WWW.KN.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:   || 2 |

«Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ»

На правах рукописи

АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

Серотипы и устойчивость к антибиотикам

штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных

у детей при респираторных инфекциях

03.02.03.- микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Маянский Николай Андреевич Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………....

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………...……………

1.1. История изучения и общая характеристика пневмококков……….

1.2. Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие пневмококка………………………………………………………………...

1.3. Антибиотикорезистентность пневмококка и генетические механизмы устойчивости к бета-лактамам и макролидам…………….

1.4. Генетическое разнообразие пневмококков………………………… РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………..

Глава 2. Спектр циркулирующих серотипов пневмококка……….

..

Глава 3. Молекулярное типирование чистой культуры S.



pneumoniae с помощью мультиплексной ПЦР………………………………………… 51 Глава 4. Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов полирезистентных штаммов………………………………..……………... 56 Глава 5. Детекция ДНК бактериальных отопатогенов в жидкости среднего уха у детей с острым средним отитом с использованием ПЦР в реальном времени………………………………………………….

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………. 70 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… 77 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………...……… 78

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ

РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………. 79 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………….. 80

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Streptococcus pneumoniae (пневмококк) является ведущей причиной респираторных инфекций бактериальной этиологии, включая острый средний отит (ОСО), синусит и внебольничную пневмонию. Кроме того, пневмококк может вызывать такие тяжелые инвазивные инфекции, как менингит, бактериемия и бактериемическая пневмония, которые связаны с высокой летальностью. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, от пневмококковых инфекций ежегодно умирают около 1 млн. детей в возрасте до 5 лет [3].

В РФ заболеваемость внебольничной пневмонией в детской популяции оценивается в 5-12 случаев на 1000, и она наиболее высока у детей в возрасте младше 5 лет. При этом у 80% пациентов из указанной возрастной группы болезнь связана с пневмококком [1]. При бактериальном менингите у детей до 5 лет пневмококк обнаруживают в 2-20% этиологически расшифрованных случаев, что соответствует заболеваемости 4-8 случаев на 100 000 детей этого возраста [14].

Самой частой клинической формой пневмококковой инфекции у детей является ОСО. К возрасту трех лет 80% детей переносят хотя бы один эпизод ОСО, а к семи годам 40% переносят шесть и более рецидивов этой инфекции [105]. В большинстве случаев нетяжелая инфекция, ОСО может стать причиной снижения слуха и повлиять на когнитивное и интеллектуальное развитие ребенка. Более того, во всем мире ОСО служит самым частым поводом для обращения за медицинской помощью и назначения антибиотиков в педиатрической практике, налагая серьезное бремя на ресурсы здравоохранения [82].





Широкое и нередко необоснованное назначение антибиотиков при респираторных инфекциях у детей без учета их этиологии служит одним из основных факторов, определяющих рост антибиотикорезистентности пневмококка. За последние 30 лет распространенность устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка выросла во всем мире. В зависимости от региона доля нечувствительных к пенициллину изолятов колеблется от 5 до 50%, к макролидам – от 5 до 80% [95; 121]. Вызывает обеспокоенность появление пневмококков с множественной устойчивостью (т.е. полирезистентностью – нечувствительностью к 3 и более группам антибиотиков), доля которых в некоторых странах достигает 30-50%. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Выраженная региональная вариабельность резистентности S. pneumoniae диктует необходимость получения данных о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России [12;

25].

В последние годы для профилактики пневмококковых инфекций широко используют пневмококковые полисахаридные конъюгированные вакцины (ПКВ), эффективность которых была показана во многих странах, внедривших ПКВ в Национальные календари иммунизации [21;

103; 125]. В состав ПКВ входят капсульные полисахариды от 7 до 13 серотипов S. pneumoniae, которые обеспечивают серотип-специфический иммунный ответ. К настоящему времени описано более 90 серотипов пневмококков, однако вирулентность их неодинакова, и большинство инвазивных пневмококковых инфекций связано с ограниченным набором (не более 15-20) клинически значимых серотипов [8; 16; 21;

125]. При создании ПКВ учитывалась распространенность серотипов, с которыми было связано основное число тяжелых пневмококковых инфекций в США и странах Европы, и именно эти серотипы были включены в состав ПКВ7 (вакцинные серотипы). Однако спектр циркулирующих серотипов S. pneumoniae может варьировать в разных странах, поэтому требуются региональные данные о наиболее актуальных серотипах пневмококка для создания новых вакцин вакцин и изучения их эпидемиологической эффективности [2; 24; 125]. В связи с этим изучение серотипового пейзажа S. pneumoniae на конкретной территории является важным методом эпидемиологического контроля, который позволит оценить эффективность вакцинации и ее влияние на эволюцию пневмококка.

Таким образом, пневмококковые инфекции являются серьезной клинико-микробиологической проблемой, заслуживающей особого внимания. Это объективно обосновывает необходимость дальнейшего слежения за серотипами пневмококка, распространенности его резистентных штаммов, преобладающими генетическими механизмами лекарственной устойчивости, клональными характеристик циркулирующей популяции бактерий в целях улучшения профилактики и лечения заболеваний, связанных с этим возбудителем.

Степень разработки темы исследования Одни из первых работ по серотипированию пневмококков при помощи специфических сывороток принадлежат немецкому бактериологу Фреду Нейфельду [53]. К настоящему времени в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка, разделенных на серотипы и серогруппы по антигенной структуре [96, 101].

В последние годы наиболее актуальной представляется проблема резистентности пневмококков. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Литературные данные о региональных особенностях резистентности S. pneumoniae свидетельствует о необходимости получения сведений о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России [12, 25], поскольку именно региональные данные крайне важны для понимания тенденций распространения серотипов и резистентности пневмококков на конкретной территории. Первичная селекция и распространение резистентных штаммов микроорганизмов происходит в отдельных популяциях, затем устойчивые клоны могут распространиться на значительные территории, преодолевая границы государств и континентов.

Идентификация устойчивости к антибиотикам, описание географии и динамики распространения резистентных штаммов имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку будут способствовать совершенствованию существующих антибактериальных препаратов и снижению вероятности возникновения резистентности.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Охарактеризовать спектр серотипов и распространенность устойчивости к антибиотикам клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве.

Задачи исследования:

1. Описать актуальный серотиповой пейзаж изучаемых клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве за 2009-2013гг.

2. Модифицировать схему типирования, основанную на мультиплексной полимеразной цепной реакции, в соответствии с данными об актуальных серотипах S. pneumoniae и сравнить результаты серологического и молекулярного метода типирования.

3. Определить распространенность устойчивых штаммов штаммов S.

pneumoniae к основным антибактериальным препаратам.

4. Охарактеризовать клональную структуру полирезистентных штаммов S. pneumoniae. Определить молекулярные механизмы резистентности к макролидам у выделенных штаммов S. pneumoniae.

5. Оценить диагностическую значимость выявления специфической ДНК при остром среднем отите у детей и определить структуру его бактериальных возбудителей.

Научная новизна работы На основании исследования 863 клинических штаммов, выделенных от детей с респираторными инфекциями в г. Москве в период 2009-2013гг., охарактеризован современный серотиповой пейзаж пневмококков и установлено, что 69,4% из них относится к 6 доминирующим серотипам: 3, 6A, 6B, 14, 19F и 23F. Оценка полноты охвата циркулирующих серотипов имеющимися пневмококковыми конъюгированными вакцинами показала целесообразность использования вакцин с расширенным спектром серотипов (13валентная пневмококковая конъюгированная вакцина).

Получены новые данные о распространенности устойчивости к антибиотикам актуальных штаммов пневмококка, циркулирующих у детей в Москве в настоящее время. Показано, что 27% штаммов нечувствительны к пенициллину, 26% резистентны к макролидам, а 22% обладают полирезистентностью.

Показано, что ведущим молекулярным механизмом резистентности изучаемых штаммов S. pneumoniae к макролидам является рибосомальное метилирование с участием гена ermB который определяется у 85% макролид-резистентных штаммов, причем у 31% штаммов он сочетается с эффлюксным механизмом.

С помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования впервые охарактеризована популяционная генетическая структура полирезистентных штаммов S. pneumoniae в Москве и показано, что большинство из них (57%) относится к четырем клональным комплексам (СС63, СС156, СС230 и СС320), которые распространены во всем мире.

Модифицирована схема мультиплексного молекулярного типирования пневмококков на основе полимеразной цепной реакции, которая позволяет типировать 90,5% штаммов за первые три реакции.

Теоретическая и практическая значимость исследования Сведения о современном серотиповом пейзаже клинических штаммов пневмококков дают представление о полноте их охвата существующими пневмококковыми конъюгированными вакцинами на конкретной территории.

Полученные данные о сиквенс-типах S. pneumoniae, указывающие на генетическую гетерогенность штаммов, создают основу для мониторинга генетической структуры полирезистентных штаммов пневмококка в нашей стране. Информация о полученных сиквенс-типах размещена в международной базе данных PMEN.

Проведен сравнительный анализ серологического и молекулярного метода типирования пневмококка. Подтверждена надежность молекулярного метода и возможность его использования в рутинной практике.

Знания об этиологической структуре возбудителей острого среднего отита и распространенности устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка будут способствовать оптимизации эмпирической антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Молекулярное типирование с помощью модифицированной мультиплексной ПЦР является адекватным и надежным методом, который можно использовать для идентификации серотипа у 90,5% циркулирующих штаммов пневмококка на основании первых трех реакций.

Впервые показана высокая чувствительность молекулярногенетического метода непосредственно в биопробе при этиологической диагностике острого среднего отита у детей вне зависимости от приема антибактериальных препаратов, предшествовавшего сбору биоматериала.

Результаты исследований и разработок внедрены в научноисследовательскую работу лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии и лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД., а также в материалы лекций по рациональной антибактериальной терапии при болезнях дыхательных путей у детей и используются в учебной программе на кафедре педиатрии в ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.

Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с серотипами и антибиотикоустойчивостью клинических штаммов S.

pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г.

Москве.. Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов.

Описание исследованных образцов В исследование включены все штаммы S. pneumoniae, выделенные в лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД в период с марта 2009 г. по апрель 2013 г. Пневмококк выделяли из образцов, полученных от детей из Москвы (медиана возраста 3,5 года, межквартильный интервал 1 месяц – 6,0 лет) с симптомами острой респираторной инфекции предположительно бактериальной этиологии, с ОСО, а также с хроническими болезнями легких. Часть образцов была получена в ходе реализации многоцентрового проекта «Определение роли пневмококковой инфекции в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационарные отделения лечебных учреждений г. Москвы в 2011–2012 годах в целях оптимизации терапии и профилактики заболевания» [4].

Исследовали несколько типов образцов, включая назофарингеальные мазки, материал из нижних дыхательных путей (мокрота, трахеальный аспират, бронхоальвеолярный лаваж), жидкость среднего уха (ЖСУ) от детей с ОСО, полученную с помощью тимпаноцентеза или после спонтанного прорыва барабанной перепонки.

В связи с тем, что эти штаммы не были связаны с инвазивными пневмококковыми инфекциями, в нашей работе используется термин «неинвазивные штаммы». Образцы отбирали с помощью набора eSWAB Collection Kit (Copan Diagnostics, Италия), состоящего из зонда и контейнера с транспортной средой, и доставляли в течение 4-24 часов в лабораторию микробиологии ФГБНУ НЦЗД для исследования. У пациентов документировали возраст, тип материала, прием антибиотиков в течение последних 3 дней до взятия образца.  Культуральные микробиологические исследования Для микробиологического анализа использовали расходные материалы и оборудование производства BioMerieux (Франция), если не указано иное. Посев биоматериала производили на питательный агар (Columbia, Bio-Rad, Франция) с добавлением 3% донорской эритроцитарной массы крови человека и 3% лошадиной сыворотки.

Образцы ЖСУ наносили также на «шоколадный» агар, содержащий 10 мкг/мл НАД, который добавляли в предварительно охлажденную до 50С среду. Посевы инкубировали в термостате с повышенным содержанием СО2 (5%) при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч.

Идентификацию пневмококка проводили на основании морфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста с оптохином и реакции латекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit).

Выделенные культуры H. influenzae идентифицировали на основании изучения морфологии, культуральных свойств, потребности в факторах роста X и V в системе API NH. Бета-гемолитические стрептококки дифференцировали по чувствительности к бацитрацину (Bacitracin, HiMedia, Индия) и методом латекс-агглютинации с реагентом Slidex Strepto Kit. Пневмококковые изоляты хранили в бульоне (Nutrient Broth, HiMedia, Индия) с добавлением 17% глицерина при -80°С.

У пациентов с ОСО положительным культуральным результатом считали выделение из ЖСУ этиологически значимых бактерий, к которым относили Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis [9; 66; 92; 139]. Отрицательным культуральным результатом считали отсутствие бактериального роста или рост другой (этиологически незначимой) микрофлоры. Случай микробиологически подтвержденного бактериального ОСО определяли как эпизод ОСО, при котором у пациента с одно- или двухсторонним процессом из одного или обоих образцов ЖСУ был выделен значимый возбудитель в виде монокультуры или в ассоциации. При наличии в ЖСУ у одного пациента 2 и более видов патогенов каждый патоген считали этиологически значимым и учитывали при расчете его доли в структуре этиологии ОСО.

Серотипирование пневмококков с помощью антисывороток Серологическое типирование S. pneumoniae проводили в реакции латексной агглютинации (Рисунок 1) и/или реакции набухания капсулы по Нейфельду (Рисунок 4).

Рисунок 1. Реакция латекс-агглютинации.

Примечание: А – положительная реакция, Б – отрицательная реакция.

–  –  –

физиологического раствора, в который помещали небольшое количество чистой культуры пневмококка, в течение 5 - 8 сек. Положительную реакция (появление хлопьев, т.е. агглютинация) определяли невооруженным глазом в течение 5 - 10 сек, но не более 30 сек. (Рисунок 1). Для проведения реакции Нейфельда на предметное стекло наносили 1 каплю физиологического раствора и смешивали с небольшим количеством чистой культуры пневмококка. Затем добавляли равное количество антисыворотки, тщательно перемешивали и накрывали покровным стеклом. Результат учитывали в течение 5 минут с помощью фазово-контрастного микроскопа при 100кратном увеличении (Рисунок 4).

Определение чувствительности к антимикробным препаратам Для определения чувствительности пневмококка к оксациллину, эритромицину, клиндамицину и триметоприму/сульфаметоксазолу (ТМП/СМЗ) диско-диффузионным методом (диски Bio-Rad, США) использовали среду Мюллера-Хинтона с добавлением 5% крови человека.

Результаты интерпретировали согласно рекомендациям МУК 4.2. 1890 – 04 [18]. Чувствительными считали штаммы с диаметром зоны подавления роста 20 мм для диска с оксациллином, 21 мм для эритромицина, 19 для клиндамицина и триметоприма/ сульфаметоксазола.

Для штаммов S. pneumoniae, резистентных к оксациллину, определяли МПК пенициллина методом Е-теста. Чувствительными считали изоляты с МПК 0,6 мкг/мл, нечувствительными к пенициллину – штаммы с МПК 0,6 мкг/мл [88].

Молекулярное типирование пневмококков Молекулярное серотипирование пневмококков проводили с помощью мультиплексной ПЦР (М-ПЦР) [114]. Выделение ДНК из чистой культуры S.

pneumoniae проводили по следующей схеме: инкубировали в течение суток при 37°С с 5% CO2, инокулировали полученную субкультуру в 250 мкл TEбуфера (состав: 10 мM Tris-HCl, 1 мM ЭДТА, pH 8,0) и доводили мутность бактериальной взвеси до 1 по стандарту МакФарланда. Затем суспензию

–  –  –

Разделение и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в ТВЕбуфере при 120 В в течение 30 мин. В качестве интерколирующего красителя использовали раствор бромистого этидия. Визуализацию результатов электрофореза проводили в УФ-свете на приборе гельдокументации. Размеры продуктов ПЦР определяли путем сравнения с молекулярным стандартом (100 bp). Пример электрофореграммы приведен на Рисуноке 2.

