WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 


«РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NF-B И ИЗОФОРМ -АКТИНИНА В СВЯЗИ С РЕОРГАНИЗАЦИЕЙ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431 ...»

На правах рукописи

БОЛЬШАКОВА

Анастасия Викторовна

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА

NF-B И ИЗОФОРМ -АКТИНИНА В СВЯЗИ С РЕОРГАНИЗАЦИЕЙ

АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук.

Институт цитологии РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Ольга Александровна Петухова Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Елена Сергеевна Корнилова Институт цитологии РАН доктор биологических наук Надежда Владимировна Кулёва Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: Институт канцерогенеза РОНЦ им. Блохина

Защита состоится 22 мая 2009 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru сайт: http://www.cytspb.rssi.ru факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 22 апреля 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одной из активно развивающихся областей современной клеточной биологии является изучение роли актинового цитоскелета в передаче сигнала и регуляции экспрессии генов.

Актиновые филаменты вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами образуют динамическую сеть в цитоплазме клеток, называемую цитоскелет, которая определяет форму клетки и лежит в основе клеточной миграции, участвует в межклеточной адгезии и адгезии клеток с матриксом (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999; Clark et al., 2002). Имеются данные, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточного сигнала. В частности, некоторые сигнальные молекулы способны непосредственно взаимодействовать с белками актинового цитоскелета на определенных этапах передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру (Yamada, Geiger, 1997; Otey, Carpen, 2004; Legrand-Poels et al., 2007).

Однако, по-прежнему, остаются невыясненными точные механизмы, с помощью которых актиновый цитоскелет принимает участие в сигнальных каскадах и регуляции экспрессии генов.

Ряд данных говорит о том, что реорганизация актинового цитоскелета может приводить к изменению активности транскрипционных факторов (Sotiropoulos et al., 1999; Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008). Реорганизация актинового цитоскелета происходит под влиянием ростовых факторов, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами. В то же самое время, факторы, вызывающие реорганизацию актинового цитоскелета, регулируют также активность транскрипционных факторов (Schoenwaelder, Burridge, 1999). Вероятно, реорганизация актинового цитоскелета сопровождается перегруппировкой белков актинового цитоскелета, входящих в состав сигнальных комплексов и взаимодействующих с транскрипционными факторами. Одним из таких транскрипционных факторов, регуляция которого может осуществляться в связи с реорганизацией актинового цитоскелета, является NF-B (Fazal et al., 2007, Nemeth et al., 2004).





Дополнительными фактами, указывающими на участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов, является открытие внутриядерных функций актина и актинсвязывающих белков. Однако эти вопросы остаются, по-прежнему мало изученными.

Одним из таких белков, способных взаимодействовать с транскрипционными факторами, является -актинин (Poch et al., 2004; Goffart et al., 2006).

Настоящая работа является частью исследования, проводимого в Лаборатории биологии клетки в культуре в течение многих лет. Ранее в лаборатории было показано, что р65 субъединица NF-B солокализуется со стресс-фибриллами в цитоплазме фибробластов и при разрушении актинового цитоскелета р65 субъединица NF-B остается связанной с агрегатами актина. Кроме того, р65 субъединица NF-B обнаруживалась в числе белков клеточных экстрактов, взаимодействующих с иммобилизованным F-актином (Are et al., 2000). Поиск белков, которые могут взаимодействовать как с актином, так и с р65 субъединицей NF-B, указал на -актинин, поскольку имеются данные о том, что киназа MEKK1, которая является одним из активаторов NF-B, способна напрямую взаимодействовать с -актинином in vitro (Christerson et al., 1999).

В немышечных клетках встречаются две изоформы -актинина:

-актинин-1 и -актинин-4. Особенностью актинина-4 является его способность транслоцироваться в ядро, где он может взаимодействовать с промоторами генов (Goffart et al., 2006) и выступать как кофактор транскрипции (Chakraborty et al., 2006). Исследования Лаборатории биологии клетки в культуре показали солокализацию р65 субъединицы NF-B и -актининов в цитоплазме клеток А431, в особенности в области дорзальных раффлов. Более того, -актинин-4 был обнаружен в ядре (Бабаков и др., 2004). Несмотря на солокализацию обоих -актининов и р65, в мультибелковых комплексах ядерных и цитоплазматических экстрактов после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 субъединице NF-B выявлялся только

-актинин-4 (Бабаков, 2004). Поэтому возникла необходимость детального исследования областей солокализации, а также сравнения распределения в субклеточных фракциях актинина-1, -актинина-4 и р65. Кроме того, обнаружение -актининов и р65 в одних и тех же белковых комплексах не является доказательством их прямого взаимодействия.

Работа была проведена на клетках А431, распластанных на фибронектине, для которых хорошо охарактеризованы структуры актинового цитоскелета и его реорганизация под влиянием эпидермального фактора роста (ЭФР) (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004).

Однако до сих пор не было исследовано, каким образом происходит перераспределение р65 в связи с реорганизацией актинового цитоскелета и важны ли актиновые структуры для транслокации р65 в ядро, Цели и задачи работы Цель настоящей работы заключалась в выяснении участия актинового цитоскелета в перераспределении р65 субъединицы NF-B, а также в сравнительной оценке участия актинина-1 и -актинина-4 в событиях, связанных с активацией NF-B.

В работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать возможность транслокации р65 в ядро в условиях разрушения актинового цитоскелета после обработки клеток цитохалазином Д (ЦХ Д).

2. Исследовать влияние ЭФР, вызывающего реорганизацию актинового цитоскелета, на распределение р65, -актинина-1 и -актинина-4 в цитоплазме и F-актина, охарактеризовать области их солокализации.

3. Определить совместное присутствие р65, -актинина-1 и -актинина-4 в различных субклеточных фракциях, соответствующих разным компартментам.

4. Исследовать возможность прямого взаимодействия -актининов и NF-B in vitro c использованием метода аффинной хроматографии (GST-pull-down).

5. Исследовать возможность участия -актинина-4 в реакции связывания NF-B с консенсусными последовательностями В.

Основные положения, выносимые на защиту ЭФР стимулирует в клетках А431 два процесса: накопление р65 субъединицы NFB в ядре и перераспределение р65 в цитоплазме. Наблюдается как зависимое от актиновых структур перераспределение, так и независимое.

В областях дискретной локализации р65 в цитоплазме, названных пэтчами, 2.

обнаруживаются белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией.

-Актинин-1 и -актинин-4 демонстрируют как общие, так и специфичные черты в 3.

характере распределения.

-Актинин способен напрямую взаимодействовать с 4. N-концевой последовательностью р65 субъединицы NF-B in vitro.

При добавлении -актинина комплекс р65 субъединицы NF-B с B-специфичной 5.

последовательностью ДНК сохраняется.

Научная новизна полученных результатов В работе впервые показано, что в клетках А431 ядерная транслокация р65 под влиянием ЭФР может происходить в клетках с разрушенным актиновым цитоскелетом при отсутствии стресс-фибрилл и раффлов. Описаны дискретные актинсодержащие области локализации р65 субъединицы NF-B в цитоплазме, включающие также белки, характерные для комплексов фокальной адгезии. Продемонстрированы особенности распределения -актинина-1 и -актинина-4 в клетках А431, показана способность непосредственного взаимодействия -актинина с N-концевой последовательностью р65 субъединицы NF-B.

