижается и образование трипептида, т.е. в конечном счете и беталактамного антибиотика.

Некоторые же первичные метаболиты являются конечными продуктами разветвленного метаболического пути. Одно «ответвление» или один конец этого пути заканчивается первичным метаболитом, другое «ответвление» - антибиотиком. Так, альфааминоадипиновая кислота является, с одной стороны, прямым предшественником лизина, с другой - беталактамного антибиотика, так как включается в исходный для его синтеза трипептид. При избытке лизина происходит подавление образования альфааминоадипиновой кислоты по принципу обратной связи и, таким образом, снижается синтез не только лизина, но и беталактамного антибиотика.

Эти примеры показывают, что у высокоактивных штаммов продуцентов антибиотиков, полученных генетическими методами, должны быть нарушены механизмы обратной регуляции биосинтеза тех первичных метаболитов, которые необходимы для образования антибиотической молекулы. Можно отметить, например, что лизин подавляет биосинтез пенициллина у низкоактивных продуцентов. Полученные из них же «изогенные» высокоактивные штаммы уже не отвечают на избыток лизина в среде снижением биосинтеза антибиотика.

Важность аэрации для обеспечения роста продуцентов на стадии ферментации обусловлена тем, что большинство из них - аэробы. Кислород необходим для биосинтеза ряда антибиотиков, так как последний расходуется при замыкании беталактамного и тиазолидинового колец во время биосинтеза беталактамной структуры. Например, для образования изопенициллина-N из LLD-три-пептида молекулярный кислород необходим в стехиометрическом отношении 1: 1 (предельное насыщение кислородом культуральной жидкости 30%). Когда ферментация идет успешно, кислород потребляется со скоростью 1 ммоль/(л * мин). В целом потребность в кислороде зависит от концентрации биомассы и ее метаболической активности. Оптимизация снабжения кислородом достигается увеличением скорости его переноса.

После стадии ферментации культуральная жидкость содержит растворенный антибиотик, мицелий продуцента, продукты его лизиса, ряд компонентов неиспользованной питательной среды, в том числе высоко- и низкомолекулярные органические вещества и неорганические соли.

Иногда антибиотик содержится не только в культуральной жидкости, но и в мицелии. Культуральная жидкость нередко отличается высокой вязкостью. Поэтому выделить антибиотик из столь сложной гетерогенной системы непросто.

В историческом аспекте можно отметить, что именно неудача химиков при выделении и очистке пенициллина отдалила на десятилетие его внедрение в медицинскую практику. Используемые в настоящее время методы и последовательность операций выделения и очистки разрабатываются применительно к конкретному антибиотику и определяются его физико-химическими свойствами: локализацией, составом культуральной жидкости, ее реологическими и другими характеристиками.

На стадии предварительной обработки культуральной жидкости отделяют растворенный антибиотик от суспензии мицелия и компонентов культуральной жидкости, находящихся в коллоидном состоянии. Если часть антибиотика находится в мицелии, его переводят в водную фазу, например, изменяя рН культуральной жидкости (в случае тетрациклинов). Иногда, наоборот, растворенный и связанный с мицелием антибиотик объединяют в общем осадке, из которого антибиотик затем экстрагируют. Отделяют нативный раствор от мицелия и коллоидных частиц методами фильтрации или центрифугирования, для чего используют барабанные вакуум-фильтры, фильтр-прессы, сепараторы разных конструкций и т.д.

На следующей стадии ставится задача получения антибиотика в виде индивидуального вещества. При этом необходимо учитывать довольно высокую лабильность многих антибиотиков, что ограничивает условия их выделения.

Принцип экстракции органическим растворителем используется при очистке таких важнейших антибиотиков, как пенициллин, эритромицин и некоторых других. При переходе в органический растворитель соответствующие антибиотики освобождаются сразу от многих примесей. Варьируя рН и меняя таким образом растворимость антибиотика в воде (точнее, в буферном растворе), можно многократно переводить антибиотик из одной фазы в другую, освобождаясь каждый раз от определенного количества примесей.

Один из примеров окончания процесса при экстракционном методе выделения и очистки — извлечение пенициллина из органического растворителя бутилацетата, где он находится в виде свободной кислоты: к бутилацетату добавляют насыщенный водный раствор ацетата калия. Выпадает калиевая соль пенициллина. Кристаллы промывают бутанолом и высушивают.

Также при очистке антибиотиков широко используются ионообменные смолы (катиониты и аниониты). Особое значение эти сорбционные методы сыграли в свое время в решении проблемы получения в высокоочищенном виде аминогликозидных антибиотиков - стрептомицина и других, имеющих свойства оснований. Аминогликозиды слаборастворимы в органических растворителях, и вследствие этого экстракционный метод применительно к ним не может быть использован. В производстве стрептомицина могут быть, например, успешно использованы карбоксильные катиониты в натриевой форме. Десорбция осуществляется раствором серной кислоты. После дополнительной процедуры, связанной с пропусканием стрептомицина через сульфокатионит (для удаления ионов натрия), получают сульфат стрептомицина.

Помимо традиционных экстракционных и сорбционных методов при выделении и очистке антибиотиков все большее значение приобретает комплекс приемов, объединяемых под названием мембранной технологии.

При обезвоживании препаратов антибиотиков в зависимости от свойств антибиотика используют лиофильную или распылительную сушку. В последнем случае раствор антибиотика распыляется из форсунок до частиц диаметром 5 - 25 мкм в токе нагретого до 160 °С воздуха. Сушка происходит в течение долей секунды. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность.

Так как биосинтез антибиотиков ведется в асептических условиях, то при выделении, очистке и получении лекарственных форм также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации. Тем не менее проблема стерильности инъекционных препаратов и обсемененности препаратов для наружного применения остается одной из самых сложных для производства как антибиотиков, так и лекарственных средств в целом.

Поэтому при обнаружении расфасованных, нестерильных серий препаратов иногда применяют метод радиационной стерилизации, учитывая нестандартность сложившейся ситуации. Определенные виды ионизирующей радиации допустимы для стерилизации лекарственных средств. Соответствующие указания имеются в официальных фармакопейных документах.

Хорошо известно, что ионизирующей радиацией стерилизуются хирургические инструменты, резиновые перчатки, шприцы одноразового пользования и т.п. Следует подчеркнуть, что при такой стерилизации (в минимальных дозах) загрязняющие препарат микроорганизмы теряют способность к размножению и гибнут вследствие повреждения ДНК (происходят сшивки между нуклеотидами, а также разрывы ДНК). При термической стерилизации в отличие от радиационной происходит денатурация многих белков клетки, в результате чего ее повреждения становятся более многочисленными;

при стерилизации путем мембранной фильтрации микробные клетки не погибают, а удаляются из лекарственного препарата.

Как уже отмечалось, радиационная или лучевая (жаргонный термин) стерилизация используется на отдельных производствах ввиду объективных трудностей при внедрении технологии получения нового препарата, а иногда и по экономическим причинам.