Рисунок 2. Результаты М-ПЦР-типирования S.

pneumoniae Примечание. Результаты мультиплексных ПЦР № I (линии 2-5), №II (линии 7-10) и №III (линии 12-15). Линии 1, 6, 11 – молекулярный стандарт. Стрелка указывает положение внутреннего положительного контроля cpsA.

ПЦР в режиме реального времени для выявления значимых отопатогенов в ЖСУ В ЖСУ проводили поиск генетического материала четырех этиологически значимых отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, H.

influenzae и M. catarrhalis) [9; 66; 92; 139] с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

В качестве молекулярного маркера S. pneumoniae был выбран ген lytA, поскольку данный ген кодирует пневмококковый белок аутолизин, который имеет ограниченное число аллельных изменений и, следовательно, является хорошей мишенью для видовой идентификации в клинических и эпидемиологических исследованиях. Секвенирование локуса lytA продемонстрировало, что ген высоко консервативен в пределах вида [137; 142] и способен отделять S. pneumoniae от генотипически близких видов стрептококков S. mitis и S. oralis [80; 145].

В качестве молекулярного маркера S. pyogenes был использован ген регулятора транскрипции (spy1258), выбранный из генома М1 штамма SF370 (GenBank регистрационный номер AE006565) [61].

Последовательность гена spy1258 отсутствует в других бактериальных геномах, которые можно получить в GenBank.

Для H. influenzae в качестве маркера был выбран ген ompP2 (outer membrane protein), кодирующий белок наружной мембраны P2. Данный белок содержит эпитоп, который присутствует во всех штаммах H.

influenzae, как типируемых, так и нетипируемых [107]. Идентификация Р2 в качестве мишени бактерицидных антител человека показывает, что этот белок является важным поверхностным антигеном и имеет потенциальную значимость для разработки вакцин [109]. Для идентификации M. catarrhalis был выбран белок наружной мембраны copB, который экспрессируется во всех штаммах [35; 38; 108].

Экстракцию ДНК из 200 мкл образца ЖСУ с использованием QIAamp DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Izasa, Барселона, Испания) проводили в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Этот протокол сводит к минимуму присутствие ингибиторов ПЦР в конечном образце. Образцы ДНК хранили при -20°С.

Постановку ПЦР-РВ проводили с использованием праймеров и ДНК-зондов, приведенных в Таблице 4. В состав ДНК-зонда входит флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения. Измеряется интенсивность флуоресценции, и результат реакции учитывается в виде графика зависимости флуоресценции от количества циклов в реакции. Таким образом, за ходом реакции можно следить уже через несколько минут после её начала (Рисунок 3).

Условия ПЦР-РВ были следующими:

1. Начальная денатурация 95С – 10' 95С 15''

2. Денатурация 60С 1' Отжиг праймеров Количество температурных циклов: 40 72С 5'

3. Пост ПЦР

–  –  –

Для определения чувствительности выбранного метода использовали серийные 10-кратные разведения очищенной ДНК (эквивалент от 108 до 104 КОЕ/мл) (Рисунок 3). Для этого чистую бактериальную культуру ресуспендировали в физиологическом растворе до мутности 0,5 по МакФарланду (~1х108 КОЕ/мл). Далее выполняли серийные разведения для получения суспензии с концентрацией 1,0х10 7, 1,0х106, 1,0х105 и 1,0х10 4 КОЕ/мл. Из полученных суспензий выделяли ДНК и проводили ПЦР-РВ. Во всем диапазоне разведений для выбранных мишеней наблюдали достаточную чувствительность (Рисунок 3).

Рисунок 3. ПЦР-РВ серийных разведений ДНК S.

pneumoniae с праймерами гена lytA Образец считали положительным, если, по крайней мере, два из трех повторов давали Ct 32. Отрицательными считали результаты с циклом порогового значения Ct 32, т.к. высокие значения пороговых циклов и низкий уровень флуоресценции при детекции могут способствовать

–  –  –

Для определения специфичности используемых праймеров проводили перекрестные ПЦР-РВ с ДНК чистых культур других значимых отопатогенов. Ни один перекрестный эксперимент не дал положительного результата. Поиск подобия в базе данных GenBank с помощью алгоритма BLAST также подтвердил специфичность выбранных мишеней.

Определение генетических маркеров резистентности к макролидам

Для амплификации генов ermB и mef в ДНК, выделенной из чистой культуры эритромицин-резистентных пневмококков, были использованы праймеры, предложенные Reinert R.R., et al (Таблица 6) [120]. Общий объем смеси составил 25 мкл, и содержал по 5 пМ каждого из праймеров и по 10-20 нг ДНК.

–  –  –

Мультилокусное сиквенс-типирование Для генотипирования штаммов S. pneumoniae использовали метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) (http://spneumoniae.mlst.net/). Использовали ДНК, экстрагированную из чистых культур пневмококков. Подготовка матриц для секвенирования включала амплификацию внутренних фрагментов генов «домашнего хозяйства»: aroE (shikimate dehydrogenase), gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase), gki (glucose kinase), recP (transketolase), spi (signal peptidase I), xpt (xanthine phosphoribosyltransferase), ddl (D-alanine-Dalanine ligase). Праймеры и условия амплификации приведены на сайте www.mlst.net. Очистку ПЦР продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дНТФ проводили ферментативным разрушением с помощью экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы (SAP, Affymetrix, США) при 37 о С в течение 30 мин. с последующей инактивацией при 85о С. Секвенирование проводили с использованием наборов реагентов и оборудования фирмы Applied Biosystem (США) по методике, описанной производителем. Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов «домашнего хозяйства»

обрабатывали с помощью программы SeqMan, затем сравнивали с базой аллелей, используя специализированную программу для обработки результатов типирования, исследуемой аллели присваивался соответствующий номер. Сиквенс-тип (sequence type – ST) определялся на основании комбинации аллелей. Штаммы, находящиеся в базе данных, сгруппированы в клональные комплексы на основании кластеризации методом eBURST (http://eburst.mlst.net/) для бактерий вида S. pneumoniae.

Статистические методы Статистическую обработку данных проводили с помощью программ SPSS 20.0 (SPSS Statistics, США) и Excel. Для сравнения распределения серотипов использовали таблицы сопряженности, 2 или точный тест Фишера. Для сравнения долей использовали z-критерий.

Различия считали статистически значимыми при p0,05.

Личное учaстие автора в получении результатов Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выделении ДНК, постановке ПЦР, учете и интерпретации результатов серотипирования классическим и молекулярными методами. Микробиологическая часть исследования (культуральный посев, определение резистентности диско-диффузионным методом) осуществлялось автором совместно с младшим научным сотрудником Пономаренко О.А. и заведующей лабораторией микробилогии к.м.н. Лазаревой А.В. в лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД.

Секвенирование культур S. pneumoniae проводилось совместно с к.б.н.

Пушковым А.А. в лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии ФГБНУ НЦЗД.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. До 70% циркулирующих в Москве штаммов S. pneumoniae представлены шестью серотипами 3, 6А, 6В, 14, 19F и 23F.

2. Модифицированный алгоритм мультиплексной ПЦР для определения серогрупп и серотипов S. pneumoniae позволяет надежно идентифицировать серотип у 90,5% изолятов пневмококка за первые три реакции.

3. Более 20% циркулирующих в Москве штаммов S. pneumoniae обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. Эти штаммы относятся к ограниченному числу серотипов и характеризуются выраженной клональностью.

Степень достоверности и апробация результатов исследования О достоверности результатов работы свидетельствует использование сертифицированных микробиологических методов, которые характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Проведен достаточный объем исследований, что позволило корректно осуществить статистическую обработку полученных данных. Комплексное молекулярногенетическое определение серотипов S. pneumoniae позволило получить сопоставимые результаты с традиционными микробиологическим и методами серотипирования, что свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Диссертация апробирована на заседании лабораторного отдела НИИ педиатрии ФГБНУ НЦЗД (протокол № 1 от 11.03.2014 г.).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на XIV, XV, XVI, XVII Конгрессах педиатров России, Москва, 2011, 2012, 2013, 2014; на XIV, XV, XVI Международных конгрессах по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID, Москва, 2012, 2013, 2014; на 5-ом Европейском Конгрессе педиатров (EUROPAEDIATRICS-2011), Вена, 2011; на 22-ом и 23ем Европейском конгрессах по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID 2012, 2013), Лондон, 2012, Берлин, 2013; на 30-ом Европейском Конгрессе по детским инфекционным болезням (ESPID 2012), Салоники, 2012.

Публикации Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах, включая 5 статей в рецензируемых научных изданиях, 6 – в материалах конференций.

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 101 странице машинописного текста, иллюстрированы 15 таблицами, 7 рисунками.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав описания результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспективных направлений дальнейшей разработки темы, списка сокращений и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 150 источников литературы, из них 28 отечественных и 122 иностранных авторов.

–  –  –

1.1. История изучения и общая характеристика пневмококков Впервые пневмококк наблюдал Л. Пастер, который обнаружил бактерию в слюне больного бешенством, что натолкнуло его на предположение о причастности пневмококка к заболеванию [130].

Однако от этой гипотезы пришлось отказаться, т.к. идентичные бактерии определялись и у здоровых людей. Этиологическая роль S. pneumoniae при пневмонии была впервые показана в 1886 г. немецким врачом А.

Френкелем. Это произошло на заре развития иммунологии, когда многие инфекции пытались лечить антисыворотками, полученными путем иммунизации животных соответствующими бактериальными продуктами. «Диплококк Френкеля» (бактериальные клетки этого возбудителя в большинстве располагаются парами) получил название Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и стал одним из главных объектов подобных экспериментов, поскольку пневмония в то время была среди основных причин смерти. Было обнаружено, что животные, которым вводили мокроту больных пневмонией, приобретали устойчивость к последующему заражению, а сыворотка больных пневмонией предотвращала развитие пневмококковой инфекции [53].

Эти данные стимулировали многих врачей и микробиологов к поиску новых способов лечения пневмонии при помощи специфических сывороток. Одним из таких ученых был немецкий бактериолог Фред Нейфельд (Fred Neufeld), который в начале 20-ого века впервые разделил пневмококки на серотипы с помощью типоспецифических антисывороток. Это наблюдение заложило основу для последующих исследований, нацеленных на борьбу с пневмококковой инфекцией, включая открытие природы типоспецифических капсульных антигенов пневмококка (они относятся к полисахаридам) и создание эффективных пневмококковых поливалентных полисахаридных вакцин [45; 53].

В своих работах для серотипирования S. pneumoniae Ф. Нейфельд использовал метод набухания (нем. quellung) капсулы. Он основан на том, что при добавлении к взвеси бактерий сыворотки, содержащей антитела против капсульных полисахаридов данного серотипа пневмококка, происходит склеивание и резкое увеличение (набухание) капсулы, которое хорошо видно под микроскопом (Рисунок 4).

Методика с использованием реакции набухания капсулы под названием «реакция Нейфельда» (в англоязычной литературе часто употребляется термин quellung reaction) до сих пор остается основным методом серотипирования пневмококка и считается «золотым стандартом»

дифференцировки пневмококков, а при разработке новых методов типирования стандартизация проводится с использованием именно реакции набухания капсулы.

Рисунок 4. Реакция набухания капсулы по Нейфельду.

Примечание: Слева – отрицательная реакция, справа – положительная реакция. Фазово-контрастная микроскопия, ув. х 1000 (собственные данные).

К настоящему времени в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка. На данный момент предложены 2 номенклатурные системы: американская и датская. В американской системе произведена порядковая нумерация серотипов, основанная на времени их первого описания, без учета способности к перекрестному реагированию. Согласно международной диагностической схеме, разработанной в Дании (Serum Staten Institute), сформировано 46 групп антигенно-родственных серотипов с номерами от 1 до 48 (номера 26 и 30 в данной классификации не используются), демонстрирующие перекрестную реактивность. Они обозначаются цифрами и буквами и объединяются в одну группу (серогруппа). Таким образом, 91 серотип распределяется между 21 серогруппой, каждая из которых представлена 2-5 серотипами, близкими по антигенной структуре, и 25 серологически однородными капсульными типами [96;

101].

Пневмококки представляют собой овальные или ланцетообразные кокки, располагаются парами; окрашиваются положительно по Граму, величиной около 1 мкм. Каждая пара бактерий окружена толстой капсулой, обнаруживаемой при помощи окраски эозином.

Строение клеточной стенки S. pneumoniae типично для грамположительных бактерий. Её основой является пептидогликан со встроенными углеводами, тейхоевыми кислотами, липопротеинами и поверхностными белками. Для пневмококков дополнительно характерно наличие мощной полисахаридной капсулы, которая выполняет защитную функцию, препятствуя опсонизации и последующему фагоцитозу. На простых питательных средах пневмококки обычно растут в виде коротких цепочек, неподвижны и не образуют спор.

Развитие капсулы стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости в питательную среду. Пневмококки – это аэробы или факультативные анаэробы, при культивировании предпочтительны капнофильные условия (5-10% СО 2), хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных 0,1% глюкозы при температурном оптимуме 37°С. Они чувствительны к изменениям рН питательной среды, оптимум рН составляет 7,8. На жидких средах пневмококки дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок; при длительном культивировании осадок увеличивается. На агаре образуют нежные полупрозрачные четко очерченные колонии около 1 мм диаметром, напоминающие росинки, иногда они могут быть плоскими с центральным углублением (Рисунок 5). На специальных питательных средах, например, на кровяном агаре, колонии окружает зона альфагемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны, сходной с наблюдаемой при росте на кровяном агаре зеленящего стрептококка (Streptococcus viridans) [20].

Рисунок 5. Колонии S. pneumoniae на кровяном агаре

Идентификацию S. pneumoniae проводят стандартными фенотипическими методами. Колонии S. pneumoniae вызывают альфагемолиз на кровяном агаре при аэробном культивировании и бетагемолиз при культивировании в анаэробных условиях, также их отличает чувствительность к бактерицидному действию хинина и некоторых его дериватов. Например, оптохин (этилгидрокупреин) подавляет рост пневмококка при концентрации 1 : 500 000. Пневмококки обнаруживают способность к быстрому аутолизу и разрушению под действием желчи и желчных солей [110]. Пневмококки ферментируют углеводы с образованием кислоты, но без образования газа. Важный отличительный признак пневмококков ферментация инулина (зеленящий стрептококк не обладает способностью разлагать инулин).

S. pneumoniae обладает широким спектром факторов патогенности, главным из которых является полисахаридная капсула [15]. Она обеспечивает подавление комплемент-зависимой бактериолитической активности крови и фагоцитарной активности лейкоцитов.

Некапсулированные штаммы пневмококка практически авирулентны, их обнаруживают редко. Большую часть пула противопневмококковых антител составляют антитела к антигенам капсулы.

1.2. Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие пневмококка S. pneumoniae относится к наиболее частым возбудителям респираторных бактериальных инфекций, менингитов и бактериемии у детей [1; 141]. Пневмококковая инфекция признается Всемирной организацией здравоохранения ведущей причиной заболеваемости и смертности во всех регионах мира [147]. Бремя пневмококковых заболеваний особенно велико среди детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц с хроническими болезнями [39].

