WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

«.00.14 - §¦ – 2011 _ НПЦ §АРМБИОТЕХНОЛОГИЯ¦ НАН РА ГНКО ПАРСАЕИМЕЙР АЛИ ХАССАНОВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВ ЭФЕДРЫ, ИХ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ...»

§¦

,

IN VITRO

.00.14 - §¦

– 2011

_________________________________________________________________________

НПЦ §АРМБИОТЕХНОЛОГИЯ¦ НАН РА ГНКО

ПАРСАЕИМЕЙР АЛИ ХАССАНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВ ЭФЕДРЫ, ИХ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В КУЛЬТУРЕ

IN VITRO И РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическиx наук по специальности 03.00.14 - §Биотеxнология¦ Ереван - 2011..

:

`.....

`.....

.....

` 2011. 25- 1400 «» - - 018 :

` 0056,.,. 14,./`(37410) 65 41 83:

«» Тема диссертации утверждена на заседании Ученого совета Института проблем гидропоники им.

Г. С. Давтяна НАН РА Научный руководитель: д.б.н. Э.Д. Саркисян Официальные оппоненты: д.б.н. Г. Г. Оганесян д.с.н. Г. Г. Саркисян Ведущая организация: Ереванский государственный университет Защита диссертации состоится 25 ноября 2011 г. в 1400 часов на заседании Специализированного совета 018 ВАК РА при НПЦ §Армбиотехнология¦ НАН РА.

Адрес: 0056, г. Ереван, ул. Гюрджяна 14, тел./факс (37410) 654183 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НПЦ §Армбиотехнология¦ НАН РА.

Автореферат разослан 25 октября 2011 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, к.б.н. Г.Е. Аветисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Потенциальная возможность изолированных клеток высших растений синтезировать полезные метаболиты была выявлена еще в 1950-ых годах. С того времени для широкомасштабной культивации клеток и продукции ими вторичных метаболитов была разработана техника создания культуры клеток. Очевидно, что будущее биотехнологии в этой области базируется на разработках технологий, позволяющих индуцировать генетические варианты, получать конкретные вторичные метаболиты в нужном количестве и создавать системы культур в соответствии с уникальными требованиями для роста клеток растений (Caretto et al, 2010). Ephedra (E.) происходит из рода голосеменных, единственного рода в семействе Ephedraceae и порядка Ephedrales, представленного в качестве лекарственного растения (Konar and Singh, 1979). По современным представлениям это удивительное растение используется во всем мире для решения многих медицинских проблем, начиная с простуды и простой лихорадки и заканчивая бронхиальной астмой и сенной лихорадкой. Компоненты этого растения, такие как протоалкалоиды (эфедрин, псевдоэфедрин), таннин, сапонины, флавоны, летучие масла были в круге интересов исследователей благодаря своей потенциальной ценности в фармацевтической области (De-Zhi et al, 2004).

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось: получить каллус из трех видов Ephedra (Ephedra procera Fisch et C. A. Mey, Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra pachyclada Boiss) в оптимальном диапазоне и найти единственно подходящий для его применения в суспензионной культуре метод, а также и исследовать вторичные метаболиты в in vitro культуре и определить оптимальные условия для ее роста и синтезирования вторичных метаболитов.

Основными задачами исследования были:

• получение каллуса и суспензионной культуры из E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada;





• изучение и определение роста каллуса в различном гормональном диапазоне;

• проведение сравнительного анализа антимикробныx и антиоксидантныx свойств вторичных метаболитов каллуса и материнского растения;

• проведение сравнительного анализа каллуса и материнского растения по содержанию в них общего фенола;

• определение влияния L-фенилаланина на продукцию эфедрина и псевдоэфедрина, в суспензионной культуре E. procera;

• роста клеток E. procera в суспензионной культуре и корреляции биосинтеза эфедрина и псевдоэфедрина с pH и параметрами роста под влиянием L-фенилаланина в различном диапазоне (2.5; 5.0; 7.5; 12.5 мМ);

• определение подходящего диапазона для применения L-фенилаланина в суспензионной культуре E. procera;

• определение содержания эфедрина и псевдоэфедрина в материнских растениях трех выбранных видов;

• создание калибровочной кривой в диапазоне 19-200 мкг/мл для определения концентрации эфедрина и псевдоэфедрина.

Научная новизна Впервые в Иране проведены следующие исследования:

изолированы культуры у видов Ephedra (E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada);

• установлено взаимосвязь между применяемыми фитогормонами и каллусной индукцией, • каллусной биомассой, синтезом эфедрина и псевдоэфедрина и накоплением хлорофилла;

• определена антимикробная активность каллуса и материнского растения против грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов;

• установлена антиоксидантная активность каллуса и материнского растения;

• установлено количество L-фенилаланина, способствующее синтезу эфедрина и псевдоэфедрина в суспензионной культуре E. procera.

Практическая ценность. Нами разработана подходящая среда для роста клеток Ephedra и продуцирования эфедрина и псевдоэфедрина. Наши анализы четко указывают на антимикробные и антиоксидантные свойства Ephedra (полученных клеточных культур и диких растений). Таким образом, в данной работе определены и представлены питательные среды, соответствующие для роста клеток E. procera и продуцирования ими эфедрина и псевдоэфедрина. С другой стороны, эта работа четко представляет практическое направление для промышленной деятельности с экономической значимостью, учитывая тот факт, что эфедрин и псевдоэфедрин, будучи вторичными метаболитами, не требуют особых затрат для своего продуцирования, имеют очень широкое применение в фармацевтической промышленности.