Установлено, что стерилизующая доза ионизирующего облучения составляет 2,5 Мрад (1 рад = 100 эрг/г).

Специалист с высшим фармацевтическим образованием должен занимать четкую и грамотную позицию в отношении бытующей радиофобии, выражающейся в том, что радиационная стерилизация может якобы привести к наведенной радиоактивности облученных препаратов. Разрешенные для стерилизации лекарств гамма-лучи изотопа кобальта (60Со) и быстрые электроны с энергией не выше 5 МэВ, получаемые на ускорителях, не могут вызвать наведенной радиации у обработанных ими препаратов независимо от поглощенной дозы облучения, так как неспособны расщепить атомное ядро.

Гамма-лучи (60Со) в воздухе распространяются на несколько десятков метров, в воде - на несколько десятков сантиметров, в свинце - на несколько сантиметров. На промышленной установке защитный слой воды, окружающий герметичную стерилизационную камеру, где находятся стандартные стержни с ^Со длиной до 1 м и упаковки со стерилизуемым лекарственным препаратом, должен составлять несколько метров. Стерилизацион-ная камера снабжена автоматизированным дистанционным управлением, позволяющим вдвигать в нее и удалять из нее стержни с кобальтом, разъединяя таким образом источник облучения и упаковки со стерилизуемым препаратом. Режим стерилизации обычно подбирается с таким расчетом, чтобы стерилизующая доза (2,5 Мрад) набиралась облучаемым препаратом примерно за сутки. При этом следует иметь в виду, что период полураспада 60Со составляет около пяти лет. Естественно, что работа на установках с радиоактивным кобальтом постоянно требует особых мер предосторожности.

Установка, где для стерилизации используются быстрые электроны, во многом принципиально отличается от рассмотренной. Проникающая способность электронов, разогнанных до разрешаемого для стерилизации лекарств показателя, невелика. Электроны не могут «пронизать» несколько рядов флаконов или ампул. Чтобы набрать стерилизующую дозу в 2,5 Мрад, требуются секунды или доли секунд. Поэтому флаконы подают по одному с помощью транспортера к соответствующему «окошку», через которое в них набирается стерилизующая доза. После выключения такая стерилизационная установка становится абсолютно безопасной в радиационном отношении.

Значительный опыт по использованию радиационной стерилизации биотехнологических препаратов накоплен при обработке антибиотиков: стерилизации подвергались расфасованные по флаконам лиофильно высушенные субстанции, соли антибиотиков и их препараты с разными наполнителями.

В ряде случаев препараты искусственно заражали микроорганизмами разных видов и их спорами. Стерилизующая доза в 2,5 Мрад обусловливала гарантированную стерильность. При этом облученные препараты — большинство антибиотиков (природные и полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины и ряд других) сохраняли активность и удовлетворяли фармакопейным тестам. Исключение составляли полиены, т.е. структуры с сопряженными двойными связями (например, нистатин, который при облучении заметно терял активность).

При сравнении их с необлученными препаратами можно было выявить некоторые отличия: белые (бесцветные) порошки теряли «блестящий» оттенок, приобретая матовый, а порошки красного (актиномицины) и желтого (тетрациклины) цвета тускнели.

Под влиянием облучения изменяется и кристаллическая решетка стекла. Оно темнеет, мутнеет и приобретает, таким образом, непривлекательный с коммерческой точки зрения вид, хотя полностью сохраняет свои функциональные качества. Потемнение обратимо, но при комнатной температуре исчезает медленно (в течение нескольких месяцев). Не выпускать облученные препараты в течение такого срока в аптечную сеть — значит сократить для потребителя срок годности облученных серий. Теоретически для изготовления флаконов и ампул можно использовать стекло с некоторыми редкоземельными элементами, однако это стекло слишком дорого для изготовления из него сотен миллионов единиц стандартных изделий.

–  –  –

1) Продуценты антибиотиков, их морфология.

2) Биотехнологические аспекты получения антибиотиков.

3) Механизмы биосинтеза антибиотиков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Биотехнология: Учебник / А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В.

Тихонов, С.А. Гринь, В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.И. Еремец, А.А. Раевский, И.Л.

Беро, Ф.Я. Дадасян / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М., 2013. – 746 с.

Дополнительная

1. Биотехнология: теория и практика: Учеб. пособие для вузов / Н.В. Загоскина, Л.В.

Назаренко, Е.А. Калашникова, Е.А. Живухина / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. – М.: Издательство Оникс, 2009. – 496 с.

2. Блинов, В.А. Общая биотехнология / В.А. Блинов. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2003. – 162с.

3. Блинов, В.А. Биотехнология (некоторые проблемы сельскохозяйственной биотехнологии) / В. А. Блинов. – Саратов: Полиграфия Поволжья, 2003. – 196 с.

4. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов. – Саратов: Гарнитура Таймс, 2008. – 102 с.

5. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа:

http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv

6. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина, Т.А. Егорова, С.М. Клунова. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 506 с.

7. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. Учебное пособие для студентов биологического факультета / Н.А. Кузьмина. – Омск: Электронное издание, 2010.

8. Орехов, С.Н. Биотехнология: учебное пособие / С.Н. Орехов, Ю.О. Сазыкин, И.И.

Чакалева. – М.: Электронное издание, 2006.

9. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Издательский центр “Академия”, 2008. – 256 с.

–  –  –

Витамины - это низкомолекулярные органические вещества, способные в очень низких концентрациях оказывать сильное и разнообразное действие. Природным источником многих витаминов являются растения и микроорганизмы. В настоящее время в производстве многих витаминов ведущие позиции принадлежат химическому синтезу, однако при производстве отдельных витаминов микробный синтез имеет огромное значение, например при производстве кормовых препаратов витаминов. Отдельные витамины, кобаламины, менахиноны продуцируются только микробными клетками. Витамины принимают активное участие во многих процессах метаболизма человека и высших животных (процессы цикла трикарбоновых кислот, распад и синтез жирных кислот, синтез аминокислот и др.), оказывая влияние на разнообразные физиологические процессы.

Микробиологическим путем получают некоторые витамины группы B, а также эргостерин и каротин, являющиеся, соответственно, предшественниками витаминов D2 и провитамина A.