Теоретическое и практическое значение работы Результаты имеют фундаментальное значение для понимания роли актинового цитоскелета и актинсвязывающих белков в качестве участников регуляции активности транскрипционных факторов и экспрессии генов. Компоненты актинового цитоскелета, такие как актинсвязывающие белки, могут являться посредниками между транскрипционными факторами и актиновыми структурами. Более того, они могут сопровождать факторы транскрипции в процессе их активации в цитоплазме и участвовать в реализации их функций в ядре. Полученные данные могут быть использованы при проведении лекционно-практических занятий в СПбГУ и СПбГПУ.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах и 11 тезисов.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2006, 2007), на 11-й и 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007, 2008), на международных конференциях American Society for Cell Biology (Сан Диего, 2006; Вашингтон, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН. Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 10 декабря 2008 г.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 174 ссылки. Диссертация изложена на 130 страницах. Иллюстративный материал содержит 7 схем, 25 рисунок и 1 таблицу.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов СПб НЦ РАН (2007 г.), РФФИ (#7852.2006.4), Ведущих научных школ (#07-04-011-90-а), гранта Visby Шведского института (#1361/2006).

Материалы и методы Культивирование клеток А431. Клетки эпидермоидной карциномы линии А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН.

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота при 37 оС в атмосфере 5 % СО2.

Адгезия клеток на фибронектине. Фибронектин в концентрации 10 мкг/мл наносили на гидрофобные чашки Петри или силиконизированные покровные стекла (ночь, +4 оС), затем обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Клетки снимали смесью трипсина и версена в соотношении 3:7. Суспензию клеток в среде ДМЕМ (1.25х106 клеток/мл) наносили на гидрофобные чашки Петри (90 мм) или покровные стекла (1.5х105 клеток/мл), покрытые фибронектином, и инкубировали при 37 С в течение 1 ч в атмосфере 5 % СО2. Клетки на чашках использовали для биохимических исследований, а клетки на стеклах анализировали с помощью иммунофлуоресценции.

ЭФР человека добавляли в концентрации 100 нг/мл, ЦХ Д- в концентрации 2 мкг/мл.

Иммунофлуоресценция. Клетки фиксировали в течение 10 мин 3.7 %-ным раствором параформальдегида, а затем пермеабилизировали 0.1 %-ным раствором Тритона Х-100.

Препараты инкубировали с первыми антителами против р65 субъединицы NF-B, актинина-1, -актинина-4, винкулина или паксиллина и соответствующими вторыми антителами (каждая инкубация по 40 мин) с трехкратной промывкой 0.

1 % Tween/PBS после каждой инкубации. Для выявления актинового цитоскелета клетки окрашивали Родамин-фаллоидином в течение 10 мин. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для вторых антител Alexa 488; HeNe-лазер с длиной волны 543 нм для Alexa 568 и родамин-фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала Alexa 488 и Alexa 568 (или Родамин-фаллоидина). Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.

Для анализа присутствия р65 на стресс-фибриллах свободные белки цитоплазмы экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, 5мМ ЭДТА pH 6.8, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.01 % дигитонина. Мембранные белки экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, 3мМ ЭДТА pH 7.4, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.5 % Тритона Х-100 (Chiang et al., 2000).

Субклеточное фракционирование.

Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков.

В процессе подбора условий для субклеточного фракционирования использовали следующие буферные растворы: буфер 1: 0.32 М сахарозы, 2 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 % Тритона Х-100, 10 мM трис-HCl pH 8.0, 1 мM ДТТ, 0.1 мM PMSF, коктейль ингибиторов протеаз; буфер 2:

буфер 1, без Тритона Х-100; буфер 3: буфер 1, содержащий 0.05 % Тритона Х-100. Клетки лизировали в одном из буферных растворов и осаждали ядра при 2000g, 10 мин.

Супернатант содержал цитоплазматическую фракцию. Осадок ядер дополнительно очищали центрифугированием в 0.5 М сахарозе (Марзлав, Хуан, 1987). Ядерные фракции, содержащие транскрипционные факторы (0.4 М NaCl фракция), экстрагировали буфером, содержащим 400 мM NaCl, 20 мM HEPES pH 7.9, 25 % глицерина, 1.5 мM MgCl2, 0.4 мM ЭДТА, 0.4 мM PMSF, 1 мM ДТТ, 2 мM Na3VO4, и центрифугировали при 12000g, 30 мин.

Осадок содержал белки, условно названные “прочно связанные с хроматином”.

Концентрацию белков в ядерных и цитоплазматических экстрактах определяли по методу Бредфорд (Bredford, 1976).

Получение ядерных подфракций по методу Двайера и Блоубела с модификациями (Dwyer, Blobel, 1976). Для лизиса клеток использовали буфер: 250 мМ сахарозы, 1 мM MgCl2, 2 мM ЭДТА, 25 мM трис НСl pH 7.2, 1 мM ДТТ, 1 мM PMSF, 1 мM Na3VO4, коктейль ингибиторов протеаз (Blobel, Potter, 1966; Бабаков и др., 2004). Ядра осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0.1 мM MgCl2 с последующим добавлением ДНКазы I (100 мкг/мл), 10 % сахарозы, 10 мM триэтаноламина (ТЭА) pH 8.5 и 0.1 мM MgCl2 (20 мин, 22 оС). Смесь центрифугировали через 30 %-ную сахарозу (18000 g, 10 мин при +4 оС). Надосадочная жидкость содержала белки нуклеоплазмы (D1S). Эту процедуру повторяли дважды. Тритон–растворимую фракцию белков ядерной оболочки (D2TS) экстрагировали в буфере: 10 % сахарозы 10 мМ ТЭА pH 7.5, 0.1 мМ MgCl2 и 2 % Тритона Х-100 (10 мин при +4 оС) и центрифугировали 10 мин при 18000 g и +4 оС. Осадок ресуспендировали буфером, содержащим 10 % сахарозы, 10 мМ ТЭА pH 7.5, 0.1 мМ MgCl2 и 2 % Тритона Х-100, далее добавляли 2 M NaCl, 100 мM ТЭА pH 7.5 для получения белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей (D2TSs), после центрифугирования осадок содержал белки комплекса ядерной ламины (D2TSp).

Фракционирование с помощью коммерческого набора (Qiagen, Германия) с получением фракций несвязанных цитоплазматических белков, мембранных белков, белков, связанных с цитоскелетом, и белков ядерной ламины проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Иммуноблотинг белковых экстрактов клеток проводили по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Антитела к р65 субъединице NF-B, -актинину-1 и -актинину-4 использовали в разведении 1:1000, вторые антитела – в разведении 1:2000 (Dako).

Получение меченых двуцепочечных ДНК зондов (Fermentas). Реакцию мечения специфического олигонуклеотида (5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы Fermentas. Использовали g-32 Р-АТФ фирмы и Т4 полинуклеотидкиназу фирмы Amersham (Швеция) Fermentas (Литва).