Пневмококк является частью комменсальной флоры верхних дыхательных путей. Наряду с M. catarrhalis, H. inluenzae, N. meningitidis, S. aureus и различными гемолитическими стрептококками пневмококки колонизируют носоглотку [132]. Чаще всего колонизация протекает бессимптомно, однако в ряде случаев может развиться местная или системная инфекция. Любой пневмококковой инфекции предшествует колонизация носоглотки гомологичным штаммом. Кроме того, носительство пневмококка служит важным источником горизонтального распространения патогена в популяции. Скопления людей, возникающие, например, в больницах, детских учреждениях, казармах, способствуют передаче пневмококков. С учетом того, что в детских сообществах наблюдается наиболее высокая частота носительства и теснота общения, именно эта возрастная группа является основным резервуаром и вектором горизонтальной диссеминации пневмококков.

Именно поэтому часть стратегии предотвращения пневмококковых инфекций нацелена на профилактику носительства, особенно у детей [21; 24].

В большинстве случаев S. pneumoniae вызывает мукозальные инфекции, такие как острый синусит и ОСО, который может приводить к расстройствам слуха и последующей задержке развития ребенка [26; 44;

125; 139]. Более 80% детей переносят как минимум один эпизод ОСО до достижения возраста 3 лет, а 40% к 7-летнему возрасту переболевают ОСО шесть и более раз [105; 140]. Чаще всего ОСО развивается на фоне вирусной инфекции верхних дыхательных путей. Она ведет к воспалению и дисфункции евстахиевой трубы, появлению отрицательного давления в полости среднего уха, в результате чего происходит передвижение секретов, содержащих респираторные вирусы и патогенные бактерии, из носоглотки в среднее ухо [90].

Наряду с респираторными инфекциями пневмококк может вызвать тяжелые инвазивные инфекции. Пневмококковые пневмония, менингит и бактериемия расцениваются как тяжелые, нередко жизнеугрожающие заболевания, представляющие серьезную проблему для здравоохранения и требующие интенсивного и дорогостоящего лечения [2; 10; 24; 122].

По данным ВОЗ, от пневмококковой инфекции ежегодно умирают 1,6 млн. человек, из них от 700 тыс. до 1 млн. составляют дети в возрасте до 5 лет. Эта статистика отражает, главным образом, ситуацию в тех странах, где до настоящего времени не введена вакцинация детей от пневмококковой инфекции. Ежегодная частота инвазивных пневмококковых инфекций в этих регионах варьирует от 10 до 100 случаев на 100 тыс. населения. Так, пневмококк является главной причиной острых пневмоний у детей младше 2 лет, а каждая 200-я госпитализация детей до 5 лет связана с пневмококковой инфекцией или ее осложнениями [2; 10; 24; 121].

Как указывалось выше, по антигенным особенностям капсульных полисахаридов выделяют более 90 серотипов пневмококка. Не все серотипы являются одинаково патогенными, и большинство пневмококковых инфекций связано с ограниченным числом серотипов [16]. В довакцинальную эру, т.е. до начала использования ПКВ, по всему миру преобладали представители примерно 10 серогрупп/серотипов пневмококка. Это, прежде всего, серогруппы 1, 3, 6, 14, 19 и 23. Именно с ними было ассоциировано 80-90% инвазивных пневмококковых инфекций. Наиболее вирулентными серотипами, которые чаще других вызывают тяжелые пневмонии с плевритом и деструкцией, принято считать серотипы 1, 3, 5 и 14 [7; 8; 121]. Кроме того, серотипы, 1 и 5 нередко опосредуют вспышки пневмококковых инфекций, главным образом в развивающихся странах, и поэтому получили название «эпидемических» серотипов [121].

В до-ПКВ эру большинство носоглоточных (неинвазивных) изолятов пневмококка относилось к этому же кругу серотипов, составлявших типичные «детские» серотипы (3, 6, 14, 19, 23). Другие носоглоточные серотипы принадлежали к серогруппам 10, 11, 13, 15, 33 и 35. Следует отметить, что некоторые серотипы, например 1, 5 и 46, редко выявлялись в носоглотке даже в тех популяциях, где они составляли существенную долю среди инвазивных изолятов. Это, вероятно, было связано с непродолжительностью периода их колонизации.

Данные о распространенности отдельных серотипов были учтены при создании первой конъюгированной полисахаридной пневмококковой вакцины (ПКВ7). В нее вошли антигены семи серотипов пневмококка: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Они охватывали 86% всех инвазивных инфекций у детей первых лет жизни в США и 74% в Европе. Массовая вакцинация ПКВ7, начавшаяся в 2000 г., в течение нескольких лет резко снизила частоту инвазивных пневмококковых инфекций, ассоциированных с вакцинными серотипами пневмококка.

Соответственно, снизилась и доля ПКВ7 серотипов в циркулирующем пуле пневмококков. Так, в США уже в 2010-2011 было отмечено практически полное исчезновение как инвазивных (снижение до 3,8%), так и неинвазивных (снижение до 4,2%) изолятов ПКВ7-серотипов [124].

Аналогичная ситуация наблюдалась и в других странах, которые ввели вакцинацию ПКВ7 в национальный календарь прививок [126; 138; 143].

Выход из циркуляции вакцинных серотипов пневмококка под давлением ПКВ7 сопровождался возрастанием роли других, невакцинных серотипов. Особую тревогу во многих странах вызвал рост встречаемости изолятов серотипа 19А, которые отличаются множественной устойчивостью к антибиотикам. В период с 1999-2000 гг. (до вакцинации) по 2008-2009 гг. (пост-ПКВ7) в США доля 19Апневмококков выросла с 2% до 22% [124; 43; 62; 57]. С началом применения 13-тивалентной ПКВ в 2010 г., имеющей в своем составе помимо ПКВ7-серотипов серотипы 1, 3, 5, 6А, 7F и 19А, этот рост прекратился [124].

Таким образом, ПКВ оказывает выраженный эффект на серологический состав популяции пневмококка в тех странах, где эта вакцина включена в национальные календари иммунизации. В РФ лицензированы три ПКВ (7-, 10- и 13-валентная), вакцинацию ПКВ в скором времени планируют ввести в национальный календарь прививок, однако массовая вакцинация пока не началась. В связи с этим актуальный серотиповой пейзаж пневмококка в РФ логично сравнивать с мировыми данными по серотипам, полученными в довакцинальную эру.

Существующие пневмококковые вакцины не покрывают всего разнообразия серотипов (их более 90), поскольку содержат ограниченный спектр полисахаридов (7-13 серотипов), индуцирующих типоспецифический иммунный ответ. Как указывалось выше, состав ПКВ7 охватывал почти 90% серотипов пневмококка, ответственных за инвазивные инфекции на момент начала вакцинации в США. Между тем, распределение серотипов может обладать достаточно выраженными географическими и временными различиями. Это делает сведения о серотиповом спектре циркулирующих пневмококков важным прогностическим критерием потенциальной эффективности вакцинации ПКВ на конкретной территории.

В РФ изучение серотипового пейзажа пневмококков проводилось с конца 1980-х гг. Работы В.К. Таточенко и Л.К. Катосовой, относящиеся к 1990-м гг., показали, что в зависимости от региона страны ПКВ7серотипы составляли 51-68% инвазивных штаммов и 70-89% штаммов, выделенных от носителей. Сравнительно умеренное покрытие инвазивных штаммов объяснялось высокой долей серотипов 1, 3 и 5, не входящих в ПКВ7, суммарная пропорция которых в отдельных регионах превышала 40% [8]. Исследования Р.С. Козлова (1999-2004 гг.) показали, что серотипы ПКВ7 охватывали 62% резистентных штаммов пневмококка в Европейской части России и только 50% - в Азиатской [11; 136].

В последние годы начали реализовываться несколько проектов, направленных на уточнение современного серотипового пейзажа пневмококков [5; 13; 25]. В целом, результаты этих исследований демонстрируют преобладание в актуальном спектре серогрупп 6, 14, 19,

23. Сложности этиологической верификации инвазивных пневмококковых инфекций можно объяснить отсутствием рутинной практики взятия крови на посев у детей с подозрением на бактериемию и менингит в сочетании с лечением антибиотиками до взятия биоматериала для микробиологического исследования. Однако даже ограниченное число изолятов демонстрирует лидерство серотипов 19F (25%) и 14 (19%) при инвазивных инфекциях в РФ, как и в других странах в довакцинальную эру [13; 73; 76; 124; 128; 131; 143]. К особенностям пейзажа пневмококков в РФ следует отнести сравнительно высокую долю серотипа 3 (до 10%). В 1980-1990-х гг. этот серотип (а не серотип 1, как в других странах) исключительно часто выявлялся при осложненной пневмонии (эмпиема) у детей [8].

1.3. Антибиотикорезистентность пневмококка и генетические механизмы устойчивости к бета-лактамам и макролидам Бета-лактамы и макролиды являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций, поэтому рост резистентности S.

pneumoniae к этим антибиотикам становится существенной клинической проблемой. Пневмококковые инфекции традиционно (и успешно) лечили пенициллином. До конца 1960-х гг. S. pneumoniae был полностью чувствителен к пенициллину и большинству других антибиотиков.

Первый штамм пневмококка со сниженной чувствительностью к пенициллину был описан в Австралии в 1967 г., имел минимальную подавляющую концентрацию (МПК) 0,6 мкг/мл и обладал резистентностью к тетрациклину [70]. Затем в 1974 г. появились сообщения о пенициллин-нечувствительных изолятах из Новой Гвинеи, а в 1977 г. в Южной Африке произошла вспышка инвазивных пневмококковых инфекций, вызванная высокорезистентными штаммами пневмококка (МПК 2-8 мкг/мл) [33; 71; 77; 83]. Эти штаммы характеризовались полирезистентностью и относились к серотипам 6А и 19А [77]. В 1979 году в Испании из крови взрослого пациента с пневмонией впервые был выделен штамм с МПК пенициллина 0,5 мкг/мл, а годом позже в том же госпитале был выявлен еще один инвазивный изолят с МПК 2 мкг/мл [94]. В течение 1980-х гг. сообщения о росте антибиотикорезистентности пневмококка стали поступать из многих стран. Появилось понятие множественной устойчивости, или полирезистентности, которое отмечало устойчивость к 3 и более классам антибиотиков. Публикация новых данных сопровождалась указаниями на неудачи при лечении пенициллином, особенно при пневмококковом менингите [60; 95; 146].

В настоящее время резистентные штаммы пневмококка распространены повсеместно. Доля пенициллин-нечувствительных штаммов варьирует от 25-50% в Испании, Франции, Греции и Израиле до 1-5% в Великобритании, Германии, Австрии, Норвегии и Швеции [121]. По данным исследования TEST, в глобальном масштабе сниженной чувствительностью к пенициллину обладают 33% штаммов пневмококка [67]. Колебания уровня резистентности к макролидам по странам Европы (от 1% в северных странах до 50% в Греции) совпадает с колебаниями устойчивости к пенициллину, а в среднем к макролидам устойчивы 23% штаммов пневмококка. Наибольшая частота резистентности к макролидам регистрируется в Китае и странах Азии, где в некоторых регионах до 80% штаммов пневмококка устойчивы к макролидам [30; 60; 85; 95; 116].

Исследования, проведенные в РФ в 2000-е гг., показывают сравнительно меньшую распространенность антибиотикорезистентности пневмококка. Так, доля нечувствительных к пенициллину носоглоточных изолятов пневмококка не превышала 10%, а макролидрезистентные штаммы составили 5% [12; 24; 135]. По другим данным, пропорция S. pneumoniae, устойчивых к пенициллину, варьировала от 3 до 24% в зависимости от региона и периода выделения изолята [23].

Частота встречаемости пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину (МПК в диапазоне от 0,120 до 1 мкг/мл) среди инвазивных штаммов, выделенных от пациентов с менингитом, достигала 24% [5]. В коллекции преимущественно неинвазивных пневмококков, собранной в 2003-2005 гг. в разных регионах РФ, было выявлено 11% макролид-резистентных штаммов, большинство из которых обладали устойчивостью и к другим антибиотикам, т.е.

являлись полирезистентными [120].

Появление и распространение антибиотикорезистентных пневмококков связывают с различными факторами, однако одним из наиболее важных является нерациональное использование антибиотиков [22]. Уровень резистентности пневмококка к пенициллину обычно пропорционален уровню потребления антибиотиков [64]. Например, во Франции отмечена самая высокая частота назначения антибиотиков и наибольшее распространение нечувствительных пневмококков (более 40%). В Нидерландах, напротив, самый низкий уровень потребления антибиотиков в Европе сочетается с невысокой резистентностью пневмококка (менее 5%) [64].

Селекция резистентных штаммов происходит в основном среди пневмококков, колонизирующих и/или инфицирующих детскую популяцию, поскольку здесь сочетаются высокая частота носительства пневмококка и частое использование антибиотиков, что создает благоприятную среду для отбора и закрепления антибиотикорезистентных пневмококков [3, 4]. Этот тезис подкрепляется тем фактом, что основная доля антибиотикорезистентных штаммов сконцентрирована в ограниченном наборе серотипов пневмококка, совпадающем с типичными «детскими» серотипами, вероятность и длительность носительства которых в носоглотке наиболее велика. Иными словами, наиболее распространенные серотипы пневмококка вероятно будут резистентными [41; 48; 50; 60; 85; 89; 112;

117; 134]. Действительно, в довакцинальный период ПКВ7-серотипы 6В, 9V, 14, 19F, 23F и невакцинные 6А и 19A, т.е. основные серотипы,

–  –  –

триметоприму/сульфаметоксазолу, чем пневмококки других серотипов, а 30% из них обладали полирезистентностью.

Ретроспективное исследование в РФ антибиотикорезистентности пневмококков, собранных в 2003-2007 гг., показало, что среди изолятов со сниженной чувствительностью к пенициллину более 80% составляли представители серогрупп 6, 14, 19 и 23, т.е. типичные педиатрические серотипы, как это наблюдалось и в других странах в довакцинальный период [25]. Уже в то время и у нас в стране встречались полирезистентные пневмококки серотипа 19А, хотя их доля была невысока (2,2% пенициллин-нечувствительных изолятов) [23; 25].

Механизм резистентности S. pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллинсвязывающих белков (penicillin binding proteins, PBPs) ферментов, которые участвуют в заключительных этапах синтеза клеточной стенки.

Антибактериальная активность бета-лактамов обусловлена их способностью связываться с PBP, угнетая синтез и ремоделирование пептидогликанов. Это приводит к нарушению целостности клеточной стенки, задержке роста бактерий или их лизису [149]. Резистентность к бета-лактамам появляется при развитии мозаицизма генов pbps, который снижает способность молекул антибиотика связываться с PBPs [133].

Всего у пневмококка описано шесть PBPs, однако основная доля резистентности ассоциирована с мутациями в трех из них – pbp1a, pbp2b, pbp2x [46; 69].

Нуклеотидные последовательности мозаичных pbp-генов могут отличаться от немозаичных аллелей более чем на 20%, что свидетельствует о непневмококковом происхождении данных последовательностей [86]. Полагают, что мозаичные блоки генетического материала возникают вследствие точечных мутаций в генах pbp у других стрептококков-комменсалов, а затем интегрируются пневмококками за счет горизонтального переноса [68; 133].

Макролиды относят к бактериостатическим антибиотикам, которые угнетают синтез белка за счет связывания с 23S субъединицей рибосом.