10.2. Получение витамина В12 Витамин В12 - (а-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин - полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов. Микробиологический синтез является единственным способом получения данного витамина. Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В12 Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры матанообразующих бактерий. Получение витамина на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В 12), осуществляется в две стадии в двух последовательных аппаратах объемом 500 л при коэффициенте заполнения 0.65-0.70. Первую стадию культивирования проводят в течение 80 ч и слабом перемешивании в анаэробных условиях до полной утилизации сахара; полученную биомассу центрифугируют. Сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение 88 ч, аэрируя культуру воздухом (2 м3/ч). Среда содержит сахара (обычно глюкозу 1-10 %), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10-100 мг/л), кукурузный экстракт (3-7 %). В качестве источника азота принят (NH4)2SO4. Ферментацию проводят при 30°С, рН стабилизируют на уровне 6.5-7.0 подтитровкой культуры раствором (NH)4OH. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения ферментации витамин экстрагируют из клеток, нагреванием в течение 10-30 минут при 80-120°С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом происходит образование CN-кобаламина; продукт сорбируют, пропуская раствор через активированный уголь и окислы алюминия; затем элюируют водным спиртом или хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин. Выход В12 составляет до 40 мг/л.

Активными продуцентами В12 являются бактерии рода Pseudomonas. Разработаны эффективные технологии на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, в течение 18 ч при 65-75°С в нестерильных условиях. Выход витамина составляет от 2.0 до 6.0 мг/л. Бактерии выращивают на богатых средах, приготовленных на основе соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Продукция В12 для медицины составляет около 12 т/г; форма выпуска - стерильный раствор на основе 0.95-го раствора NaCl и таблетки витамина в смеси с фолиевой кислотой или другими витаминами. Для нужд животноводства витамин В12 получают на основе смешанной ассоциации термофильных метаногенных бактерий. Ассоциация состоит из 4-х культур, взаимосвязано расщепляющих органический субстрат до СО2 и СН4: углеводосбраживающих, аммонифицирующих, сульфатвосстанавливающих и собственно метанобразующих бактерий. В качестве субстрата используют декантированную ацетонобутиловую барду, содержащую 2.0-2.5 % сухих веществ. Брожение проходит при 55-57°С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй - метан, углекислота и витамин В12. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2.5-3.5 суток, в двух последовательных - 2-2.5 суток. Концентрация витамина в бражке достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах, до 20 м3/м3 образуется газ (65 % метана и 30 % углекислоты). Бражка имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20 % содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В12 в сухом препарате - до 100 мкг/г.

10.3. Получение витамина В2

Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита. Широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами, бактериями. Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его в составе комбикормов. При дефиците рибофлавина в организме нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний, а в животноводстве - в качестве добавки в корма. Микроорганизмы синтезируют рибофлавин и две его коферментные формы ФАД и ФМН. Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые грибы (Aspergillus niger).

Промышленное получение рибофлавина осуществляется химическим синтезом, микробиологическим и комбинированным: при этом синтезированная микроорганизмами рибоза химически трансформируется в В2.

Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе гриба Aspergillus. Для высоких выходов витамина (до 7 г/л) используют усовершенствованные штаммы и оптимизированные среды, содержащие (в %): кукурузный экстракт пептон - 3.5, соевое масло -4.5 и стимуляторы (пептоны, глицин). Используют активный инокулят, которым засевают стерильную среду. Ферментацию проводят в течении 7 суток при 28°С и хорошей аэрации (0,3 м3/м3-мин.). Исходный рН составляет около 7.0, в ходе ферментации в связи с выделением кислот среда подкисляется до рН 4.0-4.5. После утилизации углеродного субстрата продуцент начинает утилизировать кислоты; рН повышается и после этого начинается образование витамина В2. При этом кристаллы рибофлавина накапливаются в гифах и вне мицелия. На постферметационной стадии для выделения витамина мицелий нагревают в течение 1 ч при 120°С.

В ряде стран для получения кормовых препаратов витамина В2 используют достаточно простой способ на основе микроскопического гриба Eremothecium ashbyii, который выращивают в глубинной культуре в течение 80-84 ч при 28-30°С на среде с глюкозой или мальтозой (2.5 %), источником азота в виде NH4NO3 и карбоксидом кальция (0.5 %). Выход рибофлавина составляет 1250 мкг/мл. Культуральная жидкость концентрируется в вакуумной выпарке до содержания сухих веществ 30-40 % и высушивается в распылительной сушилке. Товарная форма продукта - порошок с содержанием рибофлавина не менее 10 мг/г и 20 % сырого протеина, в препарате присутствуют никотиновая кислота и витамины В1, В3, В6 и В12. Полученный генно-инженерным методом штамм Bacillus subtilis образует за 35 суток ферментации до 4 г/л рибофлавина.

10.4. Получение эргостерина

Эргостерин - (эргоста-5,7,22-триен-3р-ол) – исходный продукт производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи, плесневые грибы.

Наиболее активные продуценты эргостерина - Saccharomyces, Rhodotoryla, Candida.

В промышленных масштабах эргостерин получают при культивировании дрожжей и мицелиальных грибов на средах с избытком сахаров при дефиците азота, высокой температуре и хорошей аэрации. Более интенсивно эргостерин образуют дрожжи рода Candida на средах с углеводородами. При получении кристаллического препарата витамина D2 культивируют плесневые грибы (Penicillium, Aspergillus). Для получения кормовых препаратов облучают суспензию или сухие дрожжи (Candida). Облучают тонкий слой 5 % суспензии дрожжей ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280-300 нм. Кормовые препараты дрожжей содержат в 1 г АСВ 5000 Е витамина D2 и не менее 46 % сырого белка. Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи или грибной мицелий подвергают, кислотному гидролизу при 110°С. Витамин экстрагируют спиртом, фильтруют, далее фильтрат упаривают, несколько раз промывают спиртом. Спиртовой экстракт сгущают до 50 % концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Полученные кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире. Кристаллический осадок растворяют в масле. Данный препарат используют в медицинских целях, эргостерин является также исходным продуктом для получения ряда стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.

–  –  –

1) Роль витаминов в организме человека.

2) Получение водорастворимых витаминов.

3) Получение жирорастворимых витаминов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Биотехнология: Учебник / А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В.

Тихонов, С.А. Гринь, В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.И. Еремец, А.А. Раевский, И.Л.

Беро, Ф.Я. Дадасян / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М., 2013. – 746 с.

Дополнительная

1. Биотехнология: теория и практика: Учеб. пособие для вузов / Н.В. Загоскина, Л.В.

Назаренко, Е.А. Калашникова, Е.А. Живухина / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. – М.: Издательство Оникс, 2009. – 496 с.

2. Блинов, В.А. Общая биотехнология / В.А. Блинов. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2003. – 162с.

3. Блинов, В.А. Биотехнология (некоторые проблемы сельскохозяйственной биотехнологии) / В. А. Блинов. – Саратов: Полиграфия Поволжья, 2003. – 196 с.

4. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов. – Саратов: Гарнитура Таймс, 2008. – 102 с.

5. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа:

http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv

6. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина, Т.А. Егорова, С.М. Клунова. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 506 с.

7. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. Учебное пособие для студентов биологического факультета / Н.А. Кузьмина. – Омск: Электронное издание, 2010.

8. Орехов, С.Н. Биотехнология: учебное пособие / С.Н. Орехов, Ю.О. Сазыкин, И.И.