Радиоактивность определяли на счетчике фирмы Для получения Beckman.

двуцепочечного фрагмента ДНК проводили отжиг меченых олигонуклеотидов с комплементарными немечеными олигонуклеотидами в 0.1 М NaCl: смесь нагревали до 78 о С и давали остыть до tкомн.

Анализ ДНК-связывающей активности ядерных экстрактов методом торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (Dent et al., 1999).

Реакцию связывания специфического меченого олигонуклеотида с белками ядерных экстрактов проводили в буферном растворе 50 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 10 мМ MgCl2, 10% глицерина, 0.5 мM ДТТ в присутствии 1000-кратного избытка неспецифического конкурента (poly[dI-dC]) в течение 20 мин, tкомн. В реакцию брали не менее 30000 имп/мин меченого олигонуклеотида и 7 мкг ядерного экcтракта. При конкурентном анализе в реакцию добавляли антитела к р65 и р50 субъединицам NF-B или -актинину-4 (20 мин, tкомн). ДНК-белковые комплексы разделяли в нативном 4 %-ном ПААГ в трис-ацетатном буфере при 100 В. Высушенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой фирмы Kodak в течение необходимого времени.

Сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блот-анализа (Demczuk et al., 1993). Реакция связывания и разделения ДНКбелковых комплексов проводили так же, как описано выше. После переноса в трисглициновом буфере, содержащем 20 % метанола и 0.1 % SDS с помощью установки для переноса (BioRad, США), белковый компонент связывался с нитроцеллюлозой, а ДНК – с мембраной ДЕ81. После переноса нитроцеллюлозу блокировали 5 %-ным обезжиренным сухим молоком и инкубировали с первыми и вторыми антителами. Для усиления сигнала использовали систему хемилюминесценции ECL. Хемилюминесцентное излучение регистрировали с помощью рентгеновской пленки. Мембрану ДЕ81 экспонировали с рентгеновской пленкой.

Метод GST-pulldown. Для анализа прямого взаимодействия N-или C- концевых доменов р65 субъединицы с очищенными белками, -актинином-1 и -актинином-4 использовали рекомендации фирмы Amersham.

Для экспрессии в E. coli, штамм BL21 использовали плазмиды pGEX 4Т-1, содержащие последовательность р65 и N-концевую (аминокислоты 1-357) C-концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550), сшитые с глютатион S – трансферазой (GST). После индукции IPTG белки, иммобилизованные на глютатион-сефарозе (Amersham), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии.

Реакцию связывания иммобилизованных N- и C- концевых последовательностей р65 с выделенными белками, -актинином-1 и -актинином-4, проводили в буферном растворе PBS. -Актинин, выделенный из желудков цыпленка, обогащенный -актинином-1, и актинин, выделенный из подоцитов почек свиньи, обогащенный -актинином-4, любезно предоставлены В.Н. Бабаковым. К различным аликвотам сефарозы с пришитыми последовательностями р65 добавляли по 20 мкг очищенных белков, -актинина-1 или актинина-4, и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч при +4С.

Сефарозу многократно отмывали от несвязавшихся белков растворами 1 %-ного Тритона Х-100/PBS и PBS и анализировали связавшиеся белки с помощью электрофореза (Laemmli, 1970) и вестерн-блота с окраской антителами к р65 субъединице, -актинину-1 или -актинину-4.

Анализ ДНК-связывающей активности выделенных белков методом торможения подвижности ДНК в геле (in vitro band-shift). Для получения свободных N- или Cконцевых последовательностей р65 субъединицы в растворе GST-сефарозу, содержащую N- и C-концевые домены р65, инкубировали с тромбином (0.125 ед/мкл) в течение ночи.

Реакцию связывания N- и C- доменов р65 со специфическим меченым олигонуклеотидом проводили как описано выше. Очищенный -актинин добавляли непосредственно в реакцию связывания N-концевого р65 с В-специфической последовательностью ДНК.

Статистическая обработка данных. Электрофореграммы после иммуноблотинга и in vitro band-shift анализировали с помощью программы Scion image. В подсчетах средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов использовали программу Microsoft Excel.

Солокализацию белков после иммунофлуоресцентного анализа проводили с использованием программы Image J. Области перекрывания белков и ДНК-белковых комплексов после анализа методом shift-western получены с использованием программы Adobe Photoshop.

Результаты и обсуждение Распределение RelA/p65 в клетках А431 при адгезии к фибронектину и воздействии ЭФР [1, 2, 3, 7, 10]. Распластывание на фибронектине приводило к формированию стрессфибрилл у большинства клеток в популяции, создавая единообразную структуру актинового цитоскелета (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). Под влиянием ЭФР наблюдалась согласованная реорганизация актинового цитоскелета, заключающаяся в расхождении существующих стресс-фибрилл к краям клеток и частично к их разборке и в последующем восстановлении стресс-фибрилл по всему телу клеток.

На рис.1 представлено распределение р65 и F-актина в клетках А431, распластанных на фибронектине. Приведены вертикальные и горизонтальные срезы. Можно видеть, что р65 обнаруживается солокализованно со стресс-фибриллами и диффузно (независимо от актиновых филаментов) в цитоплазме, причем более плотно в перинуклеарной области, а также в ядре (рис.1, А, А’). Воздействие ЭФР в течение 5 мин, когда происходит реорганизация актинового цитоскелета и образуются дорзальные раффлы, р65 обнаруживается в дорзальных раффлах (рис.1, Б – апикальный срез). Р65, окрашиваемый независимо от F-актина (диффузно), перераспределяется по направлению к краю клеток, как это можно видеть на срезе, сделанном в вентральной области клеток (рис.1, Б, б).

Через 30 мин воздействия ЭФР RelA/р65 наблюдается солокализованно со стрессфибриллами и накапливается в ядре, а также распределяется диффузно по всей цитоплазме (рис.1, В). Солокализацию на стресс-фибриллах, полученную с помощью программы Image J, можно видеть на рис.1, А’, Б’, В’, где представлены срезы в вентральной области клеток (красные). Солокализация р65 со стресс-фибриллами в клетках после 30-мин воздействия ЭФР представлена на рис.1, Д после экстракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков.

Р65 также обнаруживался в дискретных областях в цитоплазме, солокализованно с Fактином. Эти области, обозначенные рамкой на рис.1, В, представлены более детально на рис.1, Г, на срезе, проведенном ближе к апикальной поверхности клетки по сравнению с рис.1, В, где видно, что актин в этих зонах расположен в виде «клубка» и, по-видимому, р65 расположен внутри этого «клубка».

Таким образом, на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, вызванных адгезией к фибронектину и воздействием ЭФР, RelA/p65, помимо диффузного распределения, выявлялся солокализованно с актин-содержащими структурами разных типов.

Возник вопрос, не может ли происходить транслокация RelA/p65 в ядро под влиянием ЭФР с помощью этих лабильных структур F-актина. Одним из фактов в пользу участия раффлов в активации и транспорте RelA/p65 служат данные других авторов (Boyer et al., 2004). Образование дорзальных раффлов в нашем случае характерно для клеток после 5 мин воздействия ЭФР. Их формирование в клетках А431 было показано другими авторами после 1-5 мин стимуляции ЭФР (Araki et al., 2007). Накопление р65 в ядре под влиянием ЭФР мы выявляли методом иммуноблота.