На защиту выносятся:

• результаты исследования изолированных культур Ephedra (E. procera, E. strobilacea, E.

pachyclada) и оптимизации их каллусных культур;

• сравнительный анализ эфедрина и псевдоэфедрина, синтезируемых под воздействием различных гормональных диапазонов для E. procera ;

• сравнительный анализ антимикробной и антиоксидантной активности каллуса и материнского растения в отношении грамположительных, грамотрицательных патогенных и непатогенных микроорганизмов и грибов;

• сравнительный анализ суспензионной культуры E. procera под влиянием L-фенилаланина;

• сравнительный анализ количеств эфедрина и псевдоэфедрина в материнском растении Ephedra (E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada).

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции ''Biopharma from Science to Industry'', Ереван, Армения, 17-20 мая, 2010; на XIX международном симпозиуме: ''Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Экология и здоровье'', Алушта, Украина, 12-19 сентября, 2010; на Международной конференции Государственного сельскохозяйственного университета, Ереван, Армения, 21-23 октября, 2010; на Научном Совете Научнопроизводственного центра “Армбиотеxнология” НАН РА 1-2 октября, 2010 и Института проблем гидропоники им Г. С. Давтяна НАН РА, Ереван, Армения в течение 2008гг.

Структура и объем работы. Настоящая диссертация изложена на 130 страницах печатного текста, и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части с материалами и методами, заключения, выводов и ссылок. Диссертация содержит 29 таблиц, 55 рисунков и 235 ссылок, включая выдержки первоисточников и приложения. Представлены резюме на армянском и английском языкаx.

Публикации.Основные результаты исследований, изложенные в данной диссертационной работе, опубликованные в 5 научных журналах.

Исследования проводились на следующих базах:

Институт проблем гидропоники имени Г.С.Давтяна НАН РА; Химический научноисследовательский центр медицинских и натуральных продуктов, Университета медицинских наук, Шираз, Иран.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В течение последних двух десятилетий благодаря технологиям культивирования клеток и тканей растений стало возможно их исследование в качестве заменительного источника для продукции полезных вторичных метаболитов (Vanisree et al, 2004).

Фактически, в культуре растительных клеток изолированные из целого растения или его отдельных частей клетки культивируются в соответствующих физиологических условиях с последующей экстракцией из них интересующего продукта. Последние разработки в области техники культивирования тканей растений и их переработка показывают обнадеживающие результаты для многократного улучшения продуктивности, применяя надежные средства, такие как культура тканей, генная инженерия и техника анализа с помощью аппаратур: ВЭЖХ, ГХ, масс-ЖХ..., используемые в данной научной области в последние десятилетия.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Подготовка образцов растений. 3 вида Ephedra: Ephedra procera Fisch et C. A. Mey, Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra pachyclada Boiss, были собраны с области N 29° 23' Е 53° 10'.

2.2. Индуцирование каллуса. Стебли растений были поверхностно простерилизованы в гипохлориде натрия (0.5%), содержащего также несколько капель Tween; междоузлия в 0.8 ± 0.2 см отделялись от донорского растения и снова поверхностно стерилизовывались в гипохлориде Na (0.25%), содержащего Tween 20. Опыт основывался на полностью рандомизированный дизайн (ПРД) и 25 эксплантах, полученных после обраоботки и мониторирования в течение нескольких дней. Стандартная питательная среда Murashinge and Skoog (MS), по 30 мл в каждой пробирке с различными стимулирующими рост растений регуляторами, такими как 1-нафтил-уксусная кислота (НУК) в качестве ауксина и 6-бензиламинопурин (БАП) и кинетин (Кин) в качестве цитокинов в следующем диапазоне: 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 мг/л, соответственно использовались для каллусной индукции вместе с 30 г/л сахарозы и 7 г/л агаром. pH среды подводился к 5.8 с помощью 1 N NaOH и 1N HCl до автоклавирования. После чего экспланты, проявляющие каллусную индукцию выдерживались под светом (2500 - 300 люкс) при температуре 24°C ± 2°C для тестирования.

Субкультуры проводились каждые 4 недели и продолжались до достижения каллусной стабильности. В итоге, после 4-ой субкультуры только лишь один гормональный диапазон выбирался для каждого из трех видов Ephedra базируясь на: частоту каллусной индукции, свежую массу после обработки, фенотипы, каллусную стабильность в среде и относительную частоту роста (ОЧР) при обработке. Другие образцы после 4-ой субкультуры выводились из эксперимента, и лишь образцы в диапазоне (мг/л): E. procera – НУК: 2.0, Кин: 1.0; E. strobilacea – НУК: 1.5, Кин: 1.0; E.

pachyclada – НУК: 2.0, Кин: 0.5 далее мониторировались, сохранялись, подвергались субкультированию и подготавливались для тестов. ОЧР определялась для отмеченных видов, применяя следующую формулу: ОЧР = 3(Wf 1/3 - Wi 1/3) / tf - ti, где Wi – начальная масса каллуса Wf – конечная масса каллуса (при tf), t – время, tf – ti = 28 дней субкультивационного периода.

2.3. Содержание каллусного алкалоида. Для анализа эфедрина и псевдоэфедрина применялись два метода: ТСХ – тонкослойная хроматография – для быстрого скрининга и конфирмации, и ВЭЖХ, стабилизированный с градиентным методом – для определения содержания эфедрина и псевдоэфедрина в полученных образцах.

2.3.1. Система ВЭЖХ. Аппарат ВЭЖХ фирмы Knauper (Германия), состоящий из смартсистемы К – 2600 UV детектора, K – 1001 насоса, K – 1500 органайзера растворителя, on-line дегазатора, динамичного смешивателя вместе с Eurosphere 100 – C 18, 5-м, 250 4 мм колонками был применен для полноценного анализа экспериментов. Более того, система элюции фосфатного градиента, описанная Sheu et al (2001) также использовалась, а данные представлялись в мкг/г сухого веса.