Чакалева. – М.: Электронное издание, 2006.

9. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Издательский центр “Академия”, 2008. – 256 с.

Лекция 11

ПОЛУЧЕНИЕ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

–  –  –

Характерной особенностью клеток растений является способность к синтезу соединений так называемого вторичного метаболизма, к которым относятся терпеноиды, полифенолы, алкалоиды, стероиды и др. Они синтезируются, как правило, в меньших количествах, чем вещества основного первичного обмена, и, кроме того, не участвуют в нем.

Впервые термины «первичные соединения» и «вторичные соединения» ввел немецкий биолог А. Коссель (1891). В своей лекции «О химическом составе клеток», прочитанной для Берлинского общества физиологов, он говорил: «Предлагаю называть соединения, имеющие важность для каждой клетки, первичными, а соединения, не присутствующие в любой растительной клетке,- вторичными».

Долгое время считалось, что вторичные метаболиты отличаются от первичных тем, что они:

- распространены в ограниченном числе видов растений;

- являются «конечными» продуктами первичного обмена;

- не имеют значения для образующей их клетки, но могут быть необходимы для целого растения.

В настоящее время установлена важная роль вторичных метаболитов в жизни растений. Они обнаружены у 20-30 тыс. их видов, т. е. у 10-15 % всей флоры Земли. Установлена структура уже около 100 тыс. индивидуальных веществ. Выяснено участие 15генов растительных организмов в их вторичном метаболизме. Все это свидетельствует о том, что считать эти соединения синтезировании «случайно» - неправильно.

Ученые-биологи достаточно долго не уделяли должного внимания вторичным соединениям. Гораздо больше знали о них провизоры, фармацевты и криминалисты, поскольку лекарственные и ядовитые свойства растений чаще всего обусловлены этими соединениями.

Вторичные соединения придают также вкус и аромат растениям. От их присутствия зависят окраска цветков многообразие «расцветки» окружающего нас мира. Многие из вторичных соединений используются в качестве лекарствегнных препаратов, вкусовых и ароматических добавок для пищевой и парфюмерной промышленности.

Все это свидетельствует о важном народнохозяйственном значении вторичных соединений, они могут найти широкое применение в биотехнологическом производстве.

Рассмотрим основные классы вторичных соединений, синтезирующихся в клетках высших растений.

11.2. Терпены

Терпены (старое название - изопреноиды) – одни из наиболее распространенных в растениях вторичных веществ. Свое название получили от немецкого слови terpentin (скипидар), означающего смесь этих веществ.

К настоящему времени известно более 30 тыс. соединений данной группы вторичных метаболитов. Основным их структурным элементом является пятиуглеродное соединение – изопрен. Общая формула всех терпенов выражается как (С5Н8)n.

Все терпены подразделяют по единому структурному признаку - числу изопреновых единиц, входящих в состав их молекулы.

Среди терпенов встречаются также смешанные вещества, молекула которых состоит из терпеноидной и нетерпеноидной частей. Последняя может быть представлена тсграпирролом, как это характерно для хлорофилла и цитохрома, бензохиноном, что наблюдается в структуре убихинонов, а также аденином - в случае цитокининов. 1'акие соединения называют меротерпенами.

Большинство терпенов имеет название, отражающее тот растительный источник, откуда они были выделены впервые. Так, например, ментол впервые получили из растений мяты (Mehta), бетулапренолы - из листьев березы (Betula), авенастерин - из зерен овса (Avena).

Функции, выполняемые терпенами в клетках растений, чрезвычайно разнообразны.

Так, важную физиологическую активность проявляют такие их представители, как цитокинины, гиббереллины и абсцизовая кислота. Моно- и сесквитерпеноидам часто приписывают аллелопатическую роль. Аллелопатия - это вредное действие одного растения (донора) на другое (реципиент). Стеролы, локализованные в клеточных мембранах растений, по-видимому, выполняюттам такую же функцию, как холестерол в мембранах животных клеток. Существует предположение, что стеролы стабилизируют мембраны и контролируют их проницаемость. Каротиноиды защищают клетки от фотодинамического повреждения и, кроме того, участвуют в поглощении света при фотосинтезе. Смешанные терпеноиды также играют киючевую роль в обмене веществ у растений: хлорофилл, лишенный своей фитольной боковой цепи, не эффективен; пластохинон участвует в фотосинтетическом транспорте электронов, а убихинон - в митохондриальном транспортее электронов. Полипренилпирофосфаты участвуют в процессе гликозилирования при образовании клеточных стенок.

11.3. Полифенолы

Фенольные соединения, или полифенолы, являются вторыми по распространенности в растительном мире представителями вторичных соединений. Эти вещества, так же как и терпены, обнаружены не только во всех растениях, но даже в каждой растительной клетке. В настоящее время число известных фенольных структур превышает девять тысяч.

Фенольные соединения содержат в своей молекуле бензольное ядро с одной или несколькими гидроксильными группами. Их классификация зависит от числа ароматических колец (одно или два), а также от количества присоединенных к ним атомов углерода.

Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом подразделяют на следующие классы:

- соединения С6-ряда - не содержат в своей структуре дополнительных атомов углерода. К ним относятся простые фенолы, представителями которых являются фенол (в малых количествах образующийся в хвое сосны), пирокатехин (найден в листьях тополя) и флороглюцин (чешуя лука);

- соединения С6~С1-ряда - имеют в своей структуре один дополнительный атом углерода. К ним относятся оксибензойные кислоты и их производные, которые часто называют фенольными кислотами или фенолокислотами, а также лишайниковые кислоты - специфические фенольные соединения, синтезируемые лишайниками;

- соединения С6~С2-ряда - соответствующие альдегиды и спирты оксибензойных кислот, в их структуре присутствует два дополнительных атома углерода;

- соединения С6-С3-ряда — имеют три дополнительных атома углерода и составляют наиболее многочисленную и важную группу веществ, часто называемых фенил- пропаноидами. К ним относятся оксикоричные (по международной номенклатуре- гидроксикоричные) кислоты, оксикоричные (гидроксикоричные) спирты, фенилпропены, а также кумарины, изокумарины и хромоны - соединения, у которых дополнительные атомы углерода замыкаются в конденсированное лактонное кольцо; некоторые фенилпропаноиды образуют димеры, т. е. соединения типа (С6-С3)2, которые называют лигнанами.

Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами подразделяют на:

- соединения С6~С1C6-ряда - имеют два ароматических кольца, соединенных мостиком из одного углеродного атома. К ним относятся бензофеноны и ксантоны;

- соединения С6-С2~С6-ряда - имеют два ароматических кольца, соединенных двумя атомами углерода. К ним относятся стильбены (два ароматических кольца соединяются цепочкой из двух атомов углерода) и антрахиноны (дин ароматических кольца соединяются двумя атомами углерода с образованием центрального конденсированного (трегьего кольца);

- соединения С6~С3~С6-ряда - имеют два ароматических кольца, соединенных тремя атомами углерода. Наиболее многочисленная группа фенольных соединений, представленная прежде всего флавоноидами, которые, в свою очередь, включают целый ряд подгрупп, в зависимости от степени окисления трехуглеродного кислородсодержащего (пиранового) кольца. К ним относятся флавоны, антоцианы, флавононы, флавонолы, изофлавоноиды и неофлавоноиды.