Резистентность к макролидам опосредуется двумя главными механизмами, к которым относят изменения мишени связывания и эффлюкс антибиотика из бактериальной клетки. Первый механизм обусловлен модификацией сайта связывания макролидов с 23S pРНК вследствие ее метилирования, которое нарушает взаимодействие антибиотика с мишенью [87; 123]. Метилирование осуществляется ферментом метилазой, который кодируется геном erm (англ.

erythromycin ribosome methylation), и обусловливает высокий уровень устойчивости к макролидам (МПК 32–64 мкг/мл). Этот ген ассоциирован с транспозонами и может локализоваться как на плазмидах, так и на хромосомах. Описано около 20 разновидностей гена erm, однако наибольшее значение для формирования резистентности у пневмококка играет вариант ermB. Большинство пневмококков, имеющих ген ermВ, демонстрируют перекрестную резистентность ко всем макролидам, а также линкозамидам и стрептограмину В, поскольку их мишени частично перекрываются. Такой фенотип получил название MLS B по первым буквам наименования групп антибиотиков, к которым нечувствительны ermВ-экспрессирующие бактерии [27; 46; 121].

Второй механизм резистентности к макролидам связан с их активным выведением (эффлюксом) из бактериальной клетки с помощью особой помпы, встроенной в клеточную стенку. Эффлюксная помпа кодируется несколькими вариантами гена mef (англ. macrolide efflux) [75]. mef-позитивные пневмококки имеют М-фенотип, который характеризуется резистентностью к 14- и 15-членным макролидам, но сохранением чувствительности к 16-членным макролидам, линкозамидам и стрептограмину В [27; 46; 121]. Для данного типа устойчивости характерны более низкие значения МПК эритромицина (4мкг/мл). Ген mef локализован на хромосомах в составе конъюгативных элементов, что обеспечивает его эффективное внутри- и межвидовое распространение [27].

Распространенность ermВ и mef-пневмококков имеет выраженные региональные особенности. Наличие гена ermВ является преобладающим механизмом резистентности в большинстве стран Европы, особенно в Испании, Италии, Польше и Франции [59; 95]. ermВпневмококки доминируют также в странах Азии, включая Китай.

Изоляты с М-фенотипом, т.е. экспрессирующие ген mef, чаще выявляются в таких странах, как Великобритания, Германия, Канада, Норвегия и США. В РФ до 50% макролид-резистентных штаммов пневмококка в РФ имеют ген ermВ [23; 24; 120].

Серьезное беспокойство вызывает появление пневмококков, обладающих обоими механизмами резистентности, т.е. имеющих как ген ermВ, так и ген mef. Их доля неуклонно возрастает, и во многих странах 30% пневмококков и более являются ermВ/mef-положительными.

Особенно это актуально для стран Азии, Южной Африки, США, и в том числе для РФ [56; 120]. Пневмококки, несущие оба гена, отличаются повышенной резистентностью к макролидам и другим антибиотикам.

Оба гена (ermВ и mef) в сочетании с детерминантой резистентности к тетарциклину (tetM) связаны с композитным элементом Tn2010, присутствующим в большинстве полирезистентных изолятов 19Апневмококков [52]. Высокая резистентность ermВ/mef-положительных пневмококков в сочетании с указаниями на клональный характер их распространения создает опасность их дальнейшей экспансии и роста антибиотикорезистентности [46; 56].

–  –  –

разнообразии. С целью унификации подходов к изучению генетической структуры пневмококковой популяции было предложено использовать метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) [98]. Он основан на определении нуклеотидной последовательности (секвенировании) консервативных фрагментов нескольких генов «домашнего хозяйства», отвечающих, как правило, за метаболизм бактерий и не кодирующих факторы вирулентности и патогенности. Эти гены подвержены случайному мутагенезу, изменения в них постепенно накапливаются и являются маркерами генетического расстояния между различными клонами бактерий, что позволяет устанавливать степень филогенетического родства между популяциями и систематизировать их.

МЛСТ пневмококка предполагает секвенирование фрагментов 7 генов «домашнего хозяйства» (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, ddl). Каждому аллелю присваивается уникальный номер, который позволяет отождествлять аллели, выявленные в разных лабораториях. Данные о последовательностях накапливаются в единой базе данных PMEN (Pneumococcal Molecular Epidemiology Network), доступной в сети Интернет. Аккумулируя глобальную информацию о результатах МЛСТ во всех регионах мира, PMEN с помощью биоинформационных ресурсов позволяет определять генетически линии и кластеры пневмококков [58;

78; 113]. Это дает возможность выявлять эволюционные связи в бактериальных популяциях, группировать отдельные последовательности в сиквенс-типы (sequence type, ST) и клональные комплексы (clonal complex, CC), объединенные общими предшественниками [22].

Данные МЛСТ, накопленные в базе PMEN, свидетельствуют о том, что популяция глобально циркулирующих пневмококков является клональной. Клональность особенно выражена среди резистентных пневмококков, которые относятся к ограниченному числу клонов [95].

Среди наиболее важных из них, ответственных за глобальное распространение антибиотикорезистентности в 1980-1990-х гг., были Spain23F-ST81, Spain 6B-ST90, Spain9V-ST156, England 14 -ST9, клоны Taiwan 19F-ST236 и ряд других [102]. После начала вакцинации ПКВ7 распространенность большинства клонов, имевших вакцинный серотип, стала снижаться [34; 100]. Однако влияние вакцинации с особой яркостью подчеркнуло высокую способность пневмококка к генетической рекомбинации. Так, полирезистентный серотип 19А, относящийся к СС320 и получивший глобальное распространение в пост-ПКВ7 периоде, является двухлокусным вариантом пневмококка Taiwan 19F-ST236, имевшего капсулу ПКВ7-серотипа 19F [106]. Анализ эволюционного ответа пневмококковой популяции на вакцинацию показал, что использование ПКВ7 привело к отбору предсуществовавших невакцинных капсульных вариантов пневмококка, среди которых оказались клоны с резистентным генотипом, подобные 19А-изолятам СС320 [47].

Немногочисленные исследования генетического разнообразия инвазивных резистентных пневмококков на территории РФ показали присутствие глобальных клональных комплексов, включая СС81, СС156, СС315 и СС320 [22; 23; 120]. Обнаружение представителей СС320 с серотипом 19А еще до начала вакцинации ПКВ в РФ свидетельствует о необходимости постоянного мониторинга популяционного состава пневмококков для прогнозирования эффективности используемых вакцин [23].

Таким образом, обзор современной литературы, посвященной пневмококку и пневмококковым инфекциям, свидетельствует об актуальности исследуемой темы. Отечественные публикации по этим проблемам немногочисленны и нередко описывают ограниченное число наблюдений, что не позволяет в некоторых случаях делать надежные выводы. В то же время, именно региональные данные крайне важны для понимания тенденций сероэпидемиологии и резистентности пневмококков на конкретной территории. Несмотря на то, что резистентность – это общемировая проблема, ее истоки лежат прежде всего на местном уровне. Первичная селекция и распространение резистентных штаммов микроорганизмов происходит в отдельных популяциях, затем устойчивые клоны могут распространиться на значительные территории, преодолевая границы государств и континентов. Идентификация устойчивости к антибиотикам, описание географии и динамики распространения резистентных штаммов имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку дают возможность улучшить практику использования существующих антибактериальных препаратов и профилактировать возникновение резистентности. Изучение сероэпидемиологии пневмококка с описанием актуального серотипового состава поможет прогнозировать эффективность вакцинопрофилактики пневмококковых инфекций, а также даст информацию, необходимую для создания следующих поколений ПКВ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Спектр циркулирующих серотипов пневмококка Всего в период с марта 2009 по апрель 2013 гг. было выделено 863 штамма S. pneumoniae от 863 пациентов. Большинство штаммов были получено из назофарингеальных мазков (n = 617, 71,5 %), 118 изолятов (13,7%) были выделены из образцов нижних дыхательных путей. Из ЖСУ было получено 128 (14,8%) штамма и четыре из других локусов.

Из числа выделенных штаммов 10 (1,2%) изолятов не сохранилось для типирования, 18 (2%) штаммов были нетипируемые. Таким образом, серотип был определен у 835 (96,8%) пневмококковых штаммов.

В общей сложности было выявлено 45 различных серотипов.

Шесть основных серотипов составили 69,4% от общего распределения и включали серотипы: 19F (21,7%), 6В (12,8 %), 23F (10%), 14 (9%), 6А (8,4 %) и 3 (7,5%) (Таблица 7, Рисунок 6). Из образцов носоглотки было выделено 44 различных серотипа, тогда как из образцов ЖСУ только 18.

Сравнение доли серотипов в образцах из носоглотки, нижних дыхательных путей и ЖСУ выявило статистически значимые различия ( 2 = 118, р = 0,018), однако парный статистический анализ показал, что доли серотипов статистически значимо различаются только между образцами носоглотки и ЖСУ ( 2 = 64, р = 0,015). Штаммы с серотипом 3 ( 12,3 % против 6,8%, Z = 2,13, р = 0,033) и 19А (6,6% против 1,6 %, Z = 3,42, р = 0,001) были более распространены среди изолятов ЖСУ, чем среди других типов образцов.

–  –  –

Примечание. a Другие серотипы с долей в распределении 1% включали 26 невакцинальных серотипов (n): 7C (1), 8 (4), 9A (1), 10B (1), 11D (1), 12B (1), 12F (2), 13 (2), 15A (3), 16F (5), 17F (6), 18A (1), 20 (1), 21 (1), 22F (3), 23B (3), 28A (2), 28F (1), 33F (3), 34 (6), 35B (2), 35C (5), 35F (7), 38 (1), 39 (2), 42 (2).

Рисунок 6. Распределение серотипов пневмококка в трех возрастных группах Примечание.

Представлены 17 серотипов, частота встречаемости которых была более 1% (суммарно 90,9% от всех серотипов). Число наблюдений по возрастным группам составило: 24 мес. n=234, 25–48 мес.

n=280, 48 мес. n=321.

В противоположность этому, ни один штамм с серотипом 11А не был найден в образцах из ЖСУ, т.е. доля этого серотипа была значительно выше в носоглотке и образцах из нижних дыхательных путей (0% против 3,5%, Z = -2,11, р = 0,039). Частота встречаемости всех оставшихся серотипов в образцах из разных источников статистически значимо не различалась.

Четыре штамма S. pneumoniae были выявлены из других локусов: 3 штамма были выделены из влагалища (серотип 11A, 19F, 23F) и один с конъюнктивы (серотип 6А).

Учитывая незначительные различия в распределении серотипов пневмококка из разных источников, для дальнейшего анализа они были объединены как "неинвазивные изоляты".

Анализ возрастных особенностей серотипового спектра показал следующую картину (Рисунок 6). Распространенность штаммов с серотипом 19F была выше у пациентов 48 мес. по сравнению с более старшими детьми (25% против 16%, Z=3.27, p=0.001). Напротив, серотип 3 (5% против 12%, Z= -3.44, p=0.001) и 37 (0.2% против 3%, Z=-3.63, p0.001) встречались чаще у детей старше 2 лет. Доли остальных серотипов во всех возрастных группах различались статистически незначимо.

Кроме того, штаммы пневмококка с редкими серотипами, доля которых составляла 1% в общем распределении (категория «другие»

на Рисунок 6), суммарно чаще встречались у детей старшего возраста (48 мес.) (13% против 6%, Z=3.47, p=0.001).

Таким образом, сравнение распределения серотипов, полученных из разных источников, показало значимые различия между образцами, взятыми из верхних дыхательных путей, и образцами ЖСУ. Серотиповое разнообразие было значительно выше в респираторных образцах, чем в ЖСУ (44 против 18 различных серотипов). Встречаемость серотипов 3 и 19А в образцах ЖСУ была выше, чем в других источниках. Напротив, серотип 11А был выявлен исключительно в образцах дыхательных путей. Это один из типичных носоглоточных серотипов, которые редко вызывают инвазивные пневмококковые инфекции [72; 124; 144], однако некоторые из них обладают инвазивным потенциалом, что стало очевидным на фоне вакцинации ПКВ. Например, в США, после внедрения ПКВ7 существенно выросла доля серотипов 22F, 23A и 35B при инвазивных пневмококковых заболеваниях [124]. Ранее эти серотипы не были ассоциированы с тяжелыми инфекциями.

Среди всех выявленных нами серотипов ПВК7 покрывает 58,2% (Таблица 7). ПКВ13 включает 6 дополнительных серотипов, тем самым увеличивая покрытие на 20%, в основном за счет серотипов: 3, 6А и 19А. В исследованной коллекции не было обнаружено ни одного штамма, относящегося к серотипу 5. По сравнению с ПКВ7, ПКВ10, имеющая на 3 серотипа больше (1, 5 и 7F), дает дополнительно 1,6% покрытия.

Невакцинные штаммы составили 22%. Среди них 5,2% занимали изоляты, относившиеся к серогруппе 15, доля серотипа 11А была 3,1% от общего числа штаммов. Остальные 26 серотипов встречались редко (доля каждого составляла 1% от общего числа), суммарно составляя 7,9%.

Пневмококковые вакцины оказывают серьезное влияние на эпидемиологию серотипов S. pneumoniae. В странах, где была внедрена вакцинация ПКВ7, вакцинные штаммы пневмококка практически исчезли [124; 144]. Учитывая эти данные, мы сравнили наши результаты серотипирования с данными довакцинального периода, поскольку ПКВ при проведении исследования не были еще включены в национальный календарь прививок в России. Наши результаты показали, что состав и распределение основных серотипов были аналогичны описанным в довакцинальный период во всем мире, когда среди неинвазивных изолятов преобладали серогруппы 3, 6, 14, 19 и 23 [73; 76; 124; 131;128;

143]. Это типичные серогруппы пневмококка, которые вызывали инвазивные пневмококковые инфекции у детей до начала применения ПКВ [72; 144].

Глава 3. Молекулярное типирование чистой культуры S.

pneumoniae с помощью М-ПЦР Использование молекулярно-генетических методов исследования в клинической микробиологии позволило разработать альтернативный метод типирования S. pneumoniae, основанный на ПЦР. Принцип молекулярного типирования базируется на том, что формирование бактериальной капсулы контролируют гены синтеза полисахаридной капсулы, расположенные в локусе cps, центральная часть которого содержит серотип-специфичные последовательности ДНК [114]. На амплификации таких последовательностей основана дифференцировка серотипов с помощью ПЦР.

В настоящей работе мы сравнили классический серологический метод типирования S. pneumoniae и метод молекулярного типирования с помощью мультиплексной ПЦР, который модифицировали в соответствии с данными о циркулирующих в России серотипах.

Опираясь на полученные результаты (глава 2), а также предыдущие исследования серотипового пейзажа S. pneumoniae на территории РФ [6;

8; 13; 15; 16], мы изменили состав наборов праймеров для ПЦР, рекомендованный [114], с учетом частоты встречаемости отдельных серотипов в нашей стране. Изменения были направлены на то, чтобы охватить наибольшее число серотипов при проведении первых ПЦР и таким образом сократить количество реакций, необходимых для типирования. В частности, композиция первых трех ПЦР должна была обеспечить типирование у 70-90% штаммов S. pneumoniae (Таблица 8).

Для молекулярного типирования методом случайной выборки отобрали из коллекции, описанной в главе 2, 420 изолятов пневмококка.

С отобранными изолятами провели серию мультиплексных ПЦР, состоявшую максимально из семи последовательных реакций.

Исследователь, выполнявший ПЦР, не был проинформирован о

–  –  –

Серологическим методом серотип определили у всех 420 штаммов, всего было представлено 34 различных серотипа. Проведение модифицированной мультиплексной ПЦР показало следующие результаты. После постановки ПЦР №I удалось типировать 67,4% штаммов, ПЦР №II позволила типировать еще 14,3% штаммов, с помощью ПЦР №III дополнительно протипировали 8,8% изолятов, т.е. за первые три ПЦР удалось типировать 90,5% S. pneumoniae из нашей коллекции (Таблица 9). С помощью ПЦР №IV-VII дополнительно типировано 4,5% штаммов, что в целом обеспечило использованной методике молекулярного типирования 95%-ое покрытие серотипов.