2.3.2. Тонкослойная xроматография. Этот метод, описанный O’Dowd et al (1993) был применен для анализа экстрактов для определения наличия эфедрина и псевдоэфедрина.

2.4. Определение содержания хлорофилла в E. procera каллусной культуре. Этот метод, описанный Lichtenthaler (1987) и Kouril (1999) применялся для определения содержания хлорофилла с помощью спектрофотометра модели UVIDEC – 660. В качестве образца использовалось 100 мг замороженно-высушенного каллуса.

2.5. Суспензионная культура в E. procera. Эксперимент основывался на полностью рандомизированном дизайне (ПРД) с пятью обработками (диапазон фенилаланина) и трех повторах в течение 16 дней.

2.5.1. Инициация суспензионной культуры. Стабильная клеточная линия была создана из каллуса: 5 г хрупкого каллуса было получено после 6-ой субкультуры при воздействии НУК – 2.0 мг/л, Кин – 1.0 мг/л и было помещено в 100 мл жидкой MS питательной среде с тем же гормональным диапазоном. Далее, адаптированные клетки получались на стационарной фазе на 10ый день, а пробирки с каллусом подвергались субкультивации с использованием той же самой среды каждые 12 дней с продолжительностью до 4-ого пассажа. Стационарная фаза определялась с помощью анализа роста клеток в среде с использованием клеточного объема (КО) и сухого веса. В итоге, клеточные линии в партии клеточных культур начинались с 5 г адаптированных клеток в MS стандартной среде с добавлением 30 г/л сахарозы и 2.0 мг/л НУК и 1.0 мг/л Кин.

2.5.2. Применение L-фенилаланина. Для проведения сравнительного анализа синтезирования эфедрина и псевдоэфедрина с контролем применялись различные концентрации Lфенилаланина (2.5; 5.0; 7.5 и 12.5 мМ) от компании Sigma-Aldrich для свежего веса, сухого веса и КО каллуса. Эксперимент проводился в 5-и обработках и 3-х повторах, после чего приостанавливался на 16-ый день.

2.5.3. Пачечный клеточный объем (КО). Этот метод применялся путем центрифугирования 5 мл клеточной суспензии при 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут, после чего образцы анализировались в градуированной центрифуге.

2.5.4. Измерения свежего и сухого веса. Свежий вес определялся при помощи фильтрации 10 мл раствора, взятого с каждой пробирки, через фильтровальную бумагу Millipore (диаметром в 42 мм), с последующим отсасыванием среды под ламинарным потоком воздуха и взвешиванием образцов. Вес сухого вещества определялся путем замораживания и высушивания в течение 24 часов при температуре – 45° (температура конденсатора) и под давлением 0,10 гектопаскаль (гПа), и последующего быстрого и глубокого замораживания при – 80°C. Соответственно, их данные выражали в г/л.

2.5.5. Жизнеспособность клеток. Жизнеспособность клеток определялась при помощи Флюоресцеин Диацетата (ФДА), приготовленного из 0.5% (В/О) в ацетоне и выдержанного при температуре 4°C (Widholme, 1972).

2.5.6. Определение pH. Определение pH проводилось в каждые 2 дня путем анализа 3 мл MS среды pH-метром (после предварительного определения свежего веса путем отделения среды от клеток с помощью аппарата Millipore).

2.5.7. Содержание алкалоида в клетках. 10 мг замороженно-высушенных клеток экстрагировались с помощью 2 мл смеси метанол-вода (5:5) ультразвуком при окружающей температуре в течение 15 минут. После центрифугирования (10 мин при 5400 оборотов в минуту) экстракты набирались в 10 мл объемную пробирку и заливались до конца объема экстракционным раствором. Все образцы перед применением профильтровались через 0.45 мкм нейлоновые мембранные фильтры (Sigma-Aldrich). В результате, 20 мкл вводилось в аппарат ВЭЖХ с использованием 100-C18, 5-м, 250-4 мм колонок. Методом, описанным Sheu et al. (2001), проводилось определение эфедрина и псевдоэфедрина.

2.5.8. Данные анализа для суспензионной культуры. Полученные окончательные данные 3-х образцов выражались средним значением ± стандартное отклонение (СО), тогда как анализ проводился последовательным образом каждые два дня вплоть до 16-ого дня. Корреляции обработок определялись с помощью компьютерной программы SAS с последующим установлением относительной линейной зависимости относительно роста клеток в течение 16 дней.

2.6. Подготовка экстрактов на предмет определения антимикробной, антиоксидантной активности, а также и на содержание общего фенола. Надземные части этих трех видов Ephedra высушивались при комнатной температуре (26 ± 3°C) в темном помещении, после чего столчены в порошок. Метанольные экстракты получались путем мацерации неочищенного порошка растения со смесью метанол-вода (90/10) и выдерживания в течение 2 дней в камере при температуре 26 ± 3°C в темноте. Каллус экстрагировался с метанолом в течение 48 часов. Полученные метанольные экстракты отбирались с каждой среды каллусной культуры, а растворитель выпаривался под вакуумом роторным испарителем (при температуре ниже 40°C).

2.6.1. Метод диск-диффузии для определения антимикробной активности.

В каждом тесте микроорганизмы культивировались при температуре 37°C в течение 16-24 часов и подготавливались к эквиваленту мутности согласно McFarland стандарту № 0.5. После чего суспензии засевались на тестовые чашки (питательный агар). Стерильные диски импрегнировались 0.5; 1.0; 2.0 и 4.0 мг экстракта каллуса диких растений и устанавливались на поверхности тестовой чашки. Далее диски положительного контроля с гентамицином, ампициллином и кетокенозолом (10 мкг/диск) для грамотрицательных, грамположительных бактерий и грибов, соответственно, сравнивались и с каллусом, и с экстрактами растений.