В особые группы выделяют димерные и полимерные фенольные соединения. Это дубильные вещества (таннины) и лигнин. Термин «таннины» был впервые использован для описания веществ, которые превращали сырые животные шкуры в кожу в процессе дубления (tannin). Связываясь с белками коллагена шкуры животных, таннины повышают устойчивость получаемой кожи к жаре, воде и микроорганизмам.

Наиболее распространенным полимером фенольных соединений в растениях является лигнин. В его образовании принимают участие три оксикоричных спирта: конифериловый, пара-кумаровый и синаповый. В результате биохимических превращений они и образуют лигнин, который представляет собой сильно разветвленный полимер.

Для фенольных соединений характерно формирование огромного числа соединений за счет модификаций молекулы и образования конъюгатов с разнообразными структурами. Это может происходить за счет различного замещения в бензольных кольцах (к которым в различных положениях могут присоединяться группы -ОН, ОСН3), способности образовывать гликозиды с широким набором моно- и дисаха- ридов, а также наличия асимметричных атомов углерода. Фенольныее соединения могут также связываться с органическими кислотами, растительными аминами, алкалоидами, Помимо этого, растительные фенолы взаимодействуют с изопреноидами, образуя большую группу пренилированных фенолов. Такие свойства фенольных соединений обеспечивают огромное разнообразие структур, характерное для растительныхых фенолов.

Фенольные соединения играют важную роль в самых различных физиологических процессах - фотосинтезе, дыхании, росте и защитных реакциях растительного организми. Кроме того, они выполняют механические и структурные функции (лигнин), а также являются аттрактантами для насекомых-опылителей и животных - распространители семян. Многие представители фенольных соединений обусловливают вкусовые качества растений. Особенно часто это отмечается для флавоноидов. Например. флавонон нарингенин придает горький вкус кожуре грейпфрута, тогда как другой флавонин - гесперидин, обнаруженный в кожуре апельсина и мандарина, таких свойств не проявлял.

Во многих плодах (яблоки, груши, вишня, айва, персики, абрикосы) и ягодах (ежевика, земляника, брусника, смородина, малина, виноград) содержатся катехины, также относящиеся к соединениям флавоноидной природы. Наибольшее их содержание было отмечено в молодых побегах чайного растения (до 30 % на сухой вес). Катехины широко применяют в производстве какао, виноделии и особенно в чайной промышленности.

Это связано с тем, что продукты окисления катехинов обладают характерной окраской и приятным слабовяжущим вкусом. Кроме того, они проявляют Р-витаминную активность. Часто в растениях ветр чается рамноглюкозид кверцетина - рутин, используемый в медицине как капилляроукрепляющее средство.

У 200 природных флавоноидных веществ выявлено 40 видов биологического действия. В основном оно связано с их антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, а также влиянием на ферментные системы. Благодаря такой разнообразной активности флавоноидсодержащие растения служат сырьем для производства препаратов желчегонного, противоязвенного, капилляроукрепляющего, гипотомического действия. Флавоноиды применяют как антимутагены, противоопухолевые и антиаллергические препараты. Так, препарат ревенол, получаемый из коры приморской сосны, виноградных зерен и куркумы, обладает антиоксидантной активностью, в 50 раз превышающей таковую у -токоферола. Разработанный на основе экстракта виноградных косточек французский препарат эндотелон используют для лечения онкологических заболеваний.

11.4. Алкалоиды Алкалоиды представляют собой большую группу азотсодержащих вторичных веществ, найденных у 20 % видов сосудистых растений.

Термин «алкалоид» введен в 1819 г. немецким фармакологом В. Майсснером. Чтобы особая группа азотсодержащих веществ с щелочными свойствами не была классифицирована как щелочи (alcali), он предложил назвать её алкалоидами. Название происходит от арабского слова alkali – щелочь и греческого eidos - подобный.

Алкалоиды содержат азот, чаще всего в составе гетероциклического кольца. В настоящее время известно около 10 тыс. индивидуальных веществ.

Согласно химической классификации, алкалоиды - это соединения, содержащие один или несколько атомов азота в молекуле, что и придает им щелочные свойства.

Обычно их подразделяют на две подгруппы: протоалкалоиды, которые содержат азот не в гетероцикле, и истинные алкалоиды, содержащие азот в гетероцикле.

Биохимическая классификация алкалоидов основана на их метаболизме. Гликоалкалоиды, а также ряд других алкалоидов (например, алкалоиды аконита) по типу синтеза и структуре фактически являются изопреноидами, поэтому было решено выделить их в особую группу - изопреноидных псевдоалкалоидов. В связи с этим сейчас принято подразделять алкалоиды на три подгруппы: протоалкалоиды (азот не в гетероцикле); истинные алкалоиды (азот в составе гетероцикла; псевдоалкалоиды (синтез не из аминокислот). Каждая подгруппа, в свою очередь, подразделяется на 3-10 классов.

Наиболее широко алкалоиды распространены среди покрытосеменных растений.

Особенно богаты ими семейства маковых, пасленовых, бобовых, кутровых, мареновых, лютиковых. Во мхах, папоротниках и голосеменных алкалоиды встречаются относительно редко. Разные органы и ткани растения могут содержать разные алкалоиды.

Обычно их концентрация невелика и составляет десятые и сотые доли процента. При содержании алкалоидов около 1-3 % растение считается богатым этими соединениями (алкалоидоносным). Только немногие растения, например культивируемые формы хинного дерева, могут накапливать до 15- % алкалоидов.

Алкалоиды могут оказывать токсическое действие на человека. Однако их малые дозы используют в качестве эффективных фармакологических препаратов (морфин, кодеин, эфедрин, атропин). Некоторые алкалоиды (никотин, кофеин) применяют как стимуляторы или седативные средства.

11.5. Гликозиды Цианогенные гликозиды и глюкозинолаты также являются азотсодержащими веществами. Их иногда называют прототоксинами или фитоантисипинами. Они принимают непосредственное участие в защите растений от травоядных животных. При гидролизе цианогенных гликозидов специфичной гликозидазой выделяется синильная кислота.

Цианогенные гликозиды широко распространены в растительном царстве и часто встречаются у представителей бобовых, розоцветных и некоторых злаков. Их много также в крахмалистых клубнях маниока Manihot esculenta. Это важный пищевой продукт в ряде тропических стран. Клубни и мука маниока - обычная пища для аборигенов, которые научились в процессе приготовления избавляться от токсичных соединений.

