WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 


«Труды БГУ 2015, том 10, часть 1  Молекулярная биология  УДК 579.841.11:575.113:575.224.46 СОЗДАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ НОКАУТА ...»

Труды БГУ 2015, том 10, часть 1  Молекулярная биология 

УДК 579.841.11:575.113:575.224.46

СОЗДАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ НОКАУТА PSRA-ГЕНА

БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SSP. АURANTIACA

Ю.А. Шилова, М.В. Нащёкина, Е.Г. Веремеенко, Н.П. Максимова

Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь

e-mail:veremeenkoKatya@yandex.ru

Введение

Регуляция экспрессии генов, кодирующих синтез феназиновых антибиотиков у бактерий рода Pseudomonas, представляет собой сложный каскад, включающий глобальную регуляторную GacS/GacA-систему, транскрипционные факторы PsrA (от англ.

Pseudomonas sigma regulator) и Pip, сигма фактор RpoS (S), а также QS- систему [1].

Существуют литературные данные о значительной роли транскрипционного фактора PsrA в регуляции активности генов, ответственных за синтез компонентов систем секреции III типа и ряда вторичных метаболитов, таких как антибиотики, факторы вирулентности, экзоферменты и рамнолипиды [2, 3, 4]. Помимо влияния на продукцию вторичных метаболитов и активацию rpoS в настоящее время показано, что PsrA участвует в регуляции формирования биопленок, сворминга и адгезии [5], ингибирует транскрипцию оперона деградации длинноцепочечных жирных кислот fadBA5 [4], подавляет транскрипцию оперона, включающего гены биосинтеза антибиотика 2,4диацетилфлороглюцинола [6] у бактерий P. aeruginosa PAO1, а у P. putida KT2440 положительно влияет на продукцию запасных источников углерода и энергии – полигидроксиалконоатов [7].

Продукт psrA-гена относится к TetR семейству регуляторных белков и, как и другие члены данного семейства, содержит в своей структуре ДНК-связывающий домен.

Показано, что PsrA распознает палиндромную последовательность C/GAAAC N2–4 GTTTG/C и, в зависимости от ее расположения относительно первого транскрибируемого кодона, может служить как активатором, так и ингибитором транскрипции [8]. К примеру, PsrA связываясь с ДНК в области промотора (20)–(+18) ингибирует транскрипцию собственного гена, а при связывании в области –(59–35) промотора гена rpoS активирует транскрипцию последнего у P. putida WCS358 [8]. Активная форма белка представляет собой гомодимер с конусообразным туннелем между субъединицами, в котором происходит взаимодействие с эффекторной молекулой длинноцепочечной жирной кислоты. Такое взаимодействие изменяет конформацию молекулы белка, что препятствует связыванию транскрипционного фактора с ДНК [9].

Вместе с тем, роль данного гена в регуляции синтеза феназиновых антибиотиков изучена слабо, также как неизвестными остаются и его белки-партнеры, опосредующие такого рода регуляцию. Различными авторами приводятся противоречивые данные, касающиеся значения PsrA-белка для синтеза различных производных феназин-1карбоксилата даже у представителей одних и тех же штаммов. Так продемонстрировано, что у штамма Pseudomonas chlororaphis PCL1391 при росте в питательной среде Kинг B PsrA-белок ингибирует продукцию феназин-1-карбоксамида [10], а в среде MVB1 – активирует [11]. Стоит отметить, что подобного рода противоречия присутствуют и в работах других авторов, занимающих изучением системы секреции III типа, ответственных за выделение ряда экзотоксинов у бактерий Pseudomonas aeruginosa [3, 9].

Выяснение роли psrA-гена в регуляции синтеза феназинов у бактерий P. chlororaphis ssp. aurantiaca имеет не только практическое значение в связи с расширением возможностей конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов данных соединений, но и носит фундаментальный характер, поскольку позволяет более детально конкретизировать место данного белка в глобальной регуляции синтеза вторичных Труды БГУ 2015, том 10, часть 1  Молекулярная биология  метаболитов, а также попытаться установить его значение в проявлении патогенных свойств бактерий P. aeruginosa.