Тестируемыми микроорганизмами являлись: Escherichia coli (PTCC 1338), Bacillus subtilis (PTCC 1023), Staphylococcous aureus (PTCC 1112), Staphylococcous epidermis (PTCC 1114), Pseudomonas aeruginosa (PTCC 1074), Aspergillus nigra (PTCC 5010), Candida albicans (PTCC 5027), Klebsiella pneumoniae (PTCC 1031), Salmonella typhi (PTCC 1693), которые были получены из Persian Type Culture Collection (PTCC), Химического Научно-исследовательского Центра Медицинских и Натуральных Продуктов и Университета Медицинских Наук (Шираз, Иран).

2.7. Определение антиоксидантной активности. Определение антиоксидантной активности проводилось путем смешивания безводного ацетата Na (38 мМ) с дистиллированной водой с использованием FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) теста согласно методу, описанному Benzie и Strain (1996).

2.8. Определение содержания общего фенола. Тест Folin Ciocalteau (описанный Singeltonом и Rossi (1965) в 3-х разовом выполнении проводилось для определения общих фенольных соединений.

2.9. Статистический анализ и дизайн экспериментов для определения антимикробной, антиоксидантной активности и содержания общего фенола.

Все эксперименты проводились в полностью рандомизированном дизайне. Полученные экспериментальные данные выражались средним значением [(средняя величина ± стандартная ошибка (n = 3)]. Определена коррелляция вариантов (кв). Тесты повторялись трижды для точности и достоверности.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние фитогормонов на каллусную индукцию и клеточную биомассу Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra pachyclada Boiss и Ephedra procera Fisch et C. A. Mey 3.1.1. E. strobilacea. Данные, полученные относительно каллусной индукции E.

strobilacea представлены в таблице 3.1.1.1 и 3.1.1.2. Согласно результатам, частота индукции значительно увеличивалась по мере повышения уровня НУК наряду с применяемым диапазоном цитокинов. При этом никакой каллусной индукции при уровне НУК (0.5 мг/л) наряду с любым применяемым диапазоном Кин не наблюдалось, тогда как минимальная каллусная индукция наблюдалась при применении 1.0 мг/л НУК в качестве ауксина в данном растении.

Применение БАП в качестве цитокина наряду с НУК в принятых гормональных концентрациях имело значительное влияние на каллусную индукцию и параметры роста каллуса, хотя полученные данные относительно параметров каллусного роста указывают на сравнительно больший эффект при обработках с применением Кин-ов.

3.1.2. E. pachyclada. Данные относительно E. pachyclada представлены в таблице 3.1.2.1 и 3.1.2.2. Наибольший вес каллусной инициации (весом 17.42 ± 0. 39 мг/эксплант) достигался при обработке гормональным соотношением НУК : 2.0; Кин : 0.5 (мг/л). Примерное время, необходимое для каллусной инициации, определялось на 16-ый день на фоне выбранного гормонального диапазона в MS стандартной среде. После 4-ой субкультуры (весом 3.76 ± 0.27 г/эксплант) отмечалось для E. pachyclada каллусного свежего веса с определенной ОЧР в 0.13 ± 0.01 г/г/день.

Окончательные результаты указывают на то, что 44% эксплантов E. pachyclada индуцируют каллус при соотношении: НУК: 2.0; БАП: 1.0 (мг/л) в среде, а время каллусной индукции составляло 16 дней. Практически, согласно результатам, каллусная индукция в E. strobilacea была идентичной таковой в E. pachyclada, то есть она не наблюдалась при воздействии Кин или БАП, применяемых в качестве цитокинов в любых соотношениях при уровне НУК в 0.5 мг/л. Однако, она уже наблюдалась, когда уровень НУК повышался до 1.0 мг/л в среде, что приводило и к значительному повышению частоты индукции в наших опытах.

3.1.3. E. procera. На основе результатов мы заключили, что выбранный гормональный диапазон имеет значительное влияние на каллус в E. procera. А именно, частота каллусной индукции увеличивалась, а индукционное время укорачивалось значительным образом по мере увеличения НУК в качестве ауксина. Вероятно, имеется обратно-пропорциональная взаимосвязь между частотой индукции и временем индукции каллусной инициации с одной стороны и уровнем цитокинов с другой стороны. Следовательно, полученные данные указывают на то, что при обработке гормональным соотношением НУК : 2.0; Кин : 1.0 при 19.3 ± 0.8 мг/эксплант начальный свежий вес каллуса определялся в 6.65 ± 0.26 г (увеличение на 344%) после 112 дней с ОЧР, равной

0.23 г/г/день, что является наибольшим достижением среди других обработок. Количество свежего веса определялось в 2.42 ± 0.25 г (ОЧР = 0.086 г/г/день) при НУК : 2.0 мг/л и БАП : 1.0 мг/л, а наибольшее количество конечного свежего веса - при применении БАП в качестве цитокина после 42 дней достигалось гормональным диапазоном НУК : 1.0; БАП : 1.5 мг/л. При этом количество свежего веса в 2.628 ± 0.2 г (повышение на 243%) определялось с ОЧР в 0.093 ± 0.007 г/г/день и начальным весом в 10.8± 0.7 мг/эксплант.