Таким образом, 399 из 420 штаммов S. pneumoniae (95%) удалось типировать путем мультиплексной ПЦР. У оставшегося 21 штамма не удалось амплифицировать ни одного серотип-специфического продукта, хотя все эти изоляты дали положительный результат в ПЦР с праймерами для общего локуса cpsA, что указывало на их принадлежность к S. pneumoniae. Результаты серологического

–  –  –

При сопоставлении серологического и молекулярного типирования S. pneumoniae было обнаружено совпадение результатов у 396/399 (99,2%) штаммов. У оставшихся 3 штаммов серологически был определен серотип 19А, а методом ПЦР – серотип 19F. При помощи МЛСТ было установлено, что два из этих штаммов относились к сиквенс-типу ST-8025 и один – к ST-5964, причем у ранее описанных штаммов из базы данных PMEN указанные сиквенс-типы имели серотип 19А.

О разночтениях между результатами серологического и молекулярного типирования пневмококков, относящихся к cерогруппе 19, сообщалось ранее [104]. Штаммы S. pneumoniae серотипов 19A и 19F нередко имеют полифилетическую природу (т.е. несколько предшественников), что сопровождается повышенной вариабельностью cps-локусов, ответственных за синтез капсульных полисахаридов [47].

Высокая способность пневмококка к рекомбинациям крупных фрагментов ДНК, которые могут включать и cps-локус, ведет к тому, что в естественных условиях случайным образом могут возникать субпопуляции бактерий с различными капсульными вариантами, которые имеют ограниченное распространение и не относятся к доминирующей популяции, в связи с чем их трудно идентифицировать.

Однако селективное давление ПКВ дает преимущество тем капсульным вариантам, которые не входят в состав вакцины. В этих условиях предсуществующие небольшие клоны не-ПКВ пневмококков могут разрастаться, начиная играть заметную роль в структуре серотипов.

Полагают, что именно такой сценарий лежит в основе экспансии серотипа 19A, происходящего от клона серотипа 19F (Тайвань 19F-14), на фоне вакцинации ПКВ7, в состав которой входит только серотип 19F [47; 106]. Интересно отметить, что феномен переключения капсулы, т.е.

приобретения нового капсульного полисахарида при сохранении «базового» генотипа, отмечался задолго до широкого использования антибиотиков и введения вакцинации [148], что позволяет считать такой тип рекомбинации неотъемлемой частью естественной эволюции пневмококка.

Недостатком использованного нами генетического метода в настоящее время является невозможность определения всех циркулирующих капсульных серотипов S. pneumoniae, а также дифференцировка серотипов в некоторых серогруппах [13; 16; 111].

Предложенные ранее ПЦР методики [6; 18] охватывают меньшее количество включенных серотипов, поэтому содержат большой процент нетипируемых штаммов S. pneumoniae.

В заключение, с помощью предложенной методики можно выявлять более 90% циркулирующих на территории Российской Федерации неинвазивных серотипов S. pneumoniae, а также все серотипы, включенные в состав существующих ПКВ. Это позволяет расценивать указанный метод как адекватную альтернативу классическому серологическому методу типирования пневмококка.

Глава 4. Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов полирезистентных штаммов Чувствительность к антибиотикам была протестирована у 835 штаммов пневмококка.

В панель исследованных антибиотиков вошли оксациллин, эритромицин, клиндамицин и триметоприм/сульфаметоксазол (ТМП/СМЗ). Резистентность к различным группам антибиотиков варьировала от 20% до 57% (Таблица 10). Наибольший уровень резистентности пневмококка наблюдался к ТМП/СМЗ (57%).

По результатам скринингового метода определения чувствительности к бета-лактамам с помощью диска с оксациллином было выявлено 29% оксациллин-резистентных штаммов пневмококка. Для выявления уровня резистентности к пенициллину у 189/243 (78%) штаммов, устойчивых к оксациллину, была определена МПК пенициллина с помощью Е-теста. Это исследование показало, что 7% (13/189) тестированных штаммов были чувствительны к пенициллину (МПК 0,06 мг/л). Остальные 93% (176/189) изолятов имели МПК 0,06 мг/л, т.е. относились к пенициллиннечувствительным пневмококкам. Таким образом, сниженной чувствительностью или резистентностью к пенициллину обладали 27% изолятов (93% от числа оксациллин-резистентных штаммов). Среди них доля штаммов с МПК 2 мг/л составила 10% (18/176).

Среди исследованных штаммов пневмококка полирезистентностью (устойчивость к 3 и более классам антибиотиков) обладали 22% изолятов (Таблица 10). Полирезистентность была свойственна ограниченному числу пневмококковых серотипов. К ним относились серотипы 6B (31%), 14 (40%), 19F (48%), 19A (63%) (Таблица 10).

–  –  –

Примечание.

a Включены 11 серотипов, частота встречаемости которых была =2%.

Суммарно они составляли 82.7% от всех выявленных серотипов.

б На МПК к пенициллину было исследовано 189/243 оксациллинрезистентных штаммов. Из них 93% обладали МПК к пенициллину 0,06 мкг/мл.

в Триметоприм/сульфаметоксазол.

г Устойчивые к 3 и более классам антибиотиков. Другие полирезистентные серотипы (количество резистентных штаммов/всего штаммов): 8 (1/4), 9N (2/12), 9V (3/12), 15A (1/3), 35C (1/5).

Наиболее устойчивые к антибиотикам пневмококки выявлялись среди штаммов, относившихся к серотипу 19A. Уровень резистентности к антибиотикам пневмококков этого серотипа колебался от 90% (17/19) к пенициллину до 32% (6/19) к клиндамицину.

Большинство (63%, 12/19) 19А-штаммов обладали полирезистентностью. Также к категории высокой резистентности относились пневмококки серотипов 14 и 19F, устойчивость которых к пенициллину составляла 64% и 57% соответственно, а к эритромицину и 52% соответственно.

Пневмококки серотипа 3 в значительной степени сохраняли чувствительность ко всем тестированным антибиотикам. Только 1 штамм этого серотипа был не чувствительн к оксациллину и 5% (3/61) изолятов были резистентны к ТМП/СМЗ. Ни один изолят пневмококка серотипа 3 не обладал полирезистентностью.

Большинство штаммов серотипа 23F были чувствительны к оксациллину, эритромицину, клиндамицину, число полирезистентных штаммов составило всего 6% (5/81).

Полирезистентные штаммы пневмококка встречались также и среди редких серотипов: 1 из 4 штаммов серотипа 8, 2 из 12 серотипа 9N, 1 из 3 - серотипа 15А и 1 из 5 - серотипа 35С были полирезистентны.

Резистентностью к макролидам обладали 26% (218/835) исследованных штаммов пневмококка. Для уточнения механизмов резистентности к макролидам у 157/218 (72%) эритромицинрезистентных штаммов была проведена ПЦР для выявления ermB и mef гена (Таблица 11).

Таблица 11 Генетические детерминанты резистентности к макролидам у S.

pneumoniae Гены резистентности Кол-во штаммов % ermB+ mef+ ermB+/mef+ ermB-/mefВсего 157 100 Ген ermB был выявлен у 54% (85/157) штаммов, ген mef имели 13% (20/157) штаммов. Оба гена были обнаружены у 31% (48/157) исследуемых образцов. У четырех эритромицин-резистентных штаммов ни один из генов не был выявлен.

Для детекции генетических маркеров резистентности и анализа клонального родства изолятов S. pneumoniae в соответствии с международными рекомендациями использован метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ).

Для МЛСТ было отобрано 26 полирезистентных штаммов пневмококка, принадлежавших к следующим серотипам: 19А (n=8), 6В (n=6), 23F (n=3), 14 (n=3), 19F (n=5), 6А (n=1). Результаты генотипирования представлены в таблице 12.

Всего было выявлено 14 различных сиквенс-типов (ST), входящих в 7 клональных комплексов (Clonal Complex, CC). Наиболее многочисленными оказались следующие СС: СС320 (9/26), СС315 (6/26), СС156 (5/26) и СС81 (3/23), которые относились к глобальным клонам Taiwan 19F-14, Poland6B-20, Spain9V-3 и Spain 23F-1 соответственно (Таблица 12, Рисунок 7).

Самым распространенным был СС320, представленный 9 изолятами с серотипами 19A и 19F, пять из которых относились к ST236 и четыре к ST320. Следует отметить, что устойчивость к эритромицину у 8 из 9 изолятов данного СС была обусловлена наличием обеих детерминант резистентности – генов ermB и mef.

Вторым по числу изолятов был СС315, включавший в себя сиквенс-типы ST315 (n=3), ST386 (n=1), ST1032 (n=1) и ST6046 (n=1).

Все изоляты СС315 относились к серотипу 6В. У четырех изолятов резистентность к эритромицину была обусловлена наличием только гена ermB, у одного – присутствием двух генов (ermB+mef), а у изолята с ST6046 не было выявлено ни одного гена.

–  –  –

Примечание. R, устойчивый (МПК пенициллина 0,06 мкг/мл или резистентный к оксациллину, если помечен *). S, чувствительный (МПК пенициллина 0,06 мкг/мл)

–  –  –

Примечание. Показано распределение популяции исследованных штаммов, построенное с использованием eBURST-анализа. ST обозначены кружком с соответствующим номером. Размер кружка пропорционален числу изолятов, принадлежащих данному ST. Однолокусные варианты соединены линиями.

Изоляты, относящиеся к клональному комплексу CC156, были представлены ST143 (1/5), ST663 (1/5), ST790 (1/5) и ST865(2/5).

У всех изолятов СС81 устойчивость к макролидным антибиотикам была обусловлена наличием генов mef и ermB. К СС30 относился один изолят с ST1500, который имел серотип 23F, был устойчив к макролидам и обладал двумя генами резистентности (ermB+mef).

Единичными изолятами были представлены СС63 и СС230, имевшие серотип 19А (Таблица 12).

Таким образом, наиболее высокой генетической гетерогенностью характеризовались штаммы с серотипом 19А. Они принадлежали к 4 различным клональным комплексам СС63, СС156, СС230 и СС320, связанным с глобальными клонами Sweden 15A-25, Spain9V-3, Denmark 14 и Taiwan 19F-14 соответственно.

В настоящее время широкое распространение серотипа 19А наблюдается в странах, где ПКВ7, содержащая только серотип 19F (но не 19А), была внедрена в календарь вакцинации: Франция 20,5% (42), США 20% [124], Италия 19% [32].

Полученные в ходе нашего исследования результаты близки с данными Савиновой Т.А. и соавт. [23]. Авторы показали, что 56,9% исследованных штаммов относилось к четырем глобальным клональным комплексам (СС81, СС156, СС315 и СС320) и отличались высокой резистентностью к макролидам.

Сиквенс-тип ST81 Spain23F-1 первоначально был выделен в 1980-е годы в Испании, после чего он распространился по всему миру, и к концу 1990-х годов устойчивость к пенициллину данных штаммов составила почти 40% [124]. Основной характеристикой штаммов S.

Spain 23F-1 pneumoniae генотипа является то, что независимо от географической области выделения эти микроорганизмы являются полирезистентными прежде всего по отношению к бета-лактамам и макролидам. Данный сиквенстип распространен в основном в южной части Европы и регионах Ближнего Востока.

Предшественник клонального комплекса СС156, в который входят ST790, ST663, ST143, ST865, был впервые идентифицирован в 1988 году в Испании (ST-156) и относился к серотипу 9V [150]. В дальнейшем он был описан на всех континентах и мог относиться к различным серотипам [102]. Для штаммов этого клонального комплекса, выделенных в ходе нашего исследования, была характерна множественная устойчивость и наличие резистентности к макролидам за счет гена ermB.

По данным базы www.mlst.net, ST315 наиболее часто встречается на территории Европы (преимущественно в Польше и Германии), а также в Таиланде с преобладающим пенициллин-, эритромицин- и тетрациклин-резистентным фенотипом. К данному сиквенс-типу в основном относятся штаммы с серотипом 6В, которые отличаются умеренной устойчивостью к пенициллину (МПК=0,125–0,25 мкг/мл) при повышенных уровнях устойчивости к эритромицину. Все изоляты ST315, проанализированные в ходе данной работы, обладают таким же фенотипом.

Клональный комплекс СС320, представленный в нашем исследовании ST236 и ST320, широко распространен в Юго-Восточной Азии, а также встречается и в Европе (Греция, Италия, Германия). Он является полирезистентным (пенициллин-, эритромицин-, тетрациклинустойчивым), его представители чаще относятся к серотипу 19A [74].

Таким образом, уровень антибиотикоустойчивости пневмококка в нашей коллекции был значительным. Общий уровень устойчивости к пенициллину составил 27%, резистентность к макролидам была на уровне 26%, а 22% штаммов были полирезистентны.

Глава 5. Детекция ДНК бактериальных отопатогенов в жидкости среднего уха у детей с ОСО с использованием ПЦР в реальном времени Молекулярные маркеры бактериальных возбудителей были исследованы непосредственно в образцах ЖСУ 311 пациентов с ОСО (Таблица 13).

Для этого полученную из ЖСУ ДНК последовательно амплифицировали с помощью ПЦР со специфическими праймерами для четырех выбранных отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, H.

influenzae и M. catarrhalis).

В результате у 70% (218/311) пациентов ПЦР была положительна как минимум для одного возбудителя, у остальных 30% (93/311) все ПЦР были отрицательными.

Таблица 13 Характеристика обследованных пациентов с ОСО

–  –  –

Примечание (здесь и в Таблицах 14, 15):

а Положительным результатом ПЦР считали выявление у пациента ДНК одного или нескольких из исследованных отопатогенов.

б Положительным культуральным результатом считали выделение из ЖСУ одного или нескольких видов этиологически значимых бактерий, к которым относили S. pneumoniae, S. pyogenes, H. inluenzae и M. catarrhalis.

–  –  –

У всех пациентов параллельно с ПЦР проводили классическое микробиологическое исследование. Доля положительных результатов при ПЦР была статистически значимо выше доли положительных результатов при микробиологическом исследовании [70% (218/311) против 30% (93/311), р0,001] (Таблица 13). Таким образом, с помощью ПЦР удается выявить отопатоген дополнительно у 40% пациентов с ОСО. Прирост числа положительных результатов при ПЦР дали все исследованные патогены, однако, наиболее часто обнаруживался S.

pneumoniae (+108 пациентов), что повысило его долю в структуре возбудителей ОСО с 67% (62/93) при культуральном исследовании до 78% (170/218) при ПЦР (Таблица 14). ПЦР с праймерами для S.

pneumoniae, S. pyogenes и M. catarrhalis дали положительный результат у всех пациентов, у которых указанные возбудители были выявлены микробиологическим методом, а в случае отрицательного ПЦРисследования культуры также были отрицательны (Таблица 14). У 9 пациентов с бактериологически подтвержденным H. inluenzaeассоциированным ОСО результаты ПЦР оказались отрицательными. При этом у 7 пациентов с положительной ПЦР на H. inluenzae был отрицательный культуральный результат по этому возбудителю, а у 4 пациентов положительные результаты обоих методов совпали (Таблица 14).

ЖСУ для исследования получали двумя способами: при процедуре тимпаноцентеза или после спонтанного прорыва барабанной перепонки.

Сведения о способе получения ЖСУ были получены для 92% (287/311) пациентов с ОСО. Доля положительных результатов при ПЦР в материале тимпаноцентеза и при спонтанном прорыве барабанной перепонки статистически не отличались (69% (127/185) против 72% (73/102), p=0,606) (Таблица 15). Положительные результаты культурального исследования в обоих материалах также встречались примерно с одинаковой частотой [тимпаноцентез – 31% (58/185) против спонтанный прорыв – 30% (31/102), p=0,866]. Доли возбудителей как при ПЦР-исследовании, так и при микробиологическом анализе не зависели от способа получения материала (р=0,688 и р=0,558 соответственно). Таким образом, способ получения ЖСУ не влиял на результаты ПЦР-детекции и культурального выявления исследованных отопатогенов.