В связи со всем вышесказанным, целью данного исследования являлось создание генно-инженерной конструкции на основе интегративного суицидального вектора pK1mob для направленной инактивации psrA-гена Методы исследования В работе использовали штамм P. chlororaphis ssp. aurantiaca B-162, полученный из коллекции кафедры генетики БГУ (коллекционный номер КМБУ В-162). Для клонирования использовался штамм E. coli XL-1Blue (FproABlaclqlacZM15Tn10/recA1gyrA96(Narr)thihsdR17supE44relA1lac). Первоначальное клонирование исследуемых фрагментов осуществлялось в вектор pTZ57R/T («MBI Fermentas», Литва). В экспериментах по проведению инсерционного сайт-специфического мутагенеза использовали штамм E. coli BW19851 (recA, RP4 tra, uidA::pir+) из коллекции кафедры молекулярной биологии БГУ и суицидальный интегративный вектор pK18mob [12]. Культивирование бактерий осуществляли в стандартных питательных средах LB и питательном бульоне, приготовленном на основе сухого концентрата, производства фирмы ФГУП «НПО Микроген» (Махачкала) и на агаризованных полноценных питательных средах при температуре 37°С (E. coli) и 28°С (P. chlororaphis ssp. aurantiaca). Тотальную ДНК выделяли фенольным методом. Выделение плазмиды, трансформацию и электрофорез проводили согласно стандартным протоколам [13, 14]. Выделение ДНК из агарозного геля осуществлялось с использованием коммерческого набора GeneJETTM Gel Extraction Kit («MBI Fermentas», Литва). Лигирование и рестрикцию проводили в смеси стандартного состава, в условиях, рекомендованных фирмой-производителем («MBI Fermentas», Литва).

Праймеры для ПЦР полноразмерного гена psrA были сконструированы на основе информации из базы данных нуклеотидных последовательностей GeneBank.

Последовательность прямого праймера: 1P gcggatccGAGTAGCCATGGCCCA;

последовательность обратного праймера – 2P gcggatccACGGTCAGGCCTTGGC (курсивом выделены сайты для рестриктазы BamHI). ПЦР проводили в смеси стандартного состава с использованием программируемого термостата ThermoHybaib PX2. Параметры циклов амплификации для полноразмерного PsrA гена были следующими первичная денатурация – 2 мин при 94С; затем 30 циклов: денатурация – 94С, 1 мин; отжиг – 52С, 30 с; элонгация

– 72С, 1 мин; заключительная достройка – 72С, 10 мин.

Секвенирование ДНК проводили с использованием набора «BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit» (производитель «Applied Biosystems», США) на секвенаторе ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (производитель «Applied Biosystems», США).

Для амплификации серединного участка гена размером 230 п.о. на основе сиквенса были сконструированы праймеры: 1S – ggatccCATGAAGTGCACAACG и 2S – ggatccAGAGCTGCTGGAAATC (курсивом выделены сайты для рестриктазы BamHI).

Параметры амплификации: первичная денатурация – 1 мин при 94С; затем 10 циклов:

денатурация – 94С, 30 с; отжиг – 59С, 30 с; элонгация – 68С, 1 мин; 20 циклов:

денатурация – 94С, 30 с; отжиг – 53С, 30 с; элонгация – 68С, 1 мин заключительная достройка – 70С, 5 мин Конъюгация бактерий P. chlororaphis ssp. aurantiaca со штаммом E. coli BW198512, содержащим плазмиду pK18mob230psrA проводилась по следующей методике: измерив OD600 для ночных культур клеток донора и реципиента, сделать пересчет по графику зависимости OD600 от КОЕ. Смешать клетки донора и реципиента в соотношении 1:5, при этом количество клеток реципиента должно быть равно 1109. Отмыть клетки в физиологическом растворе. Перенести каплями на поверхность твердой агаризованной среды, после впитывания капель инкубировать 1 сутки при 28°С (здесь и далее режим оптимальный для реципиента). Выросшие в медальонах клетки отмыть в физиологическом растворе. При размере области гомологии в суицидальном векторе около 750 п.о. на Труды БГУ 2015, том 10, часть 1  Молекулярная биология  селективную среду (полноценный агар с канамицином 50 мкг/мл и левомицетином 200 мкг/мл.) высевали культуры в разведении 101 и 102, при размере области гомологии 230 п.о. высев культур осуществляли без разведения. Инкубировали 48 часов при 28С.