3.2. Эффект фитогормонов на содержание эфедрина и псевдоэфедрина в E. procera. Полученные результаты показали, что минимальные количества эфедрина и псевдоэфедрина синтезировались при использовании БАП в качестве цитокина с дозировкой гормонов: НУК –2.0 и БАП – 0.5 мг/л, и количеств сухого веса: 37.4 ± 0.1 мкг/г и 274.2 ± 1.9 мкг/г для эфедрина и псевдоэфедрина, соответственно (рис. 3.2.3). Фактически, в наших анализах не было выявлено никаких концентраций ни эфедрина, ни псевдоэфедрина при использовании следующего гормонального диапазона: НУК – 1.0, БАП – 0.5 мг/л. Между тем, максимальные количества эфедрина и псевдоэфедрина определялись в случае НУК – 2.0, БАП – 1.0 мг/л обработки. При этом количества сухого веса в 83.9 ± 1.3 мкг/г и 466.2 ± 0.5 мкг/г были определены для эфедрина и псевдоэфедрина, соответственно (рис. 3.2.2).

Полученные нами данные указывают на значимые результаты относительно концентраций эфедрина и псевдоэфедрина в E. procera каллусе при воздействии НУК дозой в 1.5 мг/л вместе с БАП. Тогда как, их наибольшие количества определялись при БАП: 1,0 мг/л, 64.5 ± 1.5 мкг/г и 355.4 ± 0.3 мкг/г сухого веса для эфедрина и псевдоэфедрина, соответственно (рис. 3.2.3.). В итоге, максимальные количества эфедрина и псевдоэфедрина, среди всех вариантов обработки, определялись при НУК – 2.0 и Кин – 1.0 мг/л и количеств сухого веса в 108.1 ± 0.006 мкг/г и 730.3 ± 1 мкг/г для эфедрина и псевдоэфедрина, соответственно (рис. 3.2.6 и 3.2.7). Очевидно, что большинство вариантов обработок продукции эфедрина начиналась с малой интенсивностью, с последующим достижением своих максимальных значений, а после заканчивалась резким понижением выработки и достигала минимальных концентраций, когда соотношение цитокины/ауксин удваивалось более чем в половину. С другой стороны, минимальная продукция эфедрина наблюдалась при применении НУК – 1.5, Кин – 0.5 мг/л и количества сухого веса в 319.9 ±

0.5 мкг/г, хотя и как оказалось, особенных различий между НУК – 1.5, Кин: 0.5 и НУК: 1.0, Кин: 2.0 не наблюдалось.

–  –  –

1.0 1.0 1.0

–  –  –

1.0 1.0 0.5 0.5

–  –  –

1.5 1.0 0.5

–  –  –

Таблица 3.3.

1. Влияние различного гормонального диапазона в MS стандартной среде на биомассу клеток, содержание хлорофилла, эфедрина и псевдоэфедрина в E. procera.

–  –  –

74.5 ± 3.41 76.2 ± 2.90 74.5 ± 2.08 76.5 ± 1.29 53.2 ± 2.21 85.5 ± 30 83.0±2.58 80.2 ± 2.21 80.5 ± 2.08 57.2 ± 2.5 90.7 ± 2.98 83.0 ± 2.16 81.2 ± 2.5 82.2 ± 1.7 61.2 ± 2.5 Д 91.0 ± 2.58 85.5 ± 2.64 87.5 ± 2.08 87.2 ± 2.21 63.5 ± 1.82 95.2 ± 1.70 92.2 ± 1.25 90.7 ± 2.21 92.0 ± 1.63 66.0 ± 1.82 92.7 ± 2.21 94.5 ± 0.57 96.0 ± 0.81 96.0 ± 1.41 68.5 ± 1.29 82.5 ± 2.64 90.5 ± 1.29 93.0 ± 2.58 93.5 ± 1.29 60.0 ± 1.63 69.0 ± 2.58 80.2 ± 1.70 82.7± 2.21 82.5 ± 3.10 44.2 ± 1.70 Данные представлены средним значением 3-х образцов ± стандартное отклонение (CO).

3.5.Антимикробная актовность. Сравнительный анализ результатов при обработках для определения антимикробной активности представлены в таблице 3.5.1., где показана значительная антимикробная активность всех трех указанных видов Ephedra, причем по мере увеличения количества экстрактов (мг/диск) зоны ингибиции расширялись и становились хорошо обозримыми. Согласно тесту диск-диффузии метанольные экстракты диких растений проявляли антимикробную активность против выбранных микроорганизмов на всех применяемых уровнях, и их антимикробная активность значительно повышалась при их количестве в 4 мг/мл. Согласно результатам анализов экстрактов всех отмеченных видов (каллус или растение) вид E.strobilacea проявлял наибольшую антимикробную активность против Staphylococcous epidermidis (PTCC 1114), с зоной ингибиции в 15.3 ± 1.15 мм и индексом активности в 0.73 ± 0.5. В то же время, не было значительной разницы между видами Ephedra (в каллусных экстрактах) против Staphylococcous epideridis (PTCC 1114): все виды Ephedra имели зону ингибации в 10 ± 1 мм. Было выявлено также, что экстракты Ephedra оказывали влияние на рост Escherichia Coli (PTCC 1338), причем Ephedra strobilacea Bunge имела наибольшую зону ингибации в 15.6 ± 0.5 мм с индексом активности в 0.71 ± 0.002 (Таблица 3.5.1.).

Таблица 3.5.

1. Антимикробная активность эксетрактов дикого растения и каллусной культуры трех видов Ephedra, мг/мл

–  –  –

Примечание: Средняя величина n = 3 ± стандартная ошибка. ЗИРЭ: зона ингибации экстракта растения Ephedra (мм), включая диаметр диска (6 мм); ИАРЭ: индекс активности экстракта растения Ephedra = площадь ингибации тестового образца/площадь ингибации стандарта; ЗИКЭ: зона ингибации каллуса Ephedra (мм), включая диаметр диска (6 мм); ИАКЭ: индекс активности экстракта каллуса Ephedra = площадь ингибации тестового образца/площадь ингибации стандарта; Но: не определено; контроль - это стандарт в 10 мкг/диск, в котором гентамицин используется для грамотрицатекьных бактерий, ампициллин - для грамположительных бактерий, и кетаконазол - для грибов.