–  –  –

В цитоплазматической фракции не выявлены изменения доли р65 ни в клетках, культивируемых на пластике, ни в клетках, распластанных на фибронектине. Доля р65 во фракции белков, экстрагируемых 0.4 M NaCl, в клетках, культивируемых на пластике, увеличивалась в 5 раз под влиянием ЭФР (рис.2, А), тогда как в клетках, распластанных на фибронектине, наблюдалось увеличение в 2.5 раза (рис.2, Б), поскольку само по себе распластывание на фибронектине сопровождалось увеличением доли р65.

Воздействие ЦХ Д на клетки приводило к разрушению актинового цитоскелета и образованию агрегатов актина. Удаление ЦХ Д и добавление ДМЕМ сопровождалось восстановлением стресс-фибрилл, тогда как добавление ЭФР препятствовало их восстановлению; F-актин в этом случае был представлен крупными агрегатами. Если ЭФР добавляли непосредственно в среду, содержащую ЦХ Д, то не наблюдалось даже образования крупных агрегатов, весь F-актин был представлен мелкими агрегатами по всему телу клеток.

–  –  –

видеть как на вентральных, так и на апикальных срезах. Таким образом, конфокальные срезы показали возможность контакта р65 в этих областях с основанием клетки, что предполагает связь этих структур с клеточной адгезией.

–  –  –

Очень важно, что размеры дискретных зон, в которых обнаружена солокализация р65 с белками адгезии, увеличивались, если ЭФР добавляли к клеткам, актиновый цитоскелет которых был разрушен ЦХ Д. Подобные зоны мы стабильно обнаруживали в клетках, распластанных на фибронектине, после добавления ЭФР. Полученные данные позволяют предположить, что р65 накапливается в этих областях под влиянием ЭФР. Следовательно, присутствие р65 в дискретных актин-содержащих областях цитоплазмы, включающих белки, характерные для фокальной адгезии, является одним из этапов активации NF-B в клетках А431.

Сравнительный анализ распределения изоформ -актинина в клетках и выделенных субклеточных фракциях [4, 5, 6, 8, 14] Иммунофлуоресцентный анализ показал, что обе изоформы -актинина в клетках, распластанных на фибронектине, солокализуются со стресс-фибриллами и диффузно распределяются по цитоплазме клеток. Особенностью -актинина-1 является его локализация в околоядерной области. Актинин-4 обнаруживался в ядре и, более плотно, на концах стресс-фибрилл (рис.4).

После воздействия на клетки ЭФР солокализация -актининов со стресс-фибриллами сохранялась, обе изоформы обнаружены также в раффлах, что подтверждает полученные ранее данные (Бабаков и др., 2004). Локализация -актининов на стресс-фибриллах была показана также другими авторами (Honda et al., 1998). Особенностью настоящей работы является обнаружение -актинина-4, в отличие от -актинина-1, на концах стрессфибрилл. Эти данные отличаются от результатов работы Хонды и соавторов, проведенной на фибробластах эндометрия матки, где -актинин-1 обнаруживался на концах стрессфибрилл (Honda et al., 1998). Такое несоответствие может быть связано с особым характером распределения -актининов в клетках эпителиального ряда. Другой причиной может служить влияние адгезии к фибронектину, приводящее к перераспределению актинина-4 в области фокальных контактов, как это было сделано в настоящей работе.

–  –  –

-Актинин-4 стабильно выявлялся в ядре. В ядерной фракции белков, экстрагируемых 0.4 M NaCl, обогащенной транскрипционными факторами, и фракции белков, «прочно связанных с хроматином», обнаруживался полноразмерный -актинин-4, фрагмент с мол. массой ~65 кДа, а также высокомолекулярный белок с мол. массой ~150 кДа (рис.5, Б, В). Фракционирование ядер другим способом показало присутствие -актинина-4 во всех ядерных подфракциях.

Ситуация с выявлением -актинина-1 в ядре оказалась более сложной, в отдельных экспериментах можно было обнаружить полноразмерный -актинин-1 либо его фрагмент (рис.5, Б). В случае фракционирования ядер другим способом -актинин-1 обнаруживался в тритон-растворимой фракции ядерной оболочки и фракции комплекса ядерной ламины и отсутствовал во фракции нуклеоплазмы и фракции ядерных белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей. Эти особенности распределения могут быть связаны с тем, что -актинины принадлежат к белкам цитоскелета, и при использовании различных буферных растворов для лизиса клеток цитоскелетная фракция может загрязнять ядерную фракцию. В нашем случае буферные растворы различаются присутствием Тритона Х-100.

Так, при фракционировании ядер другим способом по методу Двайера и Блоубела (Dwyer, Blobel, 1976) Тритон Х-100 отсутствовал; вероятно, в этом случае сохранялась связь актинина-1 с ядерной мембраной (рис.5, Г).

Вероятно, тесное взаимодействие -актинина-1 с ядерной оболочкой является общим свойством для спектринсодержащих белков. Исследования последних лет показали, что в наружной мембране ядерной оболочки присутствуют белки несприны, имеющие актинин–подобный актинсвязывающий домен (Zhang et al., 2001, Young, Kothary, 2005).

Присутствие -актинина-4 в ядре показано всеми применяемыми способами, подтверждает данные, ранее полученные в лаборатории, и данные других авторов и не вызывает сомнений (Бабаков и др., 2004; Poch et al., 2004, Chakraborty et al., 2006).

Совокупные результаты, полученные при сравнении нескольких биохимических методов и иммунофлуоресцентного анализа, свидетельствуют о том, что помимо того, что

-актинины являются типичными белками цитоплазмы, -актинин-1 прочно связан с мембраной ядерной оболочки, а -актинин-4 является лабильным белком и может присутствовать в разных ядерных подфракциях.

Совместное распределение -актинина-1 и -актинина-4 в и р65 субъединицы NFB в клетках А431 [9, 11, 12].

–  –  –

актинина-4 в дискретных областях, содержащих р65, в цитоплазме (пэтчах), возникающих после воздействия ЭФР, было представлено ранее на рис.3.

Для того, чтобы проверить совместное присутствие этих белков в разных субклеточных фракциях, было проведено субклеточное фракционирование с использованием коммерческого набора (Qiagen) с получением фракций свободных белков цитоплазмы, мембранных белков, ядерных и цитоскелетных белков (рис.7). Мы обнаружили присутствие р65, -актинина-1 и -актинина-4 во всех анализируемых фракциях.

Особенность заключалась в разном наборе белков, узнаваемых антителами к исследуемым белкам.

Полноразмерный р65 был обнаружен во всех субклеточных фракциях.

Во фракции свободных белков цитоплазмы антитела к р65 узнавали, кроме того, высокомолекулярный белок с мол. массой около 150 кДа. Укороченные формы р65 обнаруживались во всех фракциях кроме цитоскелетной. Цитоскелетная фракция также характеризовалась присутствием белка с мол. массой ~100 кДа (рис.7). Полноразмерный -актинин-1 был обнаружен во всех субклеточных фракциях, в том числе в ядерной. Мы полагаем, что это связано с тем, что ядерная фракция может содержать белки ядерной оболочки.