Для идентификации инсерции генно-инженерной конструкции на основе плазмиды pK18mob в область хромосомного psrA-гена проводили ПЦР-анализ с использованием смеси полимераз Taq и Pfu и праймеров к полноразмерному гену. ПЦР-анализ на наличие генно-инженерной конструкции в составе бактериальной хромосомы осуществляли по следующей программе амплификации: первичная денатурация – 3 мин при 94С; затем 30 циклов: денатурация – 94С, 1 мин; отжиг – 55С, 30 с; элонгация – 68С, 3 мин;

заключительная достройка – 68С, 5 мин. Использовали ПЦР-амплификатор С1000 TouchTM Thermal Cycler BIO RAD Результаты и обсуждение Широко известно, что сайт-направленный инсерционный мутагенез является эффективным генетическим подходом, позволяющим точно установить роль в регуляции биологических процессов продукта того или иного гена. В связи с этим, было сделано предположение, что направленная инактивация psrA гена позволит конкретизировать его влияние на уровень продукции феназиновых антибиотиков у бактерий P. chlororaphis ssp.

aurantiaca B-162.

В серии предыдущих исследований было осуществлено клонирование полноразмерного гена psrA бактерий изучаемого штамма P. chlororaphis ssp. aurantiaca BДля этого были разработаны праймеры, включающие кодирующую последовательность psrA гена и дополнительно несколько нуклеотидов правее и левее неё.

В качестве матрицы для амплификации psrA гена использовали тотальную ДНК бактерий дикого типа В-162. Размер полученного ПЦР-продукта составил 750 п.о. [15].

Затем было осуществлено клонирование полученного ПЦР-фрагмента в составе вектора pTZ57R/T, после чего рекомбинантную конструкцию перенесли в клетки штамма E. coli XL1-Blue. Последующий рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды pTZ57R/TpsrA производили с использованием рестриктаз SmaI и BamHI. Проведенная ПЦР-амплификация в присутствии специфических праймеров и ДНК этой плазмиды в качестве матрицы, подтвердили наличие в ее составе вставки, идентичной по размерам ПЦР-продукту psrA гена (750 п.н.).

Для окончательной идентификации клонированного фрагмента было осуществлено его полное секвенирование и соответствующая нуклеотидная последовательность psrA-гена бактерий P. chlororaphis ssp. aurantiaca B-162 помещена в базу данных GenBank (accession number BankIt1812739 Seq1 KR063269). Секвенирование и последующий анализ полученных результатов продемонстрировали, что, несмотря на небольшие различия в нуклеотидной последовательности (примерно в 5 нуклеотидов), аминокислотная последовательность PsrA белка полностью идентична таковой для соответствующих молекул из других штаммов P. chlororaphis, что может быть объяснено вырожденностью генетического кода [16].

Для получения штамма с дефектным psrA-геном на основе сиквенса были построены праймеры к центральной области гена, несущие навески для рестриктазы BamHI.

Полученный продукт размером 230 п.о. был клонирован в вектор pTz57R/T в клетках штамма E. coli XL1-Blue (рисунок 1), а затем был переклонирован в составе суицидального интегративного вектора pK18mob, линеаризованного по той же рестриктазе.

В связи с необходимостью конъюгативного переноса созданной генно-инженерной конструкции в клетки бактерий P. chlororaphis ssp. aurantiaca B-162, на начальном этапе вектор pK18mob230psrA был трансформирован в клетки штамма E. coli BW19851. При последующей конъюгации данного штамма с исследуемым штаммом В-162 были получены и отобраны 80 трансконъюгантов.