Далее мы оценили влияние приема антибиотиков, предшествующего взятию материала, на частоту положительных результатов детекции отопатогенов с помощью ПЦР и

–  –  –

Исследование при помощи ПЦР показало иные результаты. Доля пациентов с положительными результатами ПЦР на фоне приема антибиотиков и не принимавших антибиотики отличалась статистически незначимо [66% (41/62) против 75% (163/218) соответственно, p=0,228] (Таблица 15). Структура выявляемых возбудителей также не менялась (р=0,649). Следовательно, антибиотики не оказывали значимого влияния на частоту ПЦР-положительных результатов.

Частота выявления этиологического агента при ОСО сильно варьирует в зависимости от критериев диагноза ОСО, чувствительности используемых методов детекции возбудителя, преаналитических факторов при лабораторном исследовании и др. Наиболее высокие результаты дает сочетание строгих отоскопических критериев ОСО и нанесения материала непосредственно на питательную среду сразу после получения ЖСУ, когда доля положительных культур может достигать 80-90% [90]. Однако большинство исследований, приближенных к реальной клинической практике, сообщает число положительных культур при ОСО в пределах 39-52% [55; 66; 92; 119]. В связи с этим наиболее значимым является выделение и идентификация патогенов непосредственно из образца. Развитие молекулярных методов, основанных на ПЦР, в частности ПЦР в реальном времени, имеют значительные преимущества в скорости и чувствительности. Данный метод позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов.

Наше исследование показало, что частота выявления бактериальных отопатогенов методом ПЦР-РВ увеличивается до 70%, что согласуется с предыдущими исследованиями, где частота обнаружения отопатогенов при ОСО колебалась в пределах от 68% до 90% [51; 79; 81; 91].

Одной из причин отрицательного результата при культуральном исследовании может служить прием антибактериальных препаратов до взятия образца. В нашем исследовании более 1/3 пациентов получили одну и более доз антибиотиков до микробиологического анализа, что привело к статистически значимому снижению частоты выявления положительных культур в этой группе до 18%. При этом возрастала пропорция стерильных культур и культур с нормофлорой, что согласуется другими публикациями [127]. Однако антибиотики не оказывали значимого влияния на частоту выявления отопатогенов методом ПЦР. Обнаружение бактериальной ДНК из культуры отрицательных образцов методом ПЦР в некоторых случаях можно объяснить недавно полученной антибиотикотерапией, гибелью бактерий во время транспортировки, и/или низким количеством организмов в образце.

Таким образом, выявление и идентификация возбудителей молекулярными методами, не зависящими от жизнеспособности микроорганизмов, является перспективным направлением современной микробиологии, дальнейшее развитие которого поможет уточнению этиологического спектра ОСО.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ   

Пневмококк остается наиболее частым возбудителем бактериальных респираторных инфекций, а также значимым этиологическим агентом при бактериемии и менингите у детей. Важным способом эпидемиологического контроля за пневмококковыми инфекциями является изучение спектра пневмококковых серотипов, циркулирующих на определенной территории. В настоящей работе мы определили серотиповой состав большой коллекции клинических неинвазивных штаммов пневмококка, собранной в Москве в 2009-2013 гг. Среди выявленных 45 различных серотипов преобладали серотипы 3, 6А, 6В, 14, 19F и 23F, которые составили более 69% распределения.

Невакцинные штаммы составили 22%, среди которых изоляты серогруппы 15 составили 5,2%, серотип 11А – 3,1% от общего числа штаммов. Остальные 26 серотипов встречались редко (доля каждого составляла 1% от общего числа), суммарно составляя 7,9%. Серотип 19F имел самую высокую частоту встречаемости, которая составила 20%, причем его распространенность была еще выше у пациентов 48 мес. Напротив, серотипы 3 и 37, а также редкие серотипы преобладали у более старших детей (48 мес.). Структура серотипов имела некоторые особенности в зависимости от локуса выделения пневмококка.

Например, частота выявления серотипов 3 и 19А в образцах ЖСУ была выше, чем в других источниках, в то время как серотип 11А был выявлен исключительно в образцах дыхательных путей.

Данные об актуальных серотипах пневмококка, циркулирующих в РФ, приобретают большое значение в свете начавшейся вакцинации, после включения ПКВ в отечественный календарь иммунизации, поскольку позволяют оценить перекрытие серотипов существующими вакцинами. Наши результаты показывают совпадение спектра циркулирующих серотипов на 58% для ПКВ7, на 60% для ПКВ10 и на 78% для ПКВ13. Похожие результаты были получены в других отечественных исследованиях. По данным Р.С. Козлова [13], покрытие неинвазивных серотипов в различных регионах России составило 80,4%, 80,7% и 84,6% для 7-, 10- и 13-валентной вакцин соответственно. В исследовании, проведенном у детей с острыми отитами и пневмониями в Санкт-Петербурге, ожидаемая эффективность ПКВ7 оценена как 75%, а ПКВ13 – как 95,1% [26], что сопоставимо с нашими данными. Более того, ПКВ покрывают подавляющее большинство самых антибиотикоустойчивых серотипов, обладающих полирезистентностью (ПКВ7 и ПКВ10 – на 88%, а ПКВ13 – на 97%). С учетом того, что инвазивным пневмококковым инфекциям обязательно предшествует колонизация возбудителем нестерильных локусов, наши данные, а также данные других авторов, позволяют прогнозировать хорошую эффективность ПКВ в РФ.

Наше исследование выявило тревожную тенденцию нарастания антибиотикорезистентности пневмококка. Доля устойчивости варьировала от 20% к клиндамицину до 57% к ТМП/СМЗ, при этом 22% исследованных пневмококков обладали полирезистентностью. Доля штаммов со сниженной чувствительностью или резистентностью к пенициллину составила 27%, к эритромицину были резистентны 26% изолятов. В более ранних исследованиях, проведенных в России в конце 1990-х и в 2001-2002 гг. при изучении назофарингеальных изолятов, распространенность резистентных штаммов была значительно ниже [135; 136]. Доля пенициллин-резистентных штаммов S. pneumoniae была менее 10%, устойчивыми к макролидам были около 5% штаммов, а полирезистентность наблюдалась только у 2% изолятов. Уровень резистентности к ТМП/СМЗ был сопоставим с нашими наблюдениями (53%-65%). Таким образом, в последние годы резистентность S.

pneumoniae ощутимо выросла. Этот результат совпадает с глобальной тенденцией быстро растущей распространенности резистентных пневмококков, когда устойчивость к пенициллинам во многих регионах выросла практически с нуля до 25-50% [49;121; 134].

Это справедливо и для макролидов, уровень резистентности к которым в России вырос с 5% в 2001-2002 гг. до 26% в настоящее время [135; 136]. Наше исследование показало, что преобладающим механизмом резистентности к макролидам была модификация мишени путем метилирования, обусловленная наличием ermB-гена, который был выявлен у 54% эритромицин-резистентных штаммов в качестве одной детерминанты и в 31% в ассоциации с mef-зависимым эффлюксом. В 13% случаев наблюдался только mef-зависимый механизм устойчивости.

Число штаммов с ermB, mef и их комбинацией близки к российским данным 2004-2005 гг. [120]. В противоположность этому, в коллекции от конца 1990-х – 2002 гг. не было обнаружено ни одного штамма пневмококка, имеющего оба механизма резистентности [13; 36]. Таким образом, в последнее десятилетие в России значительно увеличилось число штаммов, имеющих сразу два механизма резистентности к макролидам, что вызывает обеспокоенность, т.к. этот фенотип связан с генетическими элементами клональных комплексов наиболее резистентных пневмококков [95].

Резистентные штаммы принадлежали ограниченному числу серотипов, среди которых выделялись серотипы 6В, 14, 19А и 19F.

Наиболее резистентными оказались 19А-пневмококки, которые обладали выраженной генетической гетерогенностью. Штаммы серотипа 19А принадлежали к четырем клональным комплексам, включая СС63, СС156, СС230 и СС320, связанным с глобальными клонами Sweden 15ASpain9V-3, Denmark 14 -32 и Taiwan19F-14 соответственно. Всего при анализе клонального родства 26 полирезистентных изолятов S.

pneumoniae методом МЛСТ было выявлено 14 различных сиквенс-типов, входящих в 7 клональных комплексов. Самым распространенным стал клональный комплекс СС320, связанный с глобальным клоном Taiwan 19F-14. Отметим, что 19А-пневмококки, принадлежащие к клональному комплексу СС320, стали наиболее значимыми возбудителями инвазивных пневмококковых инфекций только в постПКВ7 периоде [74; 106]. Циркуляция таких штаммов на территории РФ в отсутствие вакцинации ПКВ отражает, вероятно, эволюционный прессинг нерационального использования антибиотиков. Таким образом, наши данные в очередной раз демонстрируют необходимость проведения постоянного мониторинга за распространенностью антибиотикорезистентных штаммов пневмококков и изучения их генетической принадлежности в целях совершенствования эмпирической антибактериальной терапии.

В последние годы в клинической микробиологии все более широко используются молекулярно-генетические методы исследования. Они применяются для идентификации микроорганизмов и механизмов их резистентности к антибиотикам, причем как в чистой культуре, так и в клинических образцах. Разработаны подходы для определения серотиповой принадлежности и генотипических характеристик микробов при помощи молекулярных технологий. В своем исследовании для типирования пневмококка мы модифицировали мультиплексную ПЦР, которая позволяет определить серотип у 95% циркулирующих в РФ неинвазивных штаммов пневмококков, а также все серотипы, включенные в состав существующих ПКВ. Компоновка ПЦР с учетом распространенности серотипов у нас в стране позволила добиться типирования 90% штаммов уже с помощью первых трех ПЦР из мультиплексного набора, состоящего из семи реакций. При этом сопоставление результатов классического и молекулярного типирования показало совпадение результатов в 99% случаев. Полученные данные указывают на надежность молекулярного метода, что делает возможным его внедрение в рутинную практику в качестве адекватной и доступной альтернативы классическому серологическому типированию пневмококка.

Серологическое типирование по-прежнему остается «золотым стандартом» дифференцировки пневмококков. Этот метод основан на определении капсульного варианта пневмококка с помощью специфических антисывороток в реакции агглютинации на стекле, латексной агглютинации и/или реакции набухания капсулы по Нейфельду, в основе которого лежит наличие антигенных различий в строении капсульных полисахаридов S. pneumoniae [84]. К недостаткам метода можно отнести трудоемкость, большую стоимость сывороток, субъективизм при интерпретации результатов, высокие требования к персоналу и т.п. Отсутствие производства отечественных пневмококковых сывороток, экспериментальные образцы которых использовались для серотипирования пневмококков в 1990-х гг. [7;8; 27;

114], в условиях ограниченных финансовых возможностей для закупки импортных реагентов фактически остановило исследовательскую работу в этом направлении, и в течение 20 лет данные о серотиповом составе S.

pneumoniae обновлялись медленно. В связи с этим молекулярное серотипирование пневмококка с помощью ПЦР, в основе которого лежит несколько несложных манипуляций и объективная оценка результатов, без сомнения, получит широкое распространение в микробиологической практике. В сочетании с улучшением диагностических алгоритмов это будет способствовать формированию объективных представлений о частоте пневмококковых инфекций и реальном серотиповом спектре пневмококка, а значит способствовать повышению эффективности их вакцинопрофилактики.

Методы молекулярной микробиологии с использованием, в частности, ПЦР в реальном времени имеют значительные преимущества в скорости получения результата и чувствительности, позволяя определять единичные копии в исследуемом образце. В нашей работе мы изучили возможности данного метода для этиологической диагностики ОСО у детей и определения места S. pneumoniae в структуре бактериальных возбудителей при данной инфекции. ОСО является распространенным заболеванием у детей и служит одной из самых частых причин обращения за медицинской помощью и использования антибиотиков в детском возрасте [105;140]. Наиболее значимыми бактериальными отопатогенами считают S. pneumoniae и нетипируемую H. influenzae, на долю которых приходится до 60-80% микробиологически подтвержденных случаев ОСО [26; 44; 125; 139]. К менее значимым патогенам относят M. catarrhalis и S. pyogenes, хотя с последним связывают более тяжелые формы инфекции и повышенный риск развития осложнений [9; 129; 139]. В большинстве исследований, приближенных к реальной клинической практике, приводится доля положительных культуральных результатов при ОСО в пределах 39–52% [55; 66; 92; 119]. Частота обнаружения отопатогенов с помощью ПЦР может быть существенно выше, превышая обычно 70-80% [63; 118].

Результаты настоящего исследования подтвердили высокую чувствительность ПЦР для обнаружения бактериальной ДНК в образцах из ЖСУ. Доля положительных результатов достигала 70%, тем самым увеличившись на 40% по сравнению с традиционным культуральным методом, признанным в качестве "золотого стандарта ". Такая картина может быть обусловлена тем, что результат ПЦР не зависит от жизнеспособности бактерий, поэтому транспортировка и прием антибиотиков перед сбором биоматериала не являются лимитирующими факторами. Действительно, наше исследование показало, что прием антибиотика не оказывал значимого влияния на результаты ПЦРанализа. Таким образом, выявление и идентификация возбудителей молекулярными методами, не зависящими от жизнеспособности микроорганизмов, является перспективным направлением современной микробиологии, дальнейшее развитие которого поможет уточнению этиологического спектра ОСО.

В заключение, проведенное исследование представляет важные сведения о распространенности серотипов клинических штаммов пневмококков у детей в Москве. Такие данные могут быть использованы в качестве отправной точки для мониторинга и оценки влияния ПКВ на серологический состав и антибиотикорезистентность S. pneumoniae в нашей стране.

ВЫВОДЫ

1. Серологический пейзаж штаммов S. pneumoniae у детей (медиана возраста 3,5 года) с респираторными инфекциями в г. Москве, обследованных в период с марта 2009 г. по апрель 2013 г., представлен 45 различными серотипами. Установлено, что доминировали 6 серотипов: 19F (21,7%), 6В (12,8 %), 23F (10%), 14 (9%), 6А (8,4 %) и 3 (7,5%), которые составляют 69,4% от всех выявленных серотипов и серогрупп.

Пневмококковая конъюгированная 13-валентная вакцина охватывает 78% выявленных серотипов.

2. Предложенный протокол выполнения мультиплексной ПЦР, модифицированный в соответствии с данными об актуальных серотипах S.

pneumoniae, позволяет за первые три реакции типировать 90,5% штаммов пневмококка и в результате перекрывает 95% неинвазивных серотипов.

Результаты серологического и молекулярного типирования совпадают в 99% случаев.

3. Доля полирезистентных штаммов S. pneumoniae, циркулирующих у детей в Москве, составляет 22%. Наибольший уровень резистентности пневмококка наблюдается к триметоприму/ сульфаметоксазолу (57%), нечувствительны к пенициллину 27% штаммов, а устойчивостью к макролидам обладают 26% штаммов пневмококка.

4. Ведущим молекулярным механизмом резистентности к макролидам у изученных штаммов оказалось наличие гена ermВ, который встречается у 54% штаммов как единственная детерминанта и у 31% в сочетании с эффлюксом, опосредованным mef-геном.

5. Циркулирующие в Москве полирезистентные штаммы S. pneumoniae в основном относятся к четырем глобальным клональным комплексам: СС81, СС156, СС315, СС320.