Укороченная форма -актинина-1 с мол. массой ~75 кДа выявлялась в двух фракциях:

цитоплазматических и мембранных белков. В отличие от -актинина-1, как полноразмерный -актинин-4, так и укороченная форма ~75 кДа были обнаружены во всех фракциях.

Фракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков были обогащены этим фрагментом. Кроме того, во фракциях цитоплазматических, мембранных и ядерных белков выявлялся фрагмент ~65 кДа. В ядерной фракции обнаружили также фрагмент ~55кДа.

Рис.7. RelA/p65, -актинин-1 и -актинин-4 в субклеточных фракциях, полученных с помощью коммерческого набора фирмы Qiagen.

Вестерн-блот-анализ фракции свободных белков цитоплазмы (А), мембранных белков (Б), ядерных белков (В) и белков цитоскелета (Г) клеток, распластанных на фибронектине.

Таким образом, субклеточное фракционирование позволило выявить дополнительные различия в распределении изоформ -актинина, показывая особый характер состава цитоскелетной фракции и демонстрируя особенности распределения укороченных форм всех исследуемых белков.

Роль укороченных форм -актинина и р65 в клетках А431 остается пока не выясненной, хотя данные о появлении фрагмента кДа -актинина-1 в суммарной ~75 цитоплазматической фракции после распластывания клеток А431 на фибронектине (см.

рис.5) могут свидетельствовать о взаимосвязи процессов адгезии и образования фрагментов.

Существование фрагментов RelA/p65 было показано для различных типов клеток. В литературе описаны фрагменты р65 с мол. массами 53-55 кДа, 42-45 кДа и 37 кДа (Chapman et al., 2002). Подобные укороченные формы р65 были найдены в эндотелиальных клетках, миеломоноцитах, Т-клетках, клетках костной ткани, HeLa и других клетках (Narayanan et al.,1992; Ruben et al., 1992).

Образование укороченных форм -актинина было показано другими авторами in vivo и доказано их важное физиологическое значение (Selliah et al., 1996; Pavalko et al., 1998;

Communal et al., 2002; Luikart et al., 2002). Фрагменты могут быть получены in vitro при протеазном расщеплении -актинина трипсином, термолизином и химотрипсином (Immure et al., 1988; Communal et al., 2002).

Прямое взаимодействие RelA/р65 и -актинина [13].

На вопрос о прямом взаимодействии белков можно ответить с использованием метода GST pull-down. Данный метод заключается в изучении взаимодействия белков, иммобилизованных на GST-сефарозе, с очищенными белками. E. coli трансформировали плазмидами содержащими последовательность р65 pGEX 4Т-1, N-концевую (аминокислоты 1-357) и C- концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550).

После индукции IPTG белки, сшитые с глютатион S –трансферазой (GST), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии на глютатион-сефарозе. Для взаимодействия N- и С- концевой последовательности р65 были использованы очищенные белки, обогащенные -актинином-1, или -актинином-4.

Результаты вестерн-блот-анализа после разделения реакционной смеси в системе SDSэлектрофореза, приведенные на рис.8, демонстрируют, что только N-концевая последовательность взаимодействует с -актинином. Причем, установлено взаимодействие как с -актинином, выделенным их почек свиньи (-актинин-4), так и с актинином, выделенным из желудков цыплят Таким образом, (-актинин-1).

специфичность по отношению к одному из -актининов выявить не удалось. Это подтверждает полученные ранее данные о том, что р65 обнаруживается среди белков, взаимодействующих с иммобилизованным -актинином, выделенным из желудков цыплят (-актинином-1) (Бабаков, 2004).

Рис. 8. Анализ взаимодействия N- и C-концевых доменов р65, иммобилизованных на глютатион-сефарозе, с -актинином (метод GST pulldown).

Вестерн-блот-анализ с антителами к -актинину-1 и -актинину-4.

А - Контроль без добавления -актининов к GST-сефарозе. Б – взаимодействие с -актинином-1. В взаимодействие с -актинином-4. На дорожки наносили уменьшающиеся количества глютатион-сефарозы (1, 2, 3). pGex – контроль, не содержащий последовательности р65.

Возможность участия -актинина-4 в реакции ДНК-связывания NF-B с консенсусными последовательностями В [13].

Данные в пользу того, что -актинин может являться кофактором NF-B, впервые были исследованы в Лаборатории биологии клетки в культуре (Бабаков и др., 2004). В литературе описаны белки, кофакторы транскрипционного фактора NF-B, участвующие в регуляции NF-B-зависимых генов. Более подробно роль белков-коактиваторов описана для HMG 1(Y), c-jun, ATF-2, IRF (IFN regulated factor) (Thanos, Maniatis, 1995), CREBсвязывающего белка (CBP/300). Некоторые из кофакторов выполняют репрессирующую функцию, например, гистоновая деацетилаза – 1, 2 (HDAC-1, 2) (Zhong et al., 1998, 2002), белки HSCO, SINC (Owen et al., 2005). Взаимодействие с RelA/р65 показано для CBP, p300, TBP, TAF, TFIIB.

Для -актинина-4 показано взаимодействие с фактором транскрипции NF-Y (Poch et al., 2004), участие в активации транскрипционного фактора MEF-2 путем негативной регуляции активности HDAC7 (Chakraborty et al., 2006) и способность образовывать ДНКбелковые комплексы на промоторе цитохрома С (Goffart et al., 2006).

Для проверки предположения о том, что -актинин является кофактором NF-B на уровне ДНК-связывающей активности и может входить в состав B-специфичных ДНКбелковых комплексов, в настоящей работе использовали метод торможения ДНКбелковых комплексов в геле и конкурентный анализ, а также сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блота (shiftwestern). ДНК-связывающая активность характеризует первый этап регуляции экспрессии генов и является важным функциональным свойством транскрипционного фактора.

В предыдущих работах Лаборатории биологии клетки в культуре в ядерных экстрактах было выявлено формирование трех B-специфичных ДНК-белковых комплексов, различающихся по подвижности в ПААГ (Петухова и др., 2005). Комплексы II и III стабильно выявлялись в активированных клетках. Комплекс с наименьшей I электрофоретической подвижностью выявлялся нестабильно, и закономерности его появления не удалось выяснить.

Результаты конкурентного анализа показали, что комплекс II содержит р65, поскольку добавление антител к р65 приводило к торможению подвижности B-специфичного комплекса II (супершифту) (рис.9, А). Комплекс III, по-видимому, не содержит р65, поскольку при добавлении антител к р65 интенсивность этого комплекса не менялась.

Если в экстрактах присутствует комплекс III, то добавление антител к -актинину-4 приводило к исчезновению этого комплекса, что указывает на присутствие в нем актинина-4, снижалась также интенсивность комплекса II (рис.

9, А). Анализ с антителами к р50 субъединице показал, что комплекс II содержит также и р50, поскольку наблюдался супершифт и снижение его интенсивности. Тот факт, что при добавлении равного количества антител к р65 и р50 в реакцию антитела к р50 не приводили к исчезновению комплекса II, может свидетельствовать о том, что кроме комплекса р65/р50 (классический NF-B) в состав этого комплекса входят и другие белки.