–  –  –

Для выявления вставки генно-инженерной конструкции в область хромосомального psrA гена на следующем этапе работы был проведен ПЦР-анализ тотальной ДНК трансконъюгантов с использованием праймеров к полноразмерному гену. Ожидалось, что после инсерции созданной конструкции в нужную область бактериального генома будет наблюдаться исчезновение ПЦР-сигнала, соответствующего нативному psrA гену (в 750 п.о.) и появится сигнал, соответствующий по размеру нативному гену со вставкой полноразмерной плазмиды pK18mob и клонированного фрагмента в 230 п.о. Таким образом, размер ожидаемого ПЦР-продукта должен составлять около 4770. Полученные в ходе экспериментов данные полностью подтвердили теоретически ожидаемые результаты (рисунок 2). Таким образом, можно говорить о том, что были получены истинные мутанты с инактивированным psrA геном. На следующих этапах работы планируется проведение экспериментов по выяснению влияния данной мутации на уровень продукции феназинов у полученных трансконъюгантов.

–  –  –

Список литературы

1. A Novel Activator of Phenazine Biosynthesis in Pseudomonas chlororaphis PCL1391 / G. Girard [et al.] // J. of Bacteriology. – 2006. – V. 188, № 23. – P. 8283–8293.

2. Novel target genes of PsrA transcriptional regulator of Pseudomonas aeruginosa / M.

Kojic [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2005. – V. 246. – P. 175–181.

3. PsrA Is a Positive Transcriptional Regulator of the Type III Secretion System in Pseudomonas aeruginosa / D.K. Shen [et al.] // Infection and immunity. – 2006. – V. 74, № 2. – P.

1121–1129.

4. The Pseudomonas aeruginosa PsrA responds to longchain fatty acid signals to regulate the fadBA5 b-oxidation operon / Kang Y. [et al.] // Microbiology. – 2008. – V. 54. – P. 1584–1598.

5. Induction by Cationic Antimicrobial Peptides and Involvement in Intrinsic Polymyxin and Antimicrobial Peptide Resistance, Biofilm Formation, and Swarming Motility of PsrA in Pseudomonas aeruginosa / J.W. Gooderham [et al.] // J. of Bacteriology. – 2008. – V. 190. – P.

5624–5634.

Труды БГУ 2015, том 10, часть 1  Молекулярная биология 

6. Wu X. Multiple-Level Regulation of 2,4-Diacetylphloroglucinol Production by the Sigma Regulator PsrA in Pseudomonas fluorescens 2P24 / Wu X., Liu J., Zhang W., Zhang L. // PLoS ONE. 2012. V. 7. Issue 11. P. 1-10

7. Fonseca, P. A role for the regulator PsrA in the polyhydroxyalkanoate metabolism of Pseudomonas putida KT2440 / Fonseca P., de la Pena F., Prieto M.A. // Int. J. of Biological Macromolecules. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.04.014

8. Kojic, M. TetR family member psrA directly binds the Pseudomonas rpoS and psrA promoters / Kojic M., Aguilar C., Venturi V // J. Bacteriol. – 2002. – V. 184. – P. 2324–2330.

9. The long-chain fatty acid sensor, PsrA, modulates the expression of rpoS and the type III secretion exsCEBA operon in Pseudomonas aeruginosa / Y. Kang [et al.] // Molecular Microbiology. – 2009. – V. 73, № 1. – P. 120–136.

10. The Pseudomonas chlororaphis PCL1391 Sigma Regulator psrA Represses the Production of the Antifungal Metabolite Phenazine-1-Carboxamide / T.F.C. Chin-A-Woeng [et al.] // MPMI. 2005. – V. 18, № 3. – P. 244–253.

11. Regulatory roles of psrA and rpoS in phenazine-1-carboxamide synthesis by Pseudomonas chlororaphis PCL1391 / G. Girard [et al.] // Microbiology. – 2006. – V. 152. – P. 43–58.

12. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum / A. Schafer [et al.] // Gene. – 1994. – V. 145. – P. 69–73.

13.. Samdrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russel. – 3rd ed. – New York: Сold Spring Harbor Laboratory. P. 2001–2344.

14. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т.

Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук; под ред. А.А. Баева. – Москва: Мир, 1984. – С. 480

15. Генетические подходы конструирования продуцентов феназиновых антибиотиков на основе бактерий Pseudomonas chlororaphis ssp. aurantiaca / Е.Г. Веремеенко [и др.] // Сб.

научн. трудов Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Том 7. – Минск: Белорусская наука, 2015. С. 17–32.