6. Определение специфической ДНК патогенов с помощью молекулярного метода при острых средних отитах непосредственно из образца жидкости среднего уха у детей, по сравнению с микробиологическим исследованием, позволяет дополнительно выявить возбудителей у 40% пациентов. При этом доля S. pneumoniae в этиологической структуре возбудителей возрастает с 67% до 78%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для молекулярного типирования S. pneumoniae рекомендуется использование модифицированного протокола ПЦР, который позволяет надежно определить серотип 95% неинвазивных пневмококков.

2. Для обеспечения адекватной эмпирической антибактериальной терапии пневмококковых инфекций целесообразно проводить локальный мониторинг устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам.

3. Для оценки эффективности вакцинации ПКВ и ее влияния на серологический состав популяции S. pneumoniae обосновано применение серотипирования пневмококка.

4. С целью улучшения этиологической диагностики ОСО у детей рекомендуется использовать молекулярные методы выявления и идентификации патогенов.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ

РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Дальнейший мониторинг циркулирующих серотипов на фоне массовой вакцинации пневмококковыми конъюгированными вакцинами.

2. Продолжение исследований, направленных на выявление резистентных штаммов пневмококка и определения их клональной принадлежности.

3. Продолжение изучения роли генов ermB и mef в развитии устойчивости S.

pneumoniae к макролидам, а также их связи с уровнем устойчивости возбудителя.

4. Изучение других молекулярных механизмов резистентности к различным классам антибиотиков.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЖСУ - жидкость среднего уха НАД - никотинамидадениндинуклеотид МЛСТ - мультилокусное сиквенс-типирование М-ПЦР - мультиплексная полимеразная цепная реакция МПК - минимальная подавляющая концентрация ОСО - острый средний отит ПКВ - пневмококковая конъюгированная вакцина ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени CC - (clonal complex) клональный комплекс ТМП/СМЗ - триметоприм-сульфаметоксазол ФГБНУ НЦЗД - Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр здоровья детей»

PBPs - (penicillin binding proteins) пенициллин-связывающие белки PMEN - (Pneumococcal Molecular Epidemiology Network) пневмококковая молекулярная эпидемиологическая сеть ST - (sequence type) сиквенс-тип

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранов, А.А. Пневмококковая инфекция и связанные с ней заболевания – серьезная проблема современного здравоохранения / А.А. Баранов, Л.С. Намазова, В.К. Таточенко // Педиатрическая фармакология. – 2008. – Т. 5. - № 2. - С. 7-12.

2. Баранов, А.А. Результаты фармакоэкономическоно анализа применения пневмококковой конъюгированной 7-валентной вакцины для профилактики пневмококковых инфекций у детей первых 5 лет жизни в Российской Федерации / А.А. Баранов, В.В.

Омельяновский, Н.И. Брико, Ю.В. Лобзин, Л.С. НамазоваБаранова, В.К. Таточенко и др. //Педиатрическая фармакология. – 2009. - Т. 6. - № 6. - С. 6-10.

3. Баранов, А.А. Развитие научных исследований и инфраструктуры в рамках задач платформы «Педиатрия» / А.А. Баранов // Педиатрическая фармакология. – 2012. – Т. 9. - № 4. – C. 6-10.

4. Баранов, А.А. Роль Streptococcus pneumoniae в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы в 2011–2012 гг. / А.А. Баранов, Л.С.

Намазова-Баранова, Н.А. Маянский, Т.В. Куличенко, Т.А.

Полунина, А.В. Лазарева, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, О.А.

Пономаренко, И.Е. Колтунов, А.М. Иваненко, Е.А. Дегтярёва, Н.В.

Кондратенко, А.А. Корсунский, К.В. Константинов, Д.А. Тулупов, М.А. Лазарева //Педиатрическая фармакология. – 2013. – Т. 10. - № 5. - С. 6-12.

5. Белошицкий, Г.В. Фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом / Г.В. Белошицкий, И.С. Королева, К.О. Миронов //Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. – 2011.

– Т. 13. - № 3. – С. 261-266.

6. Боронина, Л.Г. Эпидемические особенности Streptococcus pneumoniae, выделенного у детей, при неинвазивных пневмококковых инфекциях и носоглоточном бактероиносительстве / Л.Г. Боронина, Е.В. Саматова // Вопросы диагностики в педиатрии. – 2013. – Т. 5. - № 1. - С. 22-26.

7. Катосова, Л.К. Серотипы S. pneumoniae у детей, больных хроническими воспалительными заболеваниями органов дыхания / Л.К. Катосова, Т.М. Сидорина, А.П. Батуро, Г.Д. Сотникова //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1990. - №2. - С. 32-37.

8. Катосова, Л.К. Серотипы S. pneumoniae у детей, больных острой пневмонией и плевритом / Л.К. Катосова, В.К. Таточенко, А.А.

Арова, А.А. Кешикбаева, А.П. Батуро, Т.А. Кузнецова, А.Б. Левин //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1990. - № 5. - С. 23-28.

9. Катосова, Л.К. Этиология и рациональная терапия тяжелых форм острых средних гнойных отитов у детей / Л.К. Катосова, А. В.

Очкасов, М.Р. Богомильский //Антибиотики и химиотерапия. – 2006. - № 2. - С. 23-29.

10. Катосова, Л.К. Этиологическая диагностика острых пневмоний у детей / Л.К. Катосова, Т.В. Спичак, С.С. Ким, С.Б. Яцышина, И.В.

Зубкова, М.Н. Прадед //Вопросы диагностики в педиатрии. -2009. С. 27-31.

11. Козлов, Р.С. Пути оптимизации мониторинга, профилактики и фармакотерапии пневмококковой инфекции / Козлов Р.С. //Текст.:

автореф. дис..докт. мед. наук / Смоленск. - 2004. - 45 с.

12. Козлов, Р.С. Динамика резистентности Streptococcus pneumoniae к антибиотикам в России за период 1999–2009 гг. / Р.С. Козлов, О.В.

Сивая, О.И. Кречикова, Н.В. Иванчик, Группа исследователей проекта «ПеГАС» //КМАХ. – 2010. – Т. 12. - № 4. – С. 269-368.

13. Козлов, Р.С. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации / Р.С. Козлов, А.Н. Чагарян, Л.В. Козлова, А.А. Муравьев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2011. – Т. 13. – С. 177–187.

14. Королева, И.С. Серотиповая характеристика пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом / И.С.

Королева, Г.В. Белошицкий, К.О. Миронов //Вопросы современной педиатрии. — 2012. – Т. 11. - № 4. – С. 122–127.

15. Костюкова, Н.Н. Факторы патогенности пневмококка и их протективные свойства / Н.Н, Костюкова, В.А, Бехало // Журнал микробиология. – 2014. - № 3. – С. – 67-77.

16. Маянский, А.Н. Стрептококки: микробиология и патология / А.Н.

Маянский // Вопросы диагностики в педиатрии. – 2010. – Т. 2. - № 2. – С. 9-19.

17. Маянский, H.A., Определение капсульных серотипов пневмококка методом мультиплексной ПЦР / H.A. Маянский, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, Т.А. Гречуха, В.Г. Пинелис, Л.С. НамазоваБаранова // Вопросы диагностики в педиатрии. – 2010. – Т. 2. - № 6. - С. 6-10.

18. Миронов, К.О. Идентификация и серотипирование российских штаммов Streptococcus pneumoniae с применением методик, основаныых на ПЦР / К.О. Миронов, А.Е. Платонов, Р.С. Козлов //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2011. – Т. 13. - № 4. - С. 304-313.

19. Методические указания. (МУК) 4.2. 1890 – 04 – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2004. – 91 с.

20. Покровский, В.И. Медицинская микробиология / В.И.

Покровского, О.К. Поздеева // М.: ГЭОТАР, Медицина. - 1998.- С.

201-203.

21. Райнерт, Р.Р. Новые данные по эффективности 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины в отношении инвазивных пневмококковых инфекций, пневмоний, острого среднего отита и назофарингеального носительства / Р.Р. Райнерт, Б. Тайши //Педиатрическая фармакология. – 2012. - № 3. – С. 12Савинова, Т.А. Генетическое разнообразие пенициллинустойчивых Streptococcus pneumoniae / Т.А. Савинова, О.Ю. Филимонова, С.А.

Грудинина, C.B. Сидоренко // Журнал инфектологии. - 2010. - Т.1.

-№ 4. - С. 66-71.

23. Савинова, Т. А. Перспективы применения антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности среди пневмококков / Т.А. Савинова, Е.Н. Ильина, С.В. Сидоренко //Антибиотики и химиотерапия. – 2011. - № 56. – С. 5-6.

24. Сидоренко, С.В. Пневмококковая инфекция и современные возможности ее профилактики – эпидемиологический обзор ситуации в мире и в России / С.В. Сидоренко, Ю.В. Лобзин, С.М.

Харит, И.С. Королева, В.К. Таточенко //Вопросы современной педиатрии. - 2010. - Т. 9. - № 1. - С. 62-69.

25. Сидоренко, С.В. Популяционная структура пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину и перспективы антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности / С.В.

Сидоренко, Т.А. Савинова, Е.Н. Ильина, М.А. Сырочкина // Антибиотики и химиотерапия. – 2011. – Т. 56. - № 5–6. – С. 11–18.

26. Харит, С.М. Распространенность пневмококковых пневмоний и отитов у детей младшего возраста (предварительные данные) / С.М. Харит, С.В. Сидоренко, А.А. Рулева, А.Л. Перова, М.О.

Волкова, В.В. Гостев, С.И. Алексеенко, А.В. Орлов. //Вопросы современной педиатрии. – 2011. - №6. - C. 103-107.

27. Страчунский, Л.С. Антибактериальная терапия / Л.С.

Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова // под ред. – М.:

Полимаг. - 2000. – C. 190.

28. Таточенко, В.К. Периодические и географические различия серотипового спектра пневмококков у детей с респираторными заболеваниями у здоровых носителей / В.К. Таточенко, Л.К.

Катосова, М.А. Уланова //ЖМЭИ. – 1994. - № 3. – С. 3-10.

29. Active Bacterial Core Surveillance (ABCs) Report; Emerging Infections Program Network; Streptococcus pneumoniae [database online]. Center for Disease Control website: CDC; 2010. Updated APRIL 2012.

30. Aguiar, S.I., Portuguese surveillance group for the study of respiratory pathogens. Changes in Streptococcus pneumoniae serotypes causing invasive disease with non-universal vaccination coverage of the sevenvalent conjugate vaccine / S.I. Aguiar, I. Serrano, F.R. Pinto, J. MeloCristino, M. Ramirez // Clin. Microbiol. Infect. – 2008. – Vol.14. – P.

835–843.

31. Aguiar, S.I. Increase of Denmark14-230 clone as a cause of pneumococcal infection in Portugal within a background of diverse serotype 19A lineages / S.I. Aguiar, F.R. Pinto, S. Nunes, I. Serrano, J.

Melo-Cristino, R. S-Leo, M. Ramirez, H. de Lencastre // J. Clin.

Microbiol. – 2010. – Vol. 48. – N 1. – P. 101–108.

32. Ansaldi, F. Increasing incidence of Streptococcus pneumoniae Serotype 19A and emergence of two vaccine escape recombinant ST695 strains in Liguria, Italy, 7 Years after Implementation of the 7-Valent Conjugated Vaccine / F. Ansaldi, P. Canepa, D. de Florentiis, R.

Bandettini, P. Durando and G. Icardi // Clinical and vaccine immunology. – 2011. - Vol. 18. - P. 343–345.

33. Appelbaum, P. C. Streptococcus pneumoniae resistant to penicillin and chloramphenicol / P. C. Appelbaum, A. Bhamjee, J. N. Scragg, A. F.

Hallet, A. A. Bowen and R. C. Cooper //Lancet. – 1977. – Vol. 2. – P.

995-997.

34. Ardanuy, C. Epidemiology of invasive pneumococcal disease among adult patients in Barcelona before and after pediatric 7-valent pneumococcal conjugate vaccine introduction, 1997–2007 / C.

Ardanuy, F. Tubau, R. Pallares, L. Calatayud, M.A. Domnguez, D. Rolo, I. Grau, R. Martn, J. Liares //Clin. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 48. – P.

57–64.

35. Bartos, L.C. Comparison of the outer membrane proteins of 50 strains of Branhamella catarrhalis / L.C. Bartos, T.F. Murphy // J. Infect. Dis.

1988. – Vol.158. – P. 761–765.

36. Beall, B. Pre- and postvaccination clonal compositions of invasive pneumococcal serotypes for isolates collected in the United States in 1999, 2001, and 2002 / B. Beall, M.C. McEllistrem, Jr.R.E. Gertz, S.

Wedel, D.J. Boxrud, A.L. Gonzalez et al. // J. Clin. Microbiol. – 2006.

– Vol. 44. – P. 999–1017.

37. Beall, B.W. Shifting genetic structure of invasive serotype 19A pneumococci in the United States / B.W. Beall, R.E. Gertz, R.L.

Hulkower, C.G. Whitney, M.R. Moore, A.B. Brueggemann // J. Infect.

Dis. – 2011. – Vol.203. – P. 1360–8.

38. Bhushan, R. Antigenic characterization and analysis of the human immune response to outer membrane protein E of Branhamella catarrhalis / R. Bhushan, C. Kirkham, S. Sethi, T.F. Murphy // Infect.

Immun. – 1997. – Vol. 65. – P. 2668–2675.

39. Centers for Disease Control and Prevention. 2009. Active Bacterial CoreSurveillance Report. Emerging Infections Program Network, Streptococcus pneumoniae. 2008.

40. CDC, Streptococcus pyogenes Laboratory Protocolsd, http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocols.htm

41. Chiba, N. Serotype and antibiotic resistance of isolates from patients with invasive pneumococcal disease in Japan / N. Chiba, M. Morozumi, K. Sunaoshi, S. Takahashi, M. Takano, T. Komori, K. Sunakawa, K.

Ubukata; IPD Surveillance Study Group //Epidemiol. Infect. – 2010. – Vol. 138. – P. 61–8.

42. Cohen, R. Risk factors for serotype 19A carriage after introduction of 7-valent pneumococcal vaccination / R. Cohen, C. Levy, E. Bonnet, F.

Thollot, M. Boucherat, B. Fritzell, V. Derkx, E. Bingen, E. Varon //BMC Infectious Diseases. – 2011. –Vol. 11. – P. 95.

43. Cohen, R. Impact of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine on pneumococcal nasopharyngeal carriage in children with acute otitis media / R. Cohen, C. Levy, E. Bingen, M. Koskas, I. Nave, E. Varon //Pediatr. Infect. Dis. J. - 2012. - Vol. 31. – P. 297–301.

44. Coker, T.R. Diagnosis, microbial epidemiology, and antibiotic treatment of acute otitis media in children. A systematic review / T.R.

Coker, L.S. Chan, S.J. Newberry et al.// JAMA. – 2010. – Vol. 304. – P. 2161-2169.

45. Collee, J.G. Practical medical microbiology / J.G. Collee, A.G. Fraser, B.P. Marmion, A. Simons, Mackie and McCartney // 14th Edn., Churchill Livingston, NY, London. – 1996. – P. 279–280.

46. Cornick J.E. Streptococcus pneumoniae: the evolution of antimicrobial resistance to beta-lactams, fluoroquinolones and macrolides / J.E.

Cornick, S.D. Bentley //Microbes Infect. – 2012. – Vol. 14(7-8). – P.

573-83.

47. Croucher, N.J. Rapid Pneumococcal evolution in response to clinical interventions / N.J. Croucher, S.R. Harris, C. Fraser, M.A. Quail, J.

Burton, M. van der Linden, L. McGee, A. von Gottberg, J.H. Song, K.S.

Ko, B. Pichon, S. Baker, C.M. Parry, L.M. Lambertsen, D. Shahinas, D.R.