–  –  –

Для уточнения результатов конкурентного анализа мы провели исследование методом shift-western, который подтвердил, что в экстрактах активированных клеток комплекс II содержит р65. В этом случае р65 выявлялся в виде широкой полосы, в которой можно выделить две области, которые мы обозначили как а и б (рис.9, Б). Полоса а соответствует подвижности р65 в экстракте неактивированных клеток, когда не образуется специфический ДНК-белковый комплекс. Полоса б выявляется в экстракте активированных клеток на уровне комплекса II. Анализ с антителами к -актинину-4 показал, что он обнаруживается как в активированных, так и в неактивированных экстрактах. Зона перекрывания положения актинина-4 с положением р65 и комплексом II представлена на рис.9, В как заштрихованная область, указанная стрелкой. Присутствие р50 субъединицы NF-B в составе комплекса II подтвердилось также и shift-western анализом. Данные, полученные методом shift-western, позволяют предположить, что -актинин-4 может входить в состав B-специфического ДНК-белкового комплекса.

Однако оказалось, что подвижность -актинина-4 в нативном геле в составе чистых белковых экстрактов практически совпадает с подвижностью -актинина, после взаимодействия экстрактов с ДНК. Следовательно, однозначно ответить на вопрос о присутствии -актинина-4 в составе комплекса, взаимодействующего с Bпоследовательностью ДНК, с помощью этого метода не удалось. Эту сложность мы пытались обойти, анализируя взаимодействие очищенных N- и С-концевых фрагментов р65 с консенсусной последовательностью ДНК в присутствии очищенного белка актинина.

В химерном белке GST-p65 содержится сайт узнавания протеазы тромбина.

Переваривание тромбином позволяет получить N- и С- концевой р65 в растворе в свободном виде. Выход р65 в супернатант после переваривания тромбином контролировали с помощью вестерн-блот-анализа. Анализ методом торможения в геле показал, что только N-концевой домен р65 способен образовывать В-специфичный ДНКбелковый комплекс, причем, в ПААГ он движется быстрее, чем комплекс II ядерных экстрактов (рис.10).

Поскольку взаимодействие р65 с ДНК осуществляется за счет N-концевой последовательности, содержащей ДНК-связывающий домен, важно было понять, сохраняется ли комплекс р65 субъединицы с B-специфичной последовательностью ДНК в присутствии -актинина. Добавление -актинина в реакцию связывания приводило к сдвигу максимума распределения плотности, соответствующей ДНК-белковому комплексу, в сторону более низкой электрофоретической подвижности по сравнению с положением максимума комплекса, образованного р65 с ВN-концевым последовательностью без добавления -актинина (рис.10). Следовательно, взаимодействие с -актинином-4 не препятствует образованию кВ-специфического ДНК-белкового комплекса, а только изменяет его подвижность.

Рис.10. Взаимодействие Nконцевого домена р65 с Впоследовательностью в присутствии актинина.

Анализ методом торможения ДНКбелковых комплексов в геле.

Электрофореграмма и графическое представление данных, полученных с помощью программы Scion Imagе 1- ядерный экстракт (на графике зеленый). 2- N- концевой домен р65 (на графике - красный). 3- добавление -актинина в реакцию связывания N- концевого домена р65 с В-последовательностью (на графике - синий). 4 плазмида pGex, не содержащая последовательность р65. 5 - С- концевой домен р65.

Заключение Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии и биохимического анализа субклеточных фракций демонстрируют существование в цитоплазме как связанного с актиновыми структурами пула р65, так и несвязанного (диффузного). На всех этапах реорганизации актинового цитоскелета, вызванных как адгезией к фибронектину, так и воздействием ЭФР, р65 в цитоплазме обнаруживался в связи с F-актином, в области стресс-фибрилл и раффлов. Помимо этого, р65 выявлялся в дискретных актинсодержащих областях, названных пэтчами, в которых присутствовали также белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией. Накопление р65 под влиянием ЭФР в областях, связанных с фокальной адгезией, свидетельствует в пользу того, что присутствие р65 в этих областях является одним из этапов активации NF-B в клетках А431. Накопление р65 в ядре через 30 мин воздействия ЭФР, по-видимому, не связано с присутствием в клетках А431 стресс-фибрилл и раффлов. В чем заключаются различия между пулом р65, направляемым в ядро, и пулом р65, ассоциированным с актинсодержащими структурами в цитоплазме, остается пока не выясненным.

Данные о том, что -актинин-4 может взаимодействовать в реакции in vitro с Nконцевой последовательностью RelA/р65, солокализуется с RelA/р65 в области стрессфибрилл, раффлов и пэтчей на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, а также выявление этих белки в одних и тех же субклеточных фракциях, присутствие актинина-4 в ядре, где он может принимать участие в формировании В-специфичного ДНК-белкового комплекса, позволяет утверждать, что -актинин-4 является функциональным партнером р65 субъединицы NF-B и сопровождает RelA/р65 в процессе активации в цитоплазме и в ядре. Выявленные особенности локализации и распределения -актинина-1, его солокализация с р65 в цитоплазме, а также возможность прямого взаимодействия этих белков позволяют предположить, что -актинин-1 может участвовать в процессах, связанных с активацией NF-kВ. Однако вопрос о том, почему в мультибелковых комплексах после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 выявлялся только -актинин-4, как это было продемонстрировано ранее в Лаборатории биологии клетки в культуре, остается невыясненным и требует дальнейших исследований.

Выводы В клетках А431 воздействие ЭФР, приводящее к реорганизации актинового 1.

цитоскелета, стимулирует накопление р65 в ядре, причем, ядерная транслокация р65 наблюдается в условиях разборки актинового цитоскелета и не требует присутствия стресс-фибрилл и раффлов.

В цитоплазме под воздействием ЭФР наблюдается как связанное с F-актином 2.

перераспределение р65 (раффлы, стресс-фибриллы, пэтчи), так и независимое. Актинсодержащие зоны дискретной локализации р65 в цитоплазме (пэтчи), включающие актинин-1, -актинин-4, винкулин и паксиллин, описаны впервые.

Изоформы -актинина различаются между собой по локализации в разных 3.

компартментах клетки. Особенностью -актинина-1 является его локализация в перинуклеарной области, а -актинина-4 – на концах стресс-фибрилл и в ядре. На биохимическом уровне различия заключаются в выявлении разного набора укороченных форм -актининов, узнаваемых антителами к этим белкам, в цитоплазматических и ядерных подфракциях. В ядре -актинин-4 выявляется во всех ядерных подфракциях, тогда как -актинин-1 обнаруживается во фракции белков ядерной оболочки.

-Актинин является функциональным партнером р65 субъединицы NF-В в 4.

клетках А431, поскольку эти белки способны непосредственно взаимодействовать друг с другом, солокализуются в цитоплазме, могут обнаруживаться в одних и тех же подфракциях, и -актинин-4 может принимать участие в регуляции ДНК-связывающей активности NF-В.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Емельянов А.Н., А.В. Большакова, О.А. Петухова, Л.В. Туроверова, И.В. Кропачева, Г.П. Пинаев.