–  –  –

или же полностью приостанавливают процесс оксидации окисляемых субстратов. Антиоксидантный потенциал экстракта Ephedra, повидимому, связан с его водород-отдающей и металл-хелатирующей способностью, ровно как и с его эффективностью удалять пероксид водорода и свободные радикалы. Имеется достаточно исследований, демонстрирующих радикал-связывающие свойства фенольных соединений растения и подтверждающих их взаимосвязь с антиоксидантной активностью (Huang et al, 2005).

–  –  –

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований четко указывают на тот факт, что среди 3-х выбранных видов Ephedra, E. procera проявлял наибольшую частоту каллусной индукции или каллусного роста в выбранном для него гормональном диапазоне (оптимальный диапазон) в MS стандартной среде, а среди Кин и БАП, Кин был наиболее эффективным. Результаты также показали, что ни один эксплант не выживал в среде при содержании в ней НУК в концентрации 0,5 мг/л, и при этом ни Кин и ни БАП как цитокины не проявляли приоритетности. Согласно результатам, имеются значимые корреляции между повышением количества ауксина в среде и накоплением хлорофилла в E. procera. То есть по мере повышения уровня ауксина, количество общего хлорофилла значительно увеличивалось. Однако, наблюдалась обратно-пропорциональная взаимосвязь между диапазоном цитокинов и степенью накопления хлорофилла: количество хлорофилла уменьшалось с увеличением соотношения цитокин/ауксин. Более того, полученные нами данные показали, что с повышением количества цитокинов соотношение хлорофилл a/ хлорофилл b понижалось заметно, однако указанная обратнопропорциональная зависимость становилась очевидной, когда количества цитокинов превышали количество ауксина в применяемом диапазоне при применении Кин в качестве цитокина наряду с НУК.

К тому же количества хлорофилла были наибольшими с обработками с БАП. Практически гиперэкспрессия хлорофилла модулируется антисенесцентным эффектом цитокинов, синтезом 5аминолевулиновой кислоты (АЛК), являющейся необходимым соединением в биосинтезе целлюлозы и в степени ее накопления при различных обработках.

Результаты наших исследований показали, что выбранный гормональный диапазон имел значительное влияние на синтезирование эфедрина и псевдоэфедрина в E. procera: во всех обработках их накопление начиналось постепенно с низкой крутизной, далее доходило до своего максимального уровня, а в конце резко уменьшалось до минимального содержания, что имело место на фоне повышения соотношения цитокины/ауксин в более чем раза. К примеру, при уровне НУК : 2.

0 мг/л на фоне применяемого Кин эфедрин синтезировался в минимальных количествах при Кин : 0.5 мг/л и сухом весе в 47.4 ± 0.9 мкг/г, а максимальное его количество при Кин : 1.0 мг/л и сухом весе 108.1 ± 0.6 мкг/г. Вместе с тем количества эфедрина и псевдоэфедрина увеличивались в каллусе по мере повышения специализации клеток E. procera. Mey, что подтверждает гипотезу применения фитогормонов для продуцирования ценных вторичных метаболитов. Полученные данные относительно суспензионной культуры E. procera показали, что клеточные линии в контроле проходили лаг-фазу на 6ой день, и постепенно переходили в экспоненциальную фазу с 6-ого по 10-ый дни, однако с последующим постепенным понижением к 12-ому дню и переходом в стационарную фазу. А при применении L-фенилаланина рост клеточных линий повышался значительно в диапазоне 2.5; 5.0 и 7.5 (мМ) на 12-й день, но наименьший уровень роста отмечался при 12.5 мМ L-фенилаланина.

К тому же выбранный диапазон L-фенилаланина имел значительное воздействие и на жизнеспособность клеток:

пик жизнеспособности на фоне применяемых 2.5; 5.0 и 7.5 мМ обработок отмечался в пределах 94.5на 12-й день, что после постепенно уменьшалось к 14-ому дню. Результаты анализов указывают также на то, что накопление эфедрина и псевдоэфедрина повышалось в большой степени в процессе роста клеточной культуры, что находилось в строгой корреляции с циклом клеточного роста. Согласно данным отмечалась и высокая антимикробная активность всех 3-х выбранных видов Ephedra, проявляющаяся в увеличении зоны ингибации и степени обозримости по мере увеличения количества экстракта (мг/диск). Согласно тестам диск-диффузии метанольные экстракты диких растений проявляли антимикробную активность против выбранных микроорганизмов при всех применяемых уровнях, причем их антимикробная активность усиливалась при концентрации 4 мг/мл. Было очевидным, что E.

pachyclada имел наибольшую антимикробную активность против Bacillus subtillis (РТСС 1023) с зоной ингибации в 16 ± 2 мм и индексом активности 0.69 ± 0.061, тогда как зона ингибации для всех остальных видов составляла 10 мм при той же концентрации (4 мг/мл). В то же время, каллус E. procera не проявлял никакой антимикробной активности против Candida albicans, тогда как экстракты каллуса E.

strobilacea имели наибольшую зону ингибации среди всех остальных видов.Тем не менее, ясно, что наши каллусные экстракты обладали сравнительно меньшей антимикробной активностью, однако при повышении их концентрации (мг/диск) зона ингибации становилась намного заметнее.