Pillai, T.J. Mitchell, G. Dougan, A. Tomasz, K.P. Klugman, J. Parkhill, W.P.

Hanage, S.D. Bentley // Science. – 2011. – Vol. – 331. - № 6016. - P.

331-430.

48. Dagan, R. Impact of conjugate pneumococcal vaccines on antibiotic resistance / R. Dagan, K.P. Klugman //Lancet Infect. Dis. - 2008. – Vol. 8. – P. 785–95.

49. Dagan, R. Impact of pneumococcal conjugate vaccine on infections caused by antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae  /  R. Dagan //Clin. Microbiol. Infect. - 2009. - Vol. 15 (Suppl 3). – P. 16-20.

50. Dagan, R. Introduction and proliferation of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 19A clones that cause acute otitis media in an unvaccinated population / R. Dagan, N. Givon-Lavi, E.

Leibovitz, D. Greenberg, N. Porat //J. Infect. Dis. - 2009. – Vol. 199. – P. 776–85.

51. Del Beccaro, M.А. Bacteriology of acute otitis media: a new perspective / M.A. Del Beccaro, P.M. Mendelman, A.F. Inglis, M.A.

Richardson, N.O. Duncan, C.R. Clausen, T.L. Stull // J. Pediatr. - 1992. – Vol. 120. – P.81–84.

52. Del Grosso, M. The macrolide resistance genes erm(B) and mef(E) are carried by Tn2010 in dual gene Streptococcus pneumoniae isolates belonging to clonal complex CC271/ M. Del Grosso, J.G. Northwood, D.J. Farrell, A. Pantosti // Antimicrob. Agents Chemother. – 2007. – Vol. 51. – P. 4184–4186.

53. Eichmann, K. Fred Neufeld and pneumococcal serotypes: foundations for the discovery of the transforming principle / K. Eichmann, R.M.

Krause // Cell. Mol. Life Sci. – 2013. – Vol. 70. – P. 2225–2236.

54. Enright, M.C. Multilocus sequence typing / M.C. Enright, B.G. Spratt // Trends in Microbiology. – 1999. – Vol. 7. – P. 482-487.

55. Falup-Pecurariu, O. Pneumococcal acute otitis media in infants and children in central Romania, 2009–2011: microbiological characteristics and potential coverage by pneumococcal conjugate vaccines / O. Falup-Pecurariu, E. Leibovitz, A. Mercas, L. Bleotu, C.

Zavarache, N. Porat, R. Dagan, D. Greenberg // Int. J. Infect. Dis. – 2013. - Vol. 17. - № 9. - P. 702-706.

56. Farrell, D.J. Emergence and spread of Streptococcus pneumoniae with erm(B) and mef(A) resistance / D.J. Farrell, S.G. Jenkins, S.D. Brown, M. Patel, B.S. Lavin, K.P. Klugman //Emerg. Infect. Dis. – 2005. – Vol. 11. – P. 851–858.

57. Farrell, D.J. Increased antimicrobial resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae in the pediatric population after the introduction of 7-valent pneumococcal vaccine in the United States / D.J. Farrell, K.P. Klugman, M. Pichichero // Pediatr. Infect. Dis. J. Vol. 26, № 2. – P. 123-8.

58. Feil, E.J. eBURST: Inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data / E.J. Feil, B.C. Li, D.M. Aanensen, W.P. Hanage, B.G. Spratt // Journal of Bacteriology. – 2004. – Vol. 186. – P. 1518-1530.

59. Felmingham, D. Regional trends in beta-lactam, macrolide, fluoroquinolone and telithromycin resistance among Streptococcus pneumoniae isolates 2001–2004 / D. Felmingham, R. Canton, S.G.

Jenkins // J. Infect. – 2007. – Vol. 55. – P. 111–118.

60. Fenoll, A. Temporal trends of invasive Streptococcus pneumoniae serotypes and antimicrobial resistance patterns in Spain from 1979 to 2007 / A. Fenoll, J.J. Granizo, L. Aguilar, M.J. Gimnez, L.

Aragoneses-Fenoll, G. Hanquet, J. Casal, D. Tarrag //J. Clin.

Microbiol. - 2009. - Vol. 47. – P. 1012–20.

61. Ferretti, J.J. Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes / J.J. Ferretti, W.M. McShan, D. Adjic, D.

Savic, G. Savic, K. Lyon, C. Primeaux, S.S. Sezate, A.N. Surorov, S.

Kenton, H. Lai, S. Lin, Y. Qian, H.G. Jia, F.Z. Najar, Q. Ren, H. Zhu, L. Song, J. White, X. Yuan, S.W. Clifton, B.A. Roe, R.E. McLaughlin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98, № 8. – P. 4658-4663.

62. Gertz, R.E. Active bacterial core surveillance team. Increased penicillin nonsusceptibility of nonvaccine-serotype invasive pneumococci other than serotypes 19A and 6A in post-7-valent conjugate vaccine era / R.E. Jr Gertz, Z. Li, F.C. Pimenta, D. Jackson, B.A. Juni, R. Lynfield, J.H. Jorgensen, M. da G. Carvalho, B.W. Beall // J. Infect. Dis. – 2010.

– Vol. 201, № 5. – P. 770-5.

63. Gok, U. Bacteriological and PCR analysis of clinical material aspirated from otitis media with effusions / U. Gok, Y. Bulut, E. Keles, S.

Yalcin, M.Z. Doymaz // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. – 2001. – Vol. 60. – P. 49–54.

64. Goossens, H. Outpatient antibiotic use in Europe and association with resistance: a cross-national database study / H. Goossens, M. Ferech, R.

Vander Stichele, M. Elseviers, ESAC Project Group //Lancet. – 2005. – Vol. 365, № 9459. – P. 579-87.

65. Greiner, O. Quantitative detection of Moraxella catarrhalis in nasopharyngeal secretions by real-time PCR / O. Greiner, P.J.R. Day, M. Altwegg, D. Nadal // J. of Clinical. Microbiology. – 2003. – Vol.

41. - № 4. - P. 1386–1390.

66. Grevers, G. Identification and characterization of the bacterial etiology of clinically problematic acute otitis media after tympanocentesis or spontaneous otorrhea in German children / G. Grevers, S. Wiedemann, J.C. Bohn, R.W. Blasius, T. Harder, W. Kroeniger, V. Vetter, J.Y.

Pirсon, C. Marano // BMC Infect. Dis. – 2012. – Vol. 20, № 12. - P.

312.

67. Hackel, M. Serotype prevalence and antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae clinical isolates among global populations / M. Hackel, C. Lascols, S. Bouchillon, B. Hilton, D. Morgenstern, J.

Purdy // Vaccine. – 2013. –Vol. 31, № 42. – P. 4881-7.

68. Hakenbeck, R. Beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae:

penicillin-binding proteins and nonpenicillin-binding proteins / R.

Hakenbeck, T. Grebe, D. Zahner and J.B. Stock // Molecular Microbiology. - 1999. - Vol. 33. – P. 673-8.

69. Hakenbeck, R. Molecular mechanisms of -lactam resistance in Streptococcus pneumoniae / R. Hakenbeck, R. Brckner, D. Denapaite, P. Maurer //Future Microbiol. – 2012. – Vol. 7, № 3. – P. 395-410.

70. Hansman, D. A resistant pneumococcus / D. Hansman, M.M. Bullen //Lancet. - 1967. – Vol. 2. – P. 264–5.

71. Hansman, D. Pneumococci relatively insensitive to penicillin in Australia and New Guinea / D. Hansman, L. Devitt, H. Miles, I. Riley //Med. J. – 1974. - Vol. 2. – P. 353–6.

72. Hausdorff, W.P., Feikin D.R., Klugman K.P.. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes  W.P.  Hausdorff, D.R.

/ Feikin, K.P. Klugman // Lancet Infect. Dis. – 2005. - Vol. 5. – P. 83Ho, P.L. Changes in nasopharyngeal carriage and serotype distribution of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae before and after the introduction of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in Hong Kong / P.L. Ho, S.S. Chiu, M.Y. Chan, I. Ang, K.H. Chow, Y.L. Lau // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2011. – Vol. 71. – P. 327-34.

74. Hsieh, Y.-C. Expansion and evolution of Streptococcus pneumoniae 19F serotype 19A ST320 clone: with comparison to its ancestral Taiwan ST236) clone / Y.-C. Hsieh, T.-L. Lin, K.-Y. Chang, Y.-C. Huang, C.-J. Chen, T.-Y. Lin, J.-T. Wang //Journal of Infectious Diseases Advance Access published. - 2013. – Vol. 208. - № 2. – P. 203- 210.

75. Hyde, T. B. Macrolide resistance among invasive Streptococcus pneumoniae isolates / T.B. Hyde, K. Gay, D.S. Stephens, D.J. Vugia, M. Pass, S. Johnson, N.L. Barrett, W. Schaffner, P.R. Cieslak, P.S.

Maupin, E.R. Zell, J.H. Jorgensen, R.R. Facklam and C. Whitney // Journal of the American Medical Association. - 2001. – Vol. 286. – P.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Том 8, №2 (март апрель 2016) Интернет-журнал "НАУКОВЕДЕНИЕ" publishing@naukovedenie.ru http://naukovedenie.ru Интернет-журнал "Науковедение" ISSN 2223-5167 http://naukovedenie.ru/ Том 8, №2 (2016) http://naukovedenie.ru/index.php?p=vol8-2 URL статьи: http://naukovedenie.ru...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИ...»

«ГБОУ ВПО ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И. М. Сеченова МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПЕДИАТРИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ кафедра гигиены детей и подростков ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ ПО ГИГИЕНЕ ПИТАНИЯ Часть II ОЦЕНК...»

«Светлова Марина Всеволодовна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ПРИМОРСКИХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 25.00.36 – Геоэкология (Науки о Земле) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный рук...»

«УДК 577.152.193 ВЭЖХ-АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ ПСЕВДОПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВ МЕТГЕМОГЛОБИНОМ Е.В. Бондарюк, В.В. Сенчук Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь Флавонолы – природные биологически активные полигидроксипроизводные 2фенил)-хромен-4-она [1]. Ряд флавонолов относится...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 26 (65). 2013. № 3. С. 232-245. УДК 612.135:528.811+537-96 АДАПТАЦИОННО-ЗАЩИТНЫЕ РЕАКЦИИ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА КОЖИ В УС...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 77–97 УДК [597.6+598.1](571.1) Л.А. Эпова1, В.Н. Куранова2, С.Г. Бабина1 Государственный природный заповедник "Кузнецкий Алатау" (г. Междуреченск) Томский государственный университет (г. Томск) ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, БИОТОПИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ЧИС...»

«5.2013 СОДЕРЖАНИЕ CONTENTS ЭКОНОМИКА И ФИНАНСЫ ECONOMY AND FINANCES Сафаров Ш. О. Пути совершенствования цено Safarov Sh. O. Ways to improve the price mecha вого механизма в сельском хозяйстве. 2 nism in agriculture АГРОЭКОЛОГИЯ AGROECOLOGY Абдуллаев С. Ф., Назаров Б. И., Маслов В. А. Abdullaev S. F., Nazar...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра геоморфологии и геоэкологии Формирование ге...»

«Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Кольцово – 2008 Работа выполне...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт наук о Земле Кафедра физической географии и экологии Марьинских Дм...»

«2015 Географический вестник 2(33) Экология и природопользование ЭКОЛОГИЯ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕ УДК 004.6:581.55 П.Н. Бахарев, В.В. Семенов, Д.Н. Андреев27 ГЕОИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА ДАННЫХ ТЕРРИТОРИИ ЗАПОВЕДНИКА "ВИШЕРСКИЙ" В статье приведены резул...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ "Кемеровский государственный университет" Институт биологии, экологии и природных ресурсов Рабочая программа дисциплины БОЛЬШОЙ ПР...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Балашовский институт (филиал) Рабочая программа дисциплины Мир...»

«НАЗАРЕНКО Александр Владимирович СИСТЕМА ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КОМПЕТЕНТНОСТНО-ОРИЕНТИРОВАННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора педагогических наук Москва 2014 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 4. – С. 127-135. УДК 598(470.12) ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕПТИЛИЙ НА ТЕРРИТОРИИ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ © 2010 Д.Н. Ползиков* Вологодский государственный педагогический университет, г. Вологда (Россия) Поступила 4 марта 2010 г. Рассмотрены особенности основных...»

«А. С. АХИЕЗЕР Жизнеспособность российского общества Вынесенное в заголовок статьи понятие "жизнеспособность" является, быть может, центральной характеристикой любого общества. В России последних лет тема жизнеспособности, равно как и выживаемость, привлекает многих ученых. Однако сами эти...»

«Классный час Покормите птиц зимой! Цель: Вызвать сочувствие к зимующим птицам. Научить проявлять заботу к ним. Расширить знания детей о птицах.Задачи: Формирование экологического представления детей об окружающем мире. Обобщить и расширить представления детей о зимующих птицах. Воспитывать и р...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ АКСАЙСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 12. 10. 2016 459 г. Аксай Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги "Устранение технических ошибок в правоустанавливающих документах о предоставлении земельного участка, принятых органами местного самоуправления" В соответствии с Земельным ко...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра физической географии и ла...»

«4 истории в картинках Я сделал свою первую мультимедийную презентацию в 17 лет. Она предназначалась для большого проекта на школьном уроке биологии и была посвящена загрязнению окружающей среды. Мое слайд-шоу должно было показать всему классу красоту окружающего мира, противопоставив ее разрушениям и ...»

«Секция 11. Экология, безопасность и охрана труда на предприятии Но уже сейчас очевидно, что успешность прогнозов, получаемых на основе имитационных моделей, существенно будет зависеть от качества стат. анализа эмпирического матери...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ ЕВРОПЕЙСКАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ КОМИССИЯ Нью-Йорк, Женева, 1996 г. ЗАЩИТА ТРАНСГРАНИЧНЫХ ВОД Пособие для политиков и лиц, принимающих решения ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. РУКОВОДСТВО ПО МОНИТОРИНГУ И ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ТРАНСГРАНИЧНЫХ РЕК Документ подготовлен гр...»

«Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 1 (67). 2015. № 3. С. 49–55. УДК 579.64:581.14(653.63) ВЛИЯНИЕ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА "ЭМБИКО" НА ПРОРАСТ...»

«ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ от 19.01.2017 Рег. номер: 2883-1 (21.12.2016) Дисциплина: Водно-технические изыскания при обустройстве нефте-газовых комплексов 05.04.06 Экология и природопользование: Геоэкологические основы устойчивого водопользования/2 года ОФО; 05.04.06 Экология и Учебный план: природопользование...»

«УДК 53.023/072.001.24:542.632–195:541.182.644 ЭФФЕКТ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ГЕЛЕ КРЕМНИЕВОЙ КИСЛОТЫ Ю.И. Сухарев (1), Ю.В. Матвейчук (2), С.В. Курчейко (3). e-mail: sucharev@water.tu-chel.ac.ru (1), diff@irex.urc.ac.ru (2,3) Южно-Уральский государственный универси...»

«Гандзюра В.П., Гандзюра Л.А., 2008. Подходы к оценке качества вод и состояния экосистем в условиях антропогенной нагрузки //М-лы Междунар. конф. по водной токсикологии и гидроэкологии "Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы. Критерии оценки качества воды". Борок, Россия. С. 37–41. Лукьяненко...»

«1. ПЛАНИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОГО ПРЕДМЕТА Предметные компетенции формируются в рамках определённого предмета. В процессе преподавания химии формируется представление о химии как неотъемлемой составляющей естественно-научной картины мира; понимание роли химии в повседневной жизни и...»








 
2017 www.kn.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.