2005. Особенности распределения р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-B в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47 (9): 808.

2. Petukhova O., A. Emelyanov, A. Bolshakova, L. Turoverova, V.Babakov, I.Kropacheva, K-E. Magnusson, G.Pinaev. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-B/RelA in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45 th Annual Meeting. 2005. p. 100a.

3. Большакова А., Е. Емельянов, О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-B в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48 (9): 746

4. Большакова А., О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев.

2006. Распределение изоформ альфа-актинина-1 и 4 в клетках А431. Цитология. 48 (9): 747.

5. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2006.

Adhesion induced actinin 1 and actinin 4 re-distribution in A431 spread on fibronectin and laminin 2/4.

Abstracts the American Society for Cell Biology, 46-th Annual Meeting.

6. Большакова А., О. Петухова, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П Пинаев. 2007.

Структурно не связанный и связанный альфа-актинин в клетках А431. Цитология. Т49. С. 719-720.

7. Большакова А., О. Петухова. 2007. Анализ субклеточного распределения р65 субъединицы NF-B при воздействии ЭФР и адгезии клеток А431 к фибронектину. Материалы 11-й пущинской международной школы-конференции молодых ученых, 29 октября-2 ноября, Пущино. С. 71-72.

8. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007.

Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 31. Р. 360-365.

9. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007. EGF influences the sub cellular distribution of alpha actinins and NFkB in A431 cells spread on fibronectin. The American Society for Cell Biology Meeting Abstracts. Mol. Biol. Cell 18 (suppl1): 484.

10. Petukhova O., Bolshakova A., Turoverova L., Tentler D., Magnusson K.-E., Pinaev G. 2008. The distribution of RelA/p65 in the cytoplasm is actin cytoskeleton-dependant but not its nuclear translocation in A431 cells stimulated with EGF. Abstracts of 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference. Athens, Greece, June, 29th –3rd July, PP4D-14, p.254.

11. Babakov, O. Petukhova, L. Turoverova, I. Kropacheva, D. Tentler, A. Bolshakova, E. Podolskaya, K-E.

Magnusson, G. Pinaev. 2008. RelA/NF-B transcription factor associates with -actinin-4. Exp. Cell Res. 314.

Р. 1030-1038.

12. Большакова А. В., Петухова О. А., Магнуссон К.–Е., Пинаев Г. П. 2008. Альфа актинины и NF-B совместно перераспределяются в клетках А431 в разных субклеточных компартментах. Материалы 4-го съезда биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая. С.16 (№269).

13. Большакова А., Петухова О. 2008. Альфа актинин 4 взаимодействует с N-концевой последовательностью RelA/р65 in vitro и может принимать участие в формировании специфических ДНК-белковых комплексов. Сборник тезисов 12-й Пущинской международной школы-конференции Молодых ученых, 10-14 ноября, Пущино. С. 8-9.

14. Большакова А. В., О. А. Петухова, Г. П. Пинаев, К.-Е. Магнуссон. 2009. Сравнительный анализ способов субклеточного фракционирования для выявления -актинина 1 и -актинина 4 в клетках А431.

Цитология. 51 (2): 122-129.

Список цитируемой литературы Бабаков В.Н. 2004. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

Бабаков В., Кропачева И., Петухова О., Туроверова Л., Пинаев Г.П. 2004. Цитология. 46(12): 1055-1063.

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова Л.В., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Г.П.

2004. Цитология. 46(12): 1064-1072.

Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. 2004. Цитология. 46(1): 5-15.

Петухова О., Туроверова Л., Емельянов А., Кропачева И., Пинаев Г. 2005. Цитология. 47(2): 175-183.

Марзлав У. и Хуан Р. 1987. М: Мир. с. 111-115.

Araki N., Egamia Y., Watanabe Y., Hataea T. 2007. Exp. Cell Res. 313: 1496-1507.

Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. Exp. Cell Res. 256: 533-544.

Are A.F., Pinaev G.P., Burova E., Lindberg U. 2001. Cell Motil. and Cytoskeleton. 48: 24-36.

Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. New York. Plenum Press: 298.

Blobel G., Potter V.R. 1966. Science. 154: 1662-1665.

Boyer L., Travaglione S., Falzano L., Gauthier N.C., Popoff M.R., Lemichez E., Fiorentini C., Fabbri A. 2004. Mol.

Biol. Cell. 15: 1124-1133.

Вradford M. M. 1976. Anal. Biochem. 72: 525-529.

Burgstaller G., Gimona M. 2004. J. Cell Sci. 117: 223-231.

Chapman N.R., Webster G.A., Gillespie P., Wilson B.J., Crouch D.H., Perkins N.D. 2002. Biochem. J. 366: 459-69.

Chakraborty S, Reineke E.L., Lam M., Li X., Liu Y., Gao C., Khurana S., Kao H.Y. 2006. JBC. 281: 35070-35080.

Chiang E.T., Lim M.J., Patton W.F., Shepro D. 2000. J. Biochem. Biophys. Methods. 46: 53—68.

Christerson L.B., Vanderbilt C.A., Cobb M.H. 1999. Cell Motil Cytoskeleton. 43:186-198.

Clark K.A., McElhinny A.S., Beckerle M.C., Gregorio C.C. 2002. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 637–706.

Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solaro R.J., Hajjar. 2002. PNAS. 99: 6252-6256.

Demczuk S., Harbers M., Vennstrom B. 1993. Proc.Natl.Acad.Sci. 90: 2574-2578.

Dent C.L., Smith M.D., Latchman D.S. 1999. Pract. Approach 2-nd Ed. Latchman D.S. Oxford. University Press.

Dwyer N., Blobel G. 1976. The J. Cell Biol. 70: 581-591.

Fazal F., Minhajuddin M., Bijli K.M., McGrath J.L., Rahman A. 2007. JBC. 282(6): 3940–3950.

Goffart S., Franko A., Clemen C.S., Wiesner R.J. 2006. Current Genetics. 49: 125-135.

Honda K., Yamada T., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. The Journal of Cell Biology. 140(6): 1383-1393.

Hynes R.O. 1999. Trends Cell Biol. 9(12): 33-37.

Immure M., Endo T., Kuroda M., Tanaka T., Masaki T. 1988. JBC. 263: 7800-7805.

Kaverina I., Stradal T.E., Gimona M.. 2003. J. Cell Sci. 116: 4915-4924.

Kustermans G., Piette J., Legrand-Poels S. 2008. Biochem. Pharmacol. 76(11): 1310-22.

Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685.

Legrand-Poels S., Kustermans G., Bex F., Kremmer E., Kufer T. A., Piette J. 2007. J. of Cell Sc. 120: 1299-1310.

Linder S., Aepfelbacher M. 2003. Trends in Cell Biol. 13: 376-385.

Lock J.G., Wehrle-Haller B., Strmblad S. 2008. Semin Cancer Biol. 18(1): 65-76.

Luikart S., Masri M., Wahl D., Hinkel T., Beck J.M., Gyetko M.R., Gupta P., Oegema T. 2002. Biochim Biophys Acta. 1591: 99-107.