Вторая важная группа растительных прототоксинов - глюкозинолаты - впервые была выявлена у растений семейства крестоцветных Cruciferae. В растении глюкозинолаты, так же как и цианогенные гликозиды, пространственно отделены от гидролизующих их ферментов. При повреждении растительных тканей происходит смешивание глюко зинолатов с соответствующими ферментами и превращение их в летучие токсичные вещества с горчичным запахом - изотиоцианаты и нитрилы. Образующиеся веществафункционируют как токсины и репелленты для травоядных животных. Большинство исследований, посвященных глюкозинолатам, выполнено на рапсе Brassica napus, коюрый служит важным источником для получения пищевого растительного масла в Северной Америке и Европе. Одна из основных задач селекционеров состоит в получении семян рапса| рапса с резко сниженным содержанием глюкозинолатов.

Таким образом, в растениях синтезируются различиие соединения вторичного метаболизма. Их группы находятся в растении в динамическом состоянии, а содержание меняется от органа к органу в ходе онтогенеза. Поэтому, с одной стоороны, при проведении скрининга желательно собрать ка можно больше образцов разных частей растенийна разных фазах развития, а с другой - при интерпретации полученных данных необходимо сравнивать данные о содержании изучаемого соединения в сходных частях растений, отобранных на одной и той же фазе развития. Очевидно, что данные о динамике содержания вторичных метаболитов представляют непосредственный интерес при | проведении хемотаксономических исследований.

Поскольку многие из вторичных метаболитов обладают высокой биологической активностью, они находят широкое практическое применение. И в этом плане перспективным источником их получения могут быть каллусные и суспензионные культуры высших растений.

–  –  –

1) Какие соединения относят к вторичным метаболитам?

2) Терпены, их структура и функции.

3) Перечислите основные классы фенольных соединений.

4) Перечислите основные группы алкалоидов.

5) Цианогенные гликозиды, их распространение и роль.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Биотехнология: Учебник / А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В.

Тихонов, С.А. Гринь, В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.И. Еремец, А.А. Раевский, И.Л.

Беро, Ф.Я. Дадасян / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М., 2013. – 746 с.

Дополнительная

1. Биотехнология: теория и практика: Учеб. пособие для вузов / Н.В. Загоскина, Л.В.

Назаренко, Е.А. Калашникова, Е.А. Живухина / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. – М.: Издательство Оникс, 2009. – 496 с.

2. Блинов, В.А. Общая биотехнология / В.А. Блинов. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2003. – 162с.

3. Блинов, В.А. Биотехнология (некоторые проблемы сельскохозяйственной биотехнологии) / В. А. Блинов. – Саратов: Полиграфия Поволжья, 2003. – 196 с.

4. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов. – Саратов: Гарнитура Таймс, 2008. – 102 с.

5. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа:

http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv

6. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина, Т.А. Егорова, С.М. Клунова. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 506 с.

7. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. Учебное пособие для студентов биологического факультета / Н.А. Кузьмина. – Омск: Электронное издание, 2010.

8. Орехов, С.Н. Биотехнология: учебное пособие / С.Н. Орехов, Ю.О. Сазыкин, И.И.

Чакалева. – М.: Электронное издание, 2006.

9. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Издательский центр “Академия”, 2008. – 256 с.

–  –  –

Термин лектин был впервые предложен У. Бойдом в 60-х годах прошлого столетия. Лектин от латинского слова “legere” (выбирать), т.е. способность избирательно связываться с теми или иными углеводными рецепторами клеток. Лектины – это белки, не относящиеся к классу иммунноглобулинов, способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов (от лат. “ligo” – связываю; в химии молекулы или ионы, принимающие участие в связывании). Первый лектин был выделен из клещевины (Ricinus communis) д-ром Германом Петером Штильмарком (1888 г.) в Дерпском университете (университет Российской империи конца позапрошлого века) и назван рицином. Г. В настоящее время растительные лектины найдены более чем у 800 видов растений в семенах листьях и др. частях.

Микробные лектины (агглютинины, адгезины, преципитины, некоторые микробные токсины и ферменты, белковые факторы, фимбрии) исследованы у более 130 видов (вирусы, бактерии, простейшие, грибы, причем у 100 видов изучена моносахаридная специфичность). Бактериальные лектины в настоящее время получены и изучены у представителей более 70 видов. Первая работа по обнаружению бактериальных лектинов (гемагглютининов) некоторых видов стафилококка и Vibrio относится к 1902 г.

(Kraus, Ludwig). И лишь спустя десятки лет из этих бактерий были выделены и охарактеризованы различные лектины. Лектины найдены в различных тканях человека и млекопитающих (плаценте, гипофизе, поджелудочной железе, печени и т.д.). Т.е. лектины были обнаружены, выделены и охарактеризованы практически из всех живых организмов от вирусов до человека.

12.2. Классификация лектинов

Известны различные классификации лектинов в основе которых лежат следующие принципы:

1 – соотношение белка и углеводов в молекуле лектина, 2 – биологическая активность, 3 – происхождение, 4 – валентность и число субъединиц, 5 – домены (функциональные и структурные), 6 - антигенная специфичность, 7 – специфичность к моно- и дисахарам, 8 – специфичность к олисахаридам.

Существуют и другие классификации лектинов – по содержанию ионов металлов, S-S связей и т.д., однако наиболее важной является классификация по углеводной специфичности.

12.3. Роль лектинов в растениях Лектины могут принимать участие в регуляции деления клеток при прорастании, в том числе в процессе органогенеза, при котором из семян формируется растение;

лектины корневой системы выполняют роль защитников растений от болезнетворных микроорганизмов и низших грибов; лектины участвуют в углевод-белковом узнавании в системе азотфиксирующих систем (бактерия-растение).

12.4. Роль лектинов в организме животных

- Лектины – адгезины (лектины, находящиеся на поверхности бактерий и вирусов служат для того, чтобы избирательно связываться с клетками макро- и микроорганизмов и инфицировать их),

- исследование структуры клеточной поверхности (на поверхности мембраны расположены разнообразные углеводные рецепторы, их детекция специфическими лектинами – важный элемент в диагностике физиолого-биохимического состояния клетки),

- имея препараты с различной специфичностью, их можно использовать для исследования клеточной поверхности,

- эндогенные лектины могут менять функционирование в мембране ионных каналов т. о. воздействуют на серию метаболических реакций,

- способность лектинов взаимодействовать с ферментами или модуляторами ферментов в организме,

- лектины-ферменты (бифункциональные лектины),

- лектины являются митогенами, т.е. веществами, влияющими на циклы клеточного деления,

- лектины способны индуцировать синтез лимфоцитами разнообразных лимфокинов, биологически активных соединений, способных регулировать иммунологические реакции, рост клеток, миграцию макрофагов, цитотоксическое действие,

- лектины способны индуцировать образование интерферона Т-лимфоцитами, элиминировать из печени высших организмов гепатоциты и купферовские клетки, измененные в процессе старения,

- сигнальная роль лектинов,

- лектины семян бобовых (лейкоагглютинин фасоли) способны выступать в качестве пребиотика, повышающего накопление биомассы “полезных” микроорганизмов в кишечном тракте,

- лектины, поступающие с пищей можно рассматривать как структуры, способные модифицировать функции практически всех присутствующих в организме физиологически активных гликопептидов и др.