Таким образом, среди всех видов Ephedra экстракт каллуса E. strobilacea проявил наибольшую антимикробную активность против большинства тестируемых микроорганизмов. Удивительным образом все метанольные экстракты каллусных культур проявляли антимикробную активность против грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa (PTCC 1074) даже будучи в минимально применяемой концентрации в 0,5 мг/мл.

По полученным нами результатам дикие растения и каллусы всех трех выбранных видов Ephedra обладали антимикробной активностью, несмотра на то, что каллус проявлял ее меньше, чем дикие растения. Следует также отметить, что среди всех видов Ephedra метанольный экстракт E. strobilacea проявлял наибольшую активность. Нашими тестами Folin Ciocalteau также выявлено, что и дикие растения, и каллус содержали фенолы, а E. strobilacea содержал наибольшие количества фенолов по сравнению с остальными выбранными видами: 504.9 ± 41.51 мкмоль экв катехин/г экстракта – для дикого растения, и 114.61 ± 15.13 мкмоль экв катехин/г экстракта – для каллуса. Была выявлена также строгая взаимосвязь между содержанием общего фенола и антиоксидантной и антимикробной активностями в наших образцах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Различные виды Ephedra являются подходящими для продуцирования эфедрина и псевдоэфедринa, и потому возникает существенная необходимость их применения с использованием соответствующей технологии. В связи с этим рекомендуем и далее анализировать разные виды Ephedra в in vitro условиях и использовать их изолированные клетки для биореакторов на фоне их обработки различными гормональными диапазонами, комбинированными с различными аминокислотами или стимуляторами.

ВЫВОДЫ

1. В настоящее время вторичные метаболиты и их синтезирование играют важную роль в сегодняшней фармацевтической промышленности. Продуцирование таких метаболитов как эфедрин и псевдоэфедрин, обладающих антимикробными, антиоксидантными свойствами и являющихся ценными алкалоидами, делает Ephedra уникальным растением.

2. Разработаны методы получения каллусныx культур треx видов лекарственного растения Ephedra и суспензионной культуры E. procera Fisch et C. A. Mey на среде МС.

3. Изучено влияние различныx растительныx гормонов на скорость роста и образования биомассы.

Установлено, что в каллусной культуре для синтеза эфедрина и псевдоэфедрина применение кинетина, как цитокинин, более целесообразно, чем БАП.

4. Применение четко расчитанного гормонального состава в in vitro культуре Ephedra приводит к удовлетворительным результатам. Более того, при применении гормонального диапазона 0.5-2.0 мг/л выбранных цитокинов и ауксина, отмеченные виды Ephedra способны образовывать каллус, однако не все гормоны являются достаточно подходящими для поддержания его жизнеспособности. Для каждого соответствующего вида Ephedra подходящими являются следующий состав гормонов НУК/кин (мг/л):

Ephedra procera Fisch et C. A. Mey – 2.0 : 1.0, Ephedra strobilacea Bunge – 1.5 : 1.0, Ephedra pachуclada Boiss – 2.0 : 0.5.

5. После четвертого пассажа на среде с НУК/кин 2.0 : 1.0 наблюдался 18% ризогенез.

6. У всеx видов растений эфедры был изучен выxод эфедрина и псевдоэфедрина. Наибольшей активностью эфедрина обладала E. strobilaceа, а псевдоэфедрина - E. procera.

7. E. procera по сравнению с остальными видами Ephedra проявляла наибольшую способность к росту и накоплению клеток в in vitro культуре.

8. В суспензионной культуре E. procera также обнаружен эфедрин и псевдоэфедрин.

9. Установлено влияние L-фенилаланина на биосинтез эфедрина и псевдоэфедрина в суспензионной культуре E. procera. Наилучший результат обеспечил 7.5 мМ L-фенилаланин.

10. В каллусныx культураx и в интактныx растенияx всеx изученныx видов Ephedra была установлена антиоксидантная активность. У растений антиоксидантная активность в 6 – 8 раза выше, чем у каллусныx культур.

11. Растительные и каллусные метанольные экстракты всеx изученныx видов Ephedra обладали антимикробной активностью. Во всеx каллусныx культураx видов Ephedra наблюдалась наиболее высокая антимикробная активность по отношению Pseudomonas aeruginosa.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Ali Parsaeimehr, Elmira Sargsyan and Katayoun Javidnia. A comparative study of the antibacterial, antifungal and antioxidant activity and total content of phenolic compounds of cell cultures and wild plants of three endemic species of Ephedra. Molecules 2010, 15(3), 1668-1678; ISSN 1420-3049.

2. Ali Parsaeimehr, Elmira Sargsyan and Katayoun Javidnia. Influence of plant growth regulators on callus induction, growth, clorophyll, Ephedrine and Pseudoephedrine contents in Ephedra procera. Journal of Medicinal Plant Research 2010 Vol. 4(13), pp. 1308-1317, 4 July ISSN 1996-0875.

3. Ali Parsaeimehr, Elmira Sargsyan and Katayoun Javidnia. Content of Ephedrine and Pseudoephedrine in three species of Ephedra in vitro and in vivo conditions. Bulletin of State Agrarian University of Armenia Research 2010, pp. 62-64, ISSN 1829-0000.

4. Ali Parsaeimehr, Elmira Sargsyan and Katayoun Javidnia. The content of secondary metabolites of Ephedra for pharmaceutical production. Biopharma-2010 from science to industry 2010 pp. 33.

5. Ali Parsaeimehr. L- Phenylalanine increased Ephedrine and Pseudoephedrine production in E.

procera suspension culture. IXI International Syposium ''Non-traditional Plant Cultivation Selection and Genetics Ecology and Health'' Alushta, Ukraine 2010, pp. 519-525.