Narayanan R., Klement J.F., Ruben S.M., Higgins K.A., Rosen C.A. 1992. Science.256: 367-370.

Nemeth Z.H., Deitch E.A., Davidson M.T., Szabo C., Vizi E.S., Hasko G. 2004. J Cell Physiol. 200(1): 71-81.

Otey C.A., Carpen O. 2004. Cell Motil. Cytoskeleton. 58: 104-111.

Owen H.R., Quadroni M., Bienvenut W., Buerki C., Hottiger M.O. 2005. J.of Proteome Research. 4: 1381-1390.

Pavalko F.M., Chen N.X., Turner C.H., Burr D.B., Atkinson S., Hsieh Y.-F., Qui J., Duncan R.L. 1998. Am. J.

Physiol. 275: 1291-1601.

Poch M. T., Al-Kassim L., Smolinski S.M., Hines R.N. 2004. Toxicol. Appl. Pharm. 199: 239-250.

Ruben S.M., Narayanan R., Klement J.F., Chen C-H., Rosen C.A. 1992. Mol.Cell.Biol. 12: 444-454.

Sastry S.K., Burridge K. 2002. Exp Cell Res. 261(1): 25-36.

Selliah N., Brooks W.H., Roszman T.L. 1996. J. Immunol. 156: 3215-3221.

Schoenwaelder S.M., Burridge K. 1999. Current Opinion in Cell Biology. 11: 274-286.

Sotiropoulos A., Gineitis D., Copeland J., Treisman R. 1999. Cell. 98: 159-169.

Thanos D., Maniatis T. 1995. Cell. 80: 529-532.

Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350-4354.

Varon C., Tatin F., Moreau V., Obberghen-Schilling E.V., Fernandez-Sauze S., Reuzeau E., Kramer I., Genot E.

2006. Mol. Cell. Biol. 26: 3582–3594.

Yamada K.M., Geiger B. 1997. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

Young K.G., Kothary R. 2005. BioEssays. 27: 144-152.

Zhang Q., Skepper J.N., Yang F., Davies J.D., Hegyi L., Roberts R.G., Weissberg P.L., Ellis J.A., Shanahan C.M.

2001. J. Cell Sci. 114: 4485-4498.

Zhong H., Voll R.E., Ghosh, S. 1998. Mol. Cell. 1: 661–671.

Zhong H., May M. J., Jimi E., Ghosh S. 2002. Mol. Cell. 9: 625-636.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Отдела клеточных культур Института цитологии за помощь в работе. Особенно благодарен автор своему научному руководителю О.А. Петуховой, проф. Г.П. Пинаеву, Л.В. Туроверовой, проф. К.-Э.

Магнуссону, В.Н. Бабакову, М.Г. Хотину, Д.Е. Бобкову и Н. Шарлаимовой.






Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РОСГИДРОМЕТ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "НАУЧНОПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "ТАЙФУН" РАДИАЦИОННАЯ ОБСТАНОВКА НА ТЕРРИТОРИИ РОС...»

«Ученые записки Таврического национального университета имени В. И. Вернадского Серия "География". Том 27 (66), № 2. 2014 г. С. 3–15. РАЗДЕЛ 1. ФИЗИЧЕСКАЯ ГЕОГРАФИЯ И ГЕОЭКОЛОГИЯ УДК 620.91:712.253.58 "ЗЕЛЁНАЯ" ЭНЕРГЕТИКА В САДОВО-ПАРКОВЫХ КОМПЛЕКСАХ Баг...»

«Пояснительная записка к рабочей программе по биологии для 9 класса Программа разработана на основе Федерального компонента государственного стандарта основного общего образования и Федерального базисного учебного плана, в соответствии с которым на изучение биологии в 9 классе выделено 68....»

«Бюллетень Никитского ботанического сада. 2010. Вып. 100 29 ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНОЙ И ПРИРОДООХРАННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОТДЕЛА ОХРАНЫ ПРИРОДЫ НБС–ННЦ, ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА "МЫС МАРТЬЯН" (1973-2010 гг.) И.И. МАСЛОВ, докт...»

«Утвержден решением Совета директоров ОАО "Колымаэнерго" Протокол № 8 от 03.08.2012 года КОДЕКС КОРПОРАТИВНОЙ ЭТИКИ ОАО "КОЛЫМАЭНЕРГО" 2012 год Термины и определения В Кодексе корпоративной этики ОАО "Колымаэнерго" употребляются следующие термины: "Общество" ОАО "Колымаэнерго"; ОАО "РусГидро" О...»

«Православие Православная версия происхождения зла "Мельников И.В." Православная версия происхождения зла / "Мельников И.В.", 2012 — (Православие) ISBN 978-5-457-19379-6 В основе всех религий лежит понимание того, что такие совершенные и сложно устроенные...»

«Песков В.Н., Тарасенко М.О., Франчук М.В. 82 Изменчивость линейных размеров. птенцов обыкновенного жулана УДК 598.292:591.3 ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ, ПРОПОРЦИЙ ТЕЛА И ПЕРИОДИЗАЦИЯ РАЗВИТИЯ...»

«Авессалом Подводный Серия "Целительство" ЭКОЛОГИЯ ЕДОКА "Аквамарин" ББК 51.230 УДК 615.874.2 П44 Авессалом Подводный "Экология едока", Москва, "Аквамарин", 2013 г. – 134 с. Каковы тенденции современной диетологии? Как работает...»

«8.2016 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ПОЧВОВЕДЕНИЕ SOIL SCIENCE Воропаев В. Н., Астахов Ю. А. Мониторинг содер Voropaev V. N., Astakhov Yu. A. Monitoring of the жания меди в почвах реперных участков. 2 copper content in reference sites of soils. 2 Хамидов М. Х., Жураев У. А. Влияние орошения Khamidov M., Jurayev...»

«1 Пояснительная записка Рабочая программа по обществознанию для 7-9 классов составлена в соответствии с нормативными и инструктивнометодическими документами Министерства образования Российской Федерации 1. "Об утверждении федерального компонента госу...»

«RU 2 378 624 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК G01F 23/296 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008111535/28, 27.03.2008 (72) Автор(ы): Казин...»

«Внеклассное мероприятие для учеников 1-4 классов " Помоги птицам перезимовать" Цель: Расширить знания детей о птицах, вызвать сочувствие к голодающим и замерзающим зимой птицам, учить проявлять заб...»

«Серия Wind Top AE2282 All-in-One (AIO) PC Модель MS-AC7B/ AC7C Введение Содержание Авторские Права iii Товарные Знаки iii Журнал Изменений iii Модернизация и Гарантия iv Приобретение Сменных Деталей iv Техническая Поддержка iv Особенности продукцииiv Экологическая политика v Информация о Х...»

«ПЕДАГОГИКА ИСКУССТВА ЭЛЕКТРОННЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ УЧРЕЖДЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ОБРАЗОВАНИЯ "ИНСТИТУТ ХУДОЖЕСТВЕННОГО ОБРАЗОВАНИЯ" http://www.art-education.ru/AE-magazine/ №2, 2011 актуальные тенденции в развитии художественног...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.