12.5. Получение и применение лектинов Для получения ряда лектинов из предварительно очищенных препаратов белков используют аффинные сорбенты. Возможен путь отбора мутантных клеток растительного, животного происхождения, и особенно, микроорганизмов по признаку максимального продуцирования в среду того или иного лектина, или группы лектинов. Перспективным является получение лектинов на основе протопластов растительных клеток

– продуцентов лектинов. Ряд наиболее важных в практическом отношении лектинов уже получают генно-инженерным путем (фитогемагглютинин (ФГА), лектин гороха (ЛГ), и др.).

Лектины выступают в качестве чувствительных биосенсоров, детектирующих определенные углеводные последовательности в олигосахаридах, которые являются специфическими лигандами в углевод-белковом взаимодействии. В последние годы лектины все шире находят применение в различных медико-биологических исследованиях. Рядом авторов отмечены противоопухолевый, митогенный, инсулиноподобный, антивирусный эффекты лектинов. Весьма перспективным является использование лектинов для диагностики онкопатологий, иммунодиагностики, заболеваний ЖКТ, мочеполовой системы, легких. Однако, в преобладающем большинстве проводимых исследований, в настоящее время используют лектины растительного происхождения. Изучение свойств и функций лектинов бактерий, и в частности непатогенных бактерий, открывает возможность использования их в качестве своеобразных структурных и функциональных зондов в изучении углеводсвязывающих рецепторов клеточных мембран, характер гликозилирования которых, как известно, играет важную роль в регуляции различных метаболических процессов в организме.

Лектины в биотехнологии.

1. Для диагностики тех или иных заболеваний.

2. Идентификации некоторых микроорганизмов.

3. Специфические реагенты, избирательно сорбирующие те или иные сложные вещества: гликопротеиды, гормоны, сиалопротеиды и т.д. (Т.е можно получить ценные вещества, используемые при лечении многих тяжелых заболеваний).

4. Создание нового поколения препаратов – своеобразных гибридов лектинов и антител для воздействия на те органы и ткани, где действие лектина полезно. Например, в Кёльне д-р Андрес Энгерт для лечения рака лимфатических узлов использовал рицин “сшитый” с антителами, избирательно доставляющими этот токсичный лектин к опухоли.

<

–  –  –

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Биотехнология: Учебник / А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В.

Тихонов, С.А. Гринь, В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.И. Еремец, А.А. Раевский, И.Л.

Беро, Ф.Я. Дадасян / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М., 2013. – 746 с.

Дополнительная

1. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов /В.М. Лахтин. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Биотехнология.- М., 1987. –Т.2. – 288 с.

2. Луцик М.Д. Лектины / М.Д. Луцик, Е.Н. Панасюк, А.Д. Луцик. – Львов: Вища школа, 1981. – 156 с.

3. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / под ред. В.В. Игнатова. – М.: Наука, 2005. –262 с.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Биотехнология: теория и практика: Учеб. пособие для вузов / Н.В. Загоскина, Л.В. Назаренко, Е.А. Калашникова, Е.А. Живухина / Под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В.

Назаренко. – М.: Издательство Оникс, 2009. – 496 с.

2. Биотехнология: Учебник / А.Я. Самуйленко, Ф.И. Василевич, Е.С. Воронин, И.В.

Тихонов, С.А. Гринь, В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.И. Еремец, А.А. Раевский, И.Л.

Беро, Ф.Я. Дадасян / Под ред. А.Я. Самуйленко. – М., 2013. – 746 с.

3. Блинов, В.А. Общая биотехнология / В.А. Блинов. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2003. – 162с.

4. Блинов, В.А. Биотехнология (некоторые проблемы сельскохозяйственной биотехнологии) / В. А. Блинов. – Саратов: Полиграфия Поволжья, 2003. – 196 с.

5. Блинов, В.А. Общая биотехнология. Курс лекций. Часть II. / В.А. Блинов. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2004. – 144с.

6. Блинов, В.А. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах / В.А. Блинов.

– Саратов: Гарнитура Таймс, 2008. – 102 с.

7. Волова, Т.Г. Биотехнология: электронное издание, ссылка доступа:

http://polnotext.ru/volova-t-g-biotechnologiya/volova-t-g-biotechnologiya-glava-2-promishlennayamikrobiologiya-protsessi-proizvodstva-poleznich-veschestv

8. Живухина, Е.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высших учебных заведений / Е.А. Живухина, Т.А. Егорова, С.М. Клунова. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 506 с.

9. Кузьмина, Н.А. Основы биотехнологии. Учебное пособие для студентов биологического факультета / Н.А. Кузьмина. – Омск: Электронное издание, 2010.

10. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов /В.М. Лахтин. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Биотехнология.- М., 1987. –Т.2. – 288 с.

11. Луцик М.Д. Лектины / М.Д. Луцик, Е.Н. Панасюк, А.Д. Луцик. – Львов: Вища школа, 1981. – 156 с.

12. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / под ред. В.В. Игнатова. – М.: Наука, 2005. –262 с.

13. Орехов, С.Н. Биотехнология: учебное пособие / С.Н. Орехов, Ю.О. Сазыкин, И.И. Чакалева. – М.: Электронное издание, 2006.

14. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева / Под ред. А.В. Катлинского. – М.: Издательский центр “Академия”, 2008. – 256 с.

СОДЕРЖАНИЕ

–  –  –



Pages:     | 1 ||

Похожие работы:

«Том 8, №2 (март апрель 2016) Интернет-журнал "НАУКОВЕДЕНИЕ" publishing@naukovedenie.ru http://naukovedenie.ru Интернет-журнал "Науковедение" ISSN 2223-5167 http://naukovedenie.ru/ Том 8, №2 (2016) http://naukovedenie.ru/index.php?p=vol8-2 URL статьи: http://naukovedenie.ru/PDF/28EVN216.pdf DOI: 10.15862/28EVN216 (http://dx.doi.org...»

«1 Содержание Б.1.Б.1 Иностранный язык..3 Б.1.Б.2 Философия..4 Б1.Б.3 История..5 Б.1.Б.4 Экономическая теория..6 Б.1.Б.5 Менеджмент Б.1.Б.6 Маркетинг..7 Б.1.Б.7Математика.. 8 Б.1.Б.8Информатика..9 Б.1.Б.9Химия..10 Б.1.Б.10Физика....»