16. Шилова, Ю.А. Клонирование регуляторного psrA-гена бактерий Pseudomonas aurantiaca / Ю.А. Шилова, Е.Г. Веремеенко // Сборник работ 71-й научной конференции студентов и аспирантов Белорусского Государственного Университета, Минск, 18–21 мая

2014. Часть 1 / Минск: Издательский центр БГУ, 2014. – С. 273–276.

CREATION OF GENETIC ENGINEERING CONSTRUCT FOR GENE PSRA

KNOCKOUT IN BACTERIA PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SSP. AURANTIACA

Y.A. Shilova, M.V. Naschokina, E.G. Veremeenko, N.P. Maximova Belarusian State University, Minsk, Belarus e-mail:veremeenkoKatya@yandex.ru Rhizosphere bacteria P. chlororaphis ssp aurantiaca B-162 are producers of phenazine antibiotic which can exhibit activity against a wide range of pathogens. Transcription factor PsrA takes part in regulation of phenazine synthesis, but the specific role of this protein in controlling of phenazine production has not been established. The goal of this research was the creation of genetic engineering construction for targeted inactivation of psrA-gene, which would allow to definitely determine the functional significance of this protein in the regulatory chain of phenazine antibiotics synthesis in bacteria Pseudomonas chlororaphis ssp. aurantiaca. Creation of this construction was based on an integrative suicidal vector pK18mob, carrying a homology region of 230 bp corresponding to the central part of psrA-gene. With help of such construction, 80 transconjugants were selected. It is planned to conduct a study of phenazine antibiotics level in genetically engineered strains.






Похожие работы:

«Приложение к основной образовательной программе основного общего образования муниципального бюджетного общеобразовательного учреждения "Средняя общеобразовательная школа №5", принятой на з...»

«АнАтолий КоЧнЕВ, ЭдуАрд Здор Добыча и использование белого медведя на Чукотке результаты исследований 1999–2012 гг. УДК 639.111.77:502.313:39(=55) ББК 47.1 + 28.688 К755 Рецензенты: Л.С. Богословская, доктор...»

«For Official Use ENV/EPOC/EAP/MIN(2004)2 Organisation de Coopration et de Dveloppement Economiques Organisation for Economic Co-operation and Development _ _ Russian Or. English ENVIRONMENT DIRECTORATE ENVIRONMENT POLICY COMMITTEE For Official Use ENV/EPOC/EAP/MIN(2004)2 TASK FORCE FOR THE IMPLEMENTATION OF...»

«МЫСЯКИНА Ирина Сергеевна ЛИПИДЫ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, ДИМОРФИЗМЕ И АДАПТАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ 03.00.07 микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2009 Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии Учреждения Российской академии наук Институте микроб...»

«Для экологического номера Journal of Eurasian Research в 2004 г. Экологическое образование в сообществах Евгений Патаракин, Сергей Шустов Ключевые слова: экологическое образование, сетевые сообщества Введение В последнее время экологическое образование переживает трудные времена. Ре...»

«Экологическое общество "Зеленое спасение" Республика Казахстан, Алматы, 2008 К Третьему совещанию сторон Орхусской конвенции For the Third Meeting of the Parties to the Aarhus Convention The Ecological Society Green Salvation The Republic of Kazakhstan, Almaty, 2008 ББК 20.1 К 11 Электронные версии публикаций Экологического общества "Зеленое спасение" мо...»

«2 СОСТАВИТЕЛЬ: Галина Сергеевна Полюхович, старший преподаватель кафедры физиологии человека и животных Белорусского государственного университета РЕЦЕНЗЕНТЫ: Валентина Михайловна Рубахова, ведущий научный сотрудник ГНУ "Институт физиологии НАН Беларуси", кандидат биологических наук, доцент; Леонид Дмитриевич Бурко,...»

«4’ 2013 4’ 2013 И. П. Айдаров, доктор технических наук А. И. Голованов, доктор технических наук Д. П. Гостищев, доктор технических наук Г. Х. Исмайылов, доктор технических наук А. Е. Касьянов, доктор технических наук А. М. Марголин, доктор экономических наук И. П. Свинцов, доктор сельскохозяйств...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.