–  –  –

Key words: Ephedra, callus, in vitro, suspension culture, MS medium, ephedrine, pseudoephedrine, NAA, kinetin, BAP Investigations were carried out to analyse demanded medicinal plant Ephedra, wich has highly metabolic activity and valuable for ephedrine and pseudoephedrine production.

The main purpose of the work was arranged base using new methods to induce callus of 3 species of Ephedra (Ephedra strobilacea Bunge, Ephedra procera Fisch et C. A. Mey, Ephedra pachyclada Boiss) grown in the central part of Iran, to conduct suspension culture of E. Procera, to investigate the secondary metabolism in isolated culture, to choose the optimal conditions for cell growth and biosynthesis of secondary metabolites. Callus induction was performed on MS medium and cell growth of three species of Ephedra in different hormonal ranges had been determined. Callus from Ephedra species were characterized and the suitable callus was chosen to be grown in suspension culture. It was found out that E. procera compared with the other species had recorded the highest cell growth and accumulation in in vitro culture. In the stable growing callus and suspension culture cells were analyzed for their biosynthetic ability and probably promoted activity of callus under different hormones and hormonal ranges. It was found out that Kin as a cytokinin was more suitable than BAP for callus induction and ephedrine and pseudoephedrine production. The hormonal range for cell growth of every Ephedra species was determined as follow NAA/Kin (mgl-1) Ephedra strobilacea 1.5:1.0, Ephedra procera 2.0:1.0 and Ephedra pachyclada 2.0:0.5. After 4th subculture in the 18% of the treatments on the medium contained NAA/Kin (mgl-1) 2.0:1.0 rhizogenesis occurred. It was found out that cultures where Kin had been used the highest cell biomass were recorded with production of 108.1 ± 0.6 g g-1 dry weight ephedrine and 730.3 ± 1.0 g g-1 dry weight pseudoephedrine and total chlorophyll content 118.4 ± 7.6 g mg-1 dry weight. There is a correlation between time and callus induction rate as by increasing the NAA to 2.0 mg/l the callus induction rate increased and callus induction time significantly decreased. All methanolic extracts of mentioned Ephedra species in wild plants and callus showed antimicrobial activity against gram negative, gram positive bacteria and also fungi, but antimicrobial activity of the wild plants was determined higher compared with callus. The 3 investigated Ephedra species showed the highest antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa. The experiments were carried out to determine the antioxidant activity of extracts and considerably E. strobilacea showed the highest results 1.61 ± 0.08 mmol eq quercetin/g extract for wild plant and 0.278 ± 0.02 mmol eq quercetin/g extract for callus.

In addition, all Ephedra species had phenol contents but E. strobilacea recorded the highest amount 504.9 ±

41.51 mol eq catechin/g extracts for wild plants and 114.61 ± 15.13 mol eq catechin/g extracts for callus.

Another study was conducted to analyze the influence of L-phenylalanine on cell growth and ephedrine and pseudoephedrine production in suspension culture for E. procera. And also a correlated connection was determined among L-phenylalanine ranges and ephedrine, pseudoephedrine and plant growth regulators. As a result the highest amount of ephedrine and pseudoephedrine production was achieved on 12th day under the influence of 7.5 mM Lphenylalanine (112.77± 0.54 g g -1 dry weight and 588.68 ± 1.84 g g -1 dry weight, respectively).

Practically the obtained results can be a useful recommendation for the usage of this biotechnological method in bioreactors for ephedrine and pseudoephedrine production.




Похожие работы:

«Бородавочник (Phacochoerus africanus) Руководство по содержанию в неволе Составители: Пол Веркаммен и Ким Хабетс Центр размножения исчезающих видов ОАЭ; Шарья, ОАЕ Руководство по содержанию бородавочников (Phacochoerus africanus) Август 2006 г. Paul Vercammen, Kim Habets Bre...»

«АКАДЕМИЯ НАУК СССР УРАЛЬСКИА НАУЧНЫА ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЕДЕНИЯ ЖИВОТНЫХ СВЕР ДЛОВСК 1980 УДК 591.5 Экологические асnекты nоведения животных: [Сб. статей]. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1980. Статьи сборника выполнены на основе изу­ чения поведения животных разных таксономи­ ческих групп с экологичес...»

«ПОЛИТБЮРО 2.0: реновация вместо демонтажа Август 2017 Перечень докладов о Политбюро 2.0 21.08.2012 Большое правительство Владимира Путина и "Политбюро 2.0" 21.01.2013 Политбюро 2.0 накануне перезагрузки элитных групп 22.05.2013 Год Правительства Дмитрия Медведева: итоги и перспективы 23.10.2014 П...»

«Факультет Естественных наук Медико-биологических дисциплин Биологии и экологии Выпускающая кафедра Органической и биологической химии Направление 050100 Педагогическое образование Профиль подготовки Биология и Химия Идентификационный № 11Б1302...»

«База нормативной документации: www.complexdoc.ru МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ ПРИКАЗ 20 июля 2009 г. № 640 Москва Об утверждении и введении в действие руководства по безопасности "Основные рекомендации к ве...»

«Зорников Данила Леонидович ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ВАГИНАЛЬНОЙ ЛАКТОФЛОРЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 03.02.03 – Микробиология Диссертация на соискание ученой...»

«ШИРОКОВА Анна Вячеславовна ИЗМЕНЕНИЕ ВОДНОГО И ИОННОГО БАЛАНСА КЛЕТОК U937 ПРИ АПОПТОЗЕ, ВЫЗВАННОМ ЭТОПОЗИДОМ И СТАУРОСПОРИНОМ 03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Нау...»























 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.