«Планирование энергоэффективных траекторий полета стратосферного дирижабля-челнока многоуровневой транспортной системы МААТ В.Х. Пшихопов, В.А. Крухмалев Экологически безопасная и экономически эффективная транспортировка грузов...»

«Раздел 5. "Химические технологии. Безопасность жизнедеятельности" УДК 734.35 ГУТОРКА А.Д., 1НУГАИЕВА Е.В., 1ЧЕРНЫШЕВА А.А., 1СОЛУЯНОВА Ю.М. (Карагандинский государственный индустриальный университет, г. Темиртау, Казахстан) ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕФТЯНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ НА ПРИМЕРЕ ТОО "ТЕНГИЗШЕВРОЙЛ" Аннотация. В статье рассмотрен...»

«МЫСЯКИНА Ирина Сергеевна ЛИПИДЫ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, ДИМОРФИЗМЕ И АДАПТАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ 03.00.07 микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2009 Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии Учреждения Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н...»

«59 Biological Bulletin УДК 591.526:598.113.6 Ю. В. Кармышев1, А. Н. Ярыгин2 РЕПРОДУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ НАСТОЯЩИХ ЯЩЕРИЦ (LACERTIDAE) УКРАИНЫ 1Мелитопольский государственный педагогический униве...»

«Самаратрансавто-2000 Транспорт Складской девелопмент VOLVO&RENAULT сервисная станция 03.09.2015, Самара Самаратрансавто-2000 ИСТОРИЯ КОМПАНИИ Фирма ООО "СамараТрансАвто-2000" была основано в 1996 году как транспортно-экспедитор...»

«Авессалом Подводный Серия "Целительство" ЭКОЛОГИЯ ЕДОКА "Аквамарин" ББК 51.230 УДК 615.874.2 П44 Авессалом Подводный "Экология едока", Москва, "Аквамарин", 2013 г. – 134 с. Каковы тенденции современной диетологии? Как работает пищеварительная система? В чем вред бобовых, моло...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕ...»

«ДИСПАНСЕРИЗАЦИЯ ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ (КРАТКАЯ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ГРАЖДАН О ДИСПАНСЕРИЗАЦИИ И ПОРЯДКЕ ЕЕ ПРОХОЖДЕНИЯ) Диспансеризация проводится бесплатно по полису ОМС в поликлинике по месту жительства (прикрепления) в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 03.12.201...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 25 (64). 2012. № 4. С. 255-263. УДК 548.736+546.64+54.057 СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ КООРДИНАЦИО...»

«3.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS AGROECOLOGY АГРОЭКОЛОГИЯ Красноперова Е. А., Юлдашбаев Ю. А., Гала Krasnoperova E. A., Yuldashbaev Yu. A., Galatov A. N. тов А. Н. Методологические аспекты экологиза Metho...»

«УДК 332.05 А.Н. Казанская, Т.Н. Мясоедова, В.А. Гаджиева (Южный федеральный университет; e-mail: akazanskaya@sfedu.ru) ОЦЕНКА СОЦИАЛЬНО-ЭКОЛОГО-ЭКОНОМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ТЕРРИТОРИЙ КАК ИНСТРУМЕНТ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ МУНИЦИПАЛЬНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ Показано применение интегрального подхо...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт наук о Земле Кафедра физической географии и экол...»

«5.2013 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ЭКОНОМИКА И ФИНАНСЫ ECONOMY AND FINANCES Сафаров Ш. О. Пути совершенствования цено Safarov Sh. O. Ways to improve the price mecha вого механизма в сельском хозяйстве....»

«УДК 577.152.193 ВЭЖХ-АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ ПСЕВДОПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВ МЕТГЕМОГЛОБИНОМ Е.В. Бондарюк, В.В. Сенчук Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь Флавонолы – природные биологически активные полигидр...»

«ББК 66.75 М 55 Научный потенциал нового поколения: проекты, инновации, перспективы. Международная молодежная конференция, – Ноябрьск: Электронное издание, 2015.– 126 с. В сборник вошли материалы IV Международной молодежной конференции "Научный потенциал нового поколения: проекты, инновации, перспективы", проведенной Ноябрьским гум...»

«Медицина труда и экология человека 2017. №1 Сетевое издание ISSN 2411-3794 uniimtech.ru Медицина труда и экология человека 2017, №1 ISSN 2411-3794 Occupational health and human ecology 2017, №1 Учредитель Федеральное бюджетное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский инст...»

«УЗА-10М.В3 МИКРОПРОЦЕССОРНОЕ УСТРОЙСТВО ЗАЩИТЫ И АВТОМАТИКИ ПО ЧАСТОТЕ И НАПРЯЖЕНИЮ ПРИСОЕДИНЕНИЙ 6-110 КВ ТЕХНИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ И ИНСТРУКЦИЯ ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ ЕМВ.002.12.12.100. В3 ТО 2012г. Перед включением оперативного тока заземлить! При проверке сопротивления изоляции мегомметром заземление отключить! Наимен...»

«ЭЛЕКТРОННЫЙ УЧЕБНИК ПО ДИСЦИПЛИНЕ "ЭКОЛОГИЯ" Акиньшин А. А., Пащенко И. В., Луценко Е. В. Шлыков К. И., Закурдаев А. В. – студенты, Шамов Ю.А. – к.т.н. доцент Алтайский государственный технический университет (г.Барнаул) Программа является электронным учебным пособием к изуч...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Дисциплина Биология человека входит в базовую часть Б1.Б.6 образовательной программы бакалавриата по направлению 06.03.01 Биология Дисциплина реализуется на биологическом факультете кафедрой гуманитарных и естественно-научных д...»

«2 отдельных уровнях. Биологическая продуктивность экосистем (биогеоценозов). Взаимосвязь биологической продуктивности и экологической стабильности. Методы управления популяциями и экосистемами (биогеоценозами). Климат и воды. Изменения климата. Причины изменений климата. Изменения кли...»

«Special material. Land law; natural resources law; environmental law; agricultural law 191 УДК 349.6 Publishing House ANALITIKA RODIS ( analitikarodis@yandex.ru ) http://publishing-vak.ru/ О понятии и классификации видов экологического терроризма Алексеева Анна Павловна Кандидат юридических наук, доцент, п...»

«ISSN 1994-0351. Интернет-вестник ВолгГАСУ. Сер.: Политематическая. 2014. Вып. 2 (33). www.vestnik.vgasu.ru _ УДК 504.056 И. К. Яжлев МЕХАНИЗМ ГАРАНТИРОВАННОЙ ЛИКВИДАЦИИ НАКОПЛЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО УЩЕРБА...»

«ПРАВИТЕЛЬСТВО АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 16 октября 2006 г. N 360-П О КРАСНОЙ КНИГЕ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ И ВНЕСЕНИИ ИЗМЕНЕНИЙ В ПОСТАНОВЛЕНИЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ ОТ 13.06.2006 N 190-П В соответствии с Федеральными законами от 24.04.95 N 52-ФЗ